出生前诊断法

本发明涉及诊断方法，尤其是出生前诊断法和这些方法中所使用的试 剂。

在全世界，在医院中广泛进行出生前诊断。现存的用于染色体疾病， 包括唐氏综合症，以及单基因缺陷，包括囊性纤维化的方法，如胎儿、肝 脏或绒毛膜活检极具侵害性，并且带有对于胎儿为不得不考虑的危险以及 对于母亲为小的危险。

例如羊膜穿刺术包括将一根针插入子宫以从胚胎组织或体液中收集细 胞。可检测唐氏综合症的该试验带有估测为1％的流产危险。

胎儿治疗是在其很早的阶段，对于广范围的疾病的很早试验的可能性 将毫无疑问地大大加快该领域的研究。目前已改进了胎儿手术技术，使得 对一些遗传疾病，如脊柱二裂和腭裂的胎儿手术极为可能。此外，只要可 足够早地进行检测，对于其它疾病，例如21-羟基化酶(用地塞米松治疗)和 羟化全酶合成酶(用生物素治疗)缺乏症，目前可获得相对简单有效的胎儿治 疗。

因此，出生前诊断的相对无侵害性的方法为一种具有吸引力的对极具 侵害性的现存的方法的替代。基于母体静脉穿刺术的方法应使得较早期的 诊断可更广泛地在开始三个月进行，增加父母和产科医生的选择(因为遗传 疾病可被更早并更安全地检测)，并允许最终开发特异性的胎儿诊断。

回收来自母体循环的胎儿细胞的可能性已引起作为一种诊断胎儿异常 的可能的对胎儿无侵害性的方法的普遍兴趣(Simpon和Elias(1993)，美国医 学协会杂志，270，2357-2361)。早期的兴趣针对滋养层检测系统，但通过流 式细胞术分离那些细胞已不可靠，因为母体的淋巴细胞看来吸收由滋养层 细胞释放的蛋白(Mueller等(1990)柳叶刀336，197-200；Covone等(1984)柳 叶刀1310月版，841-843)。最近，注意力集中在开发分离用于细胞遗传学 分析的胎儿血细胞，尤其是具核胎儿红细胞的方法，因为它们的数目超过 母体循环中的胎儿淋巴细胞的数目。已描述了母体血液中的胎儿红细胞的 确定，即在男性胎儿中用Y着丝粒探针来确定胎儿细胞或Y特异性DNA 序列的扩增(Price等(1991)美国产科学与妇科学杂志，165，1731-1735；Zheng 等(1993)医学遗传学杂志30，1051-1056；Hamada等(1993)人类遗传学91， 427-432；Cheung等(1996)自然遗传学14，264-268；和Williamson(1996)自然 遗传学14，239-249)或在三体生物情况下的核型鉴定(例如参见Bianchi等 (1992)人类遗传学90，368-370)。

Hume等(1995)早期人类发育42，85-95表明微粒体葡萄糖-6-磷酸酶蛋 白存在于人胚和胎儿红细胞中。

Pazouki等(1996)Acta histochem.(Jena)98，29-37设法使用结合利用人胎 儿血红蛋白抗体的免疫细胞化学和使用X和Y染色体探针的原位杂交方法 来鉴定胎儿具核红细胞。

Hume等(1996)血液87，762-770描述了内质网蛋白在人胚胎和胎儿红细 胞前体中的表达。

Wachtel等(1991)人类繁殖6，1466-1469描述了使用PCR来鉴定通过使 用运铁蛋白受体抗体和血型糖蛋白A抗体分选的细胞分离的母体细胞中的 Y特异性DNA序列。

yeoh等(1991)出生前诊断11，117-123描述了通过胎儿特异性的单拷 贝基因的酶促扩增对母体循环中的胎儿细胞的检测。

Holzgreve等(1992)生殖医学杂志37，410-418表明仅仅运铁蛋白受体抗 原不足以富集胎儿具核红细胞，并指出该技术的可重复性和可靠性仍然有 限，主要由于缺乏非常特异性的细胞标记。

Zheng等(1993)医学遗传学杂志30，1051-1056描述了通过使用特异于 CD45和CD32的小鼠单克隆抗体从母体血液中排除白细胞来使用磁激活细 胞分选仪(MACS)以富集胎儿具核红细胞。文章指出甚至在避免通过间期荧 光原位杂交(FISH)的对胎儿细胞的准确分析的MACS富集后，仍存在显著 的母体污染。

Tomoda(1964)自然202，910-911描述了通过免疫荧光染色证实胎儿红 细胞。

需要鉴定母体血液中的胎儿细胞以进行出生前诊断的改进方法。

我们设法借助于已建立的免疫磁分选法，顺序使用抗CD45和抗CD18 抗体以除去白细胞和随后的抗CD71(运铁蛋白受体)抗体以富集胎儿具核红 细胞以从母体血液分离胚胎和胎儿具核红细胞。我们非常失望地发现使用 抗CD71抗体的免疫磁分选法未纯化幼巨红细胞系列的胚胎红细胞。纯化幼 巨红细胞的优点是它们是胚胎和早期胎儿中主要的红细胞类型，并且它们 具核，而绝大多数成人红细胞是正常红细胞和不具核的。

在随后的常规免疫组织化学中，我们发现CD71与幼巨红细胞的相互 作用极弱，推测性地解释了使用该抗体的对胚胎细胞的较弱的纯化。这是 在目前使用母体血用于早期诊断中的一个非常主要的问题。我们已显示与 具核幼红细胞相比，具核幼巨红细胞系列在早期发育中是主要的。这意味 着使用常规抗体，即抗CD71极难获得从早期孕体产生的纯的具核造血细 胞。抗CD71未与大多数这些早期细胞发生免疫反应，使得这项技术可用于 具有专业人员和设备的特定的研究实验室中，但在常规服务的实验室中是 不可行的。

抗CD71的使用描述在Cheung等(1996)自然遗传学14，264-268中，并 综述于Williamson(1996)自然遗传学14，239-240。观察载玻片上数以千计的 细胞以发现一些胎儿细胞是该方法存在的一个问题，实际上抗CD71抗体对 胎儿细胞不具有足够的选择性并且不与胚胎细胞反应。

本发明的一个目的是提供改进的用于鉴定母体血液中的胎儿细胞并从 中将其分离的方法。尤其是，本发明的一个目的是提供鉴定和分离胚胎或 早期胎儿红细胞，并分析细胞以确定胎儿异常的方法。

本发明的第一个方面提供一种鉴定在包含母体血细胞和胚胎或胎儿红 细胞或两者的样品中的胚胎或胎儿红细胞的方法，该方法包括确定哪个细 胞或哪些细胞包含或表达成人肝的成分。

本发明的第二个方面提供一种从包含母体血细胞和胚胎或胎儿红细胞 或两者的样品中分离胚胎或胎儿红细胞的方法，该方法包括分离包含或表 达成人肝的成分的细胞。

以前未提出胚胎或早期胎儿具核红细胞在血流中循环时起成人肝细胞 的作用。

适宜地，包含母体红细胞或胚胎或胎儿红细胞或两者的样品为来自怀 孕的雌性个体的血样。

优选地，胎儿红细胞为早期胎儿红细胞。

怀孕的雌性个体可为任何哺乳动物，尤其是具有商业或农业重要性的 哺乳动物或家养哺乳动物。适宜地，哺乳动物为马、牛、羊、猪、山羊、 狗、猫等。对于所有哺乳动物，胚胎和胎儿中的血液学发育的基本类型是 相同的。

怀孕的雌性个体优选为人。

本发明一个特别的优点是该方法在妊娠早期鉴定，并可被用来分离， 胚胎和早期胎儿红细胞。因此，如果母体血样取自处在妊娠早期的怀孕雌 性，则是优选的。在为怀孕妇女的情况下，如果样品取自开始的三个月， 则是优选的。

无论是对可能的胎儿治疗或终止妊娠的选择，通常越是在怀孕的早期 越好(理想地小于10周妊娠)。另一个实用的原因是在较早的妊娠时终止怀 孕的方法技术上较容易并具有较小的生理和心理副作用。对于胎儿异常的 宫内诊断没有上限，甚至后来在妊娠治疗中，在子宫中或刚出生期仍是有 利的。具核胚胎和胎儿细胞的个体发育清楚地表明那些细胞在胚胎/胎儿中 的百分比在开始三个月比怀孕后期高。然而，总的胎儿血液体积随妊娠而 增加，成比例地胎儿向母体转输的体积可能更大。

足以准确以天计算的发育的人类孕体的详细的结构仅能在排卵后天数 长达56天时详细描述，而描述性的术语，胚胎，被作该发育分级阶段的常 规性术语(O’Rahlly和Muller(1987)人胚胎的发育阶段，公开637，华盛顿： Carnegie Institute of Washington)。描述性的术语，胎儿，被用于人子宫内发 育至足孕的剩余阶段(＞37整周妊娠)，发育龄(至最近的周)，该估计值基于 大小，包括顶踵、顶臀和踵趾的测量以及胎儿期中的人体的外形的生长， Minneapolis：University of Minnesota Press)月经史和妊娠的超声记录。

本发明的方法尤其适宜于鉴定，并可被用来分离较之与具核幼红细胞 细胞在早期发育中占主要地位的具核幼巨红细胞系列的胚胎和胎儿红细 胞。然而，具核幼红细胞也可通过基于相同优点的方法分离或鉴定。在妊 娠的较早阶段幼巨红细胞的比例更高。胚胎/早期胎儿幼巨红细胞的形态学 与胚胎/胎儿幼红细胞和可在循环中存在的少量母体幼红细胞有根本的不 同。母体幼巨红细胞和巨红细胞极少，但的确出现在维生素B12和叶酸缺 乏中。由于这些原因，优选胚胎/早期胎儿幼巨红细胞，但胚胎/早期幼红细 胞也能被使用。

包含母体血细胞和胚胎或胎儿红细胞或两者的样品可为从中除去了某 些母体血细胞的样品。例如，可顺序使用虽然具有相对低功效的抗CD45 和抗CD18抗体从母体血液中除去成人白细胞。可通过密度离心(例如Ficoll 梯度)实现样品的富集，但不分离成人和胎儿具核细胞。

样品可为富集了胎儿细胞的样品。例如，它可为通过使用如Cheung等 (1996)自然遗传学14，264-268中描述的抗运铁蛋白受体抗体富集的样品。

样品(尤其当它为其中胎儿或胚胎细胞待鉴定而非分离的样品时)可为 被处理以进行血液学、生物化学、组织化学或分子生物学分析等。例如， 样品可为被制备用于免疫细胞化学分析或荧光原位杂交(FISH)分析或仅仅 被铺展在显微镜载玻片的血液样品或血液的部分的样品(例如富集了胎儿细 胞/去除了母体细胞的样品)。

包含母体血细胞和胚胎或胎儿红细胞或两者的样品可为包含这些细胞 的任何适宜样品(包括体液)。例如，样品可为患有血尿的病人的尿、羊水或 胎儿血液。

“成人肝脏成分”指主要与成人肝脏相关的成人肝脏细胞的成分，并 且如果真要在成人的其它组织中发现它，要么发现与肝脏比较，在其它组 织中为低水平，要么与肝脏的质量比较，其中发现所述成分的其它组织的 质量小以致与整个其它组织中的总量相比，成人肝脏成分的总量在整个肝 脏中更高。当发现在其它组织中成人肝脏成分为低水平时，与其它组织相 比，它在肝脏中至少高10倍，优选至少高100倍。当成人肝脏成分以类似 于肝脏的水平在其它组织中发现时，其它组织具有肝脏质量的1/10，较优 选肝脏质量的1/25。

虽然肾脏具有许多与肝脏不相关的功能，它也可在较小的程度上进行 一些肝脏的功能，如糖异生作用。尤其优选如果在上面成人肝脏成分的定 义中，“其它组织”不是肾脏。

例如，葡萄糖-6-磷酸酶为成人肝脏的的成分。肝脏中的葡萄糖-6-磷酸 酶水平比整个胰脏中的-6-磷酸酶水平高许多。然而，在胰岛细胞(其仅为胰 腺的小部分细胞)中葡萄糖-6-磷酸酶水平可如肝脏一样高。类似的， GLUT2为在胰岛细胞中表达的成人肝脏成分。两者被认为主要的肝脏蛋 白，在人体中的胰岛的总的质量与肝脏的总质量比较是微小的意义上。成 人肝脏成分的水平以每单位细胞部分或每单位细胞或每单位组织来测定。

因此，成人肝脏成分通常是成人肝脏选择性的或成人肝脏特异性的。

成人肝脏成分可为任何适宜的这些成分，并可包括蛋白质、RNA、碳 水化合物和代谢物，前提是这些主要与成人肝脏相关，并且如果其真在成 人的其它组织中发现它，或者发现与肝脏比较，在其它组织中为低水平， 或与肝脏的质量比较，其中发现该成分的其它组织的质量小以致与全部其 它组织中的总量比较，整个肝脏中的成人肝脏成分的总量更高。

可根据本发明的方法，通过检测或与定义的一种或多种成人肝脏成分 结合来鉴定或分离胚胎或胎儿细胞。

如果成人肝脏成分基本上缺乏母体血液的母体细胞，则是尤其优选 的。优选地，与胚胎或胎儿红细胞比较，母体血液的母体细胞包含以每个 细胞为基础小于1％的成人肝脏成分；较优选它们包含以每个细胞为基础 小于0.1％的成人肝脏成分。

当肝脏被外伤急性损伤时，细胞或凝块可能散布于血流中。因此，优 选当样品不是来自其肝脏被损伤以致将细胞释放至血液中的雌性的血样。 还优选样品不是任何包含成人肝脏细胞的其它样品中。

通过常规肝功能试验，例如丙氨酸氨基转移酶活性对血浆检测来评价 肝损伤。形态学上，循环的成人肝脏细胞和胚胎具核红细胞的外观为足够 不同使得能加以区分。

优选地，成人肝脏成分为蛋白质。

优选地，成人肝脏蛋白质为任何一种微粒体葡萄糖-6-磷酸酶，葡萄糖 -6-磷酸酶体系中的其它蛋白成分，包括磷酸或葡萄糖或葡糖-6-磷酸转运蛋 白、尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶(uridine diphosphate- glucuronosyltransferase)(UDPGT)、细胞色素P450同工酶(P450)、烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)细胞色素P450还原酶(P450还原酶)、葡萄糖转运 蛋白2(GLUT2)、P-糖蛋白、MDRP(多药物抗性蛋白)、MRP(多药物抗性 样蛋白)、γ-谷氨酰转肽酶、脂蛋白受体、碱性磷酸酶、胆汁盐转运蛋白、 胆汁酸转运蛋白、激素受体、多个有机离子转运蛋白(MOAT；等同于MRP)、 胆红素转运蛋白(胆汁移位酶)或胆红素结合物(例如胆红素葡糖苷酸)转运蛋 白(等同于MRP)。

由于它们被为其代谢的主要位点的肝脏所吸收，肝脏质膜包含多种药 物、生物异源物和内源性化合物的转运蛋白。类似的，结合的代谢物接着 被转运回来透过肝脏质膜。其中许多为所定义的成人肝脏成分的转运蛋白 为用于本发明方法实例中的适宜的靶。将理解这种类型的其它转运蛋白将 被纯化并且其相应的cDNA和基因将被克隆。本发明设想其它仍未知的转 运蛋白将是适宜的靶。

在存在不为成人肝脏选择性或成人肝脏特异性的蛋白类型或特定的蛋 白的同工酶的情况下，所使用的是成人肝脏选择性或成人肝脏特异性同工 酶。例如，某些P450s不为成人肝脏选择性的或成人肝脏特异性的，因此在 本发明的实例中，相关的是成人肝脏选择性或成人肝脏特异性的那些 P450s。通常，代谢生物异源物的P450s为肝脏选择性或肝脏特异性的。

适宜地，尤其当所述胚胎或胎儿血细胞待从该样品中分离时，成人肝 脏成分为细胞表面成分。然而，将理解所述细胞表面成分可用于分离和鉴 定的目的，和细胞表面成分优选用于分离和鉴定的目的。

优选地，细胞成分为主要与成人肝脏质膜相关的质膜蛋白，并且如果 它真要在成人的其它组织中被发现，它被发现为低的水平。

通常，成人肝脏质膜蛋白为所有如上定义的任一种GLUT2、P-糖蛋 白、MDRP、MRP、γ-谷氨酰转肽酶、脂蛋白受体、碱性磷酸酶、胆汁盐 转运蛋白、胆汁酸转运蛋白、激素受体、MOAT、胆红素转运蛋白或胆红 素结合物转运蛋白。

如果转运蛋白受体为如上定义的成人肝脏成分，优选成人肝脏成分不 为转运蛋白受体。

为了鉴定或分离胚胎或胎儿红细胞，优选当所述样品与所述成人肝脏 成分结合的结合部分接触，并且根据与结合部分的结合鉴定样品中的或从 中分离所述胚胎或胎儿细胞。

将理解胚胎或胎儿红细胞可以其它方式鉴定。

例如，许多成人肝脏成分为酶，因此这些细胞可通过酶的存在而得以 鉴定。适宜地，可使用对葡萄糖-6-磷酸酶的组织化学染色。而且对UDP葡 糖醛酸转移酶的适宜的分析也是可用的。

本发明还设想通过检测为mRNAs的成人肝脏成分，例如使用逆转录聚 合酶链反应(RT-PCR)检测成人肝脏成分。

在另一个优选的具体实施方案中，细胞内检测成人肝脏成分。例如， 当成人肝脏成分为酶时，通常使用底物(它进入取决于底物而可能被或不能 被透过的细胞中)以及当被所述酶代谢时，产生荧光或有色产物或可容易地 被检测的产物。将理解在该具体实施方案中，由于由所述酶产生的所述产 物的存在，胚胎或早期胎儿红细胞将是带荧光的或着色的(或以一些其它方 式标记)。可使用FACS分选仪从无荧光的细胞中分离荧光细胞。现有技术 已知产生着色产物的葡萄糖-6-磷酸酶的底物。

除开成人肝脏的各个已鉴定的蛋白成分，作为用于胚胎和胎儿细胞分 离和/或鉴定的抗体可能的来源，下面的方法也是适用的。通过差速离心(或 通过其它现有技术已知的其它方法)从匀浆的肝脏中分离人/或其它哺乳动 物肝脏质膜，并且(a)直接被用来产生抗体或(b)在产生抗特定成分的抗体之 前进行肝脏质膜的细分级。这些抗体可为与成人肝脏质膜，并且根据本发 明与胚胎和胎儿红细胞的质膜结合的多特异性多克隆抗体。

将理解针对成人肝脏质膜成分的已确定的抗体的混合物也可用于本发 明的方法中。

优选地，抗体与暴露于细胞表面的成人肝脏质膜成分的某些部分结 合。

方便地，所述结合部分为抗体或其片段或衍生物。

与许多这些抗原(无论蛋白抗原或非蛋白抗原)结合的单克隆抗体已为 已知，但在任何情况下，使用目前与单克隆抗体技术相关的技术，可制备 大多数抗原的抗体。抗原结合部分可为抗体的一部分(例如Fab片段)或合成 的抗体片段(例如单链Fv片段[ScFv])。选择的抗原的适宜的单克隆抗体可 通过已知技术制备，例如公开在“单克隆抗体：技术手册”，HZola(CRC出版， 1988)和“单克隆杂交瘤抗体：技术和应用”IGR Hurrell(CRC出版，1982)中 的那些。

Neuberger等(1988，第8界国际生物技术论文集，第2部分，792-299)讨 论了嵌合抗体。

多克隆抗体可用于本发明方法中。优选单特异性的多克隆抗体。可使 用现有技术熟知的方法制备适宜的多克隆抗体。

也可以遗传工程改造的抗体和抗体片段的形式使用抗体片段，如Fab 和Fab2片段。

抗体的可变重(VH)和可变轻(VL)区参与抗原的识别，这一事实首先通过 早期蛋白酶消化实验被认识。通过啮齿类抗体的“人源化”发现进一步的 证实。啮齿类来源的可变区可与人来源的恒定区融合，这样产生的抗体保 留了啮齿类亲本抗体的抗原特异性(Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci. USA81，6851-6855)。

从包括均包含一个或多个可变区的抗体片段的细菌表达实验已知抗原 特异性由可变区带来，并独立于恒定区。这些分子包括Fab样分子(Better 等(1988)科学240，1041)；Fv分子(Skerra等(1988)科学240，1038)；单链 Fv(ScFv)分子，其中VH和VL配对区借助于柔性寡肽连接(Bird等(1988)科 学242，423；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879)和包含分 离的V区的单区抗体(dAbs)(Ward等(1989)自然341，544)。保留了其特异性 结合位点的抗体片段的合成中所涉及的技术的综述见于Winter和 Milstein(1991)自然349，293-299。

“ScFv分子”指其中VH和VL配对区借助于柔性寡肽连接的分子。

Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段均可在大肠杆菌中表达并从中分泌， 因此允许容易地产生大量所述片段。

全抗体和F(ab’)2片段为“二价”。“二价”指所述抗体和F(ab’)2片段具 有两个抗原结合位点。相反，Fab、Fv、ScFv和dAb区为一价，仅具有 一个抗原结合位点。

将理解当成人肝脏成分为受体时，受体以及因此的胚胎或胎儿红细胞 可使用受体的配体来鉴定。例如，相关激素为激素受体的配体。

通常，在鉴定配体或胎儿红细胞的方法中，结合部分被可检测性地标 记或至少能检测。例如结合部分被放射性原子或着色分子或荧光分子或可 容易地以任何其它方式检测的分子标记。结合部分可直接用可检测标记来 标记或它可被间接标记。例如，结合部分可为可通过本身被标记的其它抗 体检测的未标记的抗体。另一方面，二抗可能与生物素结合，标记的链霉 抗生物素蛋白与生物素的结合被用来间接标记一抗。

通常，在分离胚胎或胎儿红细胞的方法中，结合部分被固定在固体载 体中，这样胚胎或早期胎儿红细胞可通过亲和性结合而分离。方便的，固 体载体包含任何适宜的介质，如琼脂糖、丙烯酰胺、Sepharose(商标)和 Sephadex(商标)。固体载体也可为固体介质，如微量滴定板等。

有利地，结合部分为磁标记的(直接或间接)，这样在提供了适宜的磁场 时，当被结合时，胚胎或胎儿细胞可与样品的其余部分分开。用于磁细胞 分选的微珠通常被称为MACS胶体超顺磁微珠。

以这种方式标记的胎儿或胚胎细胞可通过磁活化细胞分选仪(MACS) 而被分选。

适宜地，结合部分被荧光分子标记(直接或间接地)，使用荧光激活细胞 分选仪(FACS)分离胚胎或胎儿红细胞。

因此，我们开发了清楚鉴别并为你显示你所期望的正确的细胞类型(即 胚胎或胎儿红细胞)的工具和方法。

本发明的第三个方面提供一种鉴定胎儿异常的方法，该方法包括根据 本发明的第一或第二方面的方法鉴定或分离胚胎或胎儿细胞并分析所述胚 胎或胎儿细胞的所述胎儿异常。

在一个具体实施方案中，如上所述，使用结合部分，或根据所述酶的 存在来鉴定细胞，对所述胎儿异常的分析直接在鉴定的细胞中进行。例如， 可使用适宜的结合部分或使用适宜的酶检测系统通过免疫组织化学鉴定细 胞，胎儿异常的分析在如此鉴定的细胞中使用如荧光原位杂交(FISH)以检测 染色体异常的技术而原位进行。可原位使用聚合酶链反应。虽然荧光检测 系统工作得很好，但还可以使用标记的探针和酶联检测系统。

在一个尤其优选的具体实施方案中，根据本发明的第二个方面分离胚 胎或胎儿细胞。通过这种方法分离的细胞基本上均为胚胎或胎儿细胞，尤 其是基本上没有母体细胞存在。

根据将研究何种可能的异常，对胎儿异常的分析包括对所述胚胎或胎 儿细胞的分析。

虽然根据本发明可使用该方法，但优选不检测葡萄糖-6-磷酸酶的家族 性缺陷，或当通过使用与细胞内成人肝脏成分，如葡萄糖-6-磷酸酶结合的 结合部分鉴定细胞时，不诊断肝脏蛋白表达的紊乱。

虽然根据本发明可使用该方法，但还优选当使用与细胞内成人肝脏成 分结合的结合部分鉴定细胞时，不诊断内质网蛋白的遗传缺陷。

优选通过分析遗传物质鉴定胎儿细胞异常。尤其是，来自通过本发明 第二个方面的方法分离的胎儿细胞的基因组DNA与来自胎儿体细胞的基因 组DNA相同。在一个优选的具体实施方案中，检测了染色体异常。“染色 体异常”包括一条染色体或染色体数目的任何严重的异常。例如，这包括 检测唐氏综合症的指标的染色体21中的三体性、三体性18、三体性13、 性染色体异常，如克兰费尔特氏综合症(47，XXY)，XYY或特纳综合症、染 色体易位和缺失，少部分唐氏综合症病人具有易位和染色体缺失综合症， 包括Pradar-Willi综合症和Angelman综合症，这两种均包含染色体15的部 分缺失，和各基因中的突变(如缺失、插入、转换、颠换和其它突变)的检测。 还存在其它类型的染色体问题，如可通过DNA分析检测的Fragile X综合 症。下表表明一些基因和从中导致特定遗传疾病的突变。     疾病     缺损的基因 免疫缺陷 高胆固醇血症 血友病 高歇病 粘多糖病 肺气肿 囊性纤维化 苯丙酮尿症 血氨过多 瓜氨酸尿症 肌肉萎缩症 地中海贫血症 镰状细胞贫血 白细胞粘附缺陷症 腺苷脱氨酶 嘌呤核苷磷酸化酶 LDL受体 因子IX 因子VIII 葡糖脑苷脂酶 β-葡糖醛酸酶 α1-抗胰蛋白酶 囊性纤维化跨膜调节蛋白 苯丙氨酸羟化酶 鸟氨酸转氨甲酰基酶 精氨基琥珀酸合成酶 肌营养不良蛋白 β-珠蛋白 β-珠蛋白 CD-18

也已知可通过DNA分析检测的其它遗传疾病，如21-羟化酶缺乏或全 羧化酶合成酶缺乏、天冬氨酰葡糖胺尿症、异染色性脑白质营养不良、肝 豆状核变性病、类固醇硫酸酯酶缺乏、X-相关的肾上腺脑白质营养不良、 磷酸酶激酶缺乏(VI型糖原贮存疾病)和脱支酶缺乏(III型糖元贮存疾病)。在 遗传疾病的代谢和分子基础，第7版，卷I，II和III，Scriver，C.R.，Beaudet， A.L.，Sly，W.S.和Valle，D.(编)，McGraw Hill，1995中提到了这些以及其它遗 传疾病。很清楚，其中基因被克隆并且突变被检测的任何遗传疾病可通过 本发明的方法的具体实施方案来分析。

遗传分选法包括限制性片段长度多态性分析和PCR基检测的标准技术 以及下面描述的其它方法。

检测可包括任何用于鉴定突变或多态性的适宜方法，如：在一个或多 个相关位置进行DNA测序；被设计在野生型或突变序列的相关位置杂交的 寡核苷酸探针的示差杂交；在用适宜限制酶消化后的变性凝胶电泳，优选 在相关DNA区扩增之后；S1核酸酶序列分析；非变性凝胶电泳，优选在 相关DNA区扩增之后；常规RFLP(限制性片段长度多态性)分析；使用与野 生型序列匹配，不与突变序列匹配或与之相反的寡核苷酸的选择性DNA扩 增；或使用与野生型或突变基因型匹配的PCR(或类似)引物的限制位点的选 择性的导入，接着限制性消化。分析可能是间接的，即能检测已知与一个 或多个突变位置连接的其它位置或基因的突变。探针和引物可为从自然分 离的DNA片段或可为合成的。

非变性凝胶可被用来检测不同长度的由用适宜限制酶消化产生的片 段。通常在消化前，例如使用聚合酶链反应(PCR)方法和其改进扩增DNA。

可通过如Saiki等(1988)科学239，487-491公开的已建立的PCR方法或 通过其改进或另外的方法，如连接酶链反应，QB复制酶和基于核酸序列的 扩增来实现DNA的扩增。

“适宜的限制酶”为识别并切断野生型序列并且不切断突变序列或反 之的酶。被限制酶识别和切断的序列(或没有，情况可能是这样)可以突变的 结果出现或它可通过在PCR反应中使用错配的寡核苷酸而被导入正常或突 变等位基因中。如果酶仅偶尔切断DNA，换句话说，如果它识别仅仅很少 出现的序列则是很方便的。

在另一种方法中，使用与野生型基因型或突变基因型但不是两者匹配 (即与其杂交)的一对PCR引物。是否产生扩增的DNA将表明野生型或突变 基因型(和由此的表型)。然而，该方法部分取决于可能是由于技术缺陷的阴 性结果(即扩增的DNA的不存在)。因此，它是较不可靠的和/或需要另外的 对照实验。

可优选的方法采用类似的PCR引物，但除开仅与一个野生型或突变序 列杂交外，它们还导入不另外存在于野生型或突变序列中的限制性位点。

为了简化随后的对扩增序列的克隆，引物可具有附着于其5’末端的限 制酶位点。因此，引物的所有核苷酸来自感兴趣的基因序列或该基因附近 的基因序列，除开形成限制酶位点的极少的核苷酸外。现有技术熟知这些 酶和位点。引物本身可使用现有技术熟知的技术来合成。通常，可使用可 商购的合成机器制备引物。

本发明的第四个方面提供用于确定胎儿异常的试剂盒，包括(a)用于确 定细胞是否包含或表达插入肝脏成分的试剂(mean)和(b)用于分析细胞异常 的试剂(mean)。

用于确定细胞是否包含或表达插入肝脏成分的试剂包括前述的结合部 分和当成人肝脏成分为酶时用于检测所述酶的试剂(例如底物)和试剂，如 PCR引物、脱氧核苷酸和当成人肝脏成分为mRNA时，用于检测所述mRNA 的DNA聚合酶。成人肝脏成分的抗体或其片段或衍生物是优选的。尤其优 选成人肝脏成分为如上所述的细胞表面成分。

用于分析细胞异常的试剂包括所有这类试剂。尤其优选当试剂为用于 检测基因异常的试剂。因此，适宜的这类试剂包括核酸分子，如PCR引物 和探针，它们选择性地与感兴趣的基因杂交，即杂交到寻找的遗传遗传位 于其中的基因。

本发明的另一个方面提供其结合部分与成人肝脏成分结合的结合部分 在确定胎儿异常中的用途，该方法包括根据本发明的第一或第二个方面鉴 定或分离胚胎或胎儿细胞，并分析所述胚胎或胎儿细胞的所述胎儿异常。

优选地，结合部分被用于其中胎儿细胞异常通过分析遗传物质来确定 的方法中，例如染色体异常或DNA突变的方法。

本发明的另一个方面提供用于确定细胞是否包含或表达成人肝脏成分 的试剂在鉴定或分离胚胎或胎儿红细胞中的用途。

用于确定细胞是否包含或表达成人肝脏成分的试剂为描述在本发明第 四个方面的那些。

现参考下面的实施例和附图更详细地描述本发明，其中：

图1(95绒毛膜aGLUT21；100X40RH)表明在排卵后56天，在胎儿绒毛 膜血管(bv)中，在幼巨红细胞(箭头)中显示强的αGLUT2免疫反应性，在正 常红细胞(楔形符号)中无反应性的人绒毛膜绒毛。合胞体滋养层(s)和细胞滋 养层(c)为最小的免疫反应性。

实施例1：成人肝脏成分的抗体

通过皮内和皮下注射的结合，在Suffolk Cross Blackface羊中产生抗纯 化的大鼠肝脏睾酮/4-硝基苯酚UDPGT的抗体。通过硫酸铵沉淀和二乙基氨 基乙基纤维素层析的结合(Burchell等(1984)生物化学学会学报12，50)从抗 血清中制备IgG。通常羊抗大鼠肝脏睾酮/4-硝基苯酚UDPGT抗体制备物 (RAL1)抑制UDPGT对胆红素、睾酮、1-萘酚、雄酮、雌酮和吗啉的活性， 并且免疫印迹证实在大鼠和成人以及胎儿肝脏微粒体中对多个同种型的广 谱交叉反应性。

如(Bruchell和Waddell：肝微粒体葡萄糖-6-磷酸酶体系的遗传缺陷，在 Randle等(编)：遗传和人营养，伦敦，英国，Libbey，1990，p93；Waddell等 (1991)生物化学杂志275，363；Burchell和Cain(1985)糖尿病28，852)，通过3 次皮下注射80ug纯化蛋白和Freund氏完全佐剂在Cheviot羊中分别产生微 粒体葡萄糖-6-磷酸体系的催化亚单位、T2和T3的单特异性多克隆抗血 清。在注射抗原前从各只羊中获得免疫前血清。被用作抗原的葡萄糖-6-磷 酸酶体系、T2和T3均从饥饿的Wistar大鼠肝微粒体中分离。通过硫酸铵 和使用蛋白G柱的亲和纯化进一步纯化抗血清。虽然是针对抗大鼠肝脏蛋 白而产生的，但如在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后通过免疫印迹 分析判断的，抗体制备物多次显示对各种人蛋白良好的交叉反应。

在兔中产生牛血清白蛋白偶联的methy-moximated PGEM(PGEM-MOX) 的抗血清(Kelly等(1986)前列腺素与白细胞药物24，1)。在放射免疫分析中， PGEM-MOX抗血清与PGE2仅具有0.05％的交叉反应性。除开15-酮- PGE2(12％)和15-酮-PGE2α(0.9％)，PGEM-MOX抗血清对其它methy- moximated PGs的交叉反应性通常小于0.02％。除开6，15-二酮-13，14-二-氢 PGE2α(0.35％)、13，14-二氢PGE2α(2％)和15-酮-PGE2α(4％)，PGEM-MOX 抗血清对其它PGs的交叉反应性的百分数通常小于0.02％。Gemeprost对 PGEM-MOX抗血清的交叉反应性通常小于0.03％，对PGFM-MOX抗血清 小于0.03％。通过由PGEM-MOX的免疫染色的选择性吸附(Hume等(1993) 实验性肺研究19，361)表明PGFM-MOX抗血清的免疫组织化学的抗体特异 性。与来自许多哺乳动物种类的PGHS-1交叉反应，但为对PGH-2很小反 应性的多克隆山羊IgG部分的抗PGHS-1和单克隆15-羟基前列腺素脱氢酶 抗体购自Oxford生物药物研究公司(Oxford，MI)。

将PGE2与匙孔血蓝蛋白结合并皮内注射至羊中。产生的PGE2抗血 清在放射免疫分析中为高群选择性的，在PGs的F和E系列中具有最小的 交叉反应性。Gemeprost与PGE2抗血清的交叉反应性通常小于1％。通过 人胎儿肺中的PGE2免疫染色吸附的选择性(Hume等(1992)实验性研究肺18， 259)检测了对免疫组织化学的抗血清特异性。

如Wolf等(1984)肿瘤发生5，993中所描述的分离纯化的细胞色素P450s 的抗体。通过使用表达的人重组细胞色素P450蛋白的免疫印迹分析 (Forrester等(1992)生物化学杂志281，359)显示了以这种方式制备的抗血清的 同工酶特异性。纯化了NADPH-细胞色素P450氧化还原酶(Wolf等(1984) 肿瘤发生5，993)并且在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中(Smith等 (1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，8710)，兔中产生的抗体显示与人酶的交叉 反应。

除开使用分离的蛋白作为抗原制备的抗体外，抗肽抗体也是适宜的。

在已知序列信息和/或使用部分cDNA或与便于在适宜体系中，例如细 菌中过度表达后分离的适宜序列相连的基因而产生的蛋白的大部分的基础 上合成抗肽抗体。如下制备了抗人葡萄糖-6-磷酸酶的某些部分 (CSHIHSIYNASLKKY(SEQ ID NO：1)；CMNVLHDFGIQSTHY(SEQ ID NO：2)；CLAQVLGQPHKKSL(SEQ ID NO：3)；和CLSRIYLAAHFPHQ(SEQ ID NO：4))的一系列抗肽抗体。

将这些肽与匙孔血蓝蛋白结合并通过皮内和皮下途径注射至羊中。产 生的抗肽抗血清显示交叉反应，并可被用于免疫组织化学检测包含葡萄糖- 6-磷酸酶的包括胎儿和胚胎细胞的细胞。

实施例2：检测三体性21的对母体血样的结合的免疫细胞化学和荧光 原位杂交分析法

血样和细胞的制备

在头三个月从孕妇获得外周静脉血样(EDTA)。在15ml试管中将5ml 血样的等分试样小心地铺在3.5ml Polymorphoprep(Nycomed，挪威)，室温 下，接着将试管以500g离心30分钟。使用pasteur移液管收集在血浆/ Polymorphoprep界面(获得的两个带的上部)处的单核细胞并分散至干净的 试管中。使用5ml包含0.5％牛血清白蛋白(BSA)和5mM乙二胺四乙酸(EDTA) 的冷的磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞洗涤3次，接着每次以400g离心10分钟。 最后，将细胞沉淀以106细胞/ml重新悬浮在PBS/BSA/EDTA。

载玻片制备物

将血液单核细胞的等分试样(100ul)细胞离心至玻璃载玻片上(Cytospin， Shandon)并空气干燥过夜。

免疫细胞化学

下面的多克隆和单克隆抗体用于免疫细胞化学步骤中：(a)葡萄糖-6-磷 酸酶的小鼠单克隆抗体(b)为1∶25的兔抗小鼠IgG(DAKO)和(c)为1∶100的小 鼠PAP(DAKO)。将所有抗体稀释在包含20％正常兔血清(Serotec)的TBS 中，室温下，在湿润室中进行抗体的保温。

将干燥的离心物(cytospins)在丙酮中固定3分钟并两次更换Tris-缓冲的 盐水(TBS)将其洗涤5分钟。改进标准的PAP技术(Sternberger等，1970，组织 化学与细胞化学杂志18，315-333)。简而言之，使用0.3％过氧化氢的TBS 溶液将内源性过氧化物酶活性阻断30分钟，此后，将载玻片用两次TBS漂 洗5分钟。将细胞离心物与20％正常兔血清的TBS溶液一起保温5分钟以 阻断非特异性的结合位点。在除去大多数正常兔血清后，将细胞离心物与 抗G6Pase单克隆抗体一起保温30分钟。如前用TBS洗涤载玻片，接着与 20％正常兔血清的TBS溶液一起保温5分钟后，将细胞离心物与兔抗小鼠 IgG一起保温30分钟。如上洗涤载玻片并与20％正常兔血清的TBS溶液 一起保温5分钟，接着与小鼠PAP一起保温30分钟。如上洗涤载玻片，加 入2至3滴3，3-二氨基联苯胺(DAB)底物溶液，室温下保温7分钟。通过将 2.5mgDAB(Sigma)溶解在5mlTBS中，接着加入0.1ml在使用前立即新配制 的1％过氧化氢来制备DAB溶液。将载玻片在流动的自来水中洗涤2分钟， 接着在硫酸铜溶液(0.4g硫酸铜，0.72g氯化钠，100ml蒸馏水)中保温5分 钟并再在流动的蒸馏水中漂洗。为了在免疫细胞化学后检查细胞的形态 学，可将载玻片用Mayer氏苏木精(Sigma)复染20分钟，经梯度乙醇脱水， 使用光学显微镜Zeiss Axioskop 20检查。

使用抗G6Pase单克隆抗体和标准的PAP技术(Stemberger等，1970，组 织化学与细胞化学杂志18，315-333)进行组织切片的免疫组织化学。将切片 稍微用苏木精复柒，经梯度乙醇脱水，并在盖于合成树脂中之前用二甲苯 清洁。

荧光原位杂交(FISH)

免疫组织化学后，室温下将细胞离心物在3∶1(v/v)甲醇∶冰乙酸中固定 30分钟。用新制备的相同固定液重复固定过程，并用70∶30(v/v)冰乙酸∶水 固定90秒。两次更换PBS将载玻片洗涤5分钟，接着经70％、85％和 100％乙醇脱水，室温下空气干燥。使用人染色体21特异性的直接用荧光 素异硫氰酸(FITC)标记的探针进行FISH。简而言之，将直接液体移至各细 胞离心物中，用荧光探针覆盖的盖玻片被放置于上部，并用树胶溶液封片。 在杂交液体存在下，将探针从盖玻片上洗脱，在探针和在通过将载玻片加 入至37℃在盖玻片下出现的靶DNA变性后，37℃下，让探针与靶杂交25 分钟。在数次杂交后洗脱之后，将载玻片固定在包含二脒基-2-苯基-吲哚二 盐酸盐(DAPI)的抗褪色溶液中。

显微镜

使用装有带有汞-短电弧灯HBO 50W的显微镜反光镜和适宜Zeiss过 滤器组合(对于DAPI为02；对于FITC为09)的Zeiss Axioskop 20显微镜分 析载玻片。使用显微镜在可见光类型定位免疫阳性细胞，此后，阻断可见 光源，将显微镜转至荧光类型，并使用各个过滤器组分析载玻片。拥 Fujichrome Provia 400彩卷(富士胶卷公司，东京，日本)在可见光类型和荧 光类型中对细胞照相。从彩卷中产生黑和白的负片和正片。

结果

来自染色体21的三个阳性荧光点存在于来自受影响胎儿的胚胎或胎儿 细胞中。相反，正常的母体细胞和正常的胎儿细胞对于染色体21产生两个 阳性的荧光点。通过对葡萄糖-6-磷酸酶的免疫反应性区分胎儿和母体细 胞，即胎儿红细胞为免疫阳性，母体红细胞为免疫阴性。

实施例3：胎儿细胞的分离和对镰状细胞贫血和地中海贫血的PCR分 析

图1(95绒毛膜aGLUT21；100X40RH)表明在排卵后56天，在胎儿绒 毛膜血管(bv)中，在幼巨红细胞(箭头)显示强的αGLUT2免疫反应性，在正 常红细胞(楔形符号)中无反应性的人绒毛膜绒毛。合胞体滋养层(s)和细胞滋 养层(c)为最小的免疫反应性。

以下面的方式分离来自在开始三个月抽取的母体血液的胎儿细胞，并 用PCR分析镰状细胞贫血和地中海贫血。

血样和细胞分离

将来自处在头三个月的孕妇的外周血(16-18ml)收集至EDTA Vacutainer 试管中(Becton Dickinson，Rutherford，NJ)。接着将血液用磷酸缓冲盐溶液 (PBS)以1∶2稀释，每15ml覆盖10ml Ficoll-paque plus(密度1.077g/ml， Pharmacia Biotech，Piscatawa，NJ)，室温下以400g离心30分钟。接着小心除 去界面细胞，用补充有5mM EDTA和0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤 两次，以80ul PBS/EDTA/BSA/107细胞的量重新悬浮。

磁激活细胞分选

按照制造商的方法，通过MiniMACS(Miltenyi Biotech，INc.，Sunnyvale， CA)富集具核红细胞。以20ul/107细胞将与MACS微珠结合的抗GLUT2抗 体加入至重新悬浮的细胞中。将磁珠标记细胞悬液吸至MiniMACS柱的顶 部，接着通过使用1ml缓冲液和柱塞泵将它们推出柱来收集未标记的细胞。

以这种方式分离的细胞基本上全部是早期胎儿或胚胎具核红细胞。

如(Saiki等(1988)科学239，487-491)所述，在50ul反应体积中使用 Perkin-Elmer DNA热循环仪进行PCR。每个扩增循环由95℃，1分钟， 55℃1分钟和72℃1分钟组成，其中最后一次循环中在72℃下进行10分 钟最后的延伸。将来自从MiniMACS柱洗脱的胎儿或胚胎的DNA先扩增 40个循环并在8％丙烯酰胺凝胶检测第5次产物。若无特异性的PCR产物 或极弱的PCR产物，使用相同的条件，将10ul第一轮PCR产物的等分试 样再扩增20至30次。被用来扩增β-珠蛋白序列的引物是生物素化‘pco3’(5’ 生物素-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’(SEQ UD NO：5))，生物素化的 ‘β110’(5’-生物素-AAAATAGACCAATAGGCAGA-3’(SEQ ID NO：6))和生物 素化的‘China 2’(5’-生物素-TGCAGCTTGTCACAGTGCAGCTCACT-3’(SEQ ID NO：7))。由‘pco3’和‘β110’扩增的248bp的DNA被用于镰刀细胞基因的 检测。由‘pco3’和‘China2’扩增的460bp的DNA被用于β-地中海贫血的检 测。

反向斑点印迹杂交

如(Maggio等(1993)血液81，239-242；Cai等(1994)人突变3，59-63)所描 述地制备包含多斑点的β-珠蛋白序列的固定的人和突变的寡核苷酸探针。这 些用于检测突变的寡核苷酸探针如下：对于检测镰刀细胞基因，正常的探 针为5’-TGACTCCTGAGGAGAAGT-3’(SEQ ID NO：8)和突变探针为5’- CAGACTTCTCCACAGGA-3’(SEQ ID NO：9)；对于检测β39突变，正常探针 为5’-CTTGGACCCAGAGGTTCTT-3’(SEQ ID NO：10)和突变探针为5’- AGAACCTCTAGGTCCAAGG-3’(SEQ ID NO：11)和对于检测β110突变，正 常探针为5’-GAAAATAGACCAATAGGCAGA-3’(SEQ ID NO：12)和突变探针 为5’-CTGCCTATTAGTCTTTTTC-3’(SEQ ID NO：13)。将胎儿细胞的PCR 产物加入至0.8ml包含2×SSC/0.1％SDS的溶液中。加入包含寡核苷酸探 针的条，并通过在水浴中煮沸5分钟使DNA变性。42℃水浴过夜进行杂 交。接着42℃下，将条在0.5×SSC/0.1％SDS中洗涤10分钟，室温下与 链霉抗生物素蛋白-HRP结合15分钟，室温下用包含四甲基联苯胺溶液、 柠檬酸钠和H2O2的显色底物显色，直至肉眼可见颜色，无论胎儿细胞是否 具有可通过本方法检测的镰刀细胞或地中海贫血突变。