[0001] 本发明涉及产多巴胺神经前体细胞的制造方法。

[0002] 帕金森病是由于中脑黑质中产多巴胺神经细胞的脱落而发生的神经退行性疾病，目前，世界上大约有400万人的患者。作为帕金森病的治疗，进行利用L-DOPA或多巴胺激动
剂进行的药物治疗、利用定位脑手术进行的凝固术或深部电刺激治疗和胎儿中脑移植等。

[0003] 胎儿中脑移植在其供给源的组织存在伦理问题的同时感染的危险性也高。因此，提出了使用由胚性干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞分化诱导而
得的神经细胞的治疗方法(非专利文献1)。然而，却被指出在移植分化诱导而得的神经细胞
时形成良性肿瘤的可能性和运动障碍，运动障碍的原因被认为是除了作为目的的产多巴胺
神经细胞以外的细胞，从而需要选择植活并且安全的细胞来进行移植。

[0004] 因此，提出利用成为产多巴胺神经细胞或产多巴胺神经前体细胞的标记的基因对适合移植的细胞进行筛选(专利文献1～4)，但标记的选择尚有改善的余地。此外，这些文献
中，并未对是否适合用筛选之后的细胞进行给药、或者是否可以用由该中间体细胞诱导而
得的细胞进行给药进行研究。

[0005] 进而认为，为了抑制含有生物来源成分所导致的个体差异的影响、价格的大幅上涨，产多巴胺神经细胞的制造方法是有改善的余地的。

[0006] 现有技术文献

[0007] 专利文献

[0008] 专利文献1：WO2005/052190

[0009] 专利文献2：WO2006/009241

[0010] 专利文献3：WO2007/119759

[0011] 专利文献4：WO2013/015457

[0012] 非专利文献

[0013] 非专利文献1：Wernig M,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2008,105:5856-5861

[0014] 本发明的目的是，制造适合作为帕金森病治疗剂的产多巴胺神经前体细胞。因此，本发明的课题是，提供产多巴胺神经前体细胞的制造工序或制造中所需的试剂盒。

[0015] 为了解决上述课题，本发明人等着眼于被认为是产多巴胺神经前体细胞的标记基因的细胞表面膜蛋白Corin和/或Lrtm1，发现，通过以之为指标提取细胞、进一步继续培养
后再进行移植，即使在移植后，产多巴胺细胞也会植活，确认了通过本制造工序可获得作为
帕金森病治疗剂的产多巴胺神经前体细胞，从而完成了本发明。

[0016] 即，本发明如下。

[0017] [1]一种由多能干细胞制造产多巴胺神经前体细胞的方法，包括下面的工序：

[0018] 工序(i)，在含有选自由BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8和GSK3β抑制剂组成的组的试剂的培养液中，将多能干细胞在细胞外基质上进行贴壁培养；

[0019] 工序(ii)，从上述工序(i)中得到的细胞收集Corin和/或Lrtm1阳性细胞；

[0020] 工序(iii)，将上述工序(ii)中得到的细胞在含有神经营养因子的培养液中进行悬浮培养。

[0021] [2]根据[1]所述的方法，细胞外基质为层粘连蛋白511或其片段。

[0022] [3]根据[2]所述的方法，层粘连蛋白511片段为层粘连蛋白511E8。

[0023] [4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，上述工序(i)包括下面的工序：

[0024] 工序(a)，在含有BMP抑制剂和TGFβ抑制剂的培养液中，将多能干细胞在细胞外基质上进行贴壁培养；

[0025] 工序(b)，在含有BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂和FGF8的培养液中，将上述工序(a)中得到的细胞在细胞外基质上进行贴壁培养；

[0026] 工序(c)，在含有BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8和GSK3β抑制剂的培养液中，将上述工序(b)中得到的细胞在细胞外基质上进行贴壁培养；

[0027] 工序(d)，在含有BMP抑制剂和GSK3β抑制剂的培养液中，将上述工序(c)中得到的细胞在细胞外基质上进行贴壁培养。

[0028] [5]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，BMP抑制剂为LDN193189。

[0029] [6]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，TGFβ抑制剂为A83-01。

[0030] [7]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，SHH信号激活剂为嘌吗啡胺(Purmorphamine)。

[0031] [8]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，GSK3β抑制剂为CHIR99021。

[0032] [9]根据[1]至[8]中任一项所述的方法，上述神经营养因子为BDNF和GDNF。

[0033] [10]根据[1]至[9]中任一项所述的方法，上述工序(iii)的工序中使用的培养液进一步含有B27添加剂(Supplement)、抗坏血酸和二丁酰环磷酸腺苷。

[0034] [11]根据[1]至[10]中任一项所述的方法，上述(i)和/或(iii)的工序中使用的培养液进一步含有ROCK抑制剂。

[0035] [12]根据[11]所述的方法，ROCK抑制剂为Y-27632。

[0036] [13]根据[1]至[12]中任一项所述的方法，上述工序(i)进行至少10天。

[0037] [14]根据[1]至[13]中任一项所述的方法，上述工序(i)进行12天至21天。

[0038] [15]根据[1]至[13]中任一项所述的方法，上述工序(i)进行12天至14天。

[0039] [16]根据[1]至[15]中任一项所述的方法，上述工序(iii)进行至少7天。

[0040] [17]根据[1]至[16]中任一项所述的方法，上述工序(iii)进行14天至30天。

[0041] [18]根据[1]至[17]中任一项所述的方法，上述工序(iii)进行14天至16天。

[0042] [19]根据[1]至[18]中任一项所述的方法，结合于Corin的物质或结合于Lrtm1的物质为结合于Corin或Lrtm1的抗体或适配体。

[0043] [20]一种产多巴胺神经前体细胞，其为通过[1]至[19]中任一项所述的方法得到的。

[0044] [21]一种帕金森病治疗剂，其含有通过[1]至[19]中任一项所述的方法得到的产多巴胺神经前体细胞。

[0045] [22]一种用于由多能干细胞制作产多巴胺神经前体细胞的试剂盒，其含有BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8、GSK3β抑制剂、细胞外基质和神经营养因子。

[0046] [23]根据[22]所述的试剂盒，其进一步含有抗Corin抗体和/或抗Lrtm1抗体。

[0047] [24]根据[22]或[23]所述的试剂盒，细胞外基质为层粘连蛋白511E8。

[0048] [25]根据[22]至[24]中任一项所述的试剂盒，BMP抑制剂为LDN193189。

[0049] [26]根据[22]至[25]中任一项所述的试剂盒，TGFβ抑制剂为A83-01。

[0050] [27]根据[22]至[26]中任一项所述的试剂盒，SHH信号激活剂为嘌吗啡胺。

[0051] [28]根据[22]至[27]中任一项所述的试剂盒，GSK3β抑制剂为CHIR99021。

[0052] [29]根据[22]至[28]中任一项所述的试剂盒，神经营养因子为BDNF和GDNF。

[0053] 发明的效果

[0054] 根据本发明，能够有效地获得对帕金森病治疗剂等有用的、适合于移植的、植活率高的产多巴胺神经前体细胞。
附图说明

[0055] 图1中显示的是产多巴胺细胞的制造方案的一例。图中，“Y”表示Y-27632，“AA”表示抗坏血酸。

[0056] 图2是表示使用MG(基质胶)、CS(CELLStart)、LM111(层粘连蛋白111E8)或LM511(层粘连蛋白511E8)作为包被剂来分化诱导时第12天的Tra-1-60阳性细胞的含有率、PSA-
NCAM阳性细胞的含有率和Corin阳性细胞的含有率的图表。

[0057] 图3显示的是人iPS细胞(836B3)和分化诱导工序的细胞的相位差图像(照片)。图像分别显示分化诱导前(左图)、分化诱导之后(第0天，day0)(中央图)和诱导后第12天
(day12)(右图)。

[0058] 图4显示的是分化诱导工序中Corin(○)、PSA-NCAM(□)和Tra-1-60(Δ)阳性细胞数的含有率的变化。显示的是第12天以后未进行分选的条件下的结果。

[0059] 图5显示的是未分化标记和分化标记的表达量的变化。值用以第0天的值为1时的相对值来表示。图5A中的第12天显示了Sox1、hGSC、Sox17、Brachyury、Nanog和Oct4的值。图
5B中的第42天显示了Lmx1a、TH、Foxa2、Nurr1、Map2ab、En1和Oct4的值。

[0060] 图6显示的是在多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤维连接蛋白被膜上培养的第42天的细胞的免疫染色图像(照片)。

[0061] 图7显示的是第12天(day12)使用抗Corin抗体分选时的Corin阳性、Corin阴性或未分选的细胞的基因表达分析结果。图7A显示的是各细胞中Lmx1a、En1、Foxa2、Otx2、Gbx2
和Six3的表达量。表达量用以未分选(unsorted)为1时的相对值来表示。图7B显示的是第12
天利用微阵列对于未分选的(unsorted)细胞和Corin阳性细胞(Corin+)的表达进行比较而
得到的分析结果。

[0062] 图8表示的是第12天使用抗Corin抗体分选的Corin阳性细胞(Corin+)或Corin阴性细胞(Corin-)、或未分选的细胞(Unsorted)的基因表达分析结果。图8A显示的是各细胞
中Foxa2/Lmx1a(上图)和Otx2/Lmx1a/DAPI(下图)的三重染色图像(照片)。图8B显示的是各
细胞中Foxa2阳性和Lmx1a阳性的细胞含有率。图8C显示的是各细胞中Otx2阳性和Lmx1a阴
性的细胞含有率。图8D显示的是各细胞和分化诱导前的细胞中Oct4和Nanog的表达量。

[0063] 图9显示的是第21天使用抗Corin抗体分选的Corin阳性细胞(Corin+)或Corin阴性细胞(Corin-)、或未分选的细胞(Unsorted)的基因表达分析结果。图9A显示的是各细胞
中Lmx1a、En1、Foxa2、Otx2、Gbx2、和Six3的表达量。表达量用以未分选的(unsorted)为1时
的相对值来表示。图9B显示的是各细胞中Corin/Lmx1a(上图)和Foxa2/Lmx1a(下图)的双重
染色图像(照片)。图9C显示的是各细胞中Foxa2阳性和Lmx1a阳性的细胞含有率。

[0064] 图10显示的是分化诱导第28天(day28)和第42天(day42)球体(sphere)的大小的分析结果。图10A显示的是各细胞团的相位差图像(照片)。图10B显示的是各细胞团的直径
的值的图表。

[0065] 图11显示的是分化诱导第28天(day28)和第42天(day42)的基因表达分析结果。图11A显示的是针对Foxa2/DAPI和Nurr1/TH(酪氨酸羟化酶)的免疫染色图像(照片)。图11B显
示的是第28天(左图)和第42天(右图)Nurr1阳性细胞、Foxa2阳性细胞和TH阳性细胞的含有
率。图11C显示的是由Corin+和未分选的、1×106个第42天的细胞释放的多巴胺(DA)、3,4-
二羟基苯乙酸(DOPAC)和血清素(5-HT)的量。

[0066] 图12显示的是将对通过分选(第12天)而采取到的Corin阳性细胞进行培养而得到的细胞(Corin+)或未进行分选而诱导的细胞(Unsorted)在分化诱导第28天移植至大鼠(6-
羟基多巴胺(6-OHDA)给药)脑内后第16周的移植片的情形。图12A显示的是移植片的GFAP、
Ki67和人核的免疫染色图像(照片)。对图中框内的放大图像另外进行显示。图12B、C和D分
别显示描绘移植了第28天、第42天和第19天的细胞时移植片的大小的图表。图12E显示的是
移植了第28天的细胞时移植片中的Ki67阳性细胞含有率。

[0067] 图13显示的是将对通过分选(第12天)而采取到的Corin阳性细胞进行培养而得到的细胞(Corin+)、未进行分选而诱导的细胞(Unsorted)或阴性对照(Medium，培养基)在分
化诱导第28天(day28)和第42天(day42)移植至大鼠(6-OHDA给药)脑内的结果。图13A显示
的是用第28天的细胞给药时移植后的各时期每单位时间的回巢行动数(日文：旋回行動
数)。图13B显示的是对用第28天的细胞给药时每个移植片的TH阳性细胞数进行描绘的图
表。图13C显示的是用第28天的细胞给药时脑的TH(红色)和人核(绿色)的染色图像(照片)。
图13D显示的是用第42天的细胞给药时移植后的各时期每单位时间的回巢行动数。图13E显
示的是对用第42天的细胞给药时每个移植片的TH阳性细胞数进行描绘的图表。图13F显示
的是用第42天的细胞给药时脑的TH(红色)和人核(绿色)的染色图像(照片)。

[0068] 图14显示的是移植了第28天的细胞时移植片的分析结果。图14A显示的是对单位神经细胞(NeuN+)的TH阳性细胞数进行描绘的图表。图14B显示的是对单位供体细胞(人nuc
+)的TH阳性细胞数进行描绘的图表。图14C显示的是针对移植片的Foxa2/TH、Pitx3/TH、
Nurr1/TH和Girk2/TH的双重染色图像(照片)。

[0069] 图15显示的是将对通过分选(第12天)而采取到的Corin阳性细胞进行培养而得到的细胞(Corin+)或未进行分选而诱导的细胞(Unsorted)在分化诱导第28天移植至大鼠(6-
OHDA给药)脑内的结果。图15A显示的是各细胞中第16周的移植片中的血清素(绿)/TH(红)
的双重染色图像(照片)。图15B显示的是各细胞中第16周单位生存细胞(NeuN阳性细胞)的
血清素阳性细胞的含有率。

[0070] 图16显示的是第28天的细胞、第42天的细胞和胎儿腹侧中脑细胞的基因表达分析的结果。图16A显示的是使用微阵列对在第12天以Corin阳性细胞分选的细胞(d28Corin+)
和未分选的细胞(d28Unsorted)的表达进行比较的结果(左图)、以及以Corin阳性细胞分选
的诱导第28天的细胞(d28Corin+)和诱导第42天的细胞的表达进行比较的结果(右图)。图
16B显示的是，对于第28天的细胞(d28Corin+)、第42天的细胞(d42Corin+)和胎儿腹侧中脑
细胞(VM)，使用PCR测定CORIN、LMX1A、FOXA2、NURR1、TH和TPH2的结果。用以胎儿腹侧中脑细胞(VM)的值为1进行比较时的数值来表示。图16C显示的是，对以Corin阳性细胞分选的第28
天的细胞(d28Corin+)、未分选的第28天的细胞(d28Unsorted)、分选的第42天的细胞
(d42Corin+)、未分选的第42天的细胞(d42Unsorted)和胎儿腹侧中脑细胞(VM)的微阵列进
行聚类分析的结果。

[0071] 图17显示的是对通过分选(第14天)而采取到的Lrtm1阳性细胞进行培养而得到的细胞的染色图像。图17A显示的是分选后第7天使用Foxa2、Lmx1a和DAPI的染色图像(照片)。
图中的数字表示各阳性细胞的含有率，双重染色时表示双重阳性细胞的含有率。图17B显示
的是将对Lrtm1阳性细胞进行分选的细胞(Lrtm1+)和未分选的细胞(Unsort)培养21天后各
标记(Foxa2、Nurr1和TH)的染色图像(照片)。图中的数字表示各阳性细胞的含有率，双重染
色时表示双重阳性细胞的含有率。

[0072] 图18显示的是将对通过分选(第14天)而采取到的Lrtm1阳性细胞进行1天培养而得到的细胞移植至10周龄SD大鼠后移植片中的各标记(Foxa2、TH和Nurr1)的免疫染色图像
(照片)。

[0073] 图19-1：图19显示的是对于通过对Lrtm1阳性细胞进行分选而采取到的细胞进一步进行培养后染色的图像(从左侧开始，显示的是Foxa2/DAPI、Nurr1/DAPI、TH/DAPI、Foxa2
+TH+/DAPI、Nurr1+TH+/DAPI和Foxa2+Nurr1+TH+/DAPI)。图中的数字表示染色图像的阳性
细胞率。图19A显示的是在分化诱导第14天进行分选并培养7天后的染色图像。

[0074] 图19-2：图19显示的是对于通过对Lrtm1阳性细胞进行分选而采取到的细胞进一步进行培养后染色的图像(从左侧开始，显示的是Foxa2/DAPI、Nurr1/DAPI、TH/DAPI、Foxa2
+TH+/DAPI、Nurr1+TH+/DAPI和Foxa2+Nurr1+TH+/DAPI)。图中的数字表示染色图像的阳性
细胞率。图19B显示的是在分化诱导第14天进行分选并培养14天后的染色图像。

[0075] 图19-3：图19显示的是对于通过对Lrtm1阳性细胞进行分选而采取到的细胞进一步进行培养后染色的图像(从左侧开始，显示的是Foxa2/DAPI、Nurr1/DAPI、TH/DAPI、Foxa2
+TH+/DAPI、Nurr1+TH+/DAPI和Foxa2+Nurr1+TH+/DAPI)。图中的数字表示染色图像的阳性
细胞率。图19C显示的是在分化诱导第21天进行分选并培养7天后的染色图像。

[0076] 本发明提供一种由多能干细胞制造产多巴胺神经前体细胞的方法，其包括下面的工序：

[0077] 工序(i)，在含有选自由BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8和GSK3β抑制剂组成的组的试剂的培养液中，将多能干细胞在细胞外基质上进行贴壁培养；

[0078] 工序(ii)，从上述工序(i)中得到的细胞收集Corin和/或Lrtm1阳性细胞；

[0079] 工序(iii)，将上述工序(ii)中得到的细胞在含有神经营养因子的培养液中进行悬浮培养。

[0080] ＜多能干细胞＞

[0081] 本发明中可使用的多能干细胞是具有能够分化为存在于活体中的全部细胞的多能性并且还具有增殖能力的干细胞，对其并无特殊限定，包括例如胚性干(ES)细胞、来自通
过核移植得到的克隆胚胎的胚性干(ntES)细胞、精子干细胞(“GS细胞”)、胚性生殖细胞
(“EG细胞”)、人工多能性干(iPS)细胞、来自培养成纤维细胞、骨髓干细胞的多能细胞(Muse
细胞)等。优选的多能干细胞是ES细胞、ntES细胞和iPS细胞。

[0082] (A)胚性干细胞

[0083] ES细胞是由人、小鼠等哺乳动物的早期胚胎(例如胚泡)的内部细胞团建立的、具有多能性和自我复制所带来的增殖能力的干细胞。

[0084] ES细胞是来自受精卵的8细胞期、作为桑椹胚后的胚的胚泡的内部细胞团的胚来源的干细胞，具有分化为构成成体的所有细胞的能力即所谓分化多能性、以及自我复制所
带来的增殖能力。ES细胞在小鼠中于1981年被发现(M.J.Evans and M.H.Kaufman(1981),
Nature 292:154-156)，之后，利用人、猴子等灵长类也建立了ES细胞系(J.A.Thomson et 
al.(1998),Science282:1145-1147；J.A.Thomson et al.(1995),
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:7844-7848；J.A.Thomson et al.(1996),Biol.Reprod.,55:
254-259；J.A.Thomson and V.S.Marshall(1998),Curr.Top.Dev.Biol.,38:133-165)。

[0085] ES细胞可以通过下述方法来建立：从对象动物的受精卵的胚泡将内部细胞团取出，将内部细胞团在成纤维细胞的饲养细胞上培养。此外，通过继代培养进行的细胞维持可
以使用添加有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor(LIF))、碱性成纤维细胞生
长因子(basic fibroblast growth factor(bFGF))等物质的培养液来进行。关于人和猴子
的ES细胞的建立和维持方法，例如在USP5,843,780；Thomson JA,et al.(1995),Proc 
Natl.Acad.Sci.U S A.92:7844-7848；Thomson JA,et al.(1998),Science.282:1145-
1147；H.Suemori et al.(2006),Biochem.Biophys.Res.Commun.,345:926-932；M.Ueno et 
al.(2006),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:9554-9559；H.Suemori et al.(2001),
Dev.Dyn.,222:273-279；H.Kawasaki et al.(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:1580-
1585；Klimanskaya I,et al.(2006),Nature.444:481-485等中有记载。

[0086] 使用例如补充有0.1mM 2-巯基乙醇、0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酸、20％KSR和4ng/ml bFGF的DMEM/F-12培养液作为用于制作ES细胞的培养液，在37℃、2％CO2/98％空
气的湿润气氛下，能够维持人ES细胞(O.Fumitaka et al.(2008),Nat.Biotechnol.,26:
215-224)。此外，ES细胞需要每3～4天进行继代，此时，继代可以使用例如含有1mM CaCl2和
20％KSR的PBS中的0.25％胰蛋白酶和0.1mg/ml胶原酶IV来进行。

[0087] ES细胞的选择一般可以以碱性磷酸酶、Oct-3/4、Nanog等基因标记的表达为指标通过实时(Real-Time)PCR法来进行。尤其在人ES细胞的选择中，可以以OCT-3/4、NANOG、
ECAD等基因标记的表达为指标(E.Kroon et al.(2008),Nat.Biotechnol.,26:443-452)。

[0088] 人ES细胞株、例如WA01(H1)和WA09(H9)可以从WiCell Reserch Institute获得、KhES-1、KhES-2和KhES-3可以从京都大学再生医科学研究所(京都、日本)获得。

[0089] (B)精子干细胞

[0090] 精子干细胞是精巢来源的多能干细胞，是用于形成精子的作为起源的细胞。该细胞与ES细胞同样地能够分化诱导为各种系的细胞，例如，具有如果移植至小鼠胚泡则能够
形成嵌合体小鼠等性质(M.Kanatsu-Shinohara et al.(2003)Biol.Reprod.,69:612-616；
K.Shinohara et al.(2004),Cell,119:1001-1012)。利用含有神经胶质细胞源性神经营养
因子(glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF))的培养液能够自我复制，
此外，通过反复在与ES细胞同样的培养条件下继代，能够获得精子干细胞(竹林正则等
(2008),实验医学,26卷,5号(增刊),41～46页,羊土社(东京、日本))。

[0091] (C)胚性生殖细胞

[0092] 胚性生殖细胞是由胚胎期的原始生殖细胞建立的、与ES细胞同样具有多能性的细胞，可以通过在LIF、bFGF、干细胞因子(stem cell factor)等物质的存在下对原始生殖细
胞进行培养来建立(Y.Matsui et al.(1992),Cell,70:841-847；J.L.Resnick et al.
(1992),Nature,359:550-551)。

[0093] (D)人工多能干细胞

[0094] 人工多能性干(iPS)细胞是可以通过将特定的重编程因子以DNA或蛋白质的形态导入至体细胞来制作的、具有与ES细胞大体同等的特性、例如分化多能性和自我复制所带
来的增殖能力的、体细胞来源的人工干细胞(K.Takahashi and S.Yamanaka(2006)Cell,
126:663-676；K.Takahashi et al.(2007),Cell,131:861-872；J.Yu et al.(2007),
Science,318:1917-1920；Nakagawa,M.等,Nat.Biotechnol.26:101-106(2008)；国际公开
WO2007/069666)。重编程因子可以由ES细胞特异表达的基因、其基因产物或非编码RNA或对
维持ES细胞的未分化起到重要作用的基因、其基因产物或非编码RNA、或低分子化合物构
成。作为重编程因子中包括的基因，可例示例如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、
Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-
catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等，这些重编程因子可以单独使用，也可以组合使用。作为重编程因子的组合，可例示如下文献中记载的组合：WO2007/
069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/
102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/
050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/
111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D,et al.(2008),Nat.Biotechnol.,26:795-797、Shi Y,et al.(2008),Cell 
Stem Cell,2:525-528、Eminli S,et al.(2008),Stem Cells.26:2467-2474、Huangfu D,
et al.(2008),Nat Biotechnol.26:1269-1275、Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3,
568-574、Zhao Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3:475-479、Marson A,(2008),Cell 
Stem Cell,3,132-135、Feng B,et al.(2009),Nat Cell Biol.11:197-203、R.L.Judson 
et al.,(2009),Nat.Biotech.,27:459-461、Lyssiotis CA,et al.(2009),Proc Natl 
Acad Sci U S A.106:8912-8917、Kim JB,et al.(2009),Nature.461:649-643、Ichida 
JK,et al.(2009),Cell Stem Cell.5:491-503、Heng JC,et al.(2010),Cell Stem 
Cell.6:167-74、Han J,et al.(2010),Nature.463:1096-100、Mali P,et al.(2010),Stem 
Cells.28:713-720、Maekawa M,et al.(2011),Nature.474:225-9。

[0095] 上述重编程因子中还包括以提高组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂[例如丙戊酸(VPA)、曲古抑菌素A、丁酸钠、MC 1293、M344等低分子抑制剂、针对HDAC的siRNA和shRNA(例
如HDAC1siRNA Smartpool(Millipore)、针对HDAC1的HuSH 29mer shRNA构建体(OriGene)
等)等核酸性表达抑制剂等]、MEK抑制剂(例如PD184352、PD98059、U0126、SL327和
PD0325901)、糖原合酶激酶-3抑制剂(例如Bio和CHIR99021)、DNA甲基转移酶抑制剂(例如
5-氮杂胞苷)、组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如BIX-01294等低分子抑制剂、针对Suv39hl、
Suv39h2、SetDBl和G9a的siRNA和shRNA等核酸性表达抑制剂等)、L-钙通道激动剂(例如
Bayk8644)、丁酸、TGFβ抑制剂或ALK5抑制剂(例如LY364947、SB431542、616453和A83-01)、
p53抑制剂(例如针对p53的siRNA和shRNA)、ARID3A抑制剂(例如针对ARID3A的siRNA和
shRNA)、miR-291-3p、miR-294、miR-295和mir-302等miRNA、Wnt信号(例如可溶性Wnt3a)、神
经肽Y、前列腺素类(例如前列腺素E2和前列腺素J2)、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、
PITX2、DMRTBl等的建立效率为目的而使用的因子，本说明书中，对于出于改善它们的建立
效率的目的而使用的因子也未与重编程因子进行特别的区别。

[0096] 重编程因子在为蛋白质形态的情况下，例如可以通过脂质体转染、与细胞膜透过性肽(例如HIV来源的TAT和聚精氨酸)的融合、显微注射等方法导入至体细胞内。

[0097] 另一方面，在为DNA形态的情况下，可以通过例如病毒、质粒、人工染色体等载体、脂质体转染、脂质体、显微注射等方法导入至体细胞内。作为病毒载体，可例示逆转录病毒
载体、慢病毒载体(以上，Cell,126,pp.663-676,2006；Cell,131,pp.861-872,2007；
Science,318,pp.1917-1920,2007)、腺病毒载体(Science,322,945-949,2008)、腺病毒伴
随病毒载体、仙台病毒载体(WO2010/008054)等。此外，作为人工染色体载体，包括例如人人
工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC、PAC)等。作为质粒，可使用哺
乳动物细胞用质粒(Science,322:949-953,2008)。载体中，可以以核重编程物质能够表达
的方式包含启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子、聚腺苷酸化位点等调控序列，进一步
根据需要可以含有试剂抗性基因(例如卡那霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因、嘌呤霉素抗
性基因等)、胸苷激酶基因、白喉毒素基因等筛选标记序列、绿色荧光蛋白质(GFP)、β葡萄糖
醛酸酶(GUS)、FLAG等报告基因序列等。此外，上述载体中，为了在导入体细胞后将编码重编
程因子的基因或启动子和编码与之结合的重编程因子的基因一起切除，在它们的前后可以
具有LoxP序列。

[0098] 此外，在为RNA形态的情况下，可以通过例如脂质体转染、显微注射等方法导入至体细胞内，为了抑制分解，可以使用引入5-甲基胞苷和假尿苷(TriLink Biotechnologies)
的RNA(Warren L,(2010)Cell Stem Cell.7:618-630)。

[0099] 作为用于进行iPS细胞诱导的培养液，包括例如含有10～15％FBS的DMEM、DMEM/F12或DME培养液(这些培养液中可以进一步适当含有LIF、青霉素/链霉素、嘌呤霉素、L-谷
氨酰胺、非必需氨基酸类、2-巯基乙醇等。)或市售的培养液[例如小鼠ES细胞培养用培养液
(TX-WES培养液、Thromb-X公司)、灵长类ES细胞培养用培养液(灵长类ES/iPS细胞用培养
液、ReproCELL公司)、无血清培养基(mTeSR、Stemcell Technology公司)]等。

[0100] 作为培养方法的例子，例如在37℃、5％CO2存在下，使体细胞和重编程因子在含有10％FBS的DMEM或DMEM/F12培养液上接触，并培养约4～7天，之后，将细胞重新播种于饲养
细胞(例如丝裂霉素C处理的STO细胞、SNL细胞等)上，在体细胞与重编程因子接触约10天
后，用含有bFGF的灵长类ES细胞培养用培养液培养，该接触约30～约45天或其以上后，能够
生成iPS样集落。

[0101] 或者，在37℃、5％CO2存在下，在饲养细胞(例如丝裂霉素C处理的STO细胞、SNL细胞等)上用含有10％FBS的DMEM培养液(其中可以进一步适当含有LIF、青霉素/链霉素、嘌呤
霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸类、2-巯基乙醇等。)培养，约25～约30天或其以上后，能够生成ES样集落。可优选例示使用经重编程的体细胞本身(Takahashi K,et al.(2009),PLoS 
One.4:e8067或WO2010/137746)或使用细胞外基质(例如层粘连蛋白-5(WO2009/123349)和
基质胶(BD公司))来代替饲养细胞的方法。

[0102] 此外，还可例示使用不含血清的培养基进行培养的方法(Sun N,et al.(2009),Proc Natl Acad Sci USA.106:15720-15725)。进而，为了提高建立效率，可以利用低氧条
件(0.1％以上、15％以下的氧浓度)来建立iPS细胞(Yoshida Y,et al.(2009),Cell Stem 
Cell.5:237-241或WO2010/013845)。

[0103] 上述培养期间，培养开始第2天以后，与新鲜培养液的培养液进行替换，每天1次。此外，核重编程中使用的体细胞的细胞数没有限定，为每100cm2培养盘约5×103～约5×106
细胞的范围。

[0104] iPS细胞可以通过所形成的集落的形状进行选择。另一方面，导入与体细胞经重编程时所表达的基因(例如Oct3/4、Nanog)相关联而表达的试剂抗性基因作为标记基因时，可
以对通过利用含有相应试剂的培养液(选择培养液)进行培养而建立的iPS细胞进行选择。
此外，标记基因为荧光蛋白质基因时通过利用荧光显微镜的观察、在为荧光素酶基因时通
过加入发光基质、此外在为显色酶基因时通过加入发色基质，能够对iPS细胞进行选择。

[0105] 本说明书中使用的“体细胞”用语是指除了卵子、卵母细胞、ES细胞等生殖系细胞或分化全能性细胞以外的所有动物细胞(优选为包括人的哺乳动物细胞)。体细胞中，非限
定性地包括胎儿(幼仔)的体细胞、新生儿(幼仔)的体细胞、和成熟健全的或疾患性的体细
胞中的任一种，此外，还包括原代培养细胞、继代细胞和株化细胞中的任一种。具体而言，体
细胞可例示例如(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(体
性干细胞)、(2)组织前体细胞、(3)淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞
(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰细胞(胰外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞和脂肪细胞等已分化的细胞等。

[0106] 此外，从在将iPS细胞用作移植用细胞的材料时不发生排斥反应的观点出发，优选使用移植前的个体的HLA基因型为相同或实质上相同的体细胞。这里，“实质上相同”是指利
用免疫抑制剂能够抑制针对所移植的细胞的免疫反应的程度的、HLA基因型一致，例如具有
HLA-A、HLA-B和HLA-DR 3基因座或加上HLA-C的4基因座一致的HLA型的体细胞。

[0107] (E)通过核移植得到的克隆胚胎来源的ES细胞

[0108] nt ES细胞是通过核移植技术制作的克隆胚胎来源的ES细胞，具有与受精卵来源的ES细胞大体相同的特性(T.Wakayama et al.(2001),Science,292:740-743；S.Wakayama 
et al.(2005),Biol.Reprod.,72:932-936；J.Byrne et al.(2007),Nature,450:497-
502)。即，由通过将未受精卵的核与体细胞的核置换得到的克隆胚胎来源的胚泡的内部细
胞团建立的ES细胞为nt ES(nuclear transfer ES)细胞。为了制作nt ES细胞，利用核移植
技术(J.B.Cibelli et al.(1998),Nature Biotechnol.,16:642-646)与ES细胞制作技术
(上述)的组合(若山清香等(2008),实验医学,26卷,5号(增刊),47～52页)。核移植中，可以
通过在哺乳动物的去掉核的未受精卵中注入体细胞的核并培养数小时来进行重编程。

[0109] (F)多系分化持续应激细胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells，Muse细胞)

[0110] Muse细胞是通过WO2011/007900中记载的方法制造的多能干细胞，详细而言，是通过长时间用胰蛋白酶对成纤维细胞或骨髓间质细胞进行处理、优选进行8小时或16小时胰
蛋白酶处理后，进行悬浮培养而得到的具有多能性的细胞，SSEA-3和CD105为阳性。

[0111] ＜产多巴胺神经前体细胞＞

[0112] 本发明中，除非特殊指明，否则，产多巴胺神经前体细胞包括产多巴胺神经细胞或多巴胺能神经元等。此外，产多巴胺神经前体细胞可以是包含他种细胞的细胞集团，优选为
不含血清素神经细胞的细胞集团。产多巴胺神经前体细胞优选为含有Foxa2Nurr1和/或TH
阳性细胞的细胞集团。本发明中，作为人Foxa2，可列举NCBI登录号NM_021784或NM_153675
所示的多聚核苷酸和它们编码的蛋白质。本发明中，作为人Nurr1，可列举NCBI登录号NM_
006186所示的多聚核苷酸和它们编码的蛋白质。本发明中，作为人TH，可列举NCBI登录号
NM_000360、NM_199292或NM_199293所示的多聚核苷酸和它们编码的蛋白质。

[0113] ＜细胞外基质＞

[0114] 本发明中，细胞外基质是存在于细胞外的超分子结构体，可以为天然来源，也可以为人工物质(重组体)。可列举例如胶原蛋白、蛋白多糖、纤维粘连蛋白、透明质酸、肌腱蛋
白、巢蛋白、弹性蛋白、原纤维蛋白和层粘连蛋白等物质或它们的片段。这些细胞外基质可
以组合使用，例如可以为BD基质胶(BD Matrigel，商标)等来自细胞的制备物。优选为层粘
连蛋白或其片段。本发明中，层粘连蛋白是具有α链、β链、γ链各有1条的异源三聚体结构的蛋白质，没有特别限定，例如α链为α1、α2、α3、α4或α5，β链为β1、β2或β3，并且γ链可例示γ
1、γ2或γ3，更优选为由α5、β1和γ1构成的层粘连蛋白511。本发明中，层粘连蛋白可以为片段，只要是具有整联蛋白结合活性的片段就没有特别限定，例如可以为作为用弹性蛋白
酶消化而得到的片段的E8片段。因此，本发明中，可例示WO2011/043405中记载的层粘连蛋
白511E8(优选人层粘连蛋白511E8)。

[0115] ＜BMP抑制剂＞

[0116] 本发明中，BMP抑制剂可例示Chordin、Noggin、卵泡抑素(Follistatin)等蛋白质性抑制剂、Dorsomorphin(即6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑并[1,
5-a]嘧啶)、其衍生物(P.B.Yu et al.(2007),Circulation,116:II_60；P.B.Yu et al.
(2008),Nat.Chem.Biol.,4:33-41；J.Hao et al.(2008),PLoS ONE,3(8):e2904)和
LDN193189(即4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)。Dorsomorphin
和LDN193189已有市售，可分别从Sigma-Aldrich公司和Stemgent公司获得。本发明中使用
的BMP抑制剂可优选为LDN193189。

[0117] 培养液中LDN193189的浓度只要是阻碍BMP的浓度就没有特别限定，例如为1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM，但不限于此。优选为100nM。

[0118] ＜TGFβ抑制剂＞

[0119] 本发明中，TGFβ抑制剂是阻碍从TGFβ与受体的结合至继续向SMAD传递信号的物质，可列举阻碍与作为受体的ALK家族结合的物质、或阻碍由ALK家族导致的SMAD的磷酸化
的物质，可例示例如Lefty-1(作为NCBI Accession No.，可例示小鼠：NM_010094、人：NM_
020997)、SB431542、SB202190(以上，R.K.Lindemann et al.,Mol.Cancer,2003,2:20)、
SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、
LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)、A83-01(WO 2009146408)和它们的
衍生物等。本发明中使用的TGFβ抑制剂可优选为A83-01。

[0120] 培养液中A83-01的浓度只要是阻碍ALK5的浓度就没有特别限定，例如为1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM，但不限于此。优选为500nM至5μM，更优选为500nM。

[0121] ＜SHH信号激活剂＞

[0122] 本发明中，SHH(Sonic hedgehog)信号激活剂定义为，引起SHH结合于作为受体的Patched(Ptch1)而导致的Smoothened(Smo)的脱抑制和进一步引起Gli2的活化的物质，可
例示例如SHH、Hh-Ag1.5(Li,X.,e t al.,Nature Biotechnology,23,215～221(2005).)、
Smoothened激动剂,SAG(N-甲基-N’-(3-吡啶基苄基)-N’-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,
4-二氨基环己烷)、20a-羟基胆固醇、嘌吗啡胺和它们的衍生物等(Stanton BZ,Peng LF.,
Mol Biosyst.6:44-54,2010)。本发明中使用的SHH信号激活剂可优选为嘌吗啡胺。

[0123] 培养液中嘌吗啡胺的浓度只要是使Gli2活化的浓度就没有特别限定，例如为1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM，但不限于此。优选为2μM。

[0124] ＜GSK3β抑制剂＞

[0125] 本发明中，GSK3β抑制剂定义为阻碍GSK-3β蛋白质的激酶活性(例如对β索烃素的磷酸化能力)的物质，已知多种物质，可列举例如作为靛玉红衍生物的BIO(别名GSK-3β抑制
剂IX；6-溴靛玉红3'-肟)、作为马来酰亚胺衍生物的SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲
基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、作为苯基α溴甲酮化合物的GSK-3β抑制剂VII(4-
二溴苯乙酮)、作为细胞膜透过型磷酸化肽的L803-mts(别名GSK-3β肽抑制剂；Myr-N-
GKEAPPAPPQpSP-NH2(序列号1))和具有高选择性的CHIR99021(6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-
5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈)。这些化合物已由例如
Calbiochem公司、Biomol公司等市售，可以容易地利用，也可以由其他途径获得，或者也可
以自行制作。本发明中使用的GSK-3β抑制剂可优选为CHIR99021。

[0126] 培养液中CHIR99021的浓度例如为1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM，但不限于此。优选为1μM。

[0127] ＜FGF8＞

[0128] 本发明中，FGF8没有特别限定，为人FGF8的情况下，可例示FGF8a、FGF8b、FGF8e或FGF8f 4种剪切形式，本发明中更优选为FGF8b。FGF8已由例如和光公司、R&D systems公司
等市售，可以容易地利用，也可以通过利用本领域技术人员公知的方法在细胞中强制表达
来获得。

[0129] 培养液中FGF8的浓度例如为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL，但不限于此。优选为
100ng/mL。

[0130] ＜对细胞进行选择的方法＞

[0131] 本发明中，为了从细胞集团选择Corin阳性细胞和/或Lrtm1阳性细胞，可以使用与Corin或Lrtm1特异性结合的物质。结合于Corin或Lrtm1的物质可以使用抗体、适配体，优选
为抗体或其抗原结合片段。

[0132] 本发明中，抗体可以为多克隆或单克隆抗体。这些抗体可以使用本领域技术人员公知的技术制成(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.
(1987)Publish.John Wiley and Sons.Section 11.12-11.13)。具体而言，抗体为多克隆
抗体时，根据常规方法对在大肠菌或哺乳类细胞系等中表达并纯化的编码Corin或Lrtm1的
蛋白质、具有部分氨基酸序列的寡肽或糖脂质进行纯化，对家兔等非人动物进行免疫，可以
根据常规方法从该免疫动物的血清获得。另一方面，为单克隆抗体时，可以从由使经上述免
疫的非人动物得到的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞融合而制备的杂交瘤细胞中获得
(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John 
Wiley and Sons.Section11.4-11.11)。作为抗体的抗原结合片段，可例示抗体的一部分
(例如Fab片段)或合成抗体片段(例如单链Fv片段“ScFv”)。Fab和F(ab)2片段等抗体片段也
可以通过基因工程上公知的方法来制作。例如针对Corin的抗体可以通过WO2004/065599、
WO2006/009241所述的制作方法获得，针对Lrtm1的抗体可以通过WO2013/015457所述的制
作方法获得。

[0133] 人Corin可由NCBI登录号NM_006587获得其序列。同样地，人Lrtm1可由NM_020678获得其序列。

[0134] 以对表达Corin或Lrtm1的细胞进行识别或分离为目的，该结合的物质可以与例如荧光标记、放射性标记、化学发光标记、酶、生物素或链霉亲和素等能够检测的物质或蛋白
质A、蛋白质G珠或磁珠等使得能够分离提取的物质结合或接合。

[0135] 该结合的物质还可以间接标记。可使用本领域技术人员公知的各种方法进行，可列举例如使用特异性结合于该抗体的预先经标记的抗体(第二抗体)的方法。

[0136] 作为对产多巴胺神经前体细胞进行检测的方法，包括使用流式细胞仪或蛋白质芯片等。

[0137] 提取产多巴胺神经前体细胞的方法可例示使粒子接合于该结合的物质并沉降的方法、使用磁珠利用磁性对细胞进行筛选的方法(例如MACS)、使用荧光标记并使用细胞分
选仪的方法、或使用固定有抗体等的载体(例如细胞浓缩柱)的方法等。

[0138] 本发明中，特异性结合于Corin或Lrtm1的适配体可以使用本领域技术人员公知的技术制成(SELEX(systematic evolution of ligand by exponential enrichment，指数
富集配体的系统进化技术)法：Ellington,A.D.&Szostak,J.W.(1990)Nature,346,818-
822.,Tuerk,C.&Gold,L.(1990)Science,249,505-510.。)

[0139] ＜神经营养因子＞

[0140] 本发明中，神经营养因子是在运动神经元的生存和功能维持中发挥重要功能的膜受体的配体，可列举例如神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)、脑源性神经营养因子
(Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF)、神经营养因子-3(Neurotrophin 3，NT-3)、
神经营养因子-4/5(Neurotrophin 4/5，NT-4/5)、神经营养因子-6(Neurotrophin 6，NT-
6)、碱性FGF(basic FGF)、酸性FGF(acidic FGF)、FGF-5、表皮生长因子(Epidermal Growth 
Factor，EGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)、胰岛素(Insulin)、胰岛
素样生长因子1(Insulin Like Growth Factor 1，IGF 1)、胰岛素样生长因子2(Insulin 
Like Growth Factor 2，IGF 2)、胶质细胞源性神经营养因子(Glia cell line-derived 
Neurotrophic Factor，GDNF)、TGF-b2、TGF-b3、白细胞介素-6(Interleukin 6，IL-6)、睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Factor，CNTF)和LIF等。本发明中优选的神经营养
因子为选自由GDNF和BDNF组成的组的因子。神经营养因子已由例如和光公司、R&D systems
公司等市售，可以容易地利用，也可以通过利用本领域技术人员公知的方法在细胞中强制
表达而获得。

[0141] 培养液中GDNF1的浓度例如为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL，但不限于此。优选为10ng/mL。

[0142] 培养液中BDNF1的浓度例如为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL，但不限于此。优选为20ng/mL。

[0143] ＜工序(i)＞

[0144] 本发明中，上述工序(i)优选通过下面的多阶段工序来进行：

[0145] (a)工序，在含有BMP抑制剂和TGFβ抑制剂的培养液中，将多能干细胞在细胞外基质上进行贴壁培养；

[0146] (b)工序，在含有BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂和FGF8的培养液中，将上述工序(a)中得到的细胞在细胞外基质上进行贴壁培养；

[0147] (c)工序，在含有BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8和GSK3β抑制剂的培养液中，将上述工序(b)中得到的细胞在细胞外基质上进行贴壁培养；

[0148] (d)工序，在含有BMP抑制剂和GSK3β抑制剂的培养液中，将上述工序(c)中得到的细胞在细胞外基质上进行贴壁培养。

[0149] 本发明中，工序(i)中使用的培养液可以以动物细胞的培养中所使用的培养基为基础培养基来制备。作为基础培养基，包括例如格拉斯哥最低必需培养基(Glasgow's 
Minimal Essential Medium，GMEM)培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、伊格尔最低必
需培养基(Eagle's Minimum Essential Medium，EMEM)培养基、αMEM培养基、达尔伯克氏改
良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's Medium，DMEM)培养基、Ham's F12培养
基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal培养基(Life Technologies)和它们
的混合培养基等。优选为GMEM培养基。培养基中可以含有血清，或者也可以无血清。根据需
要，培养基既可以含有例如白蛋白、转铁蛋白、敲除型血清替代物(Knockout Serum 
Replacement，KSR)(培养ES细胞时的FBS的血清替代物)、N2添加剂(Invitrogen)、B27添加
剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-巯基甘油等一种以上的血清替代物，也可以含有脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax(Invitrogen)、非必
需氨基酸、维生素、增殖因子、低分子化合物、抗生物质、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等一种以上的物质。优选的培养液为含有KSR、2-巯基乙醇、非必需氨基酸和丙酮酸的
GMEM培养基。可以在该培养液中适当加入选自由BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂、
FGF8和GSK3β抑制剂组成的组的试剂而培养。

[0150] 工序(i)中，在细胞外基质上进行贴壁培养可以通过使用以细胞外基质进行了包被处理的培养容器来培养而进行。包被处理可以通过在将含有细胞外基质的溶液放入培养
容器后再将该溶液适当除去来进行。

[0151] 关于培养条件，培养温度没有特别限定，约为30～40℃，优选约为37℃，在含有CO2的空气气氛下进行培养，CO2浓度优选约为2～5％。

[0152] 培养时间只要是Corin和/或Lrtm1阳性细胞出现的时间就没有特别限定，工序(i)优选进行至少10天。更优选为12天至21天，进一步优选为12天至14天。

[0153] 此外，对于工序(i)中的工序(a)，可列举1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上或其以上的天数。优选为1天。同样地，对于工序(b)，可列举1天以
上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上或其以上的天数。优选为2天。同样地，对于工序(c)，可列举1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上或其以上的天数。优选为4天。同样地，对于工序(d)，可列举1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上或其以上的天数。优选为5天以上。

[0154] 多能干细胞可以使细胞解离而使用，作为使细胞解离的方法，可列举例如力学解离的方法、使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的解离溶液(例如Accutase(商标)和Accumax
(商标)等)或仅具有胶原酶活性的解离溶液的解离方法。优选使用下述方法：使用胰蛋白酶
或其替代物(可例示TrypLE CTS(Life Technologies))使人多能干细胞解离。使细胞解离
时，优选在解离后适当添加ROCK抑制剂而培养。添加ROCK抑制剂时，可以添加并培养至少1
天，更优选为1天。

[0155] ＜ROCK抑制剂＞

[0156] 本发明中，ROCK抑制剂只要是能够抑制Rho激酶(ROCK)的功能的物质就没有特别限定，可列举例如Y-27632(例如参照Ishizaki et al.,Mol.Pharmacol.57,976-983
(2000)；Narumiya et al.,Methods Enzymol.325,273-284(2000))、Fasudil/HA1077(例如
参照Uenata et al.,Nature 389:990-994(1997))、H-1152(例如参照Sasaki et al.,
Pharmacol.Ther.93:225-232(2002))、Wf-536(例如参照Nakajima et al.,Cancer 
Chemother Pharmacol.52(4):319-324(2003))和它们的衍生物、以及针对ROCK的反义核
酸、RNA干扰诱导性核酸(例如siRNA)、显性负突变体和它们的表达载体。此外，作为ROCK抑
制剂，已知还有其他低分子化合物，因而，本发明中也可以使用这样的化合物或它们的衍生
物(例如参照美国专利申请公开第20050209261号、美国专利申请公开第20050192304号、美
国专利申请公开第20040014755号、美国专利申请公开第20040002508号、美国专利申请公
开第20040002507号、美国专利申请公开第20030125344号、美国专利申请公开第
20030087919号和国际公开第2003/062227号、国际公开第2003/059913号、国际公开第
2003/062225号、国际公开第2002/076976号、国际公开第2004/039796号)。本发明中，可使
用1种或2种以上的ROCK抑制剂。本发明中使用的ROCK抑制剂可优选为Y-27632。

[0157] Y-27632的浓度例如为100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM，但不限于此。优选为10μM。

[0158] ＜工序(ii)＞

[0159] (ii)的收集Corin和/或Lrtm1阳性细胞的工序可以基于上述＜对细胞进行选择的方法＞来进行。

[0160] ＜工序(iii)＞

[0161] 工序(iii)中使用的培养液可以以动物细胞的培养中所使用的培养基为基础培养基来制备。作为基础培养基，包括例如格拉斯哥最低必需培养基(GMEM)培养基、IMDM培养
基、Medium 199培养基、伊格尔最低必需培养基(EMEM)培养基、αMEM培养基、达尔伯克氏改
良伊格尔培养基(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、
Neurobasal Medium(Life Technologies)和它们的混合培养基等。优选为Neurobasal培养
基。培养基中可以含有血清，或者也可以无血清。根据需要，培养基既可以含有例如白蛋白、
转铁蛋白、敲除型血清替代物(KSR)(培养ES细胞时的FBS的血清替代物)、N2添加剂
(Invitrogen)、B27添加剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-巯基甘油等一种以上的血清替代物，也可以含有脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、
Glutamax(Invitrogen)、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、低分子化合物、抗生物质、抗氧
化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、核酸(例如二丁酰环磷酸腺苷(dbcAMP))等一种以上的物
质。优选的培养液为含有B27添加剂、抗坏血酸和dbcAMP的Neurobasal培养基。可以在该培
养液中加入适当的神经营养因子而培养。

[0162] 工序(iii)中的悬浮培养是将细胞在不附着于培养容器的状态下进行培养，没有特别限定，出于提高与细胞的附着性的目的，可以使用如下培养容器来进行：未经人工处理
(例如以细胞外基质等进行的包被处理)的培养容器、或者经人工抑制附着的处理(例如聚
羟乙基甲基丙烯酸(poly-HEMA)、以非离子性表面活性多元醇(普朗尼克(Pluronic)F-127
等)或磷脂质类似结构物(例如以2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱为组成单元的水溶性聚
合物(Lipidure))包被处理的培养容器。

[0163] 关于培养条件，培养温度没有特别限定，约为30～40℃，优选约为37℃，在含有CO2的空气气氛下进行培养，CO2浓度优选约为2～5％。

[0164] 培养时间只要是Nurr1或Foxa2阳性细胞出现的时间就没有特别限定，工序(iii)优选进行至少7天。更优选为7天至30天，进一步优选为14天至21天或14天至16天，最优选为
16天。

[0165] 接着工序(ii)进行工序(iii)时，优选适当添加ROCK抑制剂而培养。添加ROCK抑制剂时，可以添加并培养至少1天，更优选为1天。

[0166] ＜帕金森病治疗剂＞

[0167] 本发明中得到的产多巴胺神经前体细胞能够作为制剂对帕金森病患者进行给药。通过将得到的产多巴胺神经前体细胞悬浮于生理盐水等并移植至患者的纹状体区域来进
行。因此，本发明中，提供一种包含通过上述方法由多能干细胞得到的产多巴胺神经前体细
胞的帕金森病治疗剂。

[0168] 本发明中，帕金森病治疗剂中包含的产多巴胺神经前体细胞的细胞数只要是移植片在给药后能够植活就没有特别限定，例如可含有15×104个以上。此外，也可以根据症状、
体躯的大小适当增减而制备。

[0169] 产多巴胺神经前体细胞向患病部位的移植可以通过例如Nature Neuroscience,2,1137(1999)或N Engl J Med.；344:710-9(2001)中记载的那样的方法来进行。

[0170] ＜试剂盒＞

[0171] 本发明的另一实施方式中，包括由多能干细胞制作产多巴胺神经前体细胞的试剂盒。该试剂盒中包含上述制作产多巴胺神经前体细胞的各工序中使用的培养液、添加剂或
培养容器等。例如可列举选自由抗Corin抗体、抗Lrtm1抗体、BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8、GSK3β抑制剂、细胞外基质和神经营养因子组成的组的试剂。本试剂盒中还
可以进一步包含记载有制造工序的步骤的文字、说明书。

[0172] 以下列举实施例进一步具体地对本发明进行说明，但显而易见地，本发明不限于这些实施例。

[0173] 实施例

[0174] 实施例1

[0175] 细胞和培养

[0176] 人ES细胞(KhES-1)由京都大学再生医科学研究所惠赠(Suemori H,et al.Biochem Biophys Res Commun.345:926-32,2006)。作为人iPS细胞的404C2和836B3是，
作为利用游离载体(Episomal Vector)将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-MYC、LIN28和p53shRNA导入
至人成纤维细胞而得到的细胞由京都大学的山中教授等惠赠(Okita,et al,Nat 
Methods.8:409-412,2011)。

[0177] ES细胞和iPS细胞按照基于Miyazaki T et al.,Nat Commun.3:1236,2012中记载的方法来培养。简言之，利用以层粘连蛋白511E8包被的6孔板来培养。

[0178] 将以这种方式得到的ES细胞和iPS细胞用TrypLE CTS(Life Technologies)解离，以每一个孔4×104个移入另外准备的以层粘连蛋白511E8(iMatrix-511、Nippi)包被的6孔
板，用上述培养方法培养4天后，确认已经铺满，将培养基替换为含有10μM Y-27632(和光)、
0.1μM LDN193189(STEMGENT)和0.5μM A83-01(和光)的基本培养基A(8％KSR
(Invitrogen)、含有1mM丙酮酸钠(Sodium pyruvate，Invitrogen)、0.1mM MEM非必需氨基
酸(MEM non essential amino acid，Invitrogen)和0.1mM 2-巯基乙醇(2-
Mercaptoethanol，和光)的GMEM(Invitrogen))。次日(第1天)，将培养基替换为含有0.1μM 
LDN193189、0.5μM A83-01、2μM嘌吗啡胺(和光)和100ng/mL FGF8(和光)的基本培养基A。2
天后(第3天)，将培养基替换为含有0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM嘌吗啡胺、100ng/mL FGF8和3μM CHIR99021(和光)的基本培养基A。4天后(第7天)，将培养基替换为含有0.1μ
M LDN193189和3μM CHIR99021的基本培养基A。以后每天进行一次培养基替换。此外，将上
述作为包被剂的层粘连蛋白511E8置换为基质胶(BD)、CELLstart(Invitrogen)或层粘连蛋
白111E8并进行12天同样的实验，结果，虽然使用任一包被剂进行均得到了PSA-NCAM阳性细
胞和Corin阳性细胞，但是，使用了层粘连蛋白511E8时，未分化细胞(Tra-1-60阳性细胞)的
残留少，Corin阳性细胞的含有率最高(图2)。确认到，通过利用层粘连蛋白511E8包被进行
贴壁培养，能够一次性操作比进行悬浮培养更多的细胞，期望的细胞的含有率也变高。以下
使用层粘连蛋白511E8作为包被剂。

[0179] 抗Corin抗体通过以下的方法来制作。首先，将长尾猕猴Corin基因中编码一部分(79-453氨基酸)胞外区域的基因序列导入至293E细胞，表达Corin蛋白质的胞外区域片段
并收集。用收集的蛋白质对小鼠进行免疫后，取出淋巴细胞并与骨髓瘤细胞融合。从经融合
的细胞集团选择与Corin具有反应性的克隆。使用该克隆的培养上清作为抗Corin单克隆抗
体。

[0180] 在含有0.1μM LDN193189和3μM CHIR99021的基本培养基A中培养5天后(第12天)，使用TrypLE CTS使细胞解离，悬浮于含有2％FBS、10μM Y-27632(和光)、20mM D-glucose
(D-葡萄糖)和50μg/ml青霉素/链霉素的、不含Ca2+Mg2+的HBSS(Ca2+Mg2+-free HBSS，
Invitrogen)。添加上述抗Corin抗体，在4℃温育20分钟，使用FACSAriaII(BD)进行分选，收
集Corin阳性细胞。

[0181] 将收集的Corin阳性细胞移入包被Lipidure的96孔板(Lipidure-coat 96well plate，NOF公司)，20000个/孔，使用基本培养基B(添加了不含维生素A的B27添加剂
(B27Supplement without vitamin A，Invitrogen)、20ng/mL BDNF、10ng/mL GDNF、200mM
抗坏血酸和0.4mM dbcAMP(Sigma)的Neurobasal培养基(Invitrogen))进行悬浮培养。此
时，最初的培养基使用添加有30μM的Y-27632的培养基，在3天一次每次半量替换时，使用未
添加Y-27632的培养基。进行了分选开始16天后(第28天)、或、进一步继续悬浮培养14天(第
42天)的细胞是否适合于移植的研究。此时，对于培养基，3天一次每次半量替换。将以上的
培养方法的计划示于图1。

[0182] 另一方面，作为对照，第12天未以Corin进行分选，同样地进行悬浮培养。

[0183] 分选天数的研究

[0184] 将通过上述方法由iPS细胞(836B3)得到的各分化诱导时期的细胞的情形示于图3。此外，将在第12天未进行分选的、第28天得到的细胞团移入包被有多聚-L-鸟氨酸、纤维
连接蛋白和层粘连蛋白的盘，将用基本培养基B持续培养14天时(第42天)的Corin、聚唾液
酸化(PSA)-NCAM和Tra-1-60各阳性细胞的含有率示于图4。本分化诱导方法中，从第7天开
始，作为神经细胞标记的PSA-NCAM阳性细胞的含有率增加，在第12天左右占大多数。作为底
板标记的Corin阳性细胞在第10天出现，第21天至第28达到峰值。该倾向在使用404C2时也
同样。因此，提示为了分选获得Corin阳性细胞，在第10天以后进行是优选的。

[0185] 接下来，利用定量PCR对至第12天之前的Oct4、Nanog、Sox1、Sox17、Brachyury、hGSC等的表达进行测定，将经时变化示于图5A。确认到SOX1从早期开始表达，以后其维持表
达。确认到作为未分化标记的Oct4、Nanog的表达减少。作为中胚层标记的Brachyury在短暂
性表达增加后减少。作为内胚层标记的SOX17一直为低表达。另一方面，将在第12天未进行
分选的、第28天得到的细胞团移入包被有多聚-L-鸟氨酸、纤维连接蛋白和层粘连蛋白的
盘，对用基本培养基B继续培养14天时(第42天)Oct4、Map2ab、Lmx1a、En1、Nurr1、TH和Foxa2的表达进行测定，将经时变化示于图5B。确认到上述标记中除了TH以外的标记在第12天其
表达量大体达到平稳期。该倾向在使用404C2时也同样。

[0186] 将未分选时的第42天的细胞针对TH(产多巴胺神经细胞标记)、Foxa2和Nurr1(均为中脑标记)进行免疫染色，结果，40％为TH阳性，与Foxa2和Nurr1共表达。此外还确认到，
TH阳性细胞还共表达了作为其他产多巴胺神经细胞标记的AADC、Pitx3和Girk2(图6)。

[0187] 以Corin为指标的分选的效果

[0188] 如上所述，通过PCR对第12天的分选之后的细胞中各标记基因的表达进行测定(图7A)。其结果确认到，第12天-Corin阳性细胞中，与未分选的细胞相比，Corin当然高，中脑标
记Lmx1a和En1、以及底板标记Foxa2高。另一方面，确认到后脑标记Gbx2和前脑标记Six3与
未分选的细胞相比低。关于404C2也确认到同样的倾向。通过包罗性表达分析对第12天进行
分选的情况和未分选的情况进行比较，结果确认到，吻侧标记Pax6、尾侧标记Foxa2、早期神
经标记Neurog2、终止分裂的神经细胞标记NEFM(图中未显示)和非神经细胞标记DLK1和
CYP1B1在未分选细胞中表达高(图7B)。进而，进行免疫染色时确认到，Corin阳性细胞中，
Lmx1a和Foxa2共阳性细胞的含有率变高(图8A和B：75.52±8.255％vs.47.37±6.624％)。
另一方面，确认到在中脑/后脑边界的吻侧表达的Otx2阳性和Lmx1a阴性细胞在经分选的细
胞中减少(图8C)。关于Oct4和Nanog未分化标记，未发现大的差异(图8D)。

[0189] 接下来，在第21天分选之后的细胞中进行同样的研究，结果发现，在第21天分选则Corin阳性细胞的含有率高(45.47±47.61％(第21天)vs.18.97±15.49％(第12天))，未发
现Lmx1a和Foxa2的表达量因为第21天的分选而变化(图9A)。同样地，在免疫染色中，第21天
的分选导致的Corin阳性细胞中的Lmx1a和Foxa2共阳性细胞的含有率与未分选的细胞组相
比未发现显著差异(图9B和C)。

[0190] 由上述确认到，与第21天相比，第12天的分选是优选的。

[0191] 关于分选后的培养时间

[0192] 对于使用上述培养方法诱导的第28天和第42天的细胞，对第12天Corin阳性细胞的分选的有无所导致的产多巴胺神经细胞的成熟化程度进行研究。确认到Corin阳性细胞
与未分选的细胞相比，球体的大小在第28天和第42天小(图10A和B)。在第28天和第42天进
行免疫染色，结果任一情况下，第12天分选后Foxa2阳性细胞均为70至75％的含有率，与未
分选的情况相比高(图11A和B)。在第28天，Nurr1阳性细胞和TH阳性细胞分别为27.34±
5.511％和2.098±1.243％，在第42天，为19.91±6.966％和42.04±4.481％，TH阳性细胞
的含有率在第42天时比第21天变高。进而，在第42天，使用HPLC对由于高氯化钾刺激而释放
至培养基的多巴胺(DA)、3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和血清素(5-HT)进行定量，结果确认
到，与未进行Corin分选的情况相比，进行了Corin分选的细胞中DA和DOPAC的释放量明显多
(图11C)。

[0193] 接下来，对在第12天进行了Corin分选的细胞或未进行分选的细胞进行悬浮培养，在第28天或第42天分别将4×105个悬浮于2μl(生理盐水)，使用22号(gauge)的注射针给药
至帕金森病模型大鼠(6-OHDA给药大鼠)大脑的纹状体，观察16周后移植片的情形(图12A)。
首先，对使用了第28天细胞时移植片的大小进行测定，结果确认到，进行了Corin阳性细胞
的分选的细胞时，移植片的大小大体一定(8.5～1.5mm3)(图12B)，未进行Corin分选时，为
88.4～0.5mm3，偏差大，平均值为34.96±37.52mm3(无分选)和3.45±2.932mm3(有分选)，发
现有显著差异(图12B)。进而，对在第12天进行了Corin分选的细胞或未进行分选的细胞进
行悬浮培养7天后(第19天)，同样地对帕金森病模型大鼠给药，结果，分选组中移植片的大
小显著小(图12D)。此外，对移植片中Ki67阳性细胞的比例进行定量，结果确认到，不管有无
分选，均为低至1％以下的值，但在进行了Corin分选的细胞中比例明显低(图12E)。另一方
面，第42天时，不管有无分选，移植片的大小均为1mm3以下(图12C)，未确认到Ki67阳性细
胞。

[0194] 接下来，对由于因左右多巴胺浓度的不均衡引起的苯异丙胺诱导导致的回巢进行研究，结果，用在第12天对Corin阳性细胞进行分选的细胞(第28天)和未分选的细胞(第28
天)给药的组与未用细胞给药的组(仅介质)相比，回巢数均显著减少。此外，细胞给药后第
16周时，因分选的有无导致的行动的变化没有差别(图13A)。这里，对移植片中TH阳性细胞
进行观察，结果确认到，移植了经Corin分选的细胞时，TH阳性细胞显著残留(图13B和C、
6747±2341细胞/移植片(cells/graft)(有分选)vs.3436±2384细胞/移植片(无分选))。
此时单位NeuN阳性细胞数(全神经细胞)的TH阳性细胞数、或单位hNc阳性细胞数(全部存活
细胞)的TH阳性细胞数也同样地，在进行了分选时显著高(图14A或B)。进而，确认到其他产
多巴胺细胞标记(Foxa2、Nurr1和Pitx3)也共表达。作为黑质致密部的A9产多巴胺细胞标记
的Girk2也有约半数为共阳性(图14C)。此外，对血清素细胞的数量进行观察，结果，任一情
况下含有率均低(图15A和B)。

[0195] 另一方面，同样用在第12天对Corin阳性细胞进行了分选的和未分选的细胞(第42天)给药，结果未发现因分选的有无导致的对于异常回巢的改善的显著差异(图13D)。进而，
移植片中TH阳性细胞的数量和浓度也同样未发现显著差异(图13E和F)。与这些结果相关
联，相对于在第28天移植中为6747±2341细胞/移植片(图13B)，生存的TH阳性细胞的平均
值在第42天移植中为1431±753.7细胞/移植片(图13E)，发现了第28天时植活细胞数多的
倾向。

[0196] 接下来，通过微阵列分析，分别对在第12天进行分选的第28天的细胞与未进行分选的第28天的细胞、以及在第12天进行分选的第28天的细胞与在第12天进行分选的第42天
的细胞进行比较(图16A)。确认到，第28天的细胞中，未进行分选时，作为前脑标记的PAX6的
表达高。另一方面，确认到，在进行了分选时ALCAM的表达高。接下来，第28天与第42天的细
胞的比较中，确认到第28天的细胞中SHH、WNT5A和CORIN的表达高。另一方面，确认到TH在第
42天的细胞中表达高。

[0197] 进而，对于迄今为止针对帕金森病临床使用的胎儿腹侧中脑细胞(7周龄)与对Corin阳性细胞在第12天进行了分选的第28天和第42天的细胞进行比较。与第28天的细胞
相比，作为产多巴胺神经细胞的标记的TH和PITX3(图中未显示)在胎儿腹侧中脑细胞高表
达。作为血清素能神经细胞的标记的TPH2也在胎儿腹侧中脑细胞中高表达(图16B)。进行阶
梯聚类分析时，确认到胎儿中脑细胞与第42天的细胞近似(图16C)。第28天的细胞中，轴突
诱导相关基因(SPON1和SLIT2)表达，因而提示其为发生阶段比胎儿腹侧中脑细胞更早的细
胞。

[0198] 根据以上结果，提示：通过使用对Corin阳性细胞进行选择后悬浮培养16天的细胞(第28天)，能够增加移植片的增殖、产多巴胺细胞的植活，适合作为用于治疗帕金森病的细
胞。

[0199] 实施例2

[0200] 细胞培养

[0201] 使用TrypLE CTS(Life Technologies)将ES细胞(Kh-ES1)解离，全部移入另外准备的以层粘连蛋白511E8包被的6孔板，用含有10μM Y-27632、0.1μM LDN193189、0.5μM 
A83-01的基本培养基A(含有8％KSR、1mM丙酮酸钠、0.1mM MEM非必须氨基酸和0.1mM 2-巯
基乙醇的GMEM)培养。培养开始1天后(第1天)，将培养基替换为含有0.1μM LDN193189、0.5μ
M A83-01、2μM嘌吗啡胺和100ng/mL FGF8的基本培养基A。培养开始3天后(第3天)，将培养
基替换为含有0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM嘌吗啡胺、100ng/mL FGF8和3μM 
CHIR99021的基本培养基A。培养开始7天后(第7天)，将培养基替换为含有0.1μM LDN193189
和3μM CHIR99021的基本培养基A。第12天(培养开始12天后)，将培养基替换为添加有不含
维生素A的B27添加剂、2mM L-谷氨酰胺、20ng/mL重组人(rh)BDNF、10ng/mL rhGDNF、400μM 
dbcAMP(西格码)和200μM抗坏血酸的Neurobasal培养基(Invitrogen)。除非指定，否则培养
基替换按前一天的组成每天进行。

[0202] day14(培养开始14天后)，使用TrypLE CTS使细胞解离，使用抗Lrtm1抗体(WO2013/015457)以FACS进行分选，收集Lrtm1阳性细胞。

[0203] 将收集的Lrtm1阳性细胞移入Lipidure-coat 96孔板(Thermo)，20000个/well，使用添加有30μM Y-27632、不含维生素A的B27添加剂、2mM L-谷氨酰胺、20ng/mL重组人(rh)
BDNF、10ng/mL rhGDNF、400μM dbcAMP、1％KSR、青霉素/链霉素(Gibco)和200μM抗坏血酸的Neurobasal培养基进行悬浮培养。之后，将培养基替换为不含Y-27632的培养基，3天一次、
每次半量。分选后7天后(第21天)或21天后(第35天)用于各种实验。

[0204] 以Lrtm1为指标的分选的效果(免疫染色)

[0205] 通过免疫染色对第21天时的细胞进行研究，结果，Foxa2阳性细胞为87.4％，Lmx1a阳性细胞为87.5％，Foxa2和Lmx1a阳性细胞为82.7％(图17A)。另一方面，根据第35天时的
分选的有无进行比较，结果，Foxa2、Nurr1和TH阳性细胞由于以Lrtm1进行分选而其含有率
变高(图17B)。

[0206] 以Lrtm1为指标的分选的效果(细胞移植)

[0207] 以Lrtm1分选的次日(第15天)，对10周龄SD大鼠脑内给药10～15×104细胞/束(cells/tract)，在4周后进行观察。确认到移植细胞来源(人来源)的Foxa2、TH、Nurr1阳性
细胞的植活(图18)。

[0208] 实施例3

[0209] 细胞培养

[0210] 使用TrypLE CTS(Life Technologies)将ES细胞(Kh-ES1)解离，将4×105个移入另外准备的以层粘连蛋白511E8包被的6孔板，用含有10μM Y-27632的StemFit培养基(味之
素)培养。4天后，将培养基替换为含有0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01的上述基本培养基A
(第0天)。培养开始1天后(第1天)，将培养基替换为含有0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM嘌吗啡胺和100ng/mL FGF8的基本培养基A。培养开始3天后(第3天)，将培养基替换为含
有0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM嘌吗啡胺、100ng/mL FGF8和3μM CHIR99021的基本培养基A。培养开始7天后(第7天)，将培养基替换为含有0.1μM LDN193189和3μM CHIR99021
的基本培养基A。第14天(培养开始14天后)分选或将培养基替换为添加有不含维生素A的
B27添加剂、2mM L-谷氨酰胺、20ng/mL重组人(rh)BDNF、10ng/mL rhGDNF、400μM dbcAMP
(Sigma)和200μM抗坏血酸的Neurobasal培养基(Invitrogen)。除非指定，否则培养基替换
按前一天的组成每天进行。

[0211] 分选

[0212] 用上述方法培养，在第14天(培养开始14天后)或第21天(培养开始21天后)，使用TrypLE CTS将细胞解离，使用抗Lrtm1抗体(WO2013/015457)以FACS进行分选，收集Lrtm1阳
性细胞。

[0213] 将收集的Lrtm1阳性细胞移入包被Lipidure的96孔板(Thermo)，2×104个/孔，使用添加有30μM Y-27632、不含维生素A的B27添加剂、2mM L-谷氨酰胺、20ng/mL重组人(rh)
BDNF、10ng/mL rhGDNF、400μM dbcAMP、1％KSR、青霉素/链霉素(Gibco)和200μM抗坏血酸的Neurobasal培养基进行悬浮培养。之后，培养基替换为不含Y-27632的培养基，3天一次、每
次半量。分选后7天后或14天后用于各种实验。

[0214] 以Lrtm1为指标的分选的效果(免疫染色)

[0215] 第14天-7天(第14天分选、培养7天)、第14天-14天(第14天分选、培养14天)和第21天-7天(第21天分选、培养7天)时利用免疫染色(Foxa2、Nurr1、TH)对细胞进行研究，结果确
认到，Foxa2阳性细胞的含有率在任一条件下均为90％以上，Nurr1和TH阳性细胞含有率在
第14天-7天、第14天-14天和第21天-7天分别为13.1％、24.0％和10.2％(图19)。因此，第14
天-14天时Foxa2、Nurr1和TH阳性细胞的含有率最高。

[0216] 以上结果表明，关于分选的时期，与分化诱导开始第21天相比，第14天较好，关于分选后的培养时间，与7天相比，14天较好。

[0217] 产业可利用性

[0218] 本发明对再生医疗、尤其是帕金森病的治疗是有用的。