Apparatus for manufacturing an implantable prosthesis, kit and it

【発明の詳細な説明】 埋込型プロステーシス、キットおよびそれを製造するための装置 本発明は損傷した靭帯や腱などの結合組織を取り替えたり修復したりするのに適する方法と、そのような方法において使用するためのプロステーシスに関する。 またそのようなプロステーシス形成するための装置が、プロステーシスを形成するもとのキットとともに開示されている。 米国特許第５０７８７４４号により、前方十字靭帯（ＡＣＬ）などの損傷した靭帯の一部を、架橋（cross-linked）し整列した繊維群に形成した精製結合性動物腱あるいは靭帯組織繊維からなる人工靭帯で置き換えることにより、修復することが公知である。 ＡＣＬの修復あるいは再構築のための最も一般的な方法は、自生の組織からなる人工移植片を植え込むことである。 従って宿主から、例えば膝蓋腱などの自生の組織を収集し植え込みのためのプロステーシスを形成することが一般的な外科処置として行われている。 幾つかの合成の生物同化可能でない素材が人工靭帯の製造に用いられてきており、それら素材は、プロステーシスの植え込み後の繊維芽細胞の進界成長を支持あるいは促進するため、その親和性によって選ばれている。 本発明によれば、宿主に埋め込む前の形態において、繊維芽細胞を接種した生物適合性で合成の実質的に生物同化可能なマトリックス素材からなる埋込型プロステーシスが提供される。 「合成」という用語は単に、哺乳類において結合組織修復に天然では用いられない素材あるいはそのような素材の化学的変形物でない素材を意味する。 したがってこの用語からは、コラーゲンや人工的に架橋したコラーゲンマトリックスは除外される。 （ただしもし所望ならばコラーゲンを合成素材に加えて用いることが可能であるが） 「繊維芽細胞」（fibroblast）という用語は、繊維芽細胞、繊維細胞、腱細胞あるいは滑膜細胞という名称でしばしば呼ばれる細胞を含んでいる。 この用語はまたこれらの細胞に対する前駆体細胞もカバーしている。 「実質的に生物同化可能なマトリックス素材」は、繊維芽細胞を支持するための（例えば骨格、メッシュあるいは中実構造の形態の）３次元構造であって、埋込型（又は植込型）プロステーシス（人工器具又は人工補装器、prostheses）において、体成分の化学的／生物学的機能により、哺乳類の体の中で時間とともに（プロステーシスへの物理的応力による単なる破損ではなく）実質的に分解するものを意味する。 プロステーシスが成人に埋め込まれてから５年後（より望ましくは埋め込み１年後）に、この生物同化可能な素材は、分解してプロステーシスの全体としての構造に実質的に寄与しない程度に分解していることが望ましい。 マトリックスはさらに次の分子を１つ以上含有することが望ましい。 それらは、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチンあるいはその活性結合領域、あるいは１つ以上の成長因子、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ） 繊維芽細胞成長因子、血管形成因子あるいはその他の刺激因子である。 本発明のさらに別の実施態様によれば、プロステーシスあるいはその１部分（ すなわち植え込み後に骨と接触するプロステーシス領域）は、細胞の浸潤を容易にするため、骨誘導的(osteoinductive)あるいは骨通導的(osteoconductive)薬剤を含浸させることが望ましい。 浸潤しやすい好適な骨誘導的素材の例としては、ヒドロキシアパタイト、冷凍乾燥したあるいは脱塩した（demineralised)骨、 成長因子（例えば骨形成タンパク質）などがあげられる。 含浸は、プロステーシスの埋め込みの直前に行うことが好適である。 そのような素材はプロステーシスの両端に組み込まれることが好適である。 本発明のさらに別の実施態様によれば、マトリックス上あるいは中において繊維芽細胞の接種のための適切な条件下で、適切な培地および繊維芽細胞の存在のもとで生物適合性で合成の、実質的に生物同化可能なマトリックス素材を培養することと、そののち接種したマトリックスを宿主に埋め込むこととからなる、ヒトあるいはヒト以外の動物における損傷した結合組織を修復あるいは取り替える方法が提供される。 適切な実質的に生物同化可能な合成ポリマーの例としては、ポリラクチド（Ｐ ＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシブチレート（ＩＣ ＩＢＩＯＰＯＬ、登録商標）、ポリヒドロキシブチレートコヒドロキシバレレート（ＩＣＩＢＩＯＰＯＬ、登録商標）、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリオルトカーボネート、ポリアミノカーボネート、ポリトリメチレンカーボネートおよび上記のポリマーが形成される単量体を混和したコポリマーがあげられる。 本発明によるプロステーシスがコポリマーからなるとき、そのコポリマーはヒドロキシバレレートおよびヒドロキシブチレート単量体を含有することができる。 そのようなコポリマーにおいて、含まれるヒドロキシバレレートの量は１から４７モル％である。 その他の特に適切なコポリマーはＰＬＡ／ＰＧＡおよびＰＬ Ａ／ＰＣＬコポリマーである。 上記の実質的に生物同化可能な素材を複数含む複合物(composite)もまたマトリックス素材あるいはその一部分として好適である。 マトリックスは、時間とともに機械的性質の２つ以上の相損失を与えるような異なった分解速度を有する（例えば異なった繊維型の）２つ以上の異なった素材から作られていてもよい。 異なった繊維型は異なった機械的性質をもっていてもよい。 例えば、高度に伸長可能な繊維を、より伸長性の低い繊維と組合してもよい。 マトリックスは、伸長性の低い繊維が伸長を妨げる前に、ある一定の程度伸長するように設計できる。 この設計は、ある限度の制御された応力を細胞に与え、かつ形成中の組織に対する損傷に対して防御するために有利である。 例えば、ポリカプロラクトン繊維は、ポリラクチド繊維よりもヤング率が低い。 さらに１つのポリマー上に別のポリマーをコーティングしてもよい。 これは、 機械的性質に基づいて選ばれた良い素材が、（改変しない限り）必ずしも細胞培地にとって良い素材ではないとき有利である。 ここでより生物適合性の良いポリマーが、より生物適合性の低いベース素材をコーティングするために用いられる。 例えばポリラクチドはポリカプロラクトンよりも繊維芽細胞拡散に対して、より良い基質を提供する。 繊維芽細胞との共存性を改善するために、ポリカプロラクトン繊維にポリラクチドをコーティングしてもよい。 上に示したように共重合性素材を用いることができる。 これはコポリマーが、 それを構成するホモポリマーの分解速度の中間の値の分解速度を有しているとき有利になる。 従ってコポリマーの組成を制御することにより、分解速度を制御することができる。 また繊維紡ぎあるいは押し出しによるコポリマー繊維の製造は、ホモポリマーよりも機械的性質のすぐれた繊維を生み出す。 ポリラクチドポリグリコリドコポリマーはこれら両方の点の良い例である。 マトリックスに接種するために好適な繊維芽細胞は自己原性繊維芽細胞、同種異系繊維芽細胞、あるいは異種繊維芽細胞である。 繊維芽細胞は自己原性のものであることが望ましい。 繊維芽細胞は、例えば真皮、腱あるいは靭帯から由来するものである。 マトリックスに接種するための繊維芽細胞は１つ以上の上記の型の繊維芽細胞の混合物を含有してもよい。 繊維芽細胞が自己原性のものである時は、大がかりな侵襲的外科術の必要性を避けるため、それらを真皮から分離培養することが望ましい。 繊維芽細胞は好適な方法のいずれかによって得ることができる。 望ましい方法は皮膚バイオプシーを行うことである。 マトリックス素材は、繊維芽細胞の存在下で適切な培地（例えばＤＭＥＭ）を含有する培養容器にマトリックスを入れ、細胞培養条件下で培養することにより、繊維芽細胞の接種をすることができる。 繊維芽細胞を培地に懸濁し、得られる懸濁液をマトリックスの添加の前あるいは後に培養容器に加える。 １ミリリットルの培地当たりの繊維芽細胞の個数は、どの程度の接種を行いたいかによって変化させることができる。 本発明のプロステーシスは、損傷した靭帯、腱、角膜、真皮、硬膜（あるいは結合組織を有する他の部分）の全部あるいは一部と置き換えるため用いることができる。 損傷がかなりのものであるときは損傷した靭帯あるいは腱を全面的に外科的にプロステーシスで置き換えることができる。 損傷がそれほどでもないときは、既存の損傷靭帯あるいは腱に（例えば縫合によって）結合させるため、マトリックスを設計することができる。 マトリックスの設計はいくつかの可能性のいずれかによることができる。 マトリックスは繊維状構造であることが好適である。 骨への固着を助けるため両端にループやその他の構造を有していてもよい（例えば「２トンネル（two tunnel）」あるいは「オーバーザトップ（over the top）」技術のどちらかを用いて）。 それは例えば編むこと、ニッティング、織ること、かぎ針編みなどの適切な技術のいずれかにより形成することができる。 マトリックスは伸長した形態であることが好ましく、可撓性であることが望ましい。 この装置は、靭帯あるいは腱の自然の構造と固定を密接に模倣するのがよい。 例えはＡＣＬ再構築のためには装置は大腿骨から脛骨へ直接通ずるかあるいは装置の軸のまわりに螺旋を描く繊維束からなる(fasicular)ユニットに分かれて一緒に束ねた繊維の階層構造(hierarchy)によって構成されていてもよい。 固定は靭帯あるいは腱の自然の固定領域に対してなされる。 適切な固定手段のいずれか（例えば、ネジ、くぎ、ステープルあるいはスチン（sutine）など）を用いることができる。 固定手段はそれ自身生物同化可能であり、例えばポリヒドロキシブチレートから形成されている。 本発明は、合成の生物適合マトリックス素材と繊維芽細胞の素材源とからなる本発明のプロステーシスを形成するためのキットをさらに提供する。 適当な条件下での培養により、繊維芽細胞はマトリックスの上及び／又は中で成長し、繊維芽細胞により接種したマトリックスを生成する。 キットはさらに繊維芽細胞の増殖用の好適な培地からなることができる。 理想的にはキットは無菌包装により提供される。 あるいはまた、キットの部分(parts)は使用直前に殺菌される。 埋め込み前に、繊維芽細胞がプロステーシス中で種となるように上記のような適切な培養条件下で、キットの成分を一緒に保存することができる。 繊維芽細胞はすぐ使用できるような適切な形態のいずれかを有する。 したがって繊維芽細胞が低温保存することが好適である。 マトリックスあるいはその成分／前駆体は、凍結乾燥した形態で提供できる。 好ましい実施態様においては、本発明は、埋め込み前の形態において、密接に接触するポリマーゲルを有し、ゲルがその中に分散した繊維芽細胞をもつような、生物適合性で合成の実質的に生物同化可能なマトリックス素材を含有する埋込型プロステーシスからなる。 これは、ゲルが、素材表面の単一層をただ支持するのではなく、細胞を真に３次元の配置で支持することができるという点において利点を有する。 環境は細胞の自然の生理学的環境を密接に模倣する。 またゲル中への細胞の組み込みは、均一な細胞分布を実現し、組み込まないときには重力の影響により起こるかも知れない細胞の貯り(pooling)を防ぐことができる。 本発明は、繊維芽細胞を分散させたポリマーゲルに接触するマトリックスを含有するプロステーシスを形成するため、適切な条件下でゲル形成組成物および繊維芽細胞の存在のもとで生物適合性のマトリックス素材を培養することと、その後にプロステーシスを宿主に埋め込むこととからなる、ヒトあるいはヒト以外の動物における結合組織を修復あるいは取り替える方法が提供される。 好ましいゲル形成組成物には、コラーゲンゲル形成組成物と繊維素ゲル形成組成物が含まれる。 コラーゲンゲル中の繊維芽細胞はコラーゲンを利用しそれを再編成する能力を持っている。 適切な機械的刺激の下でそれらは、靭帯や腱の自然の超構造に似た非ランダムに方向付けられた組織化された構造に、原繊維(fibrils)を再編成する能力を有する。 機械的刺激は、もしそれを与えなければ２点でゲルを固定することにより時間とともに起きるゲル収縮の防止でもよい。 マトリックスはこれを達成するために設計される。 あるいはまたマトリックスの上または中のゲルは、 繊維芽細胞の整列を刺激するために機械的応力装置を用いてかけられる応力にさらされる。 この方法はゲル中の繊維芽細胞拡散のための適切な条件の下でゲル接触マトリックスを培養し、その後そのマトリックスを宿主に埋め込む工程をさらに有していてもよい。 本発明の望ましい実施態様によれば、適切な培地と、ゲル形成組成物と、種としていれる繊維芽細胞の存在のもとでマトリックスを培養することにより、マトリックスの接種をすることができる。 もし必要ならばゲル形成組成物のゲル化を引き起こす適切な薬剤を用いてもよい。 ゲル形成組成物、繊維芽細胞（および必要ならばゲル化剤）の存在下でのマトリックスの接種により、ゲル中に繊維芽細胞が分散した、ゲルでコーティングあるいは充填したマトリックスが得られる。 ゲルはゲル化剤とゲル形成組成物の相互作用により形成することができる。 望ましいゲルはコラーゲンゲルである。 適切なコラーゲン源を用いて、Ｉ型、ＩＩ型、あるいはＩＩＩ型コラーゲン溶液を調製することができる。 例えばＩ型のコラーゲン溶液は上記のように真皮から調製することができる（Ｉ型のコラーゲンは皮膚において見られる細胞外タンパク質の７０％までを形成する）。 あるいはまたＩ型コラーゲン溶液は、例えばラットあるいはウシの腱のような、ほとんど排他的にＩ型コラーゲンを含む腱から調製することができる。 コラーゲンは当業者に公知の何れかの標準方法によって抽出することができる。 マトリックスの中あるいは上にゲルを組み込む好適な方法がいくつかある。 例えば、ゲル形成溶液（繊維芽細胞を含有していてもよい）がマトリックスを完全に取り囲むようのやり方で、マトリックスを懸濁することができる。 マトリックスを取り囲む型枠(mould)を用いることができる。 ゲルをマトリックスに導くために遠心分離や吸引を代替的に用いることができる。 望ましい実施態様のプロステーシスを形成するために用いられるキットは、生物適合性のマトリックスと、ゲル形成組成物と、繊維芽細胞の源を含むことができる。 あるいはまた、キットはポリマーゲルを含むコーティングを有する及び／又は中に組み込んだポリマーゲルを有する生物適合性マトリックスと、繊維芽細胞の源を含む。 適切な条件の下での培養により、繊維芽細胞はゲルに侵入し、中に繊維芽細胞をもつゲルを含むマトリックスを生成することができる。 本発明のプロステーシスは、埋め込み前に繊維芽細胞を有するので、埋め込み後に繊維芽細胞の進界成長を高め、繊維芽細胞が生育して新しい靭帯を形成する骨組となるように設計された、従来の公知のプロステーシスに対し利点を有する。 このように損傷した組織は、自己複製する生育可能な繊維芽細胞を含むプロステーシスによって置き換えることができる。 繊維芽細胞は既に埋め込み時に実質的に整列しているか、あるいは少なくとも非ランダムに方向付けられている。 この過程は、埋め込み後の繊維芽細胞によるプロステーシスの浸潤（infiltration ）に依存する従来の公知の方法に比較して速い。 繊維芽細胞によるプロステーシスの接種をするために時間調整した初期の予め決められた培養期間後に、プロステーシスを埋め込むことができるということが明らかになるであろう。 あるいはまた、プロステーシスが埋め込まれたとき繊維芽細胞が自己増殖し既にコラーゲン原繊維を分泌し始めるように、初期培養期間より長い培養期間にわたってプロステーシスを培養することができる。 本発明のプロステーシスと方法は、腱を収集するため大がかりな外科手術を実行する必要性を避けられるという点において、通常の外科処置あるいは宿主膝蓋腱を収集することに対して別の利点を有する。 単純な皮膚生検（実質的に傷跡を残さない標準手順）を用い、繊維芽細胞を得て、培地で拡散させることができる。 さらにこのプロステーシスは、繊維芽細胞方向を最適化するよう設計することもできる。 これらの利点の累積効果により病院滞在の期間を短縮することができる。 コラーゲンゲルがマトリックスに接触する、本発明の望ましい１つの実施態様によれば、本発明のプロステーシスは、繊維芽細胞によって利用できるなコラーゲン源を提供する。 ゲル中のコラーゲンは非架橋形態（non-cross-linked）であることが望ましい。 さらにもう１つ別の本発明の望ましい実施態様によれば、繊維素ゲルが用いられる。 本発明のさらに別の態様によれば、繊維芽細胞を生育可能な条件に維持するチャンバーを備え、チャンバーがマトリックス素材を離脱可能に保持する手段と、 単一の軸だけに沿ってマトリックス素材に応力を印加するようにした手段とを備える、本発明によるプロステーシスを形成するため用いられる細胞培養用の装置が提供される。 そのような装置は上に述べたようにキットの中に含めることができる。 いくつかの応力手段が存在するときは、本発明の装置はある時間において複数の試料に応力を印加することができる。 したがってこの装置は培地を保持するようにした１つ以上のチャンバーを有し、複数のマトリックス素材を離脱可能に保持する手段を備えることができる。 これは同時に行うことができる。 幾つかのチャンバーの各々は、複数のマトリックス素材を離脱可能に保持する手段を備えることができる。 あるいはまた各チャンバーは単一のマトリックス素材を離脱可能に保持する手段を備えることができる。 チャンバーは装置の中に永久に固定することができる。 あるいはまたチャンバーは、必要に応じて装置から取り除くこと、例えばマトリックス素材の保持と離脱を容易にするためチャンバーを取り除くことができるよう、離脱可能に固定されていても良い。 チャンバーは、例えばガンマ線照射、蒸気殺菌あるいはエチレンオキシド（Ｅ ＴＯ）殺菌のような適切な殺菌方法によって殺菌された素材の何れかから作ることができる。 チャンバーは所望の形状および大きさであってもよい。 チャンバーは円柱、立方体あるいは球体の形状であることが好適である。 チャンバーの寸法は、マトリックス素材を保持し引き続き応力の印加によって伸長できるような寸法とするべきである。 本発明の装置は（非伸長形態の素材に対して）マトリックス素材の１ ００％までの伸長を引き起こす応力を印加するように形成することができる。 しかしながら一般的に言えば、１０％まであるいは５％までの伸長で十分である。 このようにチャンバーの寸法は、マトリックス素材を所望のレベルまで伸長できるような寸法とすることができる。 チャンバーの寸法は、７５ｃｍ ³まで、例えば５０ｃｍ ³までの容量を持つようにすることが望ましい。 チャンバーは適切な素材の何れか、例えばステンレススチールあるいはパースペックス(Perspex：商標)素材から作ることができる。 殺菌を行い易くするため、素材はオートクレーブ処理可能なものであることが望ましい チャンバーは、培養期間中にマトリックス素材を見ることができるように透明なあるいは半透明の窓を備えていることが望ましい。 好適な素材の例としてはガラスおよびポリメチルメタクリレート（ＰＥＲＳＰＥＸ）があげられる。 チャンバーは内部にアクセスできるよう、取り外し可能にあるいは蝶番式に取り付けられた閉部分を備える。 従って例えばチャンバーはその少なくとも１つの端が取り外しできるようなガラス円筒を備える。 チャンバーは折り畳み可能あるいは入れ子式のものであることが好適である。 チャンバーは恒温的に制御することが望ましく、水ジャケットあるいはその他の加熱手段によって加熱される。 それは各種のセンサ、例えばチャンバーの頭部空間の中のＣＯ ₂含有量のセンサを備えることが望ましい。 ＣＯ ₂源も備えることができる。 マトリックス素材はチャンバー内の保持手段によって取り外し可能に保持される。 応力を印加する手段は、エレメント間の間隔が変動しうるようにチャンバー内で可動である２つのエレメントから構成できる。 あるいはまた、１つのエレメントを可動とし、他の１つを固定することも可能である。 保持手段は、マトリックス試料を取り外し可能に保持する適切な手段の何れかである。 保持手段のデザインはマトリックス素材の両端のデザインに依存する。 したがって例えばマトリックス素材がループ状の両端を有しているとき、保持手段は１対のクリップあるいはフックを備える。 保持手段は例えば、共にネジ留めするかバネで支持できるチャックあるいはレイズあるいは顎部を備えることが好適である。 保持手段は、マトリックス素材の両端がその上にうまく乗るようにデザインされた、スロットあるいはその他の開口部の形状であることが好適である。 したがって例えばマトリックス素材の両端は、スロットの中に保持された樹脂の中に埋め込むことができる。 マトリックス素材に開口部があり、保持手段がその中にはまるような、逆配置を用いることも可能である。 マトリックス素材を取り外し可能に保持するさらに別の方法は、マトリックス素材をまわりに巻き付けて摩擦で位置を保持することができるように概ね円筒形のスプール状の物を設けることである。 スプール状の物は、把持装置(gripping device )により支持される。 そのようなスプールの物は２つ設け、２つの把持装置にそれぞれ１つ支持させることができる。 本発明の装置により応力を印加するべきマトリックス素材は、生育可能細胞を支持する適切な素材の何れかを備える。 細胞はマトリックス素材の中にあるいはその全長にわたって存在する。 あるいはまた、マトリックス素材の１部分、例えばその両端に細胞がないようにすることもできる。 マトリックス素材が伸長下に保持される前か後に細胞をマトリックス素材に加えられる。 しかしながらチャンバー内で素材が伸長下に保持される前に、細胞を素材に加えることが望ましい。 マトリックス素材は、補綴の靭帯あるいは腱の形状でデザインされる。 例えばマトリックス素材が補綴の靭帯の形態の場合、応力をかけない時の靭帯の長さは１から３０ｃｍの範囲にあることが望ましい。 マトリックス素材は、埋め込みによって、例えば膝においてかかる応力の大きさに耐えられるように選択する必要がある。 応力を印加する手段は、マトリックス素材の両端あるいは１端を引っ張ることにより作用し、マトリックス素材の伸長をもたらす。 これは種々の手段、例えば機械的、電気化学的、電気的、ピエゾ電気的、空気圧的、油圧的あるいはその他の手段で行うことができる。 マトリックス素材は、チャンバーの一端にある静止成分に取り外し可能に取り付けられ、マトリックス素材の逆の端は張力印加部材（例えば巻き上げ装置など）に取り付けられる。 チャンバー内に一端があり、他端はチャンバー外にある隔壁によって、応力をマトリックス素材に印加することが好適である。 枢軸的に取り付けたレバーを用いて応力を印加しても良い。 本発明はまた、マトリックスと細胞をおおうのに適当な量の培地を有するチャンバー内において、生存細胞を密接に接触してもっているマトリックス素材を剥離可能に固定し、単一の軸に沿ってマトリックス素材に応力を印加することとからなる応力下に細胞を培養する方法を提供する。 本発明のマトリックスにおいて用いるのに適切な素材は、以下に例示するように評価することができる。 素材の評価 繊維芽細胞の生育を補助する適切な素材の初期評価を行うために、以下の表１ に示されるように、様々の素材（これは限定的に解釈されるべきではない）を取得し、次の温度で２．５トンで５分間、膜状に成形した。 ポリラクチド１７０℃ 、ポリグリコリド２４５℃、ポリヒドロキシブチレート１８５℃およびポリカプロラクトン６５℃。

繊維芽細胞を素材１cm

²あたり１×１０

⁴個の密度でこれらの素材の表面上に接種し、培養条件下で３日間培養した。 培養期間後に、細胞を接種をした試料の顕微鏡写真をとった。 これらは上の表１に示される試料について、図１ａから１ｄに示されている。 （この出願のため提供された全ての写真の写真複写は関連する写真の直後に作られる。） 繊維芽細胞が全ての素材の表面に十分付着し、健全な培養繊維芽細胞に特有の形態を示していることが見て取れる。 繊維芽細胞の１つの試料を、長い（１６日間の）培養期間を用いた以外は上記と同様にしてポリラクチド上で成長させた。 この期間の後、細胞を生体染料（カルセインＡＭ（２μＭ））で染色し、フルオレセインフィルタを用いて蛍光顕微鏡で視覚化した。 生存細胞の融合性単一層が観察され、ポリラクチドは培養時間の延長に対して生存繊維芽細胞を支持する能力があることが示された。 図２は、生物同化性合成素材の４例すなわち（いずれも上述の）ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ） およびポリカプロラクトン（ＰＣＬ）上の繊維芽細胞の拡散を、組織培養処理したポリスチレン（ＴＣＰ）コントロール（ＴＣＰは良い繊維芽細胞成長を支持することが知られているので）と比較した時の相対割合を示すグラフである。 図２ａ）からｅ）は、（それぞれの参照例について）単一のグラフ上で、これらの各々の素材を示す。 細胞を１×１０

⁴ cells.cm

^-2で三つに分けて接種し、標準細胞培養技術を用いて培養の後、７日までの時間点において、細胞ＤＮＡへのトリチウム化したチミジンの摂取量を測定することにより、拡散率を定量した。 培地は２日、４日、および６日に変えた。 点は３つの測定量の平均を表し、誤差線は範囲を表す。 全てのポリマーは繊維芽細胞の拡散を支持した。 図３は１５日間の培養の後の３次元コラーゲンゲルの中に埋め込まれた繊維芽細胞の顕微鏡写真である。 、マトリックスに接触させるためには用いられなかった点以外は（後述の）実施例２に記載されているようにして、細胞を接種したゲルを調製した。 ゲルは、細胞が埋め込まれ、膜インテグリン受容体を通じてコラーゲン分子との反応を形成できる３次元構造を提供する。 細胞はランダムに配置され、長い過程を示し、ゲルの中のコラーゲン原繊維を再編成する能力がある。 図４は、ゲルが、組織培養適合性接着剤で培養皿に貼り付けた２つのステンレススチールの釘(peg)により１つの方向に収縮することを抑制された点を除いて、上の図３に記述されたような３次元コラーゲンゲル内に埋め込まれた繊維芽細胞の顕微鏡写真である。 細胞は高度に方向づけられた態様で、その長い軸が抑制釘(constraining pegs)の間の軸に平行になるように配置される。 コラーゲン原繊維(fibrils)は同じ軸に沿って整列する。 この効果は、培養物中に繊維芽細胞が存在する時に、起こるであろうゲル収縮を防止する釘のためである。 つぎの実施例は、制限的に解釈すべきではないが、細胞を接種した種々のマトリックスがいかに生成されるかを示す。 実施例１：繊維芽細胞を接種したポリラクチドマトリックスプロステーシスの調製ａ）細胞の調製 バイオプシーをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、７０％アルコールですすいだ。 すすいだバイオプシーは次に、 ダルベッコの修正基礎培地（ＤＭＥＭ）に浸し、３７℃で２４時間培養した。 培養の後、バイオプシーをＰＢＳの下で小片に切り分けた。 切り分けた小片は、消化させるための５ミリリットルのコラーゲナーゼ溶液を含む５０ｍｍのペトリ皿に移された。 表皮シートをコラーゲナーゼ溶液から取り除いた。 得られた溶液を遠心分離した。 繊維芽細胞ペレットをＤＭＥＭに再懸濁し、その後ＤＭＥＭを用いて３ ５ｍｍのペトリ皿に接種した。 細胞は２日から４日の間に融合性であってもよい。 その後、マトリックスに接種するため適切な量の繊維芽細胞を提供するため、 細胞を培養してもよい。 分離した繊維芽細胞を培養するための適切な培地は、以下のものすなわち、グルタミン、胎児子牛血清、非必須アミノ酸および抗生物質を補ったＤＭＥＭからなる。 さらに培地は、重炭酸塩などの緩衝剤を有してもよい。 ｂ）マトリックス素材の調製 靭帯と置き換えるプロステーシスにおいて用いるのに好適なポリラクチドマトリックス素材は、ポリラクチド繊維を得て、靭帯と置き換えるのに適切な寸法の編みひも(braid)を形成するためにそれらを編む（braiding）ことにより調製できる。 ポリラクチド繊維は、押し出し成形、繊維紡糸、溶融紡糸、延引成形、熱アニーリングなどにより得ることができる。 繊維を編むことは、標準の編み技術によって行うことができ、適切な性質をもつ編みひもを形成するため、編みひもの長さと厚さ、存在する繊維の数および存在する繊維の直径を選択される。 装置の両端は、ネジあるいはその他の固定手段によって装置に固定することを助けるために適切な方法で構成される。 これは両端に小穴(eyelets)を形成することにより行われる。 ｃ）細胞によるマトリックス素材の接種 編んだ装置は体積比で１０％の血清を含む培地で２４時間培養され、マトリックス素材の表面が細胞懸濁液で完全に覆われるまで、細胞懸濁液をマトリックス素材の表面上にピペットで分取することにより細胞を接種する。 （あるいはまたマトリックスを、例えばボトルローラー上で撹拌する条件のもとで約６時間懸濁液とともに培養してもよい。また別の方法としては、真空下で装置の中を通して細胞懸濁液を吸引する（もし多孔質である場合）ことによるか、あるいは装置を通して細胞懸濁液を遠心分離することにより装置に接種することである。 ｄ）細胞を接種したマトリックスに応力をかけること 細胞を接種した装置は、単一の長手方向の軸に沿って装置に応力をかける応力装置において両端を把持する。 これは、細胞の顕微鏡解析により評価されるように、長手方向の一般的方向に沿って繊維芽細胞を実質的に整列させることができるように十分の時間をかけて行われる。 応力の印加が数時間にわたってあるいは数日にわたって起こるが細胞が生育可能のままであるように、装置は培養チャンバーを備える。 通常は装置は３７℃で応力を印加する。 応力印加時、好適な条件下で細胞を培養するため培地が用いられる。 これは血清と、アスコルビン酸塩あるいはその安定な類似体と、成長因子を含有する。 アスコルビン酸塩は繊維芽細胞を刺激してコラーゲンを合成させる。 血清は細胞の拡散と細胞の付着を促進する因子を含有し、成長因子は細胞拡散と成長および移動を刺激することができる。 ｅ）細胞を接種したマトリックスの埋め込み 繊維芽細胞の整列が所期の程度になるよう十分な期間、細胞を接種した装置に応力を印加した後、装置を細胞応力装置から剥離し、所期の技術の何れかによって患者に埋め込まれる。 侵襲的外科術が最小になることが望まれる。 人工器官の前方十字靭帯については、埋め込みは「２トンネル」あるいは「オーバーザトップ」技術を利用して行われる。 固定は、マトリックスの小穴を通して置かれたネジ（あるいはその他の固定成分）を用いて達成できる。 ネジは、ポリヒドロキシブチレートなどの生物分解性素材から形成されるのが好適である。 実施例２：繊維芽細胞が組み込まれたコラーゲンゲルを含有する、繊維芽細胞を接種したポリラクチドマトリックスプロステーシス調製。 これは、ポリラクチドマトリックスに接種するのに用いられるコラーゲンゲル中に繊維芽細胞が組み込まれるという代替的手順を挿入すること以外は実施例１ に記載した方法と類似の態様で行うことができる。 この別段の手順は以下に記載している。 ａ）コラーゲンの調製 酸に可溶で、かつ架橋していない形態でコラーゲンを形成することが望ましい。 これは次のように行うことができる。 Ｉ型のコラーゲンを腱から調製するが、例えば皮膚のような他の組織からのものであっても良い。 組織を細かく切り刻み、（体積比）７０％のエタノールで少なくとも３０分消毒し、（体積比１％の）酢酸に分散させ、４℃で撹拌しつつ培養する。 上澄みを取り除き、適当な量の１．０Ｍ水酸化ナトリウムを加えて中性にする。 沈澱したＩ型のコラーゲンを８０００×ｇでの遠心分離によりペレット化し、適当な量の（体積比１％の）酢酸にペレットを再懸濁する。 この溶液のコラーゲン濃度は適当な方法（例えば全タンパク検定−ＢＣＡ検定）の何れかで測定し、コラーゲン溶液の濃度を適切に（例えば３ｍｇ．ｍｌ-1を用いることができる）調節する。 もし生成物がキットの場合は、無菌のコラーゲン溶液を冷凍乾燥し、架橋形成を防ぐため、真空下あるいは不活性ガス（例えばアルゴン）下で保存する。 希釈（酢酸）も準備することができる。 あるいは溶液として準備し４℃から−２０℃ で保存してもよい。 ｂ）細胞によるマトリックス素材の接種 マトリックスに接種するため、通常３つの成分、すなわち適当な培地に懸濁した細胞と、コラーゲン溶液とゲル化剤（例えば１Ｍの水酸化ナトリウム）を用いる。 最終のコラーゲン濃度はおよそ１ｍｇ.ml-1であり接種密度は、ゲル１ｍｌ （あるいはマトリックスの中の体積）当たりの細胞数でおおよそ３×１ ０

⁴個である。 ３成分を０℃から４℃に維持し、混合してマトリックスに加える。 マトリックスを十分に含浸させた後、３７℃で培養し、ゲル化を開始させる。 マトリックスの含浸は好適な方法の何れかを用いて行う。 マトリックスを型内で溶液中に単に浸しても良い。 あるいは溶液を、真空を利用して骨格の中へ吸引するか、遠心分離で（例えば５００ｒｐｍで５分間、０から４℃で遠心分離した型の中で）押し込めてもよい。 温度を変化させることにより、ゲルの固化速度を変化させることができる。 実施例３：繊維芽細胞が組み込まれた繊維素（fibrin）ゲルを含有する、繊維芽細胞を接種したポリラクチドマトリックスプロステーシスの調製。 これは、コラーゲンゲルのかわりに繊維素ゲルが用いられることを除いて、実施例２に記載した方法に類似の方法によって行うことができる。 この場合もまた、３つの成分すなわち細胞懸濁液と、フィブリノーゲン溶液と、塩化カルシウム（ｍＭ）を含有するトロンビン溶液が用いられる。 最終の細胞濃度は、１ｍｌあたり細胞数３×１０

⁴個であり、フィブリノーゲン濃度は３ｍ ｇ／ｍｌで、トロンビン活性は２．５ユニット／ｍｌで、塩化カルシウム濃度は５ｍＭである。 試薬を混合しマトリックスと共に培養する。 溶液と含浸させた後、マトリックスを３７℃で培養して高速にゲル化させる。 マトリックスの含浸は、上記の何れかの技術によって行うことができる。 トロンビン活性及び／又は温度を変化させることにより、ゲル化速度を変化させることができる。 装置を形成するため合わせることのできる種々の構成要素を示す、図５ａ）、 ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）のみを参照して、例示により、前に言及した細胞応力装置を説明する。 装置はパースペックス（Perspex：商標）の容器１０（カッタウェイ部分図で示す）およびふた２０（図５ａ）および５ｅ）を参照）を備える。 容器１０は、 細胞培養条件下で繊維芽細胞を接種した伸長可能な素材を収容するのに用いることができる。 参照し易いように、当業者によく知られているであろうような、サーモスタットやセンサーや培地の上部除去（topping up）のための入口（inlets ）やその他の成分は図示していない。 装置はさらに第一および第二グリップ３０および４０を備え、そのそれぞれは釘（pegs）５０を有する２つの平行なアーム４５を持っている。 （図５ｃ）およびｅ）を参照） グリップの１つ（グリップ４０）は、モーター（図示せず）により単一の長手方向の軸に沿って他方のグリップ３０へ向かってあるいは遠ざかる向きに動かすことのできるサポート６０を備える。 もう一方のグリップ３０は装置の端壁３５ に固定的に取り付けられている。 グリップ３０と４０は、スプール７０および８０を受けとめ保持するように働く（図５ｃ）および５ｅ）を参照）。 これは溝９０にはまる釘（ペグ、pegs）５０によりなされ、それぞれスプール７０および８０のグリップ３０および４０に対する回転を防ぐように、スプール７０および８０をグリップ３０および４０に取り付ける。 スプール７０と８０は、細胞を接種したポリラクチド編みひもプロステーシス１００で示される、繊維芽細胞を接種した伸長可能な素材を保持する働きをする。 これは開口部１１０および１２０を通してプロステーシス１００の両端を通し、プロステーシス１００がスプール７０および８０に摩擦によって保持されるように、スプール７０と８０をそれぞれ軸ＡおよびＢのまわりに数回回転させることによりなされる。 （図５ｂ）参照） 次にスプール７０と８０は上に述べたようにグリップ３０と４０にはめ込まれ（図５ｃ）参照）、グリップ３０と４０の間隔がより大きくなるように容器の中でサポート６０を引き込むことにより、プロステーシス１００を伸長させることができる。 一旦所望の伸長がなされた時、取り外し可能なロック装置（図示せず）によりサポート６０を固定保持し、伸長したプロステーシス００を、必要な時間だけ培養条件下で培養することができる。 プロステーシス１００を容易に見ることができるように、透明あるいは半透明の素材でできた窓１３０が設けられる。 これは、いつプロステーシス１００が埋め込みできる状態になったかを決めるため、プロステーシス１００上に生育する繊維芽細胞の顕微鏡的解析に用いることができる。 容器１０の底に置くために溝をつけた透明あるいは半透明のブロック１４０も設けられる（図５ｄ）参照）。 スプール７０と８０がグリップ３０と４０により保持された状態で、スプール７０と８０の上に置かれたとき、プロステーシス１ ００をおおう十分な培地を溝１５０が収容することができるように、ブロックの大きさが決められる。 このことにより用いられる培地の量が経済的になる。 応力装置の要素を形成するのに用いられる素材は、オートクレーブ処理可能でアルコールで消毒可能である。 通常、その装置は３７℃の温度で５％のＣＯ

₂の雰囲気で作動させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９３１４４７１．５ (32)優先日 1993年７月７日(33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３１４５８０．３ (32)優先日 1993年７月14日(33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３２０３５２．９ (32)優先日 1993年10月２日(33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３２０３６８．５ (32)優先日 1993年10月２日(33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 サール，リチャード，ジョン イギリス国、ヨーク ワイオー２ ６エイ チイー、アッパー・ポップルトン、フェア ウェイ・ドライブ 12 (72)発明者 マシューズ，ジェーン，ブリジェット イギリス国、ヨーク ワイオー２ １ディ ーピー、サウス・バンク・アベニュー 84 (72)発明者 キング，ジョン，ビー. イギリス国、ケント ビーアール１ ２エ ヌダブリュ、ブロムリ、チゼルハースト・ ロード、ウェル・コテージ（番地なし) (72)発明者 パーマー，デブラ イギリス国、ドーセット エスピー７ ８ ピーダブリュ、テン・エーカーズ、シヤフ ツベリ（番地なし) (72)発明者 シェルトン，ジュリア キャロライン イギリス国、ロンドン イー９ ７エヌデ ー、ハックニイ、ビクトリア・パーク・ロ ード 187