一株鲍曼不动杆菌噬菌体及医用用途
阅读：1029发布：2020-05-15
专利汇可以提供一株鲍曼不动杆菌噬菌体及医用用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一株鲍曼不动杆菌 噬菌体 ，是一株具有杀伤活性的新型噬菌体，于2019年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，命名为：鲍曼不动杆菌噬菌体VB_AbaM_DC3，保藏编号为CCTCC NO：M 2019705。本发明进一步提供了鲍曼不动杆菌噬菌体的医用用途，该噬菌体具有较宽的裂解谱，可以裂解10株不同的鲍曼不动杆菌的临床分离株，可以单独或与除本发明之外的鲍曼不动杆菌噬菌体或其他消毒、杀菌物质配合使用，用于降低医院ICU病房及普通病房中鲍曼不动杆菌的数量，以减少院内感染的发生。，下面是一株鲍曼不动杆菌噬菌体及医用用途专利的具体信息内容。
一株鲍曼不动杆菌噬菌体及医用用途
技术领域
背景技术
[0002] 鲍曼不动杆菌是一种重要的病原菌，它广泛分布在湿润的环境中，并可以附着在人和动物的体表。鲍曼不动杆菌主要引起呼吸道感染，也可引发败血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎等多种疾病。另外，鲍曼不动杆菌易形成生物被膜，它可以吸附在医务人员的手或是医疗器械上面，造成感染的发生和传播。另外，由于抗生素的乱用和滥用，使得鲍曼不动杆菌的耐药现象日益严重，导致了“超级细菌”的出现，使得临床上一些鲍曼不动杆菌的感染变得无药可用。因此，寻求新型的抗菌制剂已经迫在眉睫。
[0003] 噬菌体是一种细菌病毒，它可以特异性的感染和杀死某种特定的细菌。烈性噬菌体通过尾丝蛋白或其他吸附相关的蛋白与宿主菌发生特异性的结合，然后将遗传物质注入到宿主菌内；首先阻断和接管宿主菌的所有代谢活动，并利用宿主菌的原料合成自身的基因组及结构蛋白；在噬菌体颗粒组装完成之后会合成裂解酶，从宿主菌内部将其细胞壁水解，最终使细菌发生崩解，释放出子代的噬菌体颗粒，然后开始下一轮的感染周期。噬菌体在发现之初，就被用于治疗细菌性感染，最初是用于促进创面的愈合。但是由于抗生素的大量发现和使用使得人们逐渐放弃了噬菌体疗法。但是近年来，随着耐药菌株的不断出现，抗生素治疗的效果越来越差，噬菌体疗法又重新受到了广大研究人员的关注。此外，有研究表明地球上约有1031数量的噬菌体，种类大约有106，这是一个非常丰富的资源库。与抗生素相比，二者最大的特点是：特异性，不影响正常菌群；与抗生素作用机制不同，对耐药菌株同样有效；高效性，可以快速的杀灭特定病原菌。目前，国内关于鲍曼不动杆菌噬菌体研究极少。
发明内容
[0004] 本发明公开一株鲍曼不动杆菌噬菌体，命名为：鲍曼不动杆菌噬菌体VB_AbaM_DC3，是一株具有杀伤活性的新型噬菌体。
[0005] 本发明进一步提供了鲍曼不动杆菌噬菌体的医用用途，该噬菌体具有较宽的裂解谱，可以裂解10株不同的鲍曼不动杆菌的临床分离株，可以单独或与除本发明之外的鲍曼不动杆菌噬菌体或其他消毒、杀菌物质配合使用，用于降低医院ICU病房及普通病房中鲍曼不动杆菌的数量，以减少院内感染的发生。
[0006] 本发明所述的鲍曼不动杆菌噬菌体，为分离自污水的新型噬菌体，该噬菌体具有呈正二十面体的头部和可伸缩的尾部；噬菌体在LB琼脂培养基上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为0.5-2mm；基因组核酸的酶切图谱显示该噬菌体核酸是双链DNA（dsDNA）；于2019年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2019705，命名为：鲍曼不动杆菌噬菌体 VB_AbaM_DC3。
[0007] 本发明的积极效果在于：提供了一株具有杀伤活性的新型噬菌体，该噬菌体具有较宽的裂解谱，可以裂解10株不同的鲍曼不动杆菌的临床分离株，可以单独或与除本发明之外的鲍曼不动杆菌噬菌体或其他消毒、杀菌物质配合使用，用于降低医院ICU病房及普通病房中鲍曼不动杆菌的数量，以减少院内感染的发生；利用本发明鲍曼不动杆菌噬菌体可以制备杀灭人体内、体表、病房、医疗器具或医疗空间环境中的鲍曼不动杆菌的药物添加剂、喷雾添加剂、消毒剂或清洁剂。
附图说明
附图说明
[0008] 图1. 本发明噬菌体VB_AbaM_DC3噬菌斑照片；图2. 本发明噬菌体VB_AbaM_DC3的透射电镜照片；
图3. 本发明噬菌体VB_AbaM_DC3的最佳MOI ；
图4.本发明噬菌体VB_AbaM_DC3的一步生长曲线。
图3. 本发明噬菌体VB_AbaM_DC3的最佳MOI ；
图4.本发明噬菌体VB_AbaM_DC3的一步生长曲线。
具体实施方式
[0009] 通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0010] 实施例1噬菌体分离及制备
噬菌体的分离过程在下文中详细描述。本发明中的污水样品采自长春市火烧李，宿主菌为鲍曼不动杆菌ABC3。采集污水，用纱布过滤，用处理过的污水代替ddH2O配制LB培养基（100mL）；培养基内加入1 mL过夜培养的宿主菌ABC3，37℃培养10-12h；取培养物1mL，
12000r/min离心2 min，上清用0.22 μm滤器过滤形成噬菌体原液并保存，将得到的滤液用于空斑测试，以检查是否包括能够鲍曼不动杆菌ABC3的噬菌体。
噬菌体的分离过程在下文中详细描述。本发明中的污水样品采自长春市火烧李，宿主菌为鲍曼不动杆菌ABC3。采集污水，用纱布过滤，用处理过的污水代替ddH2O配制LB培养基（100mL）；培养基内加入1 mL过夜培养的宿主菌ABC3，37℃培养10-12h；取培养物1mL，
12000r/min离心2 min，上清用0.22 μm滤器过滤形成噬菌体原液并保存，将得到的滤液用于空斑测试，以检查是否包括能够鲍曼不动杆菌ABC3的噬菌体。
[0011] 空斑测试：以1 %的比例在5ml LB液体培养基中接种鲍曼不动杆菌ABC3，37℃振荡培养过夜。取100 μL上述制备的细菌培养液滴于LB平板中，将菌液均匀涂布于平板上；待其晾干后，取上述噬菌体原液10 μL滴于其中一个区域；待自然晾干后，置于37℃培养箱培养10h后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成。
[0012] 如果有空斑形成，证明有噬菌体存在。取噬菌体原液1mL，进行一系列的10倍稀释。取10-4、10-5和10-6稀释液各100 μL与宿主菌培养物200 μl混匀，室温作用5min后，加入约7 mL ，45℃，LB半固体培养基中，混匀后迅速倾倒入1.5% LB琼脂培养基平板上层，摇匀平置
10min，待其凝固，置于37℃温箱培养8 h后观察，获得形成单个噬菌斑的双层平板。
10min，待其凝固，置于37℃温箱培养8 h后观察，获得形成单个噬菌斑的双层平板。
[0013] 实施例2噬菌体扩增和纯化
在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌的移液器的枪头挑取直径较大且透亮的单个噬菌斑，接种于5 ml LB液体培养基中，加入噬菌体宿主菌液200 μL，37℃震荡培养5 h，12000 r/min，4℃ 离心10 min，取上清；重复双层平板实验，如此反复4-5次，直至将噬形成大小一样的噬菌斑。
在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌的移液器的枪头挑取直径较大且透亮的单个噬菌斑，接种于5 ml LB液体培养基中，加入噬菌体宿主菌液200 μL，37℃震荡培养5 h，12000 r/min，4℃ 离心10 min，取上清；重复双层平板实验，如此反复4-5次，直至将噬形成大小一样的噬菌斑。
[0014] 取1mL新鲜培养的宿主菌，加300 μL噬菌体裂解液（以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例）。37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入800 mL TSB液体培养基，再加入CaCl2 母液至终浓度1.25mM，37℃摇振培养6 ~ 8h，12000 r/min，4℃ 离心10min，取上清，即为噬菌体裂解液。
[0015] PEG纯化：在噬菌体裂解液中加入RNase A、DNaseⅠ至终浓度均为1 μg/mL，室温放置30min；加入NaCl至终浓度为1 mol/L，混合均匀后，冰浴1-2 h；4℃，8000 r/min离心15-20min后收集上清；按每100 mL 10 g的量加入PEG-8000，轻轻搅拌使其溶解，冰浴2h以上（最好过夜），使噬菌体在PEG-8000作用下形成沉淀；4℃ ，12000 r/min离心10-20 min，弃掉上清液，加2mL SM液将沉淀重悬；加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30s；4℃ ，4000 r/min离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的上层亲水相，重复3-5次至液体变得澄清，获得纯化的噬菌体。
[0016] CsCl等密度梯度离心纯化: 按表制备CsCl梯度液，按照从高密度到低密度的顺序，在5mL半透明聚丙烯酰胺高速离心管中依次加入各梯度液1mL；将噬菌体浓缩液700μL缓慢加入到CsCl梯度液的上面，放到4℃高速离心机中，35000 r/min水平离心3h；离心结束后待真空下降为0时，打开仓门，取出样品，关机；样品下端有一层蓝色带，用细针头从带侧面插入，小心吸取；将样品置于透析袋中，用10 mM Tris-HCl，PH为7.4，100 mM MgCl2 缓冲液进行透析，2 L一次（10-14kd）；最终将样品吸出，测定噬菌体效价。
[0017] 采用双层平板法检测噬菌体效价：将以上纯化的噬菌体液进行10倍梯度稀释，取相应的几个梯度的噬菌体稀释液各100 μL与宿主菌液200 μL充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养10 h左右。选择噬菌斑个数在30-300之间的平皿进行计数，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价。纯化的噬菌体如图1所示，噬菌体在1.5%的LB琼脂培养基中可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为1-2mm。
[0018] 将纯化的噬菌体在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期为2019年9月9日，保藏号：CCTCC NO：M 2019705，分类命名：鲍曼不动杆菌噬菌体（Acinetobacter baumannii phage）VB_AbaM_DC3。
[0019] 实施例3噬菌体VB_AbaM_DC31透射电镜观察
取实施例2中PEG纯化的噬菌体做电镜观察，具体操作步骤为：加10 μL 样本滴在铜网上，待其沉淀15 min, 用滤纸吸去多余的液体，用 2%的磷钨酸（PTA）染色1-2min，干燥后使用透射电镜（日立H-7650）观察；观测结果如图2 所示，头部呈正二十面体，头部直径约为
35-40 nm，尾长约为80-90 nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV) 2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，VB_AbaM_DC3属于肌尾病毒科（Myoviridae）。
取实施例2中PEG纯化的噬菌体做电镜观察，具体操作步骤为：加10 μL 样本滴在铜网上，待其沉淀15 min, 用滤纸吸去多余的液体，用 2%的磷钨酸（PTA）染色1-2min，干燥后使用透射电镜（日立H-7650）观察；观测结果如图2 所示，头部呈正二十面体，头部直径约为
35-40 nm，尾长约为80-90 nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV) 2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，VB_AbaM_DC3属于肌尾病毒科（Myoviridae）。
[0020] 实施例4 噬菌体VB_AbaM_DC3的最佳MOI测定
最佳MOI测定：将培养至对数期的菌液调到浓度为108 CFU/mL，然后按照噬菌体/细菌的比例为0.001、0.01、0.1、1、10和100将噬菌体与菌进行混合，转接到LB液体培养基中，在
37℃振荡培养8h。将培养液在4℃进行10000 r/min离心15min，用0.22 μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤得到噬菌体增值液，利用双层平板法对增值液进行滴度测定，滴度最高的噬菌体/细菌比例即为VB_AbaM_DC3的最佳MOI，结果如图3所示。该噬菌体的最佳MOI为
0.01，表明该噬菌体具有高效的裂解活性。
最佳MOI测定：将培养至对数期的菌液调到浓度为108 CFU/mL，然后按照噬菌体/细菌的比例为0.001、0.01、0.1、1、10和100将噬菌体与菌进行混合，转接到LB液体培养基中，在
37℃振荡培养8h。将培养液在4℃进行10000 r/min离心15min，用0.22 μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤得到噬菌体增值液，利用双层平板法对增值液进行滴度测定，滴度最高的噬菌体/细菌比例即为VB_AbaM_DC3的最佳MOI，结果如图3所示。该噬菌体的最佳MOI为
0.01，表明该噬菌体具有高效的裂解活性。
[0021] 实施例5噬菌体VB_AbaM_DC3的一步生长曲线测定
一步生长曲线测定：将培养至对数期的宿主菌与噬菌体按照最佳MOI的比例进行混合，在37℃静置5 min，用新鲜LB液体培养基将沉淀悬起，将悬液置于37℃振荡培养，每隔10 min取一次样品测定噬菌体的滴度，从而绘制出噬菌体感染细菌的一步生长曲线，结果如图
4所示。噬菌体VB_AbaM_DC3的潜伏期约为30 min，爆发量约为105 PFU/mL，说明该噬菌体能够在短时间内大量扩增，进一步表明该噬菌体高效的裂解活性。
一步生长曲线测定：将培养至对数期的宿主菌与噬菌体按照最佳MOI的比例进行混合，在37℃静置5 min，用新鲜LB液体培养基将沉淀悬起，将悬液置于37℃振荡培养，每隔10 min取一次样品测定噬菌体的滴度，从而绘制出噬菌体感染细菌的一步生长曲线，结果如图
4所示。噬菌体VB_AbaM_DC3的潜伏期约为30 min，爆发量约为105 PFU/mL，说明该噬菌体能够在短时间内大量扩增，进一步表明该噬菌体高效的裂解活性。
[0022] 实施例6噬菌体VB_AbaM_DC3宿主谱分析
将实施例2获得的噬菌体VB_AbaM_DC3效价调整为10 8 PFU/mL备用。试验选择多株鲍曼不动杆菌作为对象，对噬菌体VB_AbaM_DC3的宿主谱进行分析，具体操作如下：
空斑试验测定：分别取待测菌株的过夜培养物100 μL，滴加在1.5% LB培养基平板中央，用涂棒分别将它们涂制成均匀的菌苔。取10 μL噬菌体VB_AbaM_DC3滴加在菌苔表面，待液滴干燥后倒置于37℃培养箱培养12 16h，观察结果，如有空斑产生则记为“+”，否则为~
“-”，结果如表1所示。在所测试的36株鲍曼不动杆菌中，噬菌体VB_AbaM_DC3能够裂解其中
10株菌，裂解率为27.8%，表明该噬菌体具有较宽的裂解谱，具有一定的广谱裂解作用。
将实施例2获得的噬菌体VB_AbaM_DC3效价调整为10 8 PFU/mL备用。试验选择多株鲍曼不动杆菌作为对象，对噬菌体VB_AbaM_DC3的宿主谱进行分析，具体操作如下：
空斑试验测定：分别取待测菌株的过夜培养物100 μL，滴加在1.5% LB培养基平板中央，用涂棒分别将它们涂制成均匀的菌苔。取10 μL噬菌体VB_AbaM_DC3滴加在菌苔表面，待液滴干燥后倒置于37℃培养箱培养12 16h，观察结果，如有空斑产生则记为“+”，否则为~
“-”，结果如表1所示。在所测试的36株鲍曼不动杆菌中，噬菌体VB_AbaM_DC3能够裂解其中
10株菌，裂解率为27.8%，表明该噬菌体具有较宽的裂解谱，具有一定的广谱裂解作用。
[0023] 表1. 噬菌体VB_AbaM_DC3宿主普分析结论：本发明提供的鲍曼不动杆菌噬菌体VB_AbaM_DC3具有高效的裂解活性和宽裂解谱，可以有效的降低医院ICU病房及普通病房中鲍曼不动杆菌的数量，以减少院内感染的发生；利用本发明鲍曼不动杆菌噬菌体可以制备杀灭人体内、体表、病房、医疗器具或医疗空间环境中的鲍曼不动杆菌的药物添加剂、喷雾添加剂、消毒剂或清洁剂。
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