一种葡萄味甘蔗果醋功能性饮料的制备方法 |
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| 申请号 | CN201610670598.4 | 申请日 | 2016-08-12 | 公开(公告)号 | CN106281948A | 公开(公告)日 | 2017-01-04 |
| 申请人 | 广西大学; | 发明人 | 邓立高; 李一; 李凯; 陆海勤; 杭方学; 谢彩锋; 黄婷婷; | ||||
| 摘要 | 一种葡萄味 甘蔗 果醋功能性饮料的制备方法，包括如下步骤：制备甘蔗汁，甘蔗汁酒精 发酵 得到甘蔗果酒，甘蔗果酒 醋酸 发酵得到甘蔗果醋；按照以下组分及其重量百分比进行调配，甘蔗果醋0.5～2％，鲜榨葡萄汁5～10％，白砂糖6～10％，蜂蜜3.5～5.5％，枸杞、山楂叶和杜仲混合煎煮液5～15％，陈皮苷0.5～1％，果糖酸 钙 0.5～1％， 水 55.5～79％，以上各组分的重量百分比总和为100％。甘蔗果醋具有延缓人体衰老、降血压、 软化 血管、减少胆固醇积累、降血糖、调节细胞酸 碱 平衡等保健功能。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种葡萄味甘蔗果醋功能性饮料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种葡萄味甘蔗果醋功能性饮料的制备方法技术领域背景技术[0002] 甘蔗味甜、营养丰富，被称作冬令佳果，还有人称“秋日甘蔗赛过参”。甘蔗含较高的水分，每100g甘蔗中含84％水分、0.2g蛋白质、0.5g脂肪、8mg钙、4.0mg磷与1.3mg铁。蔗汁中含有多种人体必需氨基酸和非必需氨基酸，如丝氨酸、丙氨酸、赖氨酸、天门氨酸、羟丁氨酸等；还含有苹果酸、草酸、柠檬酸等对人体新陈代谢有益的有机酸；以及维持人体健康必需的维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C等。以往主要将甘蔗汁用于制备蔗糖，鲜有对甘蔗汁进行别的加工，导致甘蔗汁的价值较低。随着人们对甘蔗汁研究的深入以及生物技术水平的提高，目前对甘蔗汁进行高附加值加工的产品逐渐被开发出来，增强了企业抗风险能力。 发明内容[0003] 本发明针对现有技术的不足，提供一种葡萄味甘蔗果醋功能性饮料的制备方法。 [0004] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案： [0005] 一种葡萄味甘蔗果醋功能性饮料的制备方法，包括如下步骤： [0006] (1)制备甘蔗汁 [0007] 新鲜甘蔗压榨得到甘蔗汁； [0009] 使用蔗糖调节甘蔗汁的糖度至17～19％，使用柠檬酸和碳酸钙调节甘蔗汁的pH值至4.4～4.7，调节完毕后高温高压灭菌并冷却至室温，然后在无菌操作下接入发酵物料重量百分比2.5～3.5％酿酒酵母，置于27～28℃条件下厌氧发酵3～4天，得到甘蔗果酒； [0010] (3)醋酸发酵 [0011] 使用蔗糖调节甘蔗果酒的糖度至5.5～6.5％，使用柠檬酸和碳酸钙调节甘蔗果酒的pH值至5.0～5.5，使用无菌水和酒精将甘蔗果酒的酒精度调节到6.5～7.5％(v/v)，调节完毕后进行巴氏灭菌并冷却至室温，然后无菌操作下接入发酵物料重量百分比9～11％醋酸杆菌，置于31～33℃的发酵4～5天，发酵结束后，先经过澄清处理，再经过高温瞬时灭菌处理，得到甘蔗果醋； [0012] (4)调配 [0013] 按照以下组分及其重量百分比进行调配， [0014] [0015] 以上各组分的重量百分比总和为100％； [0016] 所述枸杞、山楂叶和杜仲混合煎煮液安装如下方法获得，按重量份数计，取枸杞1～2份、山楂叶10～15份和杜仲3～5份，添加6～8倍重量水，煎煮60～90min，弃渣取汁即得。 [0017] 与现有技术相比较，本发明具备的有益效果： [0018] 1、甘蔗果醋的酿制工艺较简单，不需要额外加入碳源、氮源，发酵条件宽松易控制。 [0019] 2、果醋的酒精发酵时间短得率高，该酿酒酵母产酒精能力较强。 [0020] 3、该发明所需要的设备与操作相对简单，企业易实施。 [0022] 图1糖度对甘蔗果酒中酒精度的影响。 [0023] 图2温度对甘蔗果酒中酒精度的影响。 [0024] 图3接种量对甘蔗果酒中酒精度的影响。 [0025] 图4 pH值对甘蔗果酒中酒精度的影响。 [0026] 图5糖度对甘蔗果醋中总酸含量的影响。 [0027] 图6 pH值对甘蔗果醋中总酸含量的影响。 [0028] 图7酒精度对甘蔗果醋中总酸含量的影响。 [0029] 图8接种量对甘蔗果醋中总酸含量的影响。 [0030] 图9装液量对甘蔗果醋中总酸含量的影响。 [0031] 图10温度对甘蔗果醋中总酸含量的影响。 具体实施方式[0032] 下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。 [0033] 实施例1 [0034] 第一章一种葡萄味甘蔗果醋功能性饮料的制备方法，包括如下步骤： [0035] (1)制备甘蔗汁 [0036] 新鲜甘蔗压榨得到甘蔗汁； [0037] (2)酒精发酵 [0038] 使用蔗糖调节甘蔗汁的糖度至17～19％，使用柠檬酸和碳酸钙调节甘蔗汁的pH值至4.4～4.7，调节完毕后高温高压灭菌并冷却至室温，然后在无菌操作下接入发酵物料重量百分比2.5～3.5％酿酒酵母，置于27～28℃条件下厌氧发酵3～4天，得到甘蔗果酒； [0039] (3)醋酸发酵 [0040] 使用蔗糖调节甘蔗果酒的糖度至5.5～6.5％，使用柠檬酸和碳酸钙调节甘蔗果酒的pH值至5.0～5.5，使用无菌水和酒精将甘蔗果酒的酒精度调节到6.5～7.5％(v/v)，调节完毕后进行巴氏灭菌并冷却至室温，然后无菌操作下接入发酵物料重量百分比9～11％醋酸杆菌，置于31～33℃的发酵4～5天，发酵结束后，先经过澄清处理，再经过高温瞬时灭菌处理，得到甘蔗果醋； [0041] (4)调配 [0042] 按照以下组分及其重量百分比进行调配， [0043] [0044] 以上各组分的重量百分比总和为100％； [0045] 所述枸杞、山楂叶和杜仲混合煎煮液安装如下方法获得，按重量份数计，取枸杞1～2份、山楂叶10～15份和杜仲3～5份，添加6～8倍重量水，煎煮60～90min，弃渣取汁即得。 [0046] 第二章甘蔗汁酒精发酵工艺优化 [0047] 2.1.引言 [0048] 酒精发酵所用的菌种是酵母菌，酵母菌是真菌、兼性厌氧菌，在有氧的环境中，它先进行有氧呼吸，利用还原糖来进行生长繁殖，将还原糖分解为二氧化碳和水，在无氧条件下，酵母菌将还原糖转化为乙醇和二氧化碳来获得能量，也就是酒精发酵。酵母菌较大、易培养，增殖非常迅速，消耗的葡萄糖较少，大部分的葡萄糖在酒精发酵过程中被转化成酒精和二氧化碳，酒精发酵还生成了一些高级醇、有机酸、醛类、微量酯类、甘油等，使得果酒风味圆润、醇厚细腻。 [0049] 经过预试验发现，GIM2.74酿酒酵母较为适合甘蔗汁酒精发酵，其产酒精能力较强，发酵时间为3d。甘蔗汁糖度、发酵温度、接种量和pH值对酒精发酵影响较大，并确定了四个因素大致的范围。在预试验的基础上，本章内容主要探索了甘蔗汁糖度、发酵温度、酵母菌接种量以及pH值对酒精发酵的影响，并对甘蔗汁酒精发酵工艺进行了优化以获得最佳工艺条件。 [0050] 2.2.材料与方法 [0051] 2.2.1.实验原料和菌种 [0052] 甘蔗汁(实验室压榨好的，糖度14.5％，pH4.5)；白砂糖购于南宁南百超市；菌种：酿酒酵母(菌号GIM 2.74)购于广东省微生物研究所菌种保藏中心 [0053] 2.2.2.实验试剂 [0054] 碳酸钙、柠檬酸、丙三醇、无水乙醇、液体石蜡、酚酞指示剂、亚甲基蓝、硫酸铜、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、氯化钾、冰乙酸、氢氧化钠、盐酸等均为分析纯：麦芽汁培养基、技术琼脂粉为生物试剂。 [0055] 2.2.3.实验仪器设备 [0056] 电热恒温培养箱(HH-B11型，上海跃进医疗器械厂)；手提式压力蒸汽灭菌锅(YX-280D型YX系列，江阴滨江医疗设备有限公司)；智能精密摇床(BSD-YX2400型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A型，上海精宏实验设备有限公司)； pH计(PHS-3C，上海科研)；超净工作台(SW-CJ-VS2型，苏州安泰有限公司)；WAY-2S数字阿贝折光仪；水浴恒温培养摇床(SHY-100A型，湖南湘怡实验室仪器开发有限公司)；万用电炉(DL-1型，北京市永光明医疗仪器厂)；YP601N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)； BIOHIT移液枪。 [0057] 2.2.4.分析检测方法： [0058] (1)总酸的测定：GB/T 12456-2008国标 [0059] (2)还原糖的测定：GB//T 5009.7-2008国标 [0060] (3)可溶性固形物的测定：折光法，数字阿贝折光仪 [0061] (4)pH值的测定：pH计 [0062] (5)乙醇的测定：GB/T 10345-2007，酒精计法 [0063] 2.2.5.菌种的制备 [0064] 2.2.5.1酵母菌培养基 [0065] 活化培养基：麦芽汁培养基 [0066] 斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基 [0068] 2.2.5.2菌种活化 [0069] 冻干管开封后，干粉用0.3mL～0.5mL的培养液溶解，用灭菌后的吸管吸取菌体悬浮液，接种在2支琼脂斜面培养基上。在25℃～28℃下培养48h。每隔15d转接一次。斜面菌种应包好、封口保存于4℃冰箱内。 [0070] 2.2.5.3菌种扩大培养 [0071] 一级扩大培养：取三只18×180mm大试管，每只试管装入10mL甘蔗汁，塞上棉塞并用牛皮纸包扎后于121℃高压灭菌30min，冷却后，无菌条件下从酵母菌斜面培养基上取2～3环酵母菌接入试管中，置于恒温培养箱中，25℃～28℃培养24h。 [0072] 二级扩大培养：取三个250mL三角瓶，每个三角瓶装入100mL甘蔗汁，塞上棉塞并用牛皮纸包扎后于121℃高压灭菌30min，冷却后，无菌条件下将一级种子全部倒入三角瓶中，置于恒温培养箱中，25℃～28℃培养24h。 [0073] 2.3.实验内容与方法 [0074] 2.3.1.发酵前甘蔗汁成分调整 [0075] 甘蔗汁的pH值、糖度是影响酒精发酵的重要因素，因此用阿贝斯折光仪测定甘蔗汁的可溶性固形物含量，根据读数利用白砂糖调整糖度；采用pH计来测定甘蔗汁pH值，利用柠檬酸和碳酸钙调整pH值，以探索酒精发酵的较优工艺。 [0076] 2.3.2.灭菌 [0077] 用250mL的锥形瓶装入150mL的甘蔗汁，塞好棉塞并用牛皮纸包好于121℃高压灭菌30min。 [0078] 2.3.3.糖度对酒精发酵的影响 [0079] 分别将甘蔗汁的糖度调整为12％、14％、16％、18％、20％，在甘蔗汁自然pH下接入3％的酵母菌，在26℃的条件下进行酒精发酵，至可溶性固形物减少缓慢酒精度不再上升时结束发酵，测定发酵液酒精度并分析糖度对酒精发酵的影响。 [0080] 2.3.4.温度对酒精发酵的影响 [0081] 在甘蔗汁自然糖度、自然pH和接种量3％的条件下，分别在温度为22℃、24℃、26℃、28℃、30℃进行酒精发酵，至可溶性固形物减少缓慢酒精度不再上升时结束发酵，测定发酵液酒精度并分析温度对酒精发酵的影响。 [0082] 2.3.5.接种量对酒精发酵的影响 [0083] 在甘蔗汁自然糖度、自然pH的条件下，分别按1％、2％、3％、4％、5％的接种量接入酵母菌，在26℃的条件下进行酒精发酵，至可溶性固形物减少缓慢酒精度不再上升时结束发酵，测定发酵液酒精度并分析接种量对酒精发酵的影响。 [0084] 2.3.6.pH值对酒精发酵的影响 [0085] 分别将甘蔗汁的pH调整为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，在甘蔗汁自然糖度下接入3％的酵母菌，在26℃条件下进行酒精发酵，至可溶性固形物减少缓慢酒精度不再上升时结束发酵，测定发酵液酒精度并分析pH值对酒精发酵的影响。 [0086] 2.3.7.酒精发酵正交试验设计 [0087] 根据单因素试验的结果，选择糖度、温度、接种量、pH值进行四因素三水平正交试验，以酒精度为指标，表头按照L9(34)正交表设计如表1。 [0088] 表1.甘蔗汁酒精发酵正交试验设计 [0089] [0090] 2.4.结果与讨论 [0091] 2.4.1.糖度对酒精发酵的影响 [0092] 甘蔗汁糖度是酵母菌进行酒精发酵的主要原料，糖度的高低直接决定了酒精发酵产量的大小，糖度较高时，酒精发酵产生的酒精含量相对较高，但是糖度过高形成的高渗透压将抑制酵母菌活性，酒精产量反而下降，导致大量的糖残留造成浪费。因此，本实验对最适合酵母菌进行酒精发酵的糖度进行了研究，糖度对酒精发酵效果影响的单因素试验结果见图1。 [0093] 由图1可知，随着糖度的升高酒精度逐渐升高，糖度在12％～16％时，酒精度急剧增加，而16％～18％时增加较慢，当糖度到18％以后，酒精度上升较平缓。初始糖度为20％时，发酵完成后，酒精度虽较高，但残留的可溶性固形物较大，实测的残留可溶性固形物达到7.7％，造成原料浪费较大，因此选择14％、16％、18％三个水平继续进行正交试验。 [0094] 2.4.2.温度对酒精发酵的影响 [0095] 温度影响着酵母菌的生长速率、酒精产量以及原料的消耗速率等，温度适当可以提高酵母菌的生长速率，缩短发酵周期，温度过低容易导致酵母菌生长缓慢，发酵周期过长，容易污染杂菌，酒精产量下降；温度过高易导致酵母菌生长旺盛，需要较多的还原糖用于生长增殖，导致用于生产酒精的还原糖减少，酒精度降低。发酵温度对酒精发酵效果影响的单因素试验结果见图2。 [0096] 由图2可知，温度对酵母菌进行酒精发酵影响较大，在22℃～28℃范围内，随着温度的升高酒精度上升明显，而28℃～30℃，随着温度的升高酒精度反而有所下降，恒温30℃发酵结束后，实测的发酵液中的残留可溶性固形物比较低，在4％左右，温度较高有利于酵母菌的生长繁殖，大量的还原糖用于酵母菌的有氧呼吸，而用于酒精发酵的还原糖较少，不利于酒精发酵。因此取24℃、26℃、28℃进行正交试验。 [0097] 2.4.3.接种量对酒精发酵的影响 [0098] 接种量的大小和酒精发酵周期有着密切的关系。接种量小使酒精发酵周期延长，并且容易发生杂菌污染，导致酒精产量下降；接种量大，酵母菌是优势菌群能将杂菌覆盖掉，抑制杂菌污染，缩短发酵周期，节约资源。但是接种量过大，酵母菌生长增殖旺盛，消耗许多还原糖，导致用于酒精发酵的还原糖减少，酒精度下降，由于酵母菌过多引起菌体自溶，导致酵液的酵母味较重，影响果酒品质。接种量对酒精发酵效果影响的单因素试验结果见图3。 [0099] 由图3可以得知，随着接种量的增加，酒精度先上升后下降。接种量为1％时，酒精度较低而且残留可溶性固形物较大(实测为4.6％)造成原料浪费，当接种量为5％时，残留可溶性固形物较少(实测为3.9％)，但酒精度偏低，这主要是由于接种量过大，酵母菌消耗了大部分还原糖进行生长繁殖，导致酒精发酵时可利用的还原糖较少，且接种量过大导致发酵液的酵母味较浓影响产品风味。因此选取2％、3％、4％进行正交试验。 [0100] 2.4.4.pH值对酒精发酵的影响 [0101] pH值和酵母菌的生长环境有着密切的关系，酵母菌在偏酸性的环境中生长良好，但过酸的环境不利于酵母菌的生长繁殖。只有在适宜酵母菌生长增殖的pH值范围内，才不会抑制酵母菌的活性，适宜的pH值不仅有利于酵母菌的生长繁殖，还能使发酵生成的果酒香味更加香醇怡人。pH值对酒精发酵效果影响的单因素试验结果见图4。 [0102] 由图4可以看出，pH值从3.0增加到4.5的同时酒精度也上升明显，pH值从4.5增加到5.0时，随着pH值的增加酒精度反而有所降低。较高的pH值不仅不适宜酵母菌的生长繁殖，而且还影响发酵液的色泽和风味，pH值偏低时果酒的香味较醇厚，色泽较浅较明亮。以酒精度为指标，进一步选取pH4.0、pH4.5、pH5.0进行正交试验。 [0103] 2.4.5.酒精发酵正交试验结果与分析 [0104] 为了确定甘蔗汁酒精发酵最佳工艺条件，本实验对糖度(A)、温度(B)、接种量(C)、pH值(D)进行四因素三水平正交试验。正交试验结果见表2。 [0105] 表2酒精发酵正交试验结果 [0106] [0107] 由表2可以看出，影响甘蔗汁酒精发酵效果的主次因素依次是RA＞RB＞Rc＞RD，也就是糖度＞温度＞接种量＞pH值，其中糖度对酒精发酵的影响最大，在一定范围内，糖度的高低直接影响了酒精度的高低。在正交表中通过对K值的比较，可以得出实验最佳组合是A3B3C2D2，即糖度为18％、温度为28℃、接种量为3％以及pH值为4.5。 [0108] 2.4.6.甘蔗汁酒精发酵最佳工艺的验证试验 [0109] 由于从实验中得出的最佳组合A3B3C2D2没有包括在9个正交试验中，为了使结论严谨，将正交表中最佳组合A3B3C2D1和实验最佳组合A3B3C2D2做了验证试验，以酒精度为指标，试验结果见表3。 [0110] 表3验证试验结果 [0111] [0112] 由表3可以得知，实验最佳组合工艺产的酒精含量比正交表中最佳组合工艺产的酒精含量要高，因此甘蔗汁酒精发酵最佳工艺组合应该是A3B3C2D2，即糖度为18％、温度为28℃、接种量为3％以及pH值为4.5。 [0113] 第三章甘蔗汁醋酸发酵工艺优化 [0114] 3.1.引言 [0115] 醋酸发酵所用到的菌种是醋酸杆菌，醋酸杆菌是细菌、好氧菌，醋酸杆菌在有氧条件下将乙醇氧化最终生成乙酸的过程就是醋酸发酵。醋酸发酵除了生成醋酸外，还有其它的一些有机酸、酯类物质等生成，为果醋增添了许多风味。 [0116] 醋酸发酵方式大致有固态发酵法、液态发酵法以及固液发酵法。固态发酵法是以粮食、果肉等为原料采用固态醋醅发酵酿制的工艺。该法酿制的果醋，具有香气浓郁、口味醇厚等优点，缺点是生产周期长、出醋率不高、劳动强度大。液态发酵法是以水果汁为原料，采用液态醋醅发酵酿制的工艺。该法虽然风味不及固态法，但是发酵周期短、便于连续化和机械化生产、原料利用率高、产品品质较稳定。固液发酵法是在酒精发酵阶段采用液态发酵，在醋酸发酵阶段采用固态发酵的工艺，该法出醋率高、风味和固态法相近。由于甘蔗汁水分多，液态发酵法有利于对发酵过程的控制，因此本实验采用液态发酵法酿制甘蔗果醋。 [0117] 经过预试验发现，醋酸发酵进行5d后总酸含量缓慢增加然后减少，这是因为醋酸杆菌将醋酸进一步氧化成二氧化碳和水所致，因此确定了醋酸发酵时间为5d；通过预试验还确定了影响醋酸发酵的发酵液的糖度、pH值、酒精度、接种量、装液量和温度的大致范围。在预试验的基础上，本章内容主要探索了发酵液糖度、pH值、酒精度、醋酸杆菌接种量、装液量以及发酵温度对醋酸发酵的影响，并对甘蔗汁醋酸发酵工艺进行了优化以获得最佳工艺条件。 [0118] 3.2.材料与方法 [0119] 3.2.1.实验原料 [0120] 甘蔗果酒(参见2.4.6) [0121] 白砂糖购于南宁超市 [0122] 菌种：醋酸杆菌(菌号AS1.41)购于广东微生物研究所菌种保藏中心[0123] 3.2.2.主要试剂 [0124] 葡萄糖、蔗糖、碳酸钙、柠檬酸、丙三醇、无水乙醇、液体石蜡、酚酞指示剂、亚甲基蓝、硫酸铜、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、氯化钾、冰乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫代硫酸钠、氯化钠、碘化钾、亚硫酸钠等均为分析纯：技术琼脂粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等为生物试剂。 [0125] 3.2.3.仪器与设备 [0126] 电热恒温培养箱(HH-B11型，上海跃进医疗器械厂)；手提式压力蒸汽灭菌锅(YX-280D型YX系列，江阴滨江医疗设备有限公司)；智能精密摇床(BSD-YX2400型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A型，上海精宏实验设备有限公司)； PHS-3C pH计(上海科研)；超净工作台(SW—CJ—VS2型，苏州安泰有限公司)；WAY-2S数字阿贝折光仪；水浴恒温培养摇床(SHY-100A型，湖南湘怡实验室仪器开发有限公司)；万用电炉(DL-1型，北京市永光明医疗仪器厂)；YP601N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)； BIOHIT移液枪。 [0127] 3.2.4.分析检测方法 [0128] (1)总酸的测定：GB/T 12456-2008 [0129] (2)还原糖的测定：GB/T 5009.7-2008 [0130] (3)可溶性固形物的测定：折光法，数字阿贝折光仪 [0131] (4)pH值的测定：pH计 [0132] (5)乙醇的测定：GB/T 10345-2007，酒精计法 [0133] (6)菌落总数测定：GB 4789.2-2010，平板计数法 [0134] (7)大肠菌群测定：GB 4789.3-2010，平板计数法 [0135] (8)沙门氏菌检验：GB 4789.4-2010 [0136] (9)志贺氏菌检验：GB 4789.5-2012 [0137] (10)金黄色葡萄球菌检验：GB 4789.10-2010 [0138] 3.2.5.菌种的制备 [0139] 3.2.5.1醋酸杆菌培养基 [0140] 醋酸杆菌活化培养基：葡萄糖10g，酵母膏10g，碳酸钙15g，无水乙醇20mL，不必调pH，无水乙醇在培养基灭菌后冷却至50℃～60℃加入。 [0141] 醋酸杆菌斜面培养基：葡萄糖10g，酵母膏10g，碳酸钙15g，无水乙醇20mL，琼脂20g，不必调pH，无水乙醇在培养基灭菌后冷却至50℃～60℃加入。 [0142] 一级种子培养基：甘蔗汁在121℃高压灭菌30min，冷却至50℃～60℃后加入2％无水乙醇。 [0143] 二级种子培养基：甘蔗汁在121℃高压灭菌30min，冷却至50℃～60℃后加入3％无水乙醇。 [0144] 发酵培养基：巴氏消毒后酒精度为5°的甘蔗果酒 [0145] 3.2.5.2菌种活化 [0146] 冻干管开封后，干粉用0.3mL～0.5mL的复水液溶解，用灭菌后的吸管吸取菌体悬浮液，接种在2支斜面培养基上。在30℃下培养24h～48h。每隔15d转接一次。斜面菌种应包好、封口保存于4℃冰箱内。 [0147] 3.2.5.2菌种扩大培养 [0148] 一级扩大培养：取三只18×180mm大试管，每支试管中装入10mL甘蔗汁(一定糖酸)，塞上棉塞并用牛皮纸包扎后于121℃高压灭菌30min，待冷却到50℃～60℃后无菌条件下加入2％无水乙醇，冷却后，无菌条件下用接种环从醋酸菌斜面培养基上取2～3环醋酸菌接入试管中，置于恒温摇床中，在30℃、120rpm条件下培养24h。 [0149] 二级扩大培养：取三个250mL三角瓶，每个三角瓶中装入100mL甘蔗汁，塞上棉塞并用牛皮纸包扎后于121℃高压灭菌30min，待冷却到50℃～60℃后无菌条件下加入3％无水乙醇，冷却后，无菌条件下将一级种子全部倒入三角瓶中，置于恒温摇床中，在30℃、120rpm条件下培养24h。 [0150] 3.3.实验内容与方法 [0151] 3.3.1.发酵前甘蔗果酒成分调整 [0152] 用酒精计来测定甘蔗果酒的酒精度，利用浓度稀释公式用无菌水将甘蔗果酒稀释到所需要的酒精度；用阿贝折光仪和白砂糖来调整甘蔗果酒的可溶性固形物；用柠檬酸和碳酸钙来调整甘蔗果酒的pH值。 [0153] 3.3.2.灭菌 [0154] 用250mL的锥形瓶装入甘蔗果酒100mL，塞上棉塞并用牛皮纸包好，在65℃左右的水浴锅中恒温30min。 [0155] 3.3.3.糖度对醋酸发酵的影响 [0156] 分别将酒精度为5％(v/v)、pH值为5.5的甘蔗果酒的糖度调整为5.5％(原始果酒糖度)、6.5％、9.5％、12.5％、15.5％、18.5％，装液量为100mL，接入10％的醋酸杆菌，控制温度为30℃，在转速为120rpm恒温摇床中进行醋酸发酵，发酵结束测定发酵液中的总酸(以乙酸计)并分析糖度对醋酸发酵的影响。 [0157] 3.3.4.pH对醋酸发酵的影响 [0158] 分别将酒度为5％(v/v)、糖度为5.5％的甘蔗果酒的pH调整为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，装液量为100mL，接入10％的醋酸杆菌，控制温度为30℃，在转速为120rpm恒温摇床中进行醋酸发酵，发酵结束后测定发酵液中的总酸(以乙酸计)并分析pH值对醋酸发酵的影响。 [0159] 3.3.5.酒精度对醋酸发酵的影响 [0160] 分别将糖度为5.5％、pH值为5.5的甘蔗果酒的酒精度调整为3％、5％、7％、9％、11％(v/v)，装液量为100mL，接入10％的醋酸杆菌，控制温度为30℃，在转速为120rpm恒温摇床中进行醋酸发酵，发酵结束后测定发酵液中的总酸(以乙酸计)并分析酒精度对醋酸发酵的影响。 [0161] 3.3.6.接种量对醋酸发酵的影响 [0162] 在装液量为100mL、酒度为5％(v/v)、糖度为5.5％、pH值为5.5的甘蔗果酒中，分别按4％、7％、10％、13％、16％的接种量接入醋酸杆菌，控制温度为30℃，在转速为120rpm恒温摇床中进行醋酸发酵，发酵结束后测定发酵液中的总酸(以乙酸计)并分析醋酸杆菌接种量对醋酸发酵的影响。 [0163] 3.3.7.装液量对醋酸发酵的影响 [0164] 取250mL三角瓶，分别装入10％(25mL)、20％(50mL)、30％(75mL)、40％(100mL)、50％(125mL)体积、酒度为5％(v/v)、糖度为5.5％、pH值为5.5的甘蔗果酒，接入10％的醋酸杆菌，控制温度为30℃，在转速为120rpm恒温摇床中进行醋酸发酵，发酵结束后测定发酵液中总酸含量(以乙酸计)并分析装液量对醋酸发酵的影响。 [0165] 3.3.8.温度对醋酸发酵的影响 [0166] 在装液量为100mL、酒度为5％(v/v)、糖度为5.5％、pH值为5.5的甘蔗果酒中，接入10％的醋酸杆菌，分别在设为28℃、30℃、32℃、34℃和36℃以及转速为120rpm的恒温摇床中进行醋酸发酵，发酵结束后测定发酵液中的总酸(以乙酸计)并分析温度对醋酸发酵的影响。 [0167] 3.3.9.醋酸发酵正交试验设计 [0168] 根据单因素试验结果，选择对酒精度(A)、接种量(B)、装液量(C)、温度(D)进行四因素三水平正交试验，以总酸(以乙酸计)为指标，表头按照L9(34)正交表设计如表4。 [0169] 表4.甘蔗汁醋酸发酵正交试验设计 [0170] [0171] 3.3.10.甘蔗果醋的感官评价以及理化卫生指标的测定 [0172] 醋酸发酵结束后，将发酵液在离心机中5000(r/min)离心20min，离心后过滤，将滤液加热到95℃保持30s进行灭菌处理，接着进行甘蔗果醋的感官评价以及理化卫生指标的测定。感官评价和理化检测参考GB 18187-2000来执行；卫生指标按照GB 2719-2003来执行。 [0173] 3.4.结果与讨论 [0174] 3.4.1.糖度对醋酸发酵的影响 [0175] 醋酸杆菌缺乏糖酵解相关酶系，但它是乙醇脱氢酶的高产菌株，在有氧条件下，能直接氧化乙醇为乙酸，因此，糖度对醋酸发酵影响不大。糖度对醋酸发酵效果影响的单因素试验结果见图5。 [0176] 由图5可以得知，糖度对醋酸发酵的影响不大，在有酒精存在的情况下，醋酸杆菌会优先利用酒精进行生长繁殖，为了节约原料，糖度选择5.5％。 [0177] 3.4.2.pH值对醋酸发酵的影响 [0178] 醋酸杆菌适宜生长在偏酸性的环境中，适宜的发酵液pH值有利于菌体的形态和生物活性，有利于乙醇脱氢酶等酶系的活性，对醋酸发酵产物含量的提高有利。pH值对醋酸发酵效果影响的单因素试验结果见图6。 [0179] 由图6可知，pH值从4.5增加到5.5的同时总酸含量也明显上升，pH值从5.5增加到6.5时，总酸含量反而有所降低，偏酸性的环境不仅有利于醋酸杆菌活性，还有利于风味物质的保持。因此，发酵液pH选取pH5.5。 [0180] 3.4.3.酒精度对醋酸发酵的影响 [0181] 醋酸杆菌生长代谢是以酒精为原料基质，酒精度的高低直接影响了产酸量的多少。酒精度过低产酸量少；酒精度过高，大部分醋酸杆菌不耐高酒精度，抑制了醋酸杆菌活性，导致产酸量低。酒精度对醋酸发酵效果影响的单因素试验结果见图7。 [0182] 由图7可以看出，酒精度在3％～7％(v/v)时，随着酒精度的增加总酸含量急剧增加，从7％～11％(v/v)，随着酒精度的增加总酸含量反而减少，主要是由于醋酸杆菌不耐较高的酒精度，酒精度为7％(v/v)时总酸含量最高，达到4.1g/100mL，酒精度过高或过低时产酸含量都不高。酒精度为7％(v/v)左右醋酸发酵效果较好。为了使结论更准确，进一步选取5％、7％、9％(v/v)三个水平进行正交试验。 [0183] 3.4.4.接种量对醋酸发酵的影响 [0184] 醋酸杆菌是细菌，它的生长迟滞期比酵母菌长，接种量过小不仅容易污染杂菌，而且延长醋酸发酵周期；接种量过大，生长增殖迅速的醋酸杆菌将耗费较多营养物质，使得总酸含量降低。接种量对醋酸发酵效果影响的单因素试验结果见图8。 [0185] 由图8可知，接种量在4％～10％时，随着接种量的增大总酸含量逐渐上升，接种量在10％～16％时，随着接种量的增加总酸含量反而迅速下降。接种量为10％时醋酸发酵效果较好。为了使结论更准确，进一步选取7％、10％、13％三水平进行正交试验。 [0186] 3.4.5.装液量对醋酸发酵的影响 [0187] 醋酸杆菌是好氧菌，氧气不足时将抑制其活性影响生长代谢，当锥形瓶装液量过大时，锥形瓶内供氧空间不足，发酵液溶氧少，导致醋酸杆菌生长繁殖受到抑制；当锥形瓶装液量过少时，尽管锥形瓶供氧空间较大，但是由于发酵液少，溶氧量有限，同样抑制了醋酸杆菌的生长繁殖，并且装液量过少导致供氧空间太大，很容易进入杂菌污染发酵液。装液量对醋酸发酵效果影响的单因素试验结果见图9。 [0188] 由图9可知，装液量在25mL～75mL范围时，随着装液量的增大总酸含量上升明显，而装液量在75mL～125mL范围时，随着装液量的增加总酸含量反而下降，因此，装液量75mL时醋酸发酵效果较好。为了使结论更准确，进一步选取50mL、75mL、100mL三个水平进行正交试验。 [0189] 3.4.6.温度对醋酸发酵的影响 [0190] 温度和醋酸杆菌的生长代谢有着密切关系，当温度较低时，醋酸杆菌生长代谢较缓慢，延长了发酵周期，增加了污染杂菌的可能性；温度过高时，醋酸杆菌生长代谢旺盛，加速了菌体老化速度，并且发酵温度过高使生成的部分醋酸被氧化或挥发，导致总酸含量降低。温度对醋酸发酵效果影响的单因素试验结果见图10。 [0191] 由图10可知，温度在28℃～32℃范围时，随着温度的升高总酸含量急剧上升，温度在32℃～36℃范围时，随着温度的升高总酸含量反而下降，因此，32℃对醋酸发酵的效果较好。为了使结论更准确，进一步选取30℃、32℃、34℃进行三水平正交试验。 [0192] 3.4.7.醋酸发酵正交试验结果与分析 [0193] 为了确定甘蔗汁醋酸发酵最佳工艺条件，本实验对酒精度(A)、接种量(B)、装液量(C)、温度(D)进行四因素三水平正交试验。正交试验结果见表5。 [0194] 表5.甘蔗汁醋酸发酵正交试验结果 [0195] [0196] 由表5可以得知，影响甘蔗汁醋酸发酵效果的主次因素依次是RA＞RC＞RD＞RB，也就是酒精度＞装液量＞温度＞接种量，其中酒精度对醋酸发酵的影响最大，在一定范围内，酒精度的高低直接决定了总酸含量的多少。在正交表中通过对K值的比较，可以得出最佳组合是A2B2C2D2，即酒精度为7％(v/v)、接种量为10％、装液量为75mL、温度为32℃。 [0197] 3.4.8.甘蔗汁醋酸发酵最佳工艺的验证试验 [0198] 由于从实验中得出的最佳组合A2B2C2D2没有包括在9个正交试验中，为了使结论严谨，将正交表中的最佳组合A2B3C1D2和实验最佳组合A2B2C2D2做了验证试验，以总酸含量为指标，试验结果见表6。 [0199] 表6.验证试验结果 [0200] [0201] 由表6可知，实验最佳组合工艺产的醋酸含量比正交表中最佳组合工艺产的醋酸含量要高，因此，甘蔗汁醋酸发酵最佳工艺组合应该是A2B2C2D2，即酒精度7％(v/v)、接种量为10％、装液量为75mL、温度为32℃。 [0202] 3.4.9.甘蔗果醋质量评价 [0203] 甘蔗果醋的品质评价以及理化卫生测定结果见表7、表8、表9。 [0204] 表7.甘蔗果醋感官评价结果 [0205] [0206] 表8.甘蔗果醋理化指标检测结果 [0207] [0208] 表9.甘蔗果醋微生物指标检测结果 [0209] [0211] 实施例2 [0212] 一种葡萄味甘蔗果醋功能性饮料的制备方法，包括如下步骤： [0213] (1)制备甘蔗汁 [0214] 新鲜甘蔗压榨得到甘蔗汁； [0215] (2)酒精发酵 [0216] 使用蔗糖调节甘蔗汁的糖度至19％，使用柠檬酸和碳酸钙调节甘蔗汁的pH值至4.7，调节完毕后高温高压灭菌并冷却至室温，然后在无菌操作下接入发酵物料重量百分比 3.5％酿酒酵母，置于28℃条件下厌氧发酵4天，得到甘蔗果酒； [0217] (3)醋酸发酵 [0218] 使用蔗糖调节甘蔗果酒的糖度至6.5％，使用柠檬酸和碳酸钙调节甘蔗果酒的pH值至5.5，使用无菌水和酒精将甘蔗果酒的酒精度调节到7.5％(v/v)，调节完毕后进行巴氏灭菌并冷却至室温，然后无菌操作下接入发酵物料重量百分比11％醋酸杆菌，置于33℃的发酵5天，发酵结束后，先经过澄清处理，再经过高温瞬时灭菌处理，得到甘蔗果醋。 [0219] (4)调配 [0220] 按照以下组分及其重量百分比进行调配，甘蔗果醋0.5％，鲜榨葡萄汁5％，白砂糖6％，蜂蜜3.5％，枸杞、山楂叶和杜仲混合煎煮液5％，陈皮苷0.5％，果糖酸钙0.5％，水 55.5％，以上各组分的重量百分比总和为100％； [0221] 所述枸杞、山楂叶和杜仲混合煎煮液安装如下方法获得，按重量份数计，取枸杞2份、山楂叶15份和杜仲5份，添加8倍重量水，煎煮90min，弃渣取汁即得。 [0222] 实施例3 [0223] 一种葡萄味甘蔗果醋功能性饮料的制备方法，包括如下步骤： [0224] (1)制备甘蔗汁 [0225] 新鲜甘蔗压榨得到甘蔗汁； [0226] (2)酒精发酵 [0227] 使用蔗糖调节甘蔗汁的糖度至17％，使用柠檬酸和碳酸钙调节甘蔗汁的pH值至4.4，调节完毕后高温高压灭菌并冷却至室温，然后在无菌操作下接入发酵物料重量百分比 2.5％酿酒酵母，置于27℃条件下厌氧发酵3天，得到甘蔗果酒； [0228] (3)醋酸发酵 [0229] 使用蔗糖调节甘蔗果酒的糖度至5.5％，使用柠檬酸和碳酸钙调节甘蔗果酒的pH值至5.0，使用无菌水和酒精将甘蔗果酒的酒精度调节到6.5％(v/v)，调节完毕后进行巴氏灭菌并冷却至室温，然后无菌操作下接入发酵物料重量百分比9％醋酸杆菌，置于31℃的发酵4天，发酵结束后，先经过澄清处理，再经过高温瞬时灭菌处理，得到甘蔗果醋。 [0230] (4)调配 [0231] 按照以下组分及其重量百分比进行调配，甘蔗果醋2％，鲜榨葡萄汁10％，白砂糖10％，蜂蜜5.5％，枸杞、山楂叶和杜仲混合煎煮液15％，陈皮苷1％，果糖酸钙1％，水79％，以上各组分的重量百分比总和为100％。 [0232] 所述枸杞、山楂叶和杜仲混合煎煮液安装如下方法获得，按重量份数计，取枸杞1份、山楂叶10份和杜仲3份，添加6倍重量水，煎煮60min，弃渣取汁即得。 |
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