产气荚膜梭菌是引起包括坏死性肠炎，气性坏疽和食物中毒的各种疾 病的病原性细菌。产气荚膜梭菌主要是一种土壤微生物。产气荚膜梭菌是 一种重要的病原性厌氧菌。在体内有一些生境(例如，在肠道和口腔)通常是 缺氧的，其中可发现专性厌氧细菌是正常菌群的一部分。然而，引起损伤 位置供血减少的组织损伤或外伤可导致身体的其它部位变成缺氧的，然后 该缺氧位置可变成适合于诸如产气荚膜梭菌等专性厌氧菌定居。
动物肠道中存在产气荚膜梭菌可导致例如，坏死性肠炎，食物中毒和 生长迟缓。具体地说，家禽，特别是鸡(broiler chicken)的肠道存在产气荚膜 梭菌与诸如肠损害和坏死性肠炎的各种病症相联系，且可导致家禽生长显 著下降。
另外，产气荚膜梭菌是气性坏疽的病原体，它由组织损伤或外伤且因 此形成适合于诸如产气荚膜梭菌等专性厌氧菌定居的缺氧环境而造成。
总体上与病毒一样，噬菌体可分为具有RNA基因组(大多数为小的单链) 的噬菌体，具有小DNA基因组(一般小于10kb，大多数为单链)的噬菌体和 具有中到大型DNA基因组(30-200kb)的噬菌体。
噬菌体的基因聚集成早期和晚期基因。
在烈性噬菌体中，其产物为噬菌体DNA合成和宿主DNA裂解所必需 的基因，包括介导核苷酸新陈代谢的基因和组成复制复合体的蛋白质都是 感染后立即表达的。随着时间的延续，早期合成关闭且编码病毒体成份的 其它基因和裂解基因活化。早期基因的关闭在转录和翻译水平上都得以实 现。
在温和噬菌体中，噬菌体可进行溶原化，其中在感染时启动基因，导 致噬菌体整合进宿主基因组使得噬菌体以该方式间接繁殖。溶原性状态一 旦形成就相当稳定。损害溶原性细菌宿主的环境事件可引起溶原性状态破 坏并可触发整合噬菌体的裂解生活周期。此时，噬菌体启动可引起裂解生 活周期的基因(早期和晚期基因)。
在烈性和温和噬菌体中一旦表达晚期基因，就开始了装配病毒体的阶 段。分别产生头，尾，尾丝和可溶性蛋白催化的尾丝添加。头和尾一般首 先组合形成复合体，最后将尾丝添加到复合体上。
该周期的最后阶段是细胞裂解，将病毒体释放进介质中。裂解通常需 要两个基因产物：即溶菌素，它攻击坚硬的胞壁层中连接N-乙酰葡糖胺的 键；和成孔素(holin)，它在内膜上形成孔，允许溶菌素到达其底物。
因此，噬菌体溶菌素是噬菌体编码的细胞壁水解酶，它在噬菌体复制 的裂解周期中的晚期基因表达期间合成并通过细菌肽聚糖的降解介导从感 染细胞中释放后代病毒体。
EP 0 510 907公开了来自单核细胞增多性利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)噬菌体的溶菌素和基本上不含噬菌体本身的该溶菌素的配 制品，以及消灭单核细胞增多性利斯特氏菌(L.monocytogenes)的方法。尽管 EP 0 510 907还建议使用来自酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)噬菌体 的溶菌素，但是说明书没有显示如何获得该分离的溶菌素或其序列。
WO00/11472教导了使用蛋白质和/或酶的细胞壁结合结构域的检测方 法。
在本发明之前，对感染产气荚膜梭菌的噬菌体的裂解周期很少有研究。
本文使用的术语“细菌噬菌体”认为可与术语“噬菌体”互换。
发明简述
本发明的创新性发现是鉴定和测序编码溶菌素的核苷酸序列，该溶菌 素来自能够定居于病原性梭菌属细菌，特别是产气荚膜梭菌的噬菌体，以 及该溶菌素裂解病原性梭菌属细菌，特别是病原性产气荚膜梭菌细菌的用 途。

在一个方面，本发明涉及可从能够定居于产气荚膜梭菌的噬菌体获得 的溶菌素。优选，所述的溶菌素是基本上纯的形式。
本发明还涉及含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的基本纯的溶菌素或 其变体，同源物或衍生物。
在另一方面，本发明涉及含有编码包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列 的溶菌素的核苷酸序列的核酸或其变体，同源物或衍生物。
在另一方面，本发明涉及含有编码溶菌素的核苷酸序列的核酸或其变 体，同源物或衍生物，该核苷酸序列以SEQ ID No.1表示。
在另一方面，本发明涉及含有选自如下的核苷酸序列的核酸：
(a)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
(b)是SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的变体，同源物，衍生物或片段 的核苷酸序列；
(c)是SEQ ID No.1所示核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列；
(d)是SEQ ID No.1所示核苷酸序列的变体，同源物，衍生物或片段的 互补序列的核苷酸序列；
(e)能够与SEQ ID No.1所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
(f)能够与SEQ ID No.1所示核苷酸序列的变体，同源物，衍生物或片 段杂交的核苷酸序列；
(g)是能够与SEQ ID No.1所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列的互补序 列的核苷酸序列；
(h)是能够与SEQ ID No.1所示核苷酸序列的变体，同源物，衍生物或 片段杂交的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列；
(i)能够与SEQ ID No.1所示核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序 列；
(j)能够与SEQ ID No.1所示核苷酸序列的变体，同源物，衍生物或片 段的互补序列杂交的核苷酸序列；
(k)含有(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)，(i)，和/或(j)中任何一个 的核苷酸。
在另一方面，本发明涉及含有编码溶菌素的核苷酸序列的核酸，该核 苷酸序列选自由如下组成的组中：
(a)含有SEQ ID No.1所示序列的核苷酸序列；
(b)与在高度和/或中度严格条件下与SEQ ID No.1所示序列杂交的核 苷酸序列互补的核苷酸序列；和
(c)基于遗传密码简并性而与核苷酸序列SEQ ID No.1相关的核苷酸序 列。
在另一方面，本发明涉及从含有根据本发明的核苷酸序列的核酸表达 可获得或者已获得的基本上纯的溶菌素。
在另一方面，本发明提供了用含有编码根据本发明的溶菌素的核苷酸 序列的核酸转化的宿主。
EP 0 510 907公开了用表达单核细胞增多性利斯特氏菌噬菌体溶菌素 的方式转化的微生物宿主。EP 0 510 907的教导可适用于本发明。
本发明的另一方面提供了用含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核酸 或其变体，同源物或衍生物转化的宿主。
本发明还提供了从培养根据本发明的宿主产生的溶菌素。优选，该溶 菌素是基本上纯的形式。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，优选一种药用组合物，包含根 据本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序列的核 酸转化的宿主。
本发明还涉及根据本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌 素的核苷酸序列的核酸转化的宿主作为药物的用途。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本 发明的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主在制备治疗与病原性梭菌属 种类，优选与病原性产气荚膜梭菌相关的病症，疾病或症状的药物中的用 途。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本 发明的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主在制备治疗由家禽，优选鸡 肠道中的病原性梭菌属种类，优选病原性产气荚膜梭菌引起的体重增长下 降的药物中的用途。
在另一方面，本发明涉及含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或与其具 有至少80％同源性的氨基酸序列的基本上纯化形式的溶菌素在制备治疗由 家禽，优选鸡肠道中的病原性梭菌属种类，优选病原性产气荚膜梭菌引起 的体重增长下降的药物中的用途。
本发明还涉及一种药物，它含有根据本发明的溶菌素和/或用含有编码 根据本发明的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主。
本发明还涉及一种药物，它含有含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或 与其具有至少80％同源性的氨基酸序列的基本上纯化形式的溶菌素和/或用 含有编码包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的 氨基酸序列的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主。
在另一方面，本发明涉及治疗需要治疗的受试者的病症，疾病或症状 的方法，该方法包括给所述的受试者施用有效量的根据本发明的溶菌素和/ 或有效量的用含有编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿 主或者根据本发明的组合物。
在另一方面，本发明涉及治疗家禽，优选鸡的体重增长下降的方法， 该方法包括给所述的家禽施用有效量的根据本发明的溶菌素和/或有效量的 用含有编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主或者根据 本发明的组合物。
在另一方面，本发明涉及治疗家禽，优选鸡的体重增长下降的方法， 该方法包括给所述的家禽施用有效量的含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列 或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列的基本上纯化形式的溶菌素和/或 用含有编码包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列或与其具有至少80％同源性 的氨基酸序列的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主。
本发明还涉及包含一个或多个区室(compartments)的药物包，其中至少 一个区室包含一种或多种根据本发明的溶菌素和/或一种或多种用含有编码 根据本发明的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主或者根据本发明的组 合物。
本发明还涉及包含一个或多个区室的药物包，其中至少一个区室包含 一种或多种以基本上纯化形式的含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或与其 具有至少80％同源性的氨基酸序列的溶菌素和/或一种或多种用含有编码包 含SEQ ID No.2所示氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列 的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主。
在另一方面，本发明涉及制备药物组合物的方法，所述的方法包括将 一种或多种根据本发明的溶菌素和/或一种或多种用含有编码根据本发明的 溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主与可药用的稀释剂，赋形剂或载体 混合。
在另一方面，本发明涉及制备药物组合物的方法，所述的方法包括将 一种或多种以基本上纯化形式的含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或与其 具有至少80％同源性的氨基酸序列的溶菌素和/或一种或多种用含有编码包 含SEQ ID No.2所示氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列 的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主与可药用的稀释剂，赋形剂或载 体混合。
本发明还涉及消灭梭菌属的病原菌的方法，该方法包括用以基本上纯 化形式的含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的 氨基酸序列的溶菌素或含有所述溶菌素的组合物裂解病原性梭菌属细菌。
在另一方面，本发明还提供了含有一种核酸的表达载体，该核酸包含 根据本发明的核苷酸序列和与其相连的用于在合适的宿主中表达该编码序 列的调控区。
本发明还提供了根据本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶 菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主在制备用于治疗家禽生长病症的药物 中的用途，该生长病症由产气荚膜梭菌在家禽肠道或其局部定居引起。
本发明还提供了使用根据本发明的溶菌素或其模拟物为基础的诊断标 记检测样品中的病原性梭菌属细菌，优选产气荚膜梭菌的方法。
本发明还提供了使用含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或与其具有至 少80％同源性的氨基酸序列的溶菌素或其模拟物为基础的诊断标记检测样 品中的病原性梭菌属细菌，优选产气荚膜梭菌的方法。
本文使用的术语“基于”是指该诊断标记含有根据本发明的溶菌素或 其一部分。合适的是，可使用根据本发明的溶菌素的至少裂解部分和细胞 壁结合区部分。在这种情况下，其裂解部分可以是完全有功能的，即能够 裂解细菌细胞，或者可以通过修饰来改变和/或关闭溶菌素的该裂解功能。 修饰所述溶菌素的合适方法可以通过使用随机和/或定点诱变。合适的诊断 标记可仅包含溶菌素的细胞壁结合区部分或其片段。
诊断标记可包含容易鉴定的标记。合适的标记包括报道分子，包括在 本文题为“报道分子”部分详细描述的报道分子。该标记可直接或间接与 溶菌素或其部分结合。仅作为举例，合适的报道分子可包括荧光蛋白。报 道分子可与溶菌素或其部分直接或者间接偶连。
在细菌细胞被诊断标记裂解的情况下，可监测到一个或多个细菌细胞 的裂解。例如可通过光学方法监测该裂解。通过测量细菌细胞裂解释放的 细胞内成份可监测该裂解，例如可通过生物发光测量ATP的释放。
诊断标记可包含直接或间接附着到溶菌素或其部分上的固相(例如，但 不仅仅是，活化的聚苯乙烯，活化的玻璃，硅或玻璃样材料，活化的胶乳， 金或金化合物，各种铁磁性载体材料，疏水或带电荷的合成材料)。这样能 够与所述的溶菌素或其部分结合的细胞可以固定到所述的固相上。
根据本发明的检测方法的优点是它不是种特异性的，比产生抗梭菌属 细菌的抗体更容易，和/或容易完成结合和检测。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的溶菌素的细胞壁结合区部分 或其片段在给药中的用途。
在另一方面，本发明提供了筛选数据库中用于根据本发明的用途的替 代肽的方法，其中所述的方法包含使用SEQ ID No.2所示的氨基酸序列筛 选数据库，并选择与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同源的一个或多个氨 基酸序列。优选，该序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少80％ 的同源性。
在另一方面，本发明提供了修饰根据本发明的溶菌素以改变该溶菌素 对一种或多种细菌种类的裂解活性的方法。
可修饰根据本发明的溶菌素以便扩大该溶菌素对其有活性的细菌谱。 作为选择，可修饰该溶菌素以集中其对特异性细菌种类和/或菌株的活性； 换句话说，增强其宿主特异性。
为了便于引用，现在在合适的章节标题下讨论本发明的这些方面和其 它方面。然而，在各章节中的教导不必局限于各具体章节。
优选方面
优选，根据本发明的核酸是基本上纯的形式。
优选，根据本发明的核酸是分离的形式。
优选，含有根据本发明的核苷酸序列的核酸可从能够感染和/或定居产 气荚膜梭菌的噬菌体获得。
合适的是，根据本发明的核酸和/或溶菌素从能够感染和/或定居产气荚 膜梭菌的噬菌体获得。
优选，根据本发明的核酸从感染和/或定居于产气荚膜梭菌的噬菌体可 获得或者已获得。
优选，根据本发明的核酸和/或溶菌素从噬菌体φ3626或噬菌体φ8533可 获得或者已获得。
优选，根据本发明的药用组合物还含有可药用的稀释剂，赋形剂或载 体。
优选，该病症，疾病和/或症状是与病原性梭菌属种类，优选产气荚膜 梭菌相关的。
例如，合适的病症，疾病和/或症状包括例如，坏死性肠炎，气性坏疽， 食物中毒，肠损伤和体重增长下降等。
如上所述，与未感染的动物相比在某些动物，特别是家禽，例如鸡的 肠道中的梭菌属种类，特别是产气荚膜梭菌与在这些动物中生长潜力下降 相关。如果肠道中的细菌数超过阈值水平时该效果最显著。例如，该阈值 水平一般是大约106-108cfu/g。根据本发明的溶菌素和/或含有根据本发明的 溶菌素的宿主可用于治疗该生长潜力下降。换句话说，根据本发明的溶菌 素和/或含有根据本发明的溶菌素的宿主可用于控制动物，特别是家禽，例 如鸡的肠道中的细菌数，从而提高所述动物中的体重增长。在一个实施方 案中，根据本发明的溶菌素和/或含有根据本发明的溶菌素的宿主可完全消 除所述动物肠道中的所述细菌。在另一实施方案中，该溶菌素和/或宿主可 将所述的细菌数降低到阈值水平，即导致动物中体重增长降低的水平以下。
优选，根据本发明的宿主是微生物宿主。
优选，根据本发明的宿主是食品级(food-grade)的微生物。
优选，根据本发明的宿主是定居于肠道的生物体。
合适的是，该宿主可以是公认为安全(GRAS)的生物体，优选微生物。
优选，根据本发明的微生物宿主是来自下列属的一种或多种微生物： 埃希氏菌属(Escherichia)，乳杆菌属(Lactobacillus)，芽孢杆菌属(Bacillus)， 乳球菌属(Lactococcus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，片球菌属 (Pediococcus)。
在一个优选的方面，该微生物宿主是来自一个或多个下列种的细菌： 大肠杆菌(Escherichia coli)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，肉葡萄 球菌(Staphylococcus carnosus)或相关种类。
优选，在所述宿主中的核酸含有指导本发明的溶菌素编码序列通过宿 主细胞膜分泌的一个或多个信号序列。
优选，根据本发明的溶菌素是基本上纯化的形式。
优选，根据本发明的溶菌素是分离的形式。
优选，本文提及的梭菌属细菌属于产气荚膜梭菌种类。
优选，本文提及的梭菌属细菌在受试者肠道中。
合适的是，该梭菌属细菌可以在食品或饮料中。
合适的是，根据本发明的溶菌素可以是修饰的，例如通过随机或定点 诱变修饰的。
发明详述
尽管一般来说本文提及的任何分子技术都是本领域熟知的，但是尤其 可参考Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和 Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)，第4版，John Wiley & Sons，Inc.。
溶菌素
本文使用的术语“溶菌素”与术语“内溶菌素”同义。本文使用的术 语“溶菌素”是指能够裂解细胞的任何试剂，例如酶或毒素。
试剂
本文使用的术语“试剂”是指根据本发明的溶菌素和/或用含有编码根 据本发明的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主。
药物
本文使用的术语“药物”包含在人类和兽医医学中用于人类和动物用 途的药物。另外，本文使用的术语“药物”包括设计成掺入动物饲料，特 别是家禽饲料中的产品。
治疗
应认识到本文所有提及的治疗包括治愈性，缓解性和预防性治疗。
重组方法
一般来说本发明的核苷酸序列可通过重组DNA技术制备。
氨基酸序列
本文使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质” 同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些情 况下，术语“氨基酸序列”与术语“蛋白质”同义。
氨基酸序列可通过从合适的来源分离来制备或者可通过合成制备或者 可通过使用重组DNA技术制备。
在一个方面，本发明提供了一种氨基酸序列，它是能够水解病原性梭 菌属细菌，优选产气荚膜梭菌细菌细胞壁的溶菌素。
优选，该溶菌素包含SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其变体，衍生 物或同源物。
优选，该溶菌素是分离的溶菌素和/或是基本上分离的溶菌素和/或是纯 化的和/或是基本上纯化的和/或是非天然的。因此，该溶菌素可以是纯的或 基本上纯的形式。
应明白根据本发明的溶菌素可与不干扰溶菌素目的用途的载体或稀释 剂混合且仍然认为是纯的和/或分离的。
核苷酸序列
本文使用的术语“核苷酸序列”与术语“多核苷酸”同义。
核苷酸序列可以是基因组或合成或重组来源的DNA或RNA。核苷酸序 列可以是双链或单链，不论它代表有义或反义链或其组合。
对于某些应用，该核苷酸序列优选是DNA。
对于某些应用，该核苷酸序列优选通过使用重组DNA技术(例如，重组 DNA)制备。
对于某些应用，该核苷酸序列优选是cDNA。
对于某些应用，该核苷酸序列优选在该方面与天然存在的形式相同。
在本发明的一个方面，该核苷酸序列编码能够水解梭菌属细菌，优选 产气荚膜梭菌细菌的细胞壁的溶菌素。
技术人员会明白由于遗传密码的简并性许多不同的核苷酸序列可编码 相同的溶菌素。另外，技术人员应明白可使用常规技术产生基本上不影响 本发明的核苷酸序列编码的活性的核苷酸取代以反映表达该目的产物的任 一具体宿主生物的密码子习惯。因此，与所附序列表列出的核苷酸序列相 关的术语“变体”，“同源物”或“衍生物”包括对该序列的一个(或多个) 核苷酸的任何取代，变异，修饰，更换，缺失或添加，前提是所得的核苷 酸序列编码根据本发明的功能性溶菌素。
如上所述，对于序列同源性，优选与本文所示的SEQ ID No.1有至少 75％，更优选至少85％，更优选至少90％的同源性。更优选，有至少95 ％，更优选至少98％的同源性。核苷酸同源性比较可按下述进行。优选的 序列比较程序是上述的GCG Wisconsin Bestfit程序。默认的记分矩阵对于每 个相同的核苷酸匹配值为10且对于每个错配其值为-9。对于每个核苷酸， 默认的间隔产生罚分为-50，默认的间隔延长罚分为-3。
本发明还包含能够与本文序列，或其任何变体，片段或衍生物，或者 上述任一序列的互补序列选择性杂交的核苷酸序列。核苷酸序列优选至少 15个核苷酸长，更优选至少20，30，40或50个核苷酸长。这些序列可在 诸如诊断试剂盒等中用作探针。
变体/同源物/衍生物
除了本文提及的具体核苷酸和氨基酸序列和可从所述核苷酸序列得出 的氨基酸序列外，本发明还包含其变体，同源物和衍生物的使用。在此， 术语“同源性”可等同于“相同性”。
在本说明书中，采用同源性序列包括具有至少75，85，或90％相同性， 优选至少95或98％相同性的氨基酸序列或核苷酸序列。具体地说，同源性 一般应考虑已知对活性必需的序列区域。尽管同源性也可认为是相似性(即， 具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，但是在本发明说明书中，优选将同 源性表示为序列相同性。
在一个优选的方面，该变体，同源物或衍生物是与SEQ ID No.1具有 至少75，85或90％相同性，优选至少95或98％相同性的核苷酸序列。
在另一方面，该变体，同源物或衍生物是与SEQ ID No.1所示序列中 编码细胞壁结合区的片段具有至少75，85或90％相同性，优选至少95或 98％相同性的核苷酸序列。
在一个优选的方面，该变体，同源物或衍生物是与SEQ ID No.2所示 的氨基酸序列具有至少75，85或90％相同性，优选至少95或98％相同性 的氨基酸序列。
在另一方面，该变体，同源物或衍生物是与SEQ ID No.2所示序列的细 胞壁结合区具有至少75，85或90％相同性，优选至少95或98％相同性的 氨基酸序列。
同源性比较可通过眼观察，或者更常见的是借助于容易获得的序列比 较程序进行。这些商业上可获得的计算机程序可计算两个或多个序列之间 的同源性％。
同源性％可对连续的序列进行计算，即将一个序列与另一序列对位排列 (alignment)且将一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的相应氨基酸一次 一个残基地直接比较。这称为“无间隔的”对位排列。一般来说，该无间 隔的对位排列仅对较少数目的残基进行。
尽管这是非常简单和一致的方法，但是它不能考虑到例如，对于不完 全配对的序列，一个插入或缺失可引起随后的氨基酸残基不能进行对位排 列，因此在进行全局对位排列时可能导致同源性％大量降低。因此，大多 数序列比较方法设计成产生最佳对位排列，使得可能的插入和缺失不会过 分影响总体同源性得分。这点可通过在序列对位排列中插入“间隔”以使 得局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给在对位排列中出现的各间隔设定“间隔罚 分”以便对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少间隔的序列对位排列(反 映两个比较序列之间相关性更高)将比具有许多间隔的序列得到更高的记 分。一般使用“亲缘(Affine)间隔成本(gap cost)”使得存在一个间隔罚分较 高，而该间隔中各随后的残基罚分较低。这就是最常用的间隔记分系统。 高间隔罚分当然产生间隔更少的最优化对位排列。大多数对位排列程序允 许修改间隔罚分。然而，使用该软件进行序列比较时优选使用该默认值。 例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包(见下文)时，氨基酸序列的默认 间隔罚分为一个间隔是-12且每个延长(extention)为-4。
因此计算最大同源性％首先需要考虑间隔罚分后产生最佳的对位排 列。进行该对位排列的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包 (美国威斯康星大学；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12：387)。 可进行序列比较的其它软件的例子包括，但不限于，BLAST软件包(参见 Ausubel等，1999，出处同上，第18章)，FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.， 403-410)和GENEWORKS程序组的比较工具。BLAST和FASTA可用于脱 机和联机检索(参见Ausubel等，1999，出处同上，第7-58至7-60页)。然 而，优选使用GCG Bestfit程序。一种称为BLAST2 Sequences的新工具也 可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)： 247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih. gov)。
尽管最终的同源性％可按相同性测量，但是对位排列方法本身一般不 按照全或无(all or nothing)进行配对比较。相反，一般使用分级相似性记分 矩阵，根据化学相似性或进化距离给每对比较设定得分。常用的该矩阵的 一个例子是BLOSUM62矩阵，即BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin 程序一般使用公开的默认值或者如果提供了的话使用定制的符号比较表(详 情参见用户手册)。对于GCG软件包优选使用公开的默认值，或者对于其它 软件，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。
一旦该软件产生了最佳对位排列，可计算同源性％，优选序列相同性 ％。该软件一般将这点作为序列比较的一部分且产生一个数值结果。
该序列也可具有产生沉默改变并产生一个功能上相当的物质的氨基酸 残基缺失，插入或取代。根据残基的极性，电荷，可溶性，疏水性，亲水 性，和/或两亲性特性可作出有意的氨基酸取代，前提是保留该物质的二级 结合活性。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的 氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的具有不带电荷的极性头 部基团的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬 酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸，和酪氨酸。
例如，可按照下表作出保守取代。在第二列同一行中且优选在第三列 同一行中的氨基酸可进行互相取代：   脂肪族   非极性   GAP   ILV   极性-不带电荷   CSTM   NQ   极性-带电荷   DE   KR   芳香族   HFWY
本发明还包含可发生同源性取代(取代和代替在本文中都用于指已有氨 基酸残基用另一残基交换)，即相似取代相似，例如碱性取代碱性，酸性取 代酸性，极性取代极性等。也可发生非同源性取代，即从一类残基取代成 另一类残基或者任选涉及包含非天然氨基酸，例如鸟氨酸(下文称为Z)，二 氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)，正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)，pyriylalanine， 噻吩丙氨酸，萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
取代也可用非天然氨基酸进行，该非天然氨基酸包括：α*和α-二取代* 的氨基酸，N-烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的卤化衍生物，例如三氟 酪氨酸*，对-Cl-苯丙氨酸*，对-Br-苯丙氨酸*，对-I-苯丙氨酸*，L-丙烯基- 甘氨酸*，β-丙氨酸*，L-α-氨基丁酸*，L-γ-氨基丁酸*，L-α-氨基异丁酸*， L-ε-氨基己酸#，7-氨基庚酸*，L-甲硫氨酸砜#*，L-正亮氨酸*，L-正缬氨 酸*，对-硝基-L-苯丙氨酸*，L-羟脯氨酸#，L-硫代脯氨酸*，苯丙氨酸(Phe)的 甲基衍生物，例如4-甲基-Phe*，五甲基-Phe*，L-Phe(4-氨基)#，L-Tyr(甲基)*， L-Phe(4-异丙基)*，L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*，L-二氨基丙酸#和 L-Phe(4-苄基)*。对于上文讨论的论题(涉及同源性或非同源性取代)，使用 符号*表示衍生物的疏水特性，使用#表示衍生物的亲水特性，#*表示两亲性 特性。
变异氨基酸序列可包括插入该序列的任何两个氨基酸残基之间的合适 的间隔区基团，除了诸如甘氨酸或β-丙氨酸残基的氨基酸间隔区外还包括 诸如甲基，乙基或丙基基团等烷基基团。另一变异形式包括存在类肽形式 的一个或多个氨基酸残基，它是本领域的技术人员熟知的。为避免疑问， “类肽形式”用于指变异氨基酸残基，其中α-碳取代基团在该残基的氮原 子上而不是在α-碳上。制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如参 见Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
杂交
本文使用的术语“杂交”包括“核苷酸序列的一条链与互补链通过碱 基配对结合的方法”以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增方法。
能够与本文提供的核苷酸序列或与其互补序列选择性杂交的本发明的 核苷酸序列与本文提供的相应互补核苷酸序列在至少20，优选至少25或 30，例如至少40，60或100或更多个连续核苷酸的区域内一般具有至少75 ％，优选至少85％或90％且更优选至少95％或98％的同源性。
术语“可选择性杂交的”是指用作探针时该核苷酸序列在在这样的条 件下使用，即在该条件下发现靶核苷酸序列以明显高于背景的水平与该探 针杂交。由于在例如，筛选的cDNA或基因组DNA文库中存在其它核苷酸 序列，因此可发生背景杂交。在该事件中，背景是指该探针和文库中的非 特异性DNA成员之间相互作用产生的信号水平，它比用靶DNA观察到的 特异性相互作用的强度低10倍，优选低100倍。该相互作用的强度可通过 例如，用诸如32P放射性标记该探针进行测量。
杂交条件按Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA) 中的教导以核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)为基础，且提供按下文说明 限定的“严格条件”。
最高严格条件一般在大约Tm-5℃下发生(该探针的Tm下5℃)；高度严 格条件在Tm下大约5℃至10℃；中等严格条件在Tm下大约10℃至20℃； 低度严格条件在Tm下大约20℃至25℃。正如本领域技术人员的理解，可 使用最高严格杂交来鉴定或检测相同的核苷酸序列，而可使用中等(或低度) 严格杂交来鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
在一个优选的方面，根据本发明的变体，同源物或衍生物在高度严格 和/或中等严格条件下与SEQ ID No 1所示的核苷酸序列杂交。
在另一方面，根据本发明的变体，同源物或衍生物能够与SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列或与其互补序列在高度严格和/或中等严格条件下选择性 地杂交，且在至少20，优选至少25或30，例如至少40，60或100或更多 个连续核苷酸的区域内与相应互补的核苷酸序列SEQ ID No.1一般具有至 少75％，优选至少85或90％且更优选至少95％或98％的同源性。
在一个优选方面，本发明包含在严格条件下(例如，65℃和 0.1×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0))能与本发明 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。如果本发明的核苷酸序列是双链，则本 发明包含单独的或结合的该双螺旋的两条链。如果该核苷酸序列是单链， 应明白该核苷酸序列的互补序列也包含在本发明的范围内。
以许多种方式可获得与本发明的序列不是100％同源但落在本发明范 围内的核苷酸序列。本文所述序列的其它变体可通过例如探测从各种来源 制备的DNA文库来获得。另外，可获得其它病毒/细菌，或细胞同源物，特 别是在哺乳动物细胞(例如，大鼠，小鼠，牛和灵长类细胞)中发现的细胞同 源物且该同源物及其片段一般能够与本文序列表中所示的序列选择性杂 交。该序列可通过探测从其它动物种类制备的cDNA文库或基因组DNA文 库，并用含有全长或部分本文所列核苷酸序列的探针在中等到高度严格条 件下探测该文库来获得。类似的考虑可应用于获得本发明的氨基酸和/或核 苷酸序列的种同源物和等位基因变体。
变体和菌株/种同源物也可使用简并PCR获得，其中使用的引物设计成 靶向变体和同源物内编码本发明序列内的保守氨基酸序列的序列。保守序 列可通过例如，对位排列几个变体/同源物的氨基酸序列来推测。序列对位 排列可使用本领域已知的计算机软件进行。例如，GCG Wisconsin PileUp程 序是广泛使用的。简并PCR中使用的引物含有一个或多个简并位置且在比 用针对已知序列的单一序列引物克隆序列中所用的条件更低的严格条件下 使用。
作为选择，通过定点诱变鉴定的序列，例如本发明序列表中SEQ ID No 1所示的核苷酸序列可获得该核苷酸序列。它可用于这样的情况下，即例如， 需要对序列进行沉默密码子改变以优化对将要表达该核苷酸序列的特定宿 主细胞的密码子偏好。为了导入限制性酶识别位点，或者改变该核苷酸序 列编码的蛋白质活性，可能需要其它的序列改变。
本发明的核苷酸序列可用于产生引物，例如，PCR引物，用于其它扩 增反应的引物，探针，例如使用放射性或非放射性标记通过常规方法用显 示性标记物标记的探针，或者该核苷酸序列可克隆进载体中。该引物，探 针和其它片段为至少15，优选至少20，例如至少25，30或40个核苷酸长， 且也包含在本文使用的术语本发明的核苷酸序列中。
诸如根据本发明的DNA多核苷酸和探针等核苷酸序列可通过重组，合 成，或者通过本领域的技术人员可获得的任何方法产生。它们也可通过标 准技术克隆。
一般来说，引物通过合成方法产生，它包含一次一个核苷酸逐步制备 所需核苷酸序列的方法。使用自动合成技术实现这点的技术是本领域容易 获得的。
更长的核苷酸序列一般使用重组方法产生，例如，使用PCR(聚合酶链 式反应)克隆技术产生。它包括制备需要克隆的靶序列侧翼区域的引物对(例 如，具有大约15到30个核苷酸)，使得该引物与从动物或人细胞获得的 mRNA或cDNA接触，在导致所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应 (PCR)，分离该扩增的片段(例如，通过在琼脂糖凝胶上纯化该反应混合物) 并回收该扩增的DNA。该引物可设计成含有合适的限制性酶识别位点以便 可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。
由于遗传密码的内在简并性，可使用编码基本上相同或功能上相当的 氨基酸序列的其它DNA序列克隆并表达该靶序列。本领域的技术人员应明 白，对于某些表达系统，用非天然存在的密码子生产该靶序列可能具有优 势。例如，可选择具体原核或真核宿主优选的密码子(Murray E等(1989)Nuc Acids Res 17：477-508)以增强靶表达率或者产生具有所需特性，例如比天然 存在的序列产生的转录子具有更长半寿期的重组RNA转录子。
基本上纯的形式和/或分离的形式
优选，根据本发明的溶菌素或含有编码它的核苷酸序列的核苷酸是基 本上纯化的形式或是分离的形式。
术语“基本上纯化的形式”用于表示该成份，例如根据本发明的溶菌 素和/或含有根据本发明的核苷酸序列的核苷酸以高水平存在。该成份，即 根据本发明的溶菌素和/或含有编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序列的核 苷酸需要是组合物中存在的主要成分。优选，它以超过30％，超过50％， 超过75％，超过90％，或甚至超过95％的水平存在，所述的水平按干重/所 考虑的总组合物干重来测定。
在极高的水平下(例如，在超过90％，超过95％或超过99％的水平下)， 该成份可认为是“分离的”。本发明的生物学活性物质(包括多肽，核酸分子， 通过筛选鉴定的/可鉴定的半分子，等)以基本上不含可能与该物质结合的一 种或多种污染物的形式提供。因此，例如，它们可以基本上不含一种或多 种可能的污染多肽和/或核酸分子。它们可以基本上不合其它细胞成份(例如 细胞膜，细胞质的成份，等)的形式提供。当组合物基本上不合给定的污染 物时，该污染物以低水平存在(例如，按上述的干重/干重以不超过10％，不 超过5％或不超过1％的水平存在)。
可药用的盐
根据本发明的溶菌素可以是可药用的盐(例如加酸盐或碱性盐)或包括 其水合物的其溶剂化物的形式和/或以该形式给药。合适的盐的综述参见 Berge等，J.Pharm.Sci.，1977， 66，1-19。
一般来说，可药用的盐如果合适可通过使用所需的酸或碱轻易地制备。 该盐可从溶液中沉淀并通过过滤收集或者通过蒸发溶剂回收。
合适的加酸盐从形成无毒盐的酸形成，其例子有盐酸盐，氢溴酸盐， 氢碘酸盐，硫酸盐，重硫酸盐，硝酸盐，磷酸盐，磷酸氢盐，乙酸盐，马 来酸盐，延胡索酸盐，乳酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，葡萄糖酸盐，琥珀 酸盐，蔗糖盐，苯甲酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸 盐和双羟萘酸盐(pamoate)。
合适的碱性盐从形成无毒盐的碱形成，其例子有钠，钾，铝，钙，镁， 锌，二羟胺(diolamine)，羟胺(olamine)，乙二胺，氨丁三醇，胆碱，megulamine 和二乙醇胺盐。合适的药用盐的综述参见Berge等，J.Pharm.Sci.，66，1-19 (1977)；Gould P.L.，International J.of Pharmaceutics，33(1986)，201-217；和 Bighley等，Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology，Marcel Dekker Inc.， New York(1996)，第13卷，第453-497页。
本发明的化合物，即溶菌素的可药用的溶剂化物包括其水合物。
在下文中，在本发明的任一方面(除了化学过程中的中间体化合物)限定 的化合物，包括根据本发明的溶菌素或用含有编码根据本发明的溶菌素的 核苷酸序列的核酸转化的宿主，其可药用的盐，其溶剂化物和多态型，都 称为“本发明的化合物”或“本发明的试剂”。
多态性形式/不对称碳
诸如溶菌素等试剂可以多态性形式存在。
该试剂可含有一个或多个不对称碳原子，因此以两种或多种立体异构 形式存在。如果试剂含有链烯基(alkenyl)或亚烯基(alkenylene)，还可能存在 顺式(E)和反式(Z)异构现象。本发明包括该试剂的单个立体异构体，且如果 合适，还包括其单个互变异构形式，及其混合物。
非对映异构体或顺式及反式异构体的分离可通过常规技术完成，例如 通过对该试剂或其合适的盐或衍生物进行分级结晶，色谱法或H.P.L.C.完 成。从相应的光学上纯的中间体或者通过拆分(resoluteion)，例如适当地使 用合适的手性载体对相应的消旋体进行H.P.L.C.，或者通过对相应的外消 旋体与合适的光学活性酸或碱反应形成的非对映异构盐进行分级结晶也可 制备该试剂的单个对映体。
同位素变体
本发明还包含溶菌素或其可药用的盐的所有合适的同位素变体。本发 明的溶菌素或其可药用的盐的同位素变体定义为至少一个原子被具有相同 原子序数但原子质量不同于通常在自然界发现的该原子质量的原子取代的 变体。可掺入该试剂或其可药用的盐中的同位素的例子包括氢，碳，氮， 氧，磷，硫，氟和氯的同位素，分别例如2H，3H，13C，14C，15N，17O，18O， 31P，32P，35S，18F和36Cl。该试剂及其可药用的盐的某些同位素变体，例如， 掺入了诸如3H或14C的放射性同位素在药物和/或底物的组织分布研究中是 有用的。同位素氚，即3H，和碳-14，即14C是特别优选的，因为它们容易 制备和能够检测。另外，用诸如氘，即，2H等同位素取代由于代谢更稳定 可产生某些治疗优势，例如体内半寿期增加或剂量需求降低，且因此在某 些情况下可能是优选的。溶菌素及其可药用的盐的同位素变体一般可使用 合适试剂的适当同位素变体通过常规方法来制备。
前药(Prodrugs)
本领域的技术人员将预料到本发明的溶菌素可由前药产生。前药的例 子包括具有某些保护基团的实体，它本身不具有这种药理学活性，但是在 某些情况下，给药(例如通过口服或肠胃外途径)后在体内代谢形成具有药理 学活性的试剂。
本发明化合物的所有保护的衍生物和前药都包括在本发明的范围内。
前体半分子(Pro-Moieties)
还可预料到称为“前体半分子”的某些半分子，例如在H.Bundgaard， Elsevier所著的“前药的设计”，1985(本文引用其公开内容以供参考)中所述， 可赋予该试剂合适的功能。该前药也包括在本发明的范围内。
药用组合物
本发明还提供了一种药用组合物，它含有治疗有效量的本发明的试剂， 即根据本发明的溶菌素，和可药用的载体，稀释剂或赋形剂(包括其组合)。
该药用组合物可以在人类和兽医医学中用于人类或动物用途且一般包 含任意一种或多种可药用的稀释剂，载体，或赋形剂。在一个优选的实施 方案中，该药用组合物可用于家禽，特别是鸡。用于治疗用途的可接受的 载体或稀释剂是制药领域熟知的，且在例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中描述。药用载体，赋 形剂或稀释剂的选择可根据计划的给药途径和标准制药惯例来选择。该药 用组合物可包含作为载体，赋形剂或稀释剂的或者除此之外的任何合适的 粘合剂，润滑剂，悬浮剂，包衣剂，助溶剂。
在该药用组合物中可提供防腐剂，稳定剂，染料和甚至调味剂。防腐 剂的例子包括苯甲酸钠，山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。也可使用抗氧化剂 和悬浮剂。
根据不同的给药系统有不同的组合物/剂型要求。作为例子，本发明的 药用组合物可配制成使用微型泵给药或者通过粘膜途径，例如作为用于吸 入的鼻内喷雾剂和气溶胶或者可吞食的溶液，或者通过肠胃外给药，在肠 胃外途径中，该组合物配制成可注射形式用于通过例如，静脉内，肌肉内 或皮下途径给药。作为选择，该剂型可设计成通过两种途径给药。
如果该试剂通过胃肠粘膜进行粘膜给药，则在通过胃肠道运输期间它 应当能够保持稳定；例如，应当对蛋白水解降解有抗性，在酸性pH下稳定 且对胆汁的去污效应具有抗性。
如果合适，该药用组合物可以通过吸入给药，采用栓剂或阴道栓的形 式，一般采用洗剂，溶液，乳膏，软膏或撒布粉末的形式，通过使用皮肤 贴片局部给药，采用含有诸如淀粉或乳糖等赋形剂的片剂形式，或采用单 独或与赋形剂混合的胶囊或卵状体，或者采用含有调味剂或染色剂的酏剂， 溶液或悬液的形式口服，或者它们可通过肠胃外注射，例如，静脉内，肌 肉内，或皮下注射。对于肠胃外给药，该组合物最好以含有其它物质，例 如足够的盐或单糖以使得该溶液与血液等渗的无菌水溶液的形式使用。对 于口腔或舌下给药，该组合物可按常规方式配制成片剂或锭剂的形式。
对于一些实施方案，本发明的试剂也可与环糊精组合使用。已知环糊 精可与药物分子形成包涵和非包涵络合物。药物-环糊精络合物的形成可修 饰药物分子的溶解度，溶解率，生物可利用率和/或药物分子的稳定性特性。 药物-环糊精络合物一般用于大多数剂型和给药途径。作为对与药物直接络 合的替代，环糊精可用作辅助添加剂，例如，作为载体，稀释剂或助溶剂。 α-，β-和γ-环糊精是最常用的且合适的例子在WO-A-91/11172， WO-A-94/02518和WO-A-98/55148中描述。
在优选的实施方案中，本发明的试剂可全身性给药(例如口服，颊面 (buccally)，舌下)，更优选口服。
因此，优选的是该试剂是适合于口服给药的形式。
给药
术语“给药”包括通过病毒或非病毒技术传递。病毒传递机制包括但 不限于腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体，疱疹病毒载体，逆转录病毒载 体，慢病毒载体，和杆状病毒载体。非病毒传递机制包括脂类介导的转染， 脂质体，免疫脂质体，脂转染剂，阳离子表面两亲物(CFAs)及其组合。
本发明的试剂，即本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌 素的核苷酸序列的核酸转化的宿主可单独给药，但是一般作为药用组合物， 例如将该试剂与根据计划的给药途径和标准制药惯例选择的合适的药用赋 形剂，稀释剂或载体混合时给药。
例如，该试剂以可含有调味剂或染色剂的片剂，胶囊，卵状体，酏剂， 溶液或悬液的形式给药(例如，口服或局部)用于立即-，延迟-，改良-，持久 -，脉冲-或受控-释放应用。
该片剂可含有诸如微晶纤维素，乳糖，柠檬酸钠，碳酸钙，磷酸氢钙 和甘氨酸等赋形剂，诸如淀粉(优选玉米，马铃薯或木薯淀粉)，淀粉乙醇酸 钠(sodium starch glycolate)，交联甲羧纤维素钠(croscarmellose sodium)和某些 硅酸盐络合物等崩解剂，和诸如聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素 (HPMC)，羟丙基纤维素(HPC)，蔗糖，明胶和阿拉伯胶等制粒粘合剂。另 外，可包括诸如硬脂酸镁，硬脂酸，甘油榆树酸酯和滑石等润滑剂。
也可采用相似类型的固体组合物作为明胶胶囊的填充剂。在这方面优 选的赋形剂包括乳糖，淀粉，纤维素，奶糖或高分子量聚乙二醇。对于含 水悬液和/或酏剂，该试剂可与各种甜味剂或调味剂，染色物质或染料，与 乳化和/或悬浮剂及与诸如水，乙醇，丙二醇和甘油，及其组合进行混合。
该试剂，即本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌素的核 苷酸序列的核酸转化的宿主可在动物饲料或草料中给药，或者作为动物饲 料或草料的添加剂。具体地说，本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发 明的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主可掺入或加入家禽饲料中。
给药(递送)途径包括，但不限于下列一种或多种途径：口服(例如，作 为片剂，胶囊，或者作为可吞食的溶液)，局部，粘膜(例如，作为鼻内喷雾 或吸入的气溶胶)，鼻内，肠胃外(例如，通过可注射的形式)，胃肠，脊柱 内，腹膜内，肌肉内，静脉内，子宫内，眼内，真皮内，颅内，气管内， 阴道内，大脑室内，大脑内，皮下，眼用(包括玻璃体内或眼房内)，经皮肤， 直肠，口腔，阴茎，阴道，硬膜外，舌下。
应明白根据本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌素的核 苷酸序列的核酸转化的宿主不必以相同的途径给药。同样，如果该组合物 包含一种以上活性成份，那么这些成份可通过不同的途径给药。
如果本发明的试剂以肠胃外给药，那么该给药的例子包括一种或多种 下列途径：静脉内，动脉内，腹膜内，鞘内，心室内，尿道内，胸骨内， 颅内，肌肉内或皮下施用该试剂；和/或通过使用输注技术。
对于肠胃外给药，该试剂最好以含有其它物质，例如足够的盐或葡萄 糖以使得该溶液与血液等渗的无菌水溶液的形式使用。如果需要，该水溶 液应适当缓冲(优选pH从3到9)。通过本领域的技术人员熟知的标准制药 技术容易实现在无菌条件下制备合适的肠胃外剂型。
正如所述，本发明的试剂可以鼻内给药或吸入给药，采用干粉吸入剂 或由合适推进剂从加压容器，泵，喷雾器或雾化器中送出的气溶胶喷雾形 式便于运送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷， 诸如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA134ATM)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA227EATM) 等氟代烷烃，二氧化碳或其它合适的气体。对于加压气溶胶，通过装备定 量给药的阀门可测定剂量单位。加压容器，泵，喷雾器或雾化器可含有活 性化合物的溶液或悬液，例如，使用乙醇和推进剂作为溶剂的混合物，另 外它可含有润滑剂，例如山梨聚糖三油酸酯。用于吸入器或吹入器的药舱 和药筒(例如由明胶制成)可配制成含有该试剂和诸如乳糖或淀粉等合适粉 末基质的粉末混合物。
作为选择，本发明的试剂可以栓剂或阴道栓的形式给药，或者可以凝 胶，水凝胶，洗剂，溶液，乳膏，软膏或撒布粉末的形式局部使用。本发 明的试剂也可在皮肤上或者经皮肤给药，例如，通过使用皮肤贴片。它们 也可通过肺部或直肠途径给药。它们还可通过眼途径给药。对于眼科用途， 该化合物可配制成在等渗，调节过pH的无菌盐水中的微粉化悬液，或者优 选配制成在等渗，调节过pH的无菌盐水中的溶液，任选与诸如苯扎氯铵 (benzylalkonium chloride)等防腐剂混合。作为选择，它们可配制成诸如凡士 林等软膏。
对于皮肤的局部应用，本发明的试剂可配制成合适的软膏，它含有悬 浮于或溶解于例如混合物中的活性化合物，该混合物含有下列一种或多种 成份：矿物油，液态凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯化合 物，乳化蜡和水。作为选择，它可配制成悬浮于或溶解于例如，一种混合 物中的合适的洗剂或乳膏，该混合物含有下列一种或多种成份：矿物油， 山梨聚糖一硬脂酸酯，聚乙二醇，液体石蜡，聚山梨醇酯60，鯨蜡酯蜡， cetearyl alcohol，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。
本发明的组合物可通过直接注射给药。
对于一些应用，该试剂优选口服给药。
剂量水平
一般来说，医师或兽医医师会测定最适合于个体受试者的实际剂量。 对于任一具体受试者的具体剂量水平和给药频率可能会有变化且依赖于各 种因素，包括使用的具体化合物的活性，该化合物的代谢稳定性和作用的 时间长度，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食，给药的方式和时间， 排泄率，药物组合，具体症状的严重性，和受试者进行的治疗。本发明的 试剂和/或药用组合物可按每天1至10次的方案给药，例如每天一次或两次。
对于人或动物的口服和肠胃外给药，该试剂的每日剂量水平可以是单 次或分开的剂量。
根据需要，该试剂可按从0.01到30mg/kg体重，例如从0.1到10mg/kg， 更优选从0.1到1mg/kg体重的剂量给药。实际上，本文提及的剂量是举例 性的平均情况。当然也存在采用更高或更低剂量范围的个体情况。
一般来说，每天的口服剂量可以是例如，20-1000mg之间，例如优选 50-300mg。
合适的剂量包括使得梭菌属病原菌，特别是产气荚膜梭菌的数量治疗 性降低的剂量。
剂型
本发明的试剂可通过例如，与一种或多种合适的载体，稀释剂或赋形 剂混合，通过使用本领域已知的技术配制成药用组合物。
受试者
本文使用的术语“受试者”是指脊椎动物，特别是哺乳动物种类的成 员。该术语包括但不限于驯养动物，运动场动物，农业家畜，灵长类和人。 术语“农业家畜”包括家禽，例如鸡。
生物可利用率
优选，本发明的化合物(和组合)是口服可生物利用的。口服生物可利用 率是指口服给药的药物到达系统循环的比例。决定药物的口服生物可利用 率的因素是溶解作用，膜透性和代谢稳定性。一般来说，使用先在体外然 后在体内的筛选级联技术可测定口服生物可利用率。
溶解作用，胃肠道(GIT)含水成份对该药物的溶解，可通过在模拟GIT 的合适pH进行体外溶解实验来推测。优选，本发明化合物的最小溶解度为 50mcg/ml。溶解度可通过本领域已知的标准方法测定，例如在Adv.Drug Deliv.Rev.23，3-25，1997中所述的方法。
膜透性是指该化合物对GIT细胞的穿透。亲油性是判定膜透性的关键 特征且可通过使用有机溶剂和缓冲液测量体外Log D7.4来确定。优选，本发 明化合物的LogD7.4为-2至+4，更优选-1至+2。log D可通过本领域已知的 标准方法来测定，例如，在J.Pharm.Pharmacol.1990，42：144中所述的方法。
实质性增加细胞单层试验如CaCO2，来预测在诸如p-糖蛋白等流出运 载蛋白存在下优选膜(favourable membrane)的透性，即所谓的caco-2通量 (flux)。优选，本发明的化合物具有高于2×10-6cms-1的caco-2通量，更优选 高于5×10-6cms-1。caco通量可通过本领域已知的标准方法来测定，例如按 J.Pharm.Sci，1990，79，595-600所述的方法。
代谢稳定性描述了在吸收过程期间GIT或肝脏代谢化合物的能力：即 最初通过效应(the first pass effect)。诸如微粒体，肝细胞等的测定系统可预 测代谢倾向。优选，本发明的试剂在测定系统中表现出代谢稳定性，与不 超过0.5倍的肝提取值相当。测定系统和数据处理的例子在Curr.Opin.Drug Disc.Devel.，201，4，36-44，Drug Met.Disp.，2000，28，1518-1523中描述。
由于上述过程的相互影响，进一步支持了药物在人体中是口服可生物 利用的，这可通过体内动物实验获得。通过口服途径单独或以混合物施用 该试剂可在这些实验中测定绝对生物可利用率。对于绝对测定值(吸收％)， 也可采用静脉内途径。评估动物口服生物可利用率的例子可参见Drug Met. Disp.，2001，29，82-87；J.Med Chem，1997，40，827-829，Drug Met.Disp.，1999， 27，221-226。
化学合成方法
根据本发明的溶菌素可通过化学合成技术制备。
使用化学方法合成整体或部分该试剂可生产该溶菌素或其变体，同源 物，衍生物，片段或模拟物。例如，通过固相技术合成该肽，从树脂上裂 解下来，并通过制备型高效液相色谱纯化(例如，Creighton(1983)Proteins Structures And Molecular Principles，WH Freeman and Co，New York NY)。通过 氨基酸分析或测序(例如，Edman降解法；Creighton，出处同上)可证实该合 成肽的组成。
该溶菌素或其变体，同源物，衍生物，片段或模拟物的直接合成可使 用各种固相技术(Roberge JY等(1995)Science 269：202-204)进行和使用例 如，ABI 43 1A肽合成仪(Perkin Elmer)按照厂商提供的说明书可实现自动合 成。另外，在直接合成期间可改变该试剂或其任一部分包含的氨基酸序列 和/或使用化学方法与来自其它亚基或其任一部分的序列结合以产生变体试 剂。
在本发明的另一实施方案中，可使用本领域熟知的化学方法整体或部 分合成该溶菌素或其变体，同源物，衍生物，片段或类似物的编码序列(参 见Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23，Horn T等(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
模拟物
本文使用的术语“模拟物”涉及任一化学品，包括，但不限于，肽， 多肽，抗体或与对照化学试剂具有相同定性活性或效应的其它有机化学品。 即模拟物可以是已知试剂的功能等价物。
化学衍生物
本文使用的术语“衍生物”或“衍生化”包括对试剂的化学修饰。该 化学修饰的例证是用卤素基团，烷基基团，酰基基团或氨基基团取代氢。
化学修饰
在本发明的一个实施方案中，该溶菌素可以是化学修饰的溶菌素。
溶菌素的化学修饰可增强或降低氢键相互作用，电荷相互作用，疏水 相互作用，范德华相互作用或该试剂与靶之间的偶极相互作用。
在一个方面，该鉴定的溶菌素可用作开发其它化合物的模型(例如，模 板)。
载体
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的溶菌素可给受试者直接给 药。
在本发明的另一方面，可给受试者施用一种含有核酸的载体，该核酸 包含编码本发明的溶菌素的核苷酸序列。
优选，使用遗传载体制备该重组试剂和/或将其传递到靶位点。
正如本领域熟知的，载体是允许或帮助一种实体从一种环境转移到另 一环境的工具。根据本发明，作为例子，在重组DNA技术中使用的一些载 体允许诸如DNA片段等实体(例如异源性DNA片段，异源性cDNA片段) 转移进宿主和/或靶细胞用于复制含有本发明核苷酸序列的载体和/或表达 由本发明的核苷酸序列编码的本发明蛋白质。重组DNA技术中使用的载体 的例子包括但不限于质粒，染色体，人工染色体或病毒。
术语“载体”包括表达载体和/或转化载体。
术语“表达载体”是指能够体内或体外/离体表达的构建体。
术语“转化载体”是指能够从一个物种转移到另一个物种的构建体。
裸DNA
含有编码本发明溶菌素的核苷酸序列的载体可直接作为“裸核酸构建 体”给药，该载体优选还含有与宿主细胞基因组同源的侧翼序列。
本文使用的术语“裸DNA”是指含有编码本发明试剂的核苷酸序列以 及控制其生产的短启动子区的质粒。它称为“裸”DNA是因为该质粒不在 任何传递载体中携带。当该DNA质粒进入宿主细胞，例如真核或原核细胞 时，它编码的蛋白质(例如本发明的试剂)在该细胞内转录并翻译。
非病毒传递
另外，含有本发明核苷酸序列的载体或本发明的溶菌素可使用诸如转 染，转化，电穿孔和基因枪(biolistic)转化等本领域已知的各种非病毒技术导 入合适的宿主细胞中。
本文使用的术语“转染”是指使用非病毒载体将基因传递进靶哺乳动 物细胞的过程。
典型的转染方法包括电穿孔，DNA基因枪，脂类介导的转染，致密DNA 介导的转染，脂质体，免疫脂质体，脂转染剂，阳离子剂介导，阳离子表 面两亲物(CFAs)(Nature Biotechnology 1996 14；556)，多价阳离子，例如精胺， 阳离子脂类或聚赖氨酸，1，2，-双(油酰氧)-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)-胆固醇复 合物(Wolff和Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16：421)及其组合。
哺乳动物细胞对裸核酸构建体的吸收可通过一些已知的转染技术增 强，例如包括使用转染剂的技术。这些试剂的例子包括阳离子剂(例如磷酸 钙和DEAE-葡聚糖)和脂转染剂(例如lipofectamTM和transfectamTM)。一般来 说，将核酸构建体与转染剂混合产生一种组合物。
病毒载体
作为选择，含有本发明试剂或本发明核苷酸序列的载体可使用本领域 已知的各种病毒技术导入合适的宿主细胞中，例如用诸如逆转录病毒，单 纯疱疹病毒和腺病毒等重组病毒载体感染。
优选，该载体是重组病毒载体。合适的重组病毒载体包括但不限于腺 病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体，疱疹病毒载体，逆转录病毒载体，慢病 毒载体，杆状病毒载体，痘病毒载体或细小病毒载体(参见Kestler等，1999 Human Gene Ther 10(10)：1619-32)。对于病毒载体，含有编码本发明试剂的 核苷酸序列的核酸的传递可通过病毒感染靶细胞来介导。
靶向载体
术语“靶向载体”是指这样一种载体，即其感染/转染/转导细胞或在宿 主和/或靶细胞中表达的能力局限于宿主生物内某些细胞类型，通常是具有 共同或相似表型的细胞。
复制载体
含有编码本发明溶菌素的核苷酸序列的核酸可插入重组可复制载体 中。该载体可用于在相容性宿主细胞中复制该核苷酸序列。因此，在本发 明的一个实施方案中，本发明提供了通过将含有本发明核苷酸序列的核酸 导入复制载体中，将该载体导入相容性宿主细胞中，并在引起该载体复制 的条件下培养该宿主细胞来制备含有本发明核苷酸序列的核酸的方法。该 载体可从该宿主细胞中回收。
表达载体
优选，本发明溶菌素或插入载体中的本发明核苷酸序列可与能够导致 宿主细胞表达该编码序列的调控序列可操作地相连，即该载体是表达载体。 术语“可操作地相连”是指所述元件以允许它们以其目的方式发挥功能的 关系并排。调控序列与编码序列“可操作地相连”是以这样的方式连接， 即在与该调控序列相容的条件下实现该编码序列的表达。术语“调控序列” 包括启动子和增强子以及其它表达调控信号。
增强编码本发明多肽的多核苷酸的表达也可通过选择异源性调控区， 例如启动子，分泌前导和终止子区来实现，所述调控区用于增强表达和增 加所需表达宿主的目的蛋白的分泌水平和/或用于提供本发明多肽表达的诱 导型控制。
根据所用的序列和/或载体，可以使宿主重组细胞产生的本发明溶菌素 分泌或者包含在细胞内。本领域的技术人员会明白，含有本发明试剂编码 序列的表达载体可设计成具有指导本发明溶菌素编码序列通过特定原核或 真核细胞膜分泌的信号序列。
启动子
除了本发明多肽基因天然的启动子外，可使用其它启动子指导本发明 多肽的表达。
可选择具有指导本发明多肽在目的表达宿主中表达的效力的启动子。
在另一实施方案中，可选择组成型启动子指导本发明的目的多肽的表 达。优选用于真菌表达宿主的强组成型和/或诱导型启动子的例子是可从木 聚糖酶(xlnA)，植酸酶，ATP-合成酶，亚基9(oliC)，丙糖磷酸异构酶(tpi)， 乙醇脱氢酶(AdhA)，α-淀粉酶(amy)，淀粉葡糖苷酶(AG-来自glaA基因)， 乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)等真菌基因获得的启动子。
强酵母启动子的例子是可从乙醇脱氢酶，乳糖酶，3-磷酸甘油酸激酶和 丙糖磷酸异构酶的基因获得的启动子。
强细菌启动子的例子是α-淀粉酶和SP02启动子以及来自细胞外蛋白酶 基因的启动子。
也可使用杂交启动子改进表达构建体的诱导型调控。
体外表达
本发明的载体可转化或转染进下文所述的合适的宿主细胞和/或靶细胞 中以用于表达本发明的溶菌素。该方法包括在用于编码本发明溶菌素的编 码序列的载体表达的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞和/或靶细胞并 任选回收表达的本发明试剂。例如，该载体可以是质粒或病毒载体，前提 是它们具有复制起点，任选表达所述多核苷酸的启动子和任选该启动子的 调控序列。该载体可含有一个或多个选择标记基因，例如对于细菌质粒的 氨苄青霉素抗性基因或对于哺乳动物载体的新霉素抗性基因。本发明试剂 或本发明目的产物的表达可以是组成型的，以便它们可不断产生，或者可 以是诱导型的，需要刺激物来起动表达。对于诱导型表达，当按需要例如， 向培养基中加入诱导剂物质，例如地塞米松或IPTG时可起动本发明试剂或 目的产物的生产。
分泌前导序列
通常，需要将本发明的多肽从表达宿主分泌进培养基中，从其中可更 容易地回收本发明的多肽。根据本发明，可使用本发明多肽的天然分泌前 导序列以实现表达的本发明多肽的分泌。然而，本发明多肽表达的提高有 时导致蛋白质的生产水平超出该表达宿主能够加工和分泌的水平，即产生 一个瓶颈，使得该蛋白质产物在细胞内积聚。因此，本发明还提供了异源 性前导序列用于从选定的表达宿主中最有效地分泌本发明的多肽。
根据本发明，该分泌前导序列可根据目的表达宿主进行选择。可选择 与该表达构建体的其它调控区同源的异源性分泌前导序列。例如，高分泌 的淀粉葡糖苷酶(AG)蛋白的前导序列可与淀粉葡糖苷酶(AG)启动子本身结 合，以及与其它启动子结合来使用。在本发明中也可使用杂交信号序列。
优选的异源性分泌前导序列的例子是来源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基 因(例如，来自于曲霉属的glaA-18和24个氨基酸的形式)，α-因子基因(酵 母，例如糖酵母属(Saccharomyces)和克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces))或α- 淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的前导序列。
融合蛋白
本发明的溶菌素可作为融合蛋白表达以帮助提取和纯化和/或本发明的 溶菌素给受试者的给药。融合蛋白配偶体的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)，6xHis，GAL4(DNA结合和/或转录活化区)和β-半乳糖苷酶。方便的 是在该融合蛋白配偶体和目的蛋白序列之间也可包含一个蛋白水解的裂解 位点以允许切除融合蛋白序列。优选，该融合蛋白不妨碍该溶菌素的活性。
该融合蛋白可含有与本发明物质融合的抗原或抗原决定簇。在该实施 方案中，融合蛋白可以是非天然存在的融合蛋白，它含有用作佐剂的物质 用于非特异性刺激免疫系统。
抗原或抗原决定簇可附着到该物质的氨基或羧基末端。
在本发明的另一实施方案中，该氨基酸序列可连接到异源性序列上以 编码融合蛋白。例如，为了筛选肽文库中能够影响该物质活性的试剂，它 可用于编码表达异源性表位的嵌合物质，该表位可被商业上可获得的抗体 识别。
宿主细胞
可采用广泛的宿主细胞表达编码本发明溶菌素的核苷酸序列。这些细 胞可以是原核和真核宿主细胞。因此，在另一方面，本发明提供了制备根 据本发明的多肽的方法，它包含在用于编码该多肽的编码序列的载体表达 的条件下培养用上述表达载体转化和/或转染的宿主细胞，并回收该表达的 多肽。合适的宿主细胞包括细菌，例如大肠杆菌，乳杆菌属种类，芽孢杆 菌属种类，和乳球菌属种类，酵母，丝状真菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞， 一般是永生化的，例如小鼠，CHO，人和猴细胞系及其衍生物。
该载体可以是例如，质粒，病毒或噬菌体载体，前提是它们具有复制 起点，任选表达所述多核苷酸的启动子和任选该启动子的调控序列。该载 体可含有一个或多个选择标记基因。用于工业微生物的最合适的选择系统 是由一组选择标记形成的系统，它不需要在宿主生物中进行突变。真菌选 择标记的例子是乙酰胺酶(amdS)，ATP合成酶，亚基9(oliC)，乳清酸核苷-5′- 磷酸-脱羧酶(pvrA)，腐草霉素(phloemycin)和苯菌灵(benomyl)抗性(benA)的 基因。非真菌选择标记的例子是细菌G418抗性基因(它也可用于酵母，但 不能用于真菌)，氨苄青霉素抗性基因(大肠杆菌)，新霉素抗性基因(芽孢杆 菌属)和大肠杆菌uidA基因，它编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)。该载体可用 于体外，例如生产RNA或者用于转染或转化宿主细胞。
本发明的另一实施方案提供了用本发明的多核苷酸转化或转染的宿主 细胞。优选所述的多核苷酸携带在载体中用于复制和表达所述的多核苷酸。 该细胞可选择与所述的载体相容的且可以是例如原核的(例如细菌)，真菌 的，酵母或植物细胞。
来自芽孢杆菌属和乳杆菌属的细菌非常适合于作为异源性宿主，因为 它们具有将蛋白质分泌进培养基的能力。适合于作为宿主的其它细菌是来 自乳球菌属的细菌。
根据编码本发明多肽的多核苷酸的特性，和/或表达的蛋白质对进一步 加工的需求，优选诸如酵母或真菌等真核宿主。一般来说，酵母细胞相对 于真菌细胞是优选的，因为它们更容易操作。然而，一些蛋白质难以从酵 母细胞中分泌，或者在一些情况下不能进行适当的加工(例如，酵母中的高 糖基化)。在这些情况下，应选择真菌宿主生物。
也可选择异源性宿主，其中以基本上不含其它溶菌素的形式产生本发 明的多肽。通过选择正常情况下不产生这类试剂的宿主可实现这点。
在本发明范围内优选的表达宿主的例子是诸如曲霉属(Aspergillus)种类 和木霉属(Trichoderma)种类的真菌；诸如芽孢杆菌属种类和乳杆菌属种类的 细菌；和诸如克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)种类和糖酵母属 (Saccharomyces)种类的酵母。
特别优选的表达宿主可选自黑曲霉(Aspergillus niger)，黑曲霉变种 (Aspergillus niger var.tubigenis)，黑曲霉变种(Aspergillus niger var.awamori)， 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatis)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，米曲霉 (Aspergillus oryzae)，Trichoderma reesei，嗜酸乳杆菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，地衣型芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)和啤酒糖酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。
根据本发明，通过在常规营养发酵培养基中培养用本发明的一种或多 种多核苷酸转化的微生物表达宿主可实现本发明多肽的生产。
发酵培养基可包含已知培养基，该已知培养基含有碳源(例如，葡萄糖， 麦芽糖，糖蜜，等)，氮源(例如，硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，等)，有机氮 源(例如，酵母提取物，麦芽汁，蛋白胨，等)和无机营养源(例如，磷酸盐， 镁，钾，锌，铁，等)。任选可加入诱导物。
可根据表达宿主的选择和/或根据表达构建体的调控需要来选择合适的 培养基。这培养基是本领域的技术人员熟知的。如果需要，该培养基可含 有相对于其它可能的污染微生物有利于转化的表达宿主的添加成份。
发酵后，可借助于离心或过滤从发酵肉汤中取出该细胞。取出细胞后， 随后回收本发明的变体多肽，且如果需要，可通过常规方法纯化和分离。
生物体
与本发明相关的术语“生物体”包括可含有一种核酸和/或从其获得的 产物的任何生物，所述的核酸含有编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序列， 其中当在该生物体中存在时转录调控序列可允许表达根据本发明的核苷酸 序列。合适的生物体可包括原核生物，真菌，酵母或植物。优选的生物体 可以是细菌，优选乳杆菌属的细菌，更优选嗜酸乳杆菌。
与本发明相关的术语“转基因生物”包括可含有一种核酸和/或从其获 得的产物的任何生物，所述的核酸含有编码根据本发明的蛋白质的核苷酸 序列，其中转录调控序列可允许在该生物体中表达根据本发明的核苷酸序 列。优选，该核苷酸序列可插入该生物体的基因组中。
术语“转基因生物”不包括在其天然环境中的天然核苷酸编码序列， 其中它们在其天然启动子的控制下，该启动子也在其天然环境中。
因此，本发明的转基因生物包括这样的生物，它含有编码根据本发明 的氨基酸序列的核苷酸序列，根据本发明的构建体(包括其组合)，根据本发 明的载体，根据本发明的质粒，根据本发明的细胞，根据本发明的组织或 其产物中的任一种或其组合。该转化细胞或生物体可制备容易从该细胞或 生物中回收的可接受量的目的化合物。
宿主细胞/宿主生物的转化
如上所述，该宿主生物可以是原核或真核生物。合适的原核宿主的例 子包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌或嗜酸乳杆菌。转化原核宿主的教导在本 领域已充分公开，例如参见Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)和Ausubel等， Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc。
如果使用原核宿主，那么该核苷酸序列需要在转化前通过例如，去掉 内含子进行适当的修饰。
在另一实施方案中，该转基因生物可以是酵母。在这点上，酵母已被 广泛用作异源性基因表达的载体。啤酒糖酵母种的工业用途，包括其用于 异源性基因表达的用途具有很长的历史。在啤酒糖酵母中表达异源性基因 的综述参见Goodey等(1987，Yeast Biotechnology，D R Berry等，编，第 401-429页，Allen and Unwin，London)和King等(1989，Molecular and Cell Biology of Yeasts，E F Walton和G T Yarronton，编，第107-133页，Blackie， Glasgow)。
由于一些原因，啤酒糖酵母非常适合于异源性基因表达。首先，它对 人体不致病且它不能产生某些内毒素。其次，根据几个世纪的各种目的的 商业开发，其具有很长的安全使用历史。这导致了广泛的公众可接受性。 第三，对该生物体广泛的商业应用和研究导致对于啤酒糖酵母的遗传学和 生理学以及大规模发酵特性积累了丰富的知识。
关于啤酒糖酵母中异源性基因表达的原理和基因产物的分泌的综述由 E Hinchcliffe E Kenny提供(1993，“酵母作为异源性基因表达的载体”， Yeasts，第5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison，编，第2版，Academic Press Ltd.)。
一些类型的酵母载体是可获得的，包括需要与宿主基因组重组以便于 其维持的整合性载体，和自主复制的质粒载体。
为了制备转基因酵母，表达构建体可通过将本发明的核苷酸序列插入 为在酵母中表达而设计的构建体中来制备。已经开发了一些类型的构建体 用于异源性表达。该构建体含有与本发明的核苷酸序列融合的在酵母中有 活性的启动子，通常使用酵母来源的启动子，例如GAL1启动子。通常使 用酵母来源的信号序列，例如编码SUC2信号肽的序列。在酵母中有活性的 终止子终止该表达系统。
对于酵母的转化，已经开发了一些转化方法。例如，根据本发明的转 基因酵母可按照Humen等(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)； 和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)的教导来制备。
转化的酵母细胞可使用各种选择性标记来选择。用于转化的标记中有 许多营养缺陷型标记，例如LEU2，HIS4和TRP1，和显性抗生素抗性标记， 例如氨基苷类抗生素标记，例如G418。
另一宿主生物是植物。构建遗传修饰的植物的基本原则是在植物基因 组中插入遗传信息以达到稳定维持插入的遗传物质。已有一些技术用于插 入遗传信息，两个主要的原则是直接导入遗传信息和通过使用载体系统导 入遗传信息。常规技术的综述可参见Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章。关于植物转化的进一步教导可参见 EP-A-0449375。
报道分子
在本发明的检测方法和测定方法(以及筛选)中可使用多种报道分子，优 选的报道分子可提供方便的可检测信号(例如，通过光谱学)。作为例子，报 道基因可编码催化改变光吸收特性的反应的一种酶。
报道分子的例子包括但不限于β-半乳糖苷酶，转化酶，绿色荧光蛋白， 萤光素酶，氯霉素，乙酰转移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，外切葡聚糖酶和葡糖 淀粉酶。作为选择，可将放射性标记的或荧光标记-标记的核苷酸掺入新生 转录子中，然后在与寡核苷酸探针结合时可鉴定该转录子。
在本发明的检测方法中，溶菌素或其部分可通过遗传翻译的融合蛋白 直接或间接与报道分子，合适的是荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白)结合。
通过例如，使用对该蛋白质特异性的多克隆或单克隆抗体的检测和测 量蛋白质表达的各种方法是本领域已知的。其例子包括酶联免疫吸附试验 (ELISA)，放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分类术(FACS)。优选使用与多 肽上两个无干扰表位反应的单克隆抗体的基于单克隆抗体的两点免疫测定 法，但是也可采用竞争性结合试验。这些和其它测定法在Hampton R等(1990， Serological Methods，A Laboratory Manual，APS Press，St Paul MN)和Maddox DE等(1983，J Exp Med 158：1211)中和其它文献中都有描述。
报道分子的生产可通过诸如β-半乳糖苷酶等报道基因产物的酶活性来 测量。
广泛的各种标记和偶联技术是本领域的技术人员已知的且可用于各种 核酸和氨基酸试验中。产生标记的杂交或PCR探针用于检测靶多核苷酸序 列的方法包括使用标记的核苷酸进行寡聚标记，切口平移，末端标记或PCR 扩增。作为选择，可将编码序列，或其任一部分克隆进载体中用于产生 mRNA探针。该载体是本领域已知的，商业上可获得的，且可通过加入诸 如T7，T3或SP6等合适的RNA聚合酶和标记的核苷酸用于体外合成RNA 探针。
诸如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)，Promega(Madison，WI)，和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)等许多公司提供用于这些方法的商品试剂 盒和操作方案。合适的报道分子或标记包括放射性核素，酶，荧光剂，化 学发光剂，或显色剂以及底物，辅因子，抑制剂，磁性颗粒等。教导使用 该标记的专利包括US-A-3817837；US-A-3850752；US-A-3939350；US-A- 3996345；US-A-4277437；US-A-4275149和US-A-4366241。另外，可按 US-A-4816567所述生产重组免疫球蛋白。
定量特定分子表达的其它方法包括放射性标记(Melby PC等，1993 J Immunol Methods 159：235-44)或生物素标记(Duplaa C等1993 Anal Biochem 229-36)核苷酸，对照核酸的共扩增，插入实验结果的标准曲线。通过以 ELISA形式进行试验可加速多个样品的定量，其中目的寡聚体以各种稀释 度存在且分光光度测定或测热反应得到迅速定量。
尽管存在/不存在标记基因表达表明也存在目的基因，但是应证实其存 在和表达。例如，如果在标记基因序列内插入该核苷酸序列，那么通过标 记基因功能的丧失可鉴定含有该核苷酸序列的重组细胞。作为选择，标记 基因可与靶编码序列在单个启动子的控制下串联排列。标记基因对诱导或 选择产生反应而进行表达通常表明该靶序列也表达。
作为选择，以本领域的技术人员已知的各种方法可鉴定含有靶编码序 列且表达该靶编码区的宿主细胞。这些方法包括，但不限于，DNA-DNA或 DNA-RNA杂交和蛋白质生物测定或免疫测定技术，包括基于膜，基于溶液， 或基于芯片的技术，用于检测和/或定量该核酸或蛋白质。
筛选
可使用任意一种或多种合适的靶，例如含有一种或多种病原性梭菌属 细菌，特别是产气荚膜梭菌的样品，以各种药物筛选技术中的任一种鉴定 根据本发明的溶菌素。所述试验中使用的靶可游离于溶液中，固定在固相 支持物上，在细胞表面携带，或位于细胞内。该靶甚至可在动物模型内， 其中所述的靶可以是外源性靶或者导入的靶。该动物模型可以是非人动物 模型。可测量靶活性的消失或靶与待测溶菌素之间结合复合物的形成。
预期本发明的测定方法适合于小规模和大规模筛选试验化合物以及定 量试验。
在一个优选的方面，本发明的筛选包含至少下列步骤(不必以该相同连 续的顺序)：(a)进行体外筛选以测定候选溶菌素是否具有相关活性(例如裂解 一种或多种病原性梭菌属细菌，优选产气荚膜梭菌细菌的能力)；和(b)用所 述的候选溶菌素进行体内筛选(例如，使用功能性动物模型)。一般来说，如 果所述的候选试剂通过筛选(a)，然后进行筛选(c)。
诊断学
本发明还提供了诊断组合物或试剂盒用于检测一种靶，即病原性梭菌 属细菌，特别是产气荚膜梭菌细菌。在该方面，该组合物或试剂盒可含有 以根据本发明的溶菌素为基础的诊断标记，它能够显示试验样品中是否存 在一种或多种梭菌属细菌，特别是产气荚膜梭菌细菌。合适的是，该试验 样品可以是食品，消化产物(digesta)，或者可从例如，受试者肠道获得的试 验样品。
该诊断组合物或试剂盒可用于检测一种靶，即在例如食品，消化产物 等中的病原性梭菌属细菌，特别是产气荚膜梭菌细菌。
该诊断组合物或试剂盒可用于诊断由存在病原性梭菌属细菌，特别是 产气荚膜梭菌引起的病症，例如坏死性肠炎，食物中毒或坏疽。
可改造(tailor)该诊断试验以评估特定治疗方案或特定溶菌素的效力且 可用于动物试验，临床试验，或监测受试者的治疗。为了提供诊断疾病的 依据，可建立正常或标准分布图。通过将从动物或者人的正常(即未感染的) 受试者获取的体液或细胞提取物或其它样品与本发明的溶菌素组合可实现 这点。如果确认疾病，可施用治疗剂，即，根据本发明的溶菌素和/或用编 码根据本发明的溶菌素的核苷酸序列转化的宿主，并产生治疗分布图或治 疗值。最后，定期重复该试验以评估该值是向前进行还是回归到正常或标 准图型，即在其治疗期间，在诸如家禽肠道等样品中细菌的量是否降低和/ 或消灭。使用连续治疗分布图显示在几天或几个月期间的治疗效力。
诊断试验
为了提供疾病诊断的依据，应确定样品中病原性梭菌属细菌，特别是 产气荚膜梭菌细菌量的正常或标准值。例如，在受试者肠道中所述细菌的 某一水平可能不会必然对该个体有害。只有当该细菌数增加到超过某一阈 值水平时，才可能观察到有害影响且形成疾病状态。因此，该诊断试验能 够鉴定样品中病原性梭菌属细菌，特别是产气荚膜梭菌的存在，但是也能 够定量该感染水平。通过将它与加入了已知量细菌的阳性对照的系列稀释 样品比较可定量样品中的细菌量。
探针
本发明的另一方面是提供核酸杂交或PCR的探针，它们能够检测(特别 是能够选择性选择)多核苷酸序列，包括编码根据本发明溶菌素的编码核苷 酸序列的基因组序列，或诸如等位基因等近亲分子。该探针的特异性，即 它是来自于高度保守的，保守的还是来自于非保守的区域或结构域，和杂 交或扩增的严格性(高度，中等或低度)将决定该探针是仅鉴定天然存在的编 码本发明溶菌素的核苷酸序列，还是鉴定相关序列。用于检测相关核酸序 列的探针选自靶家族成员保守的或高度保守的核苷酸区且该探针可用于简 并探针库。对于相同核酸序列的检测，或者如果需要最大的特异性，核酸 探针可选自靶多核苷酸的非保守核苷酸区或者特有区。本文使用的术语“非 保守核苷酸区”是指本文公开的溶菌素编码序列特有的且在相关家族成员 中不存在的核苷酸区。
US-A-4683195，US-A-4800195和US-A-4965188中所述的PCR提供了 基于该核苷酸序列的寡核苷酸的其它用途。该寡聚体一般是化学合成的， 但是它们也可酶促产生或从重组来源生产。在鉴定特定基因或状况的优化 条件下使用的寡聚体一般含有两个核苷酸序列，一个具有有义方向(5′-＞3′) 且一个具有反义方向(3′＜-5′)。可在较低严格条件下使用相同的两个寡聚体， 嵌套的寡聚体组，或者甚至寡聚体的简并库来检测和/或定量近亲DNA或 RNA序列。
也可使用根据本发明溶菌素的核酸序列来产生上述杂交探针，用于定 位内源性基因组序列。使用熟知技术可将该序列定位于具体染色体上或者 染色体的特定区域上。它们包括与下列物质的原位杂交：染色体涂片(Verma 等(1988)Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press， New York City)，流式分类染色体标本，或人工染色体构建体，例如YACs， 细菌人工染色体(BACs)，细菌PI构建体或单染色体cDNA文库。
对染色体标本的原位杂交和使用确定的染色体标记进行的诸如连锁分 析等物理作图技术在扩展遗传图谱中是无价的。遗传图谱的例子可参见 Science(1995；270：410f和1994；265：1981f)。通常将基因定位于另一哺乳动 物种类的染色体上可揭示出相连的标记，即使具体人染色体的编号或臂是 未知的。通过物理作图可将新序列定位到染色体臂，或其片段上。这给研 究人员使用定位克隆或其它基因探索技术寻找疾病基因提供了有价值的信 息。一旦通过遗传连锁将一种疾病或综合征粗略定位于特定的基因组区域， 对该区域的任何序列图谱可提供相关或调控的基因用于进一步研究。本发 明的核苷酸序列也可用于检测由于易位，倒位等在正常，携带者或患病个 体之间染色体位置的差异。
用途
一般来说，根据本发明的溶菌素和/或用编码根据本发明的溶菌素的核 苷酸序列转化的宿主可用于制备治疗病症的药物，该病症与存在病原性梭 菌属细菌，特别是产气荚膜梭菌细菌相关。
根据本发明的溶菌素和/或用编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序列转 化的宿主可用于检测和/或消灭病原性梭菌属细菌，特别是产气荚膜梭菌。
具体地说，根据本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌素 的核苷酸序列的核酸转化的宿主可用于动物饲料或者作为动物饲料添加剂 以降低动物肠道中病原性梭菌属细菌，特别是产气荚膜梭菌的总数。因此， 可预防和/或治疗由存在病原性梭菌属细菌，特别是产气荚膜梭菌引起的诸 如体重增长下降和坏死性肠炎等病症。
根据本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序 列的核酸转化的宿主也可用于预防和/或治疗坏疽和与存在病原性梭菌属细 菌，特别是产气荚膜梭菌相关的其它疾病。
另外或者作为选择，根据本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明 的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿主可在测定法中使用以试验和检测 食品中毒爆发中的病原体和/或预防或治疗个体的食物中毒和/或作为诊断 剂用于研究目的。
制备食品
根据本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序 列的核酸转化的宿主可用于食品，包括动物饲料。
在一个实施方案中，本发明的食品和/或饲料添加剂可通过将根据本发 明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化 的宿主与食品和/或饲料添加剂直接混合来制备。作为例子，根据本发明的 溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的宿 主可与诸如磨细的小麦，玉米或大豆粉等谷类食品和/或饲料添加剂(例如， 通过喷洒)接触。
也可将根据本发明的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌素的核 苷酸序列的核酸转化的宿主掺入第二种(和不同的)食品和/或饲料或饮用水 中，然后将其加入本发明的食品和/或饲料添加剂中。因此，将根据本发明 的溶菌素和/或用含有编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序列的核酸转化的 宿主掺入谷类食品和/或饲料添加剂本身中不是必需的，尽管该掺入方法形 成本发明的一个特别优选的方面。
在本发明的一个实施方案中，可将食品和/或饲料添加剂与其它食品和/ 或饲料成份混合以产生谷类食品和/或饲料。该其它食品和/或饲料成份可包 含一种或多种其它(优选耐热的)酶添加剂，维生素食品和/或饲料添加剂， 矿质食品和/或饲料添加剂和氨基酸食品和/或饲料添加剂。然后可将包含可 能的几种不同类型化合物的所得的(组合)食品和/或饲料添加剂以合适的量 与诸如谷类和蛋白质添加剂等其它食品和/或饲料成份混合以形成人食品和 /或动物饲料。
现在参考下列附图以实施例的方式进一步描述本发明：

图1显示的是核苷酸序列；
图2显示的是氨基酸序列；
图3显示的是基因组图谱；
图4显示的是图谱；和
图5显示的是图谱。
更详细地说：
图1显示了编码根据本发明的溶菌素的核苷酸序列(SEQ ID No.1)；
图2显示了根据本发明的溶菌素的氨基酸序列(SEQ ID No.2)；
图3显示了来自产气荚膜梭菌的噬菌体(φ3626)的基因组图谱；
图4显示了使用生产φ3626溶菌素的大肠杆菌的粗提物(RE)裂解培养基 中的产气荚膜梭菌菌株NCTC3110的图谱；和
图5显示了来自产气荚膜梭菌噬菌体φ3626的溶菌素对各种细菌种和属 的底物特异性图谱。
实施例
实施例1：从产气荚膜梭菌分离和纯化噬菌体
方法：按Loessner等(1990 Appl.Environ.Microbiol，56，1912-8)所述通过 紫外照射技术筛选从各种来源分离的51个梭菌菌株的溶原性。指数生长的 梭菌(10ml)暴露于紫外光(254nm，0.0132J cm-2)5分钟。在黑暗中培养3小 时(37℃)后离心(10分钟，8000g)该培养物并无菌过滤。对所有产气荚膜梭 菌菌株通过在菌苔上点样的方法检测噬菌体活性。
使用Adams所述的软琼脂层技术(1959 Methods of study of bacterial viruses p443-457 Bacteriophages，Intersciences Publishers Inc.NY)纯化和增殖 噬菌体。向表现出裂解活性的上清稀释液中加入以0.1ml合适的繁殖菌株 的指数生长培养物接种的3.5ml熔化的软琼脂。将该软琼脂倒在TY平板上 并培养过夜。用无菌巴斯德吸管挑出单个完全分离的噬菌斑并放入0.45ml 的TY培养基中。4℃下培养4小时后，将含有该噬菌斑的溶液无菌过滤并 用于第二轮纯化。
为了从噬菌体分离DNA，高滴度原种(109pfu/ml)是必需的。通过液体 培养物将该噬菌体繁殖成高滴度。向合适的宿主培养物(OD600nm为0.1)中以 大约1的感染复数加入噬菌体溶液。通过光度测定法监测感染培养物的生 长并通过离心(10000g下10分钟)和无菌过滤培养物上清去掉细胞碎片后收 获该噬菌体。
Zink等(1992 Appl.Environ.Microbiol.58，296-302)描述了从高滴度原 种中纯化进一步分子研究所必需的噬菌体。简单地说，通过聚乙二醇8000 沉淀，递增CsCl密度梯度离心和透析来纯化和浓缩该该噬菌体(参见，例如， Sambrook等，Molecular Cloning：a laboratory manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。通过电子显微镜检(EM)检 查推定的噬菌体颗粒。
结果：使用菌株ATCC3626和NCTC8533，对紫外诱导的无菌培养物上 清观察到的裂解活性是由于存在噬菌体，通过EM证实了这一点。该噬菌 体属于Siphoviridae类型，且命名为φ3626和φ8533。两种噬菌体的最佳繁殖 宿主分别测定为NCTC3110和菌株ATCC3628。
实施例2：噬菌体裂解范围的测定
方法：通过滴到菌苔上的技术(drop-on-the-lawn technique)检测了两种噬 菌体裂解产气荚膜梭菌的能力。将10μl噬菌体原种(107pfu/ml)放在用产气 荚膜梭菌菌株接种的平板上。通过培养过夜后在细菌菌苔上形成的噬斑观 察该裂解活性。
结果：噬菌体φ3626裂解51种产气荚膜梭菌菌株中的11种菌株(21.6％) 而噬菌体φ8533能够裂解4种菌株(7.8％)。
实施例3：产气荚膜梭菌噬菌体φ3626的基因组DNA的测序和分析
方法：使用提取噬菌体λDNA的标准方法(参见Sambrook等，出处同上) 获得φ3626的基因组DNA。噬菌体φ3626基因组文库的构建按Loessner等 (2000 Mol.Microbiol 35，324-40)的详细描述进行。用Tsp509I(New England Biolabs)进行DNA的时间限制性消化和使用HindIII(MBI Fermentas)和 TaqI(Roche)进行完全消化。从琼脂糖凝胶中回收所需长度的片段(1-2kbp) 并在载体pBluescript(Stratagene)中接合。将接合产物电穿孔进大肠杆菌 DH5αMCR中。在含有Xgal-的琼脂板上进行的蓝白筛选可用于鉴定携带插 入片段的转化子。从小规模培养物中分离质粒(Qiaprep Miniprep Kit；Qiagen) 并用PauI(MBI)消化。在琼脂糖凝胶中以限制性模式鉴定了携带长度在1-2 kbp之间变化的不同插入片段的58个克隆。这些克隆用于使用荧光标记 (IRD-800 LI-COR)的与pBluescript多克隆位点两侧的序列互补的标准引物 进行测序。在自动DNA测序仪(4200IR2；LI-COR)上使用热稳定性聚合酶 (SequiTherm EXCEL II DNA Sequencing Kit-LC；Epicentre Technologies)进行 测序。
使用软件DNASIS版2.10(Hitachi)排列获得的序列。排列产生的连续序 列(contigs)用于设计特异性引物以封闭缺口。通过在φ3626 DNA上进行引物 步查(walking)封闭剩下的缺口直到在粘性位点观察到清楚的链终止。使用与 粘性位点上游和下游序列互补的引物在溶原性宿主DNA上进行PCR来测 定粘性位点的核心序列完成基因组序列。PCR产物和引物步查方法的DNA 链通过使用染色终止子技术在ABI 373A自动DNA测序仪上进行测序。
DNASIS/PROSIS(Hitachi)和Husar分析软件包，包括GCG软件包 (http：//genius.embnet.dkfz-heidelberg.de；Biocomputing Service Group at the German Cancer Research Center，DKFZ)可用于分析核苷酸和氨基酸序列。 Altschul等(1990J.Mol.Biol 215，403-10)教导的BLAST算法可用于对通过国 家生物技术信息中心(the National Center for Biotechnology Information) (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)或生物计算机服务公司(the Biocomputing Service Group)获得的数据库进行同源性检索。
结果：φ3626基因组长度为33507bp，具有9个核苷酸长的3′-突出的 单链粘性末端。平均摩尔GC含量为28.4mol％。对φ3626基因组的生物信 息分析揭示存在50个推定的蛋白质编码区，覆盖94.1％的序列。
φ3626基因组的蛋白质编码区可按ORFs的方向明显地组织成3个主要 功能性基因簇(见图3)。第一个基因簇从坐标为1的粘性位点到坐标19804， 在基因组图谱中向右转录(图3)，代表编码结构蛋白和裂解系统的基因。这 些基因可概括为“晚期基因”。第二个基因簇位于bp19805-23645且编码负 责溶原性控制的产物，包括att-位点，整合酶，阻遏物和推定的cro-阻遏物。 最后一个基因簇从核苷酸23680延伸到33507，包括以向右方向单向排列的 ORFs(参见图3)。其推定的产物负责噬菌体DNA的复制，重组，修饰且代 表“早期”基因。
实施例3：溶菌素基因的序列测定
方法：与其它噬菌体(φ105，Sfi21，φadh，φSLT，φPVL)比较揭示了φ3626 基因组具有相似的组织结构。一般来说，内溶素位于溶原性控制区的上游， 其ORFs通常以相反的方向排列(见图3)。ORF19的产物与枯草芽孢杆菌噬 菌体φ105可能的成孔素(holin)(Kobayashi，K等，未公开，登录号AB016282) 表现出相似性(105个氨基酸中的50％)。使用Sonnhammer等(1998 Proc.Int. Conf.Intell.Syst.Mol.Biol.，6：175-182)所述的生物信息分析工具TmHMM， 确定了该推定的蛋白质具有两个跨膜螺旋区是非常可能的。因此，暂时假 定ORF19编码φ3626的成孔素。
在有尾噬菌体中，内溶素基因位于编码成孔素基因的下游(参见Wang 等(2000 Ann.Rev.Microbiol.54：799：825)。使用BLASTP2的同源性检索揭 示了ORF20推定的基因产物与未知功能的产气荚膜梭菌假定的蛋白质有强 相似性(265-346氨基酸中的72-75％)(参见Garnier等，1988 Plasmid 19： 135-50；Lyristis等，1994 Mol.Microbiol 12：761-77；Shimizu等，1994 J. Bacteriol.176：1616-23)。在氨基末端内，它与不同来源的N-乙酰胞壁酰-L- 丙氨酸酰胺酶表现出相似性(枯草芽孢杆菌自溶素，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)噬菌体12862内溶素，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的 CwlV，在163-166个氨基酸上具有43-45％的相似性)(参见Ishikawa等，1999 Mol.Gen.Genet 262：738-48；Kunst等，1997 Nature 390；249-56；和Loessner 等，1997 J.Bacteriol 179：2845-51)。使用PFAM数据库的Hidden Markov Model(HMM)扫描(参见Durbin等，1998 Biological Sequence Analysis： Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids，Cambridge Uni.Press)也表 明存在推定的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶结构域。
结果：ORF20鉴定为编码内溶素的基因ply3626且发现它正好位于编码 成孔素基因的下游。该酶在氨基末端内具有酰胺酶结构域的可能性也表明 ORF20是内溶素。内溶素的羧基末端显示出无已知功能，但是根据许多内 溶素表现出模块结构(modular organization)的发现(参见Garcia等，1990 Gene 86：81-8)，推定可能的细胞壁结合功能域位于ply3626的羧基末端。
实施例4：ply3626在大肠杆菌中的表达
根据生物信息学分析，设计引物用于使用PCR扩增ply3626。引物设计 成与该基因末端互补且在该基因上游和下游具有限制性位点以允许介导克 隆进表达载体pQE30(Qiagen)中。纯化PCR产物，用合适的限制性核酸内 切酶消化并在制备的载体中连接。将连接产物通过电穿孔转化进由 Zdanovsky等(2000 App.Environ Microbiol 166：3166-73)惠赠的以前用质粒 pACYC-IRL10转化制备的大肠杆菌JM109中。pACYC-IRL10给大肠杆菌 提供在大肠杆菌中很少使用而在梭菌中经常使用的tRNAs的基因(ileX， argU和leuW)。
用编码内溶素的载体转化的大肠杆菌在室温(22℃)下生长，单独通过载 体系统的背景表达产生该内溶素。通过使用IPTG诱导观察，发现这样可防 止形成内含体(inclusion body)。16小时后，离心(8000g，15分钟)收获细胞。 沉淀重悬于PBS缓冲液中，通过使用French以40000kPa挤压细胞制备该 细胞的粗提物(RE)。将RE以35000g离心30分钟并无菌过滤。通过在产气 荚膜梭菌NCTC3110细胞上进行裂解试验显示酶活性。
通过表达载体pQE30使用与内溶素融合的HIS-标记也可纯化该内溶 素。纯化的内溶素与粗提物中的内溶素表现出相同的裂解活性。
实施例5：用重组大肠杆菌产生的ply3626对产气荚膜梭菌进行裂解 试验
对于裂解活性的光度测定试验，产气荚膜梭菌NCTC3110用作ply3626 的底物。该细菌生长过夜(500ml)，通过离心(8000g，15分钟)收获并重悬于 PBS缓冲液(5ml)中。在-20℃贮存细胞备用。对于裂解试验，将细胞在PBS 缓冲液中稀释成490mn下光密度为0.7-0.8。向180μl该底物中加入20μl生 产内溶素的重组大肠杆菌的粗提物并在一段时间内测量光密度的改变。作 为阴性对照，使用携带具有3’截短的ply3626基因的载体的大肠杆菌粗提物。 与阴性对照相比，对于含有内溶素ply3626的RE测量到由于底物细胞壁的 破裂引起光密度明显降低(见图4)。
实施例6：底物特异性
方法：为了测定从产气荚膜梭菌获得的溶菌素的底物特异性，用ply3626 对各种细菌进行裂解试验。筛选了49个不同的细菌种的109个菌株对 ply3626的敏感性。该细菌在标准条件下生长，离心收获并将沉淀重悬于PBS 中。这些原种在-20℃下贮存备用。稀释该细胞以获得0.5-0.9(在490nm下) 的光密度且通过加入20μl含有ply3626的重组大肠杆菌粗提物将180μl稀 释的细胞悬液用作裂解试验的底物。
与阴性对照相比光密度的S型降低解释为对Ply3626敏感。如果检测不 倒降低，可认为不敏感。
试验的各种细菌的列表在下面表1和2中提供(其中WS是指 Weihenstephan微生物培养保藏中心；ATCC是指美国典型培养物保藏中心， Rockville，USA；且NCTC是指国家典型培养物保藏中心，PHLS，伦敦)：
表1：  从培养物保藏中心获得的菌株  细菌种类   WS保藏号   官方保藏号   敏感性  蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)   WS1537   DSM31   否  巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)   WS1539   DSM32   否  多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)   WS1538   DSM36   否  枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)   WS1525   DSM10   否  苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)   WS2734   DSM2046   否  高卢双歧杆菌(Bifidobacterium gallicum)   WS3390   DSM20093   否  鸡胚双歧杆菌(Bifidobacterium gallinarum)   WS3410   DSM20670   否  反刍双歧杆菌(Bifidobacterium ruminantium)   WS3381   DSM6489   否  热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)   WS2021   DSM20171   否  空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)   WS3510   DSM4688   否  不同梭菌(Clostridium absonum)   WS3511   DSM599   否   巴氏梭菌(Clostridium barati)   WS3512   DSM601   否   谲诈梭菌(Clostridium fallax)   WS3514   DSM2631   是   诺氏梭菌(Clostridium novyi)   WS3515   DSM5566   否   破伤风梭菌(Clostridium tetani)   WS3516   DSM11744   否   拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)   WS2190   ATCC6015   否   双酶梭菌(Clostridium bifermentans)   WS2189   ATCC19299   否   丁酸梭菌(Clostridium butyricum)   WS1619   DSM552   否   巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)   WS2195   DSM525   否   产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)   WS2952   DSM756   是   产气荚膜梭菌   WS2953   DSM798   是   产气荚膜梭菌   WS2954   DSM2943   是   产气荚膜梭菌   WS2964   NCTC528   是   产气荚膜梭菌   WS2965   NCTC3110   是   产气荚膜梭菌   WS2966   NCTC6719   是   产气荚膜梭菌   WS2969   NCTC8346   是   产气荚膜梭菌   WS2970   NCTC8533   是   产气荚膜梭菌   WS2971   NCTC10240   是   产气荚膜梭菌   WS2972   NCTC10612   是   产气荚膜梭菌   WS2974   NCTC10719   是   产气荚膜梭菌   WS2975   NCTC11144   是   产气荚膜梭菌   WS3004   ATCC3626   是   产气荚膜梭菌   WS3005   ATCC3628   是   生孢梭菌(Clostridium sporogenes)   WS1621   DSM633   否   生孢梭菌   WS2186   DSM1664   否   生孢梭菌   WS2187   DSM795   否   第三梭菌(Clostridium terbium)   WS2188   DSM2485   否   假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)   WS2194   ATCC19407   否   酪丁酸梭菌(Clostridium tyobutyricum)   WS1620   DSM663   否   酪丁酸梭菌   WS2191   ATCC25755   否   鸡胚肠杆菌(Enterobacter gallinarum)   WS3204   DSM20628   否   粪肠球菌(Enterobacter faecalis)   WS2331   DSM20478   否   屎肠球菌(Enterococcus faecium)   WS1052   DSM20477   否   大肠杆菌(Escherichia coli)   WS1322   DSM30083   否   鸟乳杆菌鸟亚种(Lactobacillus aviarius subsp.   Aviarius)   WS3206   DSM20655   否   植物乳球菌(Lactococcus plantarum)   WS3116   DSM20686   否   肉色明串珠菌(leuconostoc carnosum)   WS3102   DSM5576   否   柠檬明串珠菌(leuconostoc citreum)   WS3103   DSM5577   否   肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)   WS3105   DSM20346   否   无害利斯特氏菌(Listeria innocua)   WS2257   ATCC33090   否   伊氏利斯特氏菌(Listeria ivanovii)   WS2256   ATCC19119   否   单核细胞增多性利斯特氏菌   (Listeria monocytogenes)   WS2301   ATCC15313   否   戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)   WS1038   DSM20206   否   金黄色葡萄球菌金黄亚种   (Staphylococcus aureus supsp.Aureus)   WS2438   DSM20231   否   表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)   WS3341   DSM20044   否   鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)   WS3287   DSM20610   否   化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)   WS3154   DSM20565   否   嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)   WS2786   DSM20617   否
表2：   各种其它来源的菌株   细菌种类   WS保藏号   官方保藏号   敏感性   Bacillus weihenstephanensis   WS2480   否   肉毒梭菌(clostridium botulinum)   WS3524   否   肉毒梭菌   WS3525   否   产气荚膜梭菌   WS2955   是   产气荚膜梭菌   WS2956   是   产气荚膜梭菌   WS2957   是   产气荚膜梭菌   WS2958   是   产气荚膜梭菌   WS2959   是   产气荚膜梭菌   WS2960   是   产气荚膜梭菌   WS2961   是   产气荚膜梭菌   WS2962   是   产气荚膜梭菌   WS2963   是   产气荚膜梭菌   WS2981   是   产气荚膜梭菌   WS2982   是   产气荚膜梭菌   WS2983   是   产气荚膜梭菌   WS2984   是 产气荚膜梭菌   WS2985   是 产气荚膜梭菌   WS2986   是 产气荚膜梭菌   WS2987   是 产气荚膜梭菌   WS2988   是 产气荚膜梭菌   WS2989   是 产气荚膜梭菌   WS2990   是 产气荚膜梭菌   WS2991   是 产气荚膜梭菌   WS2992   是 产气荚膜梭菌   WS2993   是 产气荚膜梭菌   WS2994   是 产气荚膜梭菌   WS2995   是 产气荚膜梭菌   WS2996   是 产气荚膜梭菌   WS2997   是 产气荚膜梭菌   WS2998   是 产气荚膜梭菌   WS2999   是 产气荚膜梭菌   WS3000   是 产气荚膜梭菌   WS3001   是 产气荚膜梭菌   WS3002   是 产气荚膜梭菌   WS3006   是 产气荚膜梭菌   WS3007   是 产气荚膜梭菌   WS3008   是 酪丁酸梭菌   WS2761   否 酪丁酸梭菌   WS2762   否 酪丁酸梭菌   WS2763   否 酪丁酸梭菌   WS2764   否 酪丁酸梭菌   WS2765   否 酪丁酸梭菌   WS2766   否 酪丁酸梭菌   WS2767   否 酪丁酸梭菌   WS2768   否 酪丁酸梭菌   WS2769   否 大肠杆菌   WS1329   否 瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)   WS2560   否 乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)   WS1030   否 肠沙门氏菌IV型(Salmonella enterica Group IV)   WS2870   否 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)   WS1294   否
结果：如图5所示，所有48种产气荚膜梭菌菌株都对根据本发明的溶 菌素敏感。只有一种其它梭菌种类表现出敏感性，它是谲诈梭菌(C.fallax) 菌株DSM2631。谲诈梭菌的敏感性可能是由于该梭菌种的细胞壁结构与产 气荚膜梭菌同样具有A3γ型肽聚糖，它通过LL-DAP与甘氨酸交联形成杂 合桥键(interbridge)(参见Schleifer等1972 Bacteriol Rev.36：407-77)。
在试验的所有其它细菌中(不论是诸如肉毒梭菌，破伤风梭菌，诺氏梭 菌，酪丁酸梭菌等其它梭菌种类，还是诸如芽孢杆菌属，弯曲杆菌属，明 串珠菌属，乳杆菌属，乳球菌属，片球菌属，肠杆菌属，大肠杆菌，利斯 特氏菌属，双歧杆菌属，肠球菌属，链球菌属，葡萄球菌属等非梭菌细菌)- 总共60个菌株-发现都对根据本发明的溶菌素不敏感。
结论
因此，令人惊奇的是，从产气荚膜梭菌的噬菌体分离和测序的溶菌素 对产气荚膜梭菌具有种特异性或者基本上具有种特异性。该种特异性的优 势在于给受试者施用所述的溶菌素导致选择性破坏产气荚膜梭菌和/或谲诈 梭菌(两者都是病原性梭菌属种类)而不伤害有益的和/或无害的细菌。
上面说明书中提及的所有出版物在本文中作为参考文献引用。本发明 所述的方法和系统的各种修改和变化在不偏离本发明范围和精神的前提下 对本领域的技术人员而言是显而易见的。尽管本发明结合特别优选的实施 方案进行了描述，应明白要求保护的本发明不应不适当地局限于该具体实 施方案。事实上，对生化和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的实 施本发明的所述方式的各种修改方案打算包含在下面权利要求书的范围 内。