布鲁氏菌噬菌体多核苷酸及其用途
阅读：1027发布：2020-05-24
专利汇可以提供布鲁氏菌噬菌体多核苷酸及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了包含布鲁氏菌 噬菌体 核酸序列的分离多核苷酸，该核酸序列对布鲁氏菌噬菌体有特异性并包含选自由SEQ ID NO：387‑393组成的组中的序列。示例性多核苷酸序列是包含SEQ ID NO:396中列出的核酸序列的至少100个连续核苷酸的多核苷酸序列。进一步公开了此种序列的用途。，下面是布鲁氏菌噬菌体多核苷酸及其用途专利的具体信息内容。
布鲁氏菌噬菌体多核苷酸及其用途
技术领域
[0001] 本发明在其一些实施方式中涉及布鲁氏菌（Brucella）噬菌体核酸序列及其用途。
背景技术
[0002] 布鲁氏菌（布鲁氏菌属，Brucella）是革兰氏阴性的小球杆菌属细菌。它们是导致天然宿主在怀孕的最后阶段流产的动物病原体。布鲁氏菌属包括10个物种，这10个物种分为带有光滑和粗糙外膜LPS的生物。分别与小反刍动物、牛和猪的布鲁氏菌病相关的三个光滑型布鲁氏菌物种（马尔他布鲁杆菌（羊布鲁氏菌，B.melitensis）、流产布鲁氏菌（流产布鲁杆菌，B.abortus）和猪布鲁氏菌（猪布鲁杆菌，B.suis））是人畜共患病的（zoonotic to humans）。将与海洋哺乳动物布鲁氏菌病相关的鲸型布鲁氏菌（B.ceti）和鳍型布鲁氏菌（B.pinnipedialis）记载为人布鲁氏菌病的致病物（致病因素）的报告不常见。另外，与犬布鲁氏菌病相关的犬布鲁氏菌（B.canis）是导致人感染的粗糙型生物。该疾病在人中表现为波状热，也称为马尔他发热，且它可能是由脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎和其他并发症的慢性疾病或表现造成的。在极少数情况下该疾病可能变成致命的。
[0003] 布鲁氏菌噬菌体是对布鲁氏菌物种有特异性的细菌病毒。布鲁氏菌噬菌体和它们的分类学关联性的综述出版于1981年。所有同时期已知的布鲁氏菌噬菌体显示包含属于短尾病毒科（Podoviradae）的相似的二十面体头和短尾形态。根据抗原和生理特性以及对化学试剂和物理试剂的抗性，显示所研究的噬菌体密切相关。这些研究结果激发作者将所概述的变体包括到单个物种中并提出噬菌体Tb为病毒类型（Ackerman,H.-W.,Simon,F.,和Verger,J.-M.1981.Intervirology 16:1-7）。
[0004] 布鲁氏菌噬菌体具有大小为约38千个碱基对的线性双链DNA。噬菌体Tb、Fi、Wb、Iz和R/C的限制酶消化分析在DNA上表现出相似性，而且几乎没有发现噬菌体的溶源性存在或者宿主中存在质粒形式的证据。
[0005] 先前的研究已确定鸟嘌呤核苷-胞嘧啶在噬菌体Tb中的含量为45.3-46.7%，而预期它在其他噬菌体中具有更高的百分比，为48.9%。
[0006] 数位研究者已指出噬菌体作为病原性疾病治疗药剂的用途（Brüssow,H.2005.Microbiol.151:2133–2140;Summers,W.C.2001.Ann.Rev.Microbiol.55:437-
451）。
451）。
[0007] 另外，布鲁氏菌噬菌体已用于布鲁氏菌分型，且噬菌体敏感性试验已变成分类和确定布鲁氏菌属的分类树的工具。具体地，有人建议布鲁氏菌属的分类品种（nomen-species）的划分部分地根据它们的物种特异性噬菌体敏感性判断，该物种特异性噬菌体敏感性也与菌株的宿主从属关系（亲和，affiliation）具有良好的相关性。布鲁氏菌噬菌体已根据它们对布鲁氏菌属某些种（Brucella spp）的感染性分成7组。噬菌体Izatnagar（Iz1）代表对所有光滑型布鲁氏菌分类品种（nomenspecies）和部分粗糙型菌株有感染性的组6（Corbel和Tolari,1988,Res Vet Sci;44:45-49）。
[0008] Zhu等人,2009[Int.J.Mol.Sci.10:2999–3011]教导了Tb（Tbilisi，第比利斯）布鲁氏菌噬菌体的部分序列。
[0009] Rigby等人,1989[Can J Vet Res.53:319-325]教导了Nepean噬菌体和布鲁氏菌物种的其他裂解性噬菌体的部分序列。
发明内容
[0011] 根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了包含布鲁氏菌噬菌体核酸序列的分离多核苷酸，该核酸序列对布鲁氏菌噬菌体有特异性并包含选自由SEQ ID NO:396和387-393组成的组中的序列。
[0012] 根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了与本发明分离多核苷酸杂交的长度为至少15个核苷酸的分离多核苷酸。
[0013] 根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了下调目的基因在细菌中的表达的方法，该方法包括用包含布鲁氏菌噬菌体调节序列的核酸构建体转化细菌，从而下调目的基因的表达。
[0014] 根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了包含SEQ ID NO:396中列出的核酸序列的至少100个核苷酸的核酸构建体。
[0015] 根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了核酸构建体，其包含：
[0016] i.编码可操作地融合到布鲁氏菌启动子上的目的基因的多核苷酸；
[0017] ii.融合到该启动子5’端上的第一布鲁氏菌噬菌体序列，该第一序列包含SEQ ID NO:394中列出的核酸序列的至少100个核苷酸；和
[0018] iii.融合到目的基因3’端上的第二布鲁氏菌噬菌体序列，该第二序列包含SEQ ID NO:395中列出的核酸序列的至少100个核苷酸。
[0020] 根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了分离布鲁氏菌属细菌细胞，其包含本发明的重组布鲁氏菌噬菌体。
[0021] 根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了诊断受验者布鲁氏菌感染的方法，该方法包含使受验者的样品与本发明重组布鲁氏菌噬菌体接触，从而诊断布鲁氏菌感染。
[0022] 根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了诊断受验者布鲁氏菌感染的方法，该方法包含使受验者的样品与本发明的分离布鲁氏菌属细菌细胞接触，从而诊断布鲁氏菌感染。
[0023] 根据本发明一些实施方式，该分离多核苷酸包含SEQ ID NO:396中列出的核酸序列的至少100个连续核苷酸。
[0024] 根据本发明一些实施方式，该分离多核苷酸包含SEQ ID NO:396中列出的序列。
[0025] 根据本发明一些实施方式，该分离多核苷酸包含SEQ ID NO:387-393中列出的核酸序列。
[0026] 根据本发明一些实施方式，该分离多核苷酸具有SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。
[0027] 根据本发明一些实施方式，该分离多核苷酸在正向或反向包含选自由SEQ ID NO:394和395组成的组中的至少一个核酸序列。
[0028] 根据本发明一些实施方式，该分离多核苷酸进一步包含异源核酸序列和引导（指导）异源核酸序列的表达的异源启动子序列。
[0029] 根据本发明一些实施方式，该核酸序列包含转录调节区。
[0030] 根据本发明一些实施方式，该转录调节区包含布鲁氏菌噬菌体启动子。
[0031] 根据本发明一些实施方式，该分离多核苷酸包含SEQ ID NO:2-386中列出的序列。
[0032] 根据本发明一些实施方式，该异源核酸序列编码可检测部分。
[0033] 根据本发明一些实施方式，该异源核酸序列编码对布鲁氏菌有致死性的多肽。
[0034] 根据本发明一些实施方式，该细菌包含布鲁氏菌属细菌。
[0035] 根据本发明一些实施方式，该布鲁氏菌属细菌菌株包含猪布鲁氏菌或马尔他布鲁杆菌（羊布鲁氏菌）。
[0036] 根据本发明一些实施方式，该基因是对细菌内源的基因。
[0037] 根据本发明一些实施方式，该基因是对该细菌噬菌体内源的基因。
[0038] 根据本发明一些实施方式，该调节序列包含SEQ ID NO:396中列出的核酸序列的至少100个核苷酸。
[0039] 根据本发明一些实施方式，该调节序列包含SEQ ID NO:396中列出的序列。
[0040] 根据本发明一些实施方式，该调节序列进一步包含SEQ ID NO:397中列出的序列。
[0041] 根据本发明一些实施方式，该调节序列的侧面有转座子序列。
[0042] 根据本发明一些实施方式，该核酸构建体包含SEQ ID NO:396中列出的核酸序列。
[0043] 根据本发明一些实施方式，该核酸序列的侧面有转座子序列。
[0044] 根据本发明一些实施方式，目的基因编码治疗性多肽。
[0045] 根据本发明一些实施方式，目的基因编码可检测部分。
[0046] 根据本发明一些实施方式，目的基因包含在Lux操纵子中。
[0047] 根据本发明一些实施方式，该可检测信号是发光信号。
[0048] 根据本发明一些实施方式，该重组布鲁氏菌噬菌体包含裂解活性。
[0049] 根据本发明一些实施方式，该噬菌体基因组包含编码可检测信号的多核苷酸序列。
[0050] 除非另有限定，否则本文使用的所有技术和/或科学术语的含义都与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同。虽然下面描述了示例方法和/或材料，但本发明实施方式的实践或试验中可使用与本文所描述的那些相似或者等效的方法和材料。如有冲突，以专利说明书为准，包括定义。另外，材料、方法和实例仅为了说明，并非为了限制。附图说明
[0051] 本文仅参考附图举例说明本发明的一些实施方式。关于下面详细讨论的示图，要强调的是，所示细节仅为了举例，用于示意性地讨论本发明的实施方式。在这方面，参考示图所作的描述将使本领域普通技术人员明了本发明的实施方式如何实施。
[0052] 在图中：
[0053] 图1示出在具有通过测序仪鉴定的38255个核苷酸的特异共有序列（consensus）最大重叠群（contigue）上证实的阅读序列。可以看出，C和A各自等同地分配在核苷酸5549和5550处的8个重叠群中，在一个或其他位置中留出单个核苷酸空隙。这表明SNP（或杂合子）分别位于C和A之间的位置5549处。在每个构建体中，N均被准确地鉴定为C。
[0054] 图2描述了已成功亚克隆到质粒pBS中的9个噬菌体Iz1DNA片段。这些片段与全噬菌体Iz1基因组DNA杂交，并且核苷酸测序证实它们的准确序列，该序列与完整噬菌体基因组中的重叠序列相同。
[0055] 图3A-B是示出基于布鲁氏菌质粒pBBR1mcs-4.1-II1053LuxCDABE的两个质粒构建体的示意图。这些构建体包括延伸在核苷酸15500~16509和18579~19630之间的噬菌体Iz1DNA片段，以及以正确取向添加到它们的3’端和5’端的Tn5镶嵌端（mosaic end）之一。这些工程化改造片段在两个取向上分别克隆到Lux的上游和下游。
[0056] 图4是示出用于构建图3B所示的质粒构建体的引物位置的示意图。
[0057] 图5是示出用以产生布鲁氏菌噬菌体载体克隆所采取的步骤的流程图。
具体实施方式
[0058] 本发明在其一些实施方式中涉及布鲁氏菌噬菌体核酸序列及其用途。
[0059] 在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应理解本发明的应用不必局限于下面说明书中陈述的或通过实例举例说明的细节。本发明能够有其他实施方式，或能够以多种方式实践或实施。
[0060] 布鲁氏菌物种是影响多种哺乳动物的重要的人畜共患病病原体。在农业方面重要的家畜中，这些细菌导致流产和不孕，它们是严重的全世界性经济问题。感染人的布鲁氏菌物种引起波状热，波状热如果未经治疗，会表现为睾丸炎、骨关节炎、脊椎炎、心内膜炎、和神经障碍。在极少数情况下它可能是致命的。
[0061] 本发明人已对作为所有其他布鲁氏菌噬菌体基因型代表的布鲁氏菌噬菌体Iz1的整个基因组（38,254个碱基对）进行测序。鉴定出两个基因组布鲁氏菌噬菌体Iz1群体，它们之间的差异在于核苷酸5549处的C或A。对这个序列进行BLAST分析，发现与人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi）ATCC 49188染色体1具有同源性的6个区—参见本文下面实施例部分中的表2。从全长基因组序列中扣除这些序列，使得本发明人发现对布鲁氏菌噬菌体有特异性的新的多核苷酸序列（例如，SEQ ID NO:387-393）。
[0062] 从该序列搜集的信息已使本发明人能够鉴定最少数量的ORF的明显顺序，其可用于将目的基因（例如，编码可检测部分的那些）插入到该噬菌体中，而不影响它的裂解活性。因而，依据噬菌体基因组中这个位点被可检测信号（例如，Lux操纵子）重组替代，探索重组布鲁氏菌噬菌体的发育。由于输出这个信号，因此此种噬菌体可以用来鉴定布鲁氏菌属细菌。产生噬菌体载体布鲁氏菌克隆，其中噬菌体Iz1在质粒pBBR1mcs4.1-II1053/luxCDABE/
15B-18B（图3B）的存在下共同存在（共同居住，co-residence）于该细胞中，为发生在质粒DNA上的Lux操纵子与布鲁氏菌噬菌体DNA之间的重组事件提供无限的机会。
15B-18B（图3B）的存在下共同存在（共同居住，co-residence）于该细胞中，为发生在质粒DNA上的Lux操纵子与布鲁氏菌噬菌体DNA之间的重组事件提供无限的机会。
[0063] 另外，本发明人已在噬菌体中鉴定出调节区，该调节区具有调节功能并且显示能够下调由质粒赋予的光表达，指示在布鲁氏菌属细菌内实施此种基因调节机制的可能性。
[0064] 因而，例如，本发明人鉴定出可在转化到布鲁氏菌属细菌中之后下调可操作地连接到其上的基因的噬菌体DNA片段（SEQ ID NO:396;19630-18579）。当这个序列与另外的噬菌体DNA片段（SEQ ID NO:397;16509-15500）一起转化到布鲁氏菌属细菌中时，它为布鲁氏菌物种赋予不同的致死活性，对流产布鲁氏菌菌株544具有最强的致死性，对羊布鲁氏菌具有较小的致死性，而对布鲁氏菌的猪布鲁氏菌菌株无致死性。相应地，这个片段的下调活性也显示出是物种特异性的。
[0065] 噬菌体调节区的知识有利于计算机鉴定布鲁氏菌基因组内另外未识别的调节序列。这种途径已在属于α-变形杆菌类别的豆科植物内共生菌苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）（del Val C等人,Mol Microbiol 2007;66:1080-1091），以及植物冠瘿病（Crown-Gall）的致病物根癌农杆菌（Agrobactrum tumefaciens）和布鲁氏菌中得到证明，表明这些生物之间存在密切的关系，因而可能具有共同的功能（Inon de Iannino N等人,JBacteriol 1998;180:4392-4400）。
[0066] 因而，根据本发明的一个方面，提供了包含布鲁氏菌噬菌体核酸序列的分离多核苷酸，该核酸序列对布鲁氏菌噬菌体有特异性并包括选自由SEQ ID NO:387-393组成的组中的序列。
[0067] 如本文所使用的，术语“噬菌体”（与术语“细菌噬菌体”同义）是指选择性地感染原核生物——如细菌的病毒。许多细菌噬菌体对细胞的特定属或种或菌株有特异性。
[0068] 该噬菌体通常为裂解性细菌噬菌体。
[0069] 裂解性细菌噬菌体是一种通过完成裂解循环，沿裂解途径前进，而不进入溶原途径的噬菌体。裂解性细菌噬菌体经历病毒复制，导致细胞膜的裂解、摧毁细胞并释放能够感染其他细胞的子代细菌噬菌体颗粒。
[0070] 溶原性细菌噬菌体是一种能够进入溶原途径的噬菌体，其中该细菌噬菌体在完成它的裂解循环之前变成细胞基因组的蛰伏、不活泼（passive）部分。
[0071] 根据一个实施方式，该噬菌体是Tb型噬菌体，例如，噬菌体Iz1。
[0072] 对布鲁氏菌噬菌体有特异性的序列一种存在于该噬菌体中，但不存在于其他生物体中的序列——即对布鲁氏菌特有的序列。由于布鲁氏菌噬菌体基因组的序列现在是已知的，因此布鲁氏菌噬菌体特异性序列可以利用BLAST或其他类似程序鉴定。
[0074] 根据一个实施方式，布鲁氏菌噬菌体特异性序列与另一个核酸序列的同一性不大于60%，如利用序列比对软件如BLAST分析证实的。
[0075] 如本文所使用的，短语“分离多核苷酸”是指分离并以RNA序列、互补多核苷酸序列（cDNA）、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列（例如，上面的组合）形式提供的单链或双链核酸序列。
[0076] 如本文所使用的，短语“互补多核苷酸序列”是指利用逆转录酶或任何其他RNA依赖性DNA聚合酶逆转录信使RNA产生的序列。此种序列随后可以利用DNA依赖性DNA聚合酶在体内或体外扩增。
[0077] 如本文所使用的，短语“基因组多核苷酸序列”是指源（分离）自染色体的序列，因而它代表染色体的邻接部分。
[0078] 如本文所使用的，短语“复合多核苷酸序列”是指这样的序列，其至少部分是互补的且至少部分是基因组的。复合序列可以包括编码本发明的多肽所需的一些外显子（exonal）序列，以及介入其间的一些内含子序列。这些内含子序列可以是任何来源的，包括其他基因，并通常包括保守剪接信号序列。此种内含子序列可以进一步包括顺式作用的表达调节元件。
[0079] 根据一个实施方式，该分离多核苷酸包含SEQ ID NO:387-393中列出的序列的至少15个、至少20个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少500个或至少1000个连续核苷酸。
[0080] 因而，本发明多核苷酸长度可以为15-38,254个核苷酸。
[0081] 应理解，本发明也涵盖了上文描述的序列的同源物。因此，本发明这个方面的多核苷酸可以具有与源自SEQ ID NO:387-393的序列有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少93%、至少95%或多至100%同一性的核酸序列，如利用国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的BlastN软件利用缺省参数测定的。
[0082] 因而，本发明包括上文所述的核酸序列、其片段、可与其杂交的序列、与其取向相反的序列、与其同源的序列、编码具有不同的密码子使用的类似多肽的序列、以突变为特征的改变序列，所述突变为，例如一个或多个核苷酸的缺失、插入或置换，这种突变是天然发生的或人工诱导的，随机或以靶向方式进行的。
[0083] 本发明考虑的示例性多核苷酸是包含SEQ ID NO:1和387-393中列出的核酸序列的那些。
[0084] 本发明考虑的其他示例性多核苷酸是这样的多核苷酸，其包含SEQID NO:387-393中列出的序列内的调节区，例如如本发明人给出的SEQ IDNO:395中列出的调节区的至少100个连续核苷酸，从而在以相反取向（即，SEQ ID NO:396）插入时具有下调可操作地连接到其上的基因的活性。另一个调节序列在正向或反向取向上都包括SEQ ID NO:394。这也存在于可能影响噬菌体Iz1基因的调节功能的完整噬菌体基因组中。
[0085] 利用生物信息学工具，本发明人在噬菌体中鉴定出可用作启动子序列的噬菌体基因组全长序列内的另外的调节区（即，转录调节区）（SEQ IDNO:2-386）。此种启动子序列可以设置在异源性核酸序列的上游以便促进它的转录。而且，该下调活性可以用来鉴定改变转录调节区活性的重要化学物，从而有利于新药的开发。
[0086] 还提供了编码推定的多肽的其他序列，它们也被认为在本发明范围内。此种序列提供在本文下表1中。编码此种多肽的多核苷酸序列可以用于各种用途。因而，例如编码推定的溶解素（lysin）和穿孔素（holin）的多核苷酸序列可以用来选择性地灭杀布鲁氏菌细胞。基于溶解素的治疗的优点很多：它们可以高纯度制备并具有高特异活性；它们表现出迅速的致死作用；它们是无毒的；以及明显地，所形成的对抗这些蛋白质的抗体不会中和它们的裂解活性。最后，没有细菌对这些蛋白质产生抗性，可能是因为它们具有用于细胞壁结合和水解的多个结构域。
[0087] 另外的重要多肽的实例是：
[0088] 1.包括鞭毛蛋白的分泌蛋白（分泌型III，这种装置与许多革兰氏阴性病原体使用的注射体（injectisome）和用于将效应蛋白质转移到宿主细胞中的共生体（symbiont）有关）和VirB（分泌型IV，DNA跨生物膜的易位是许多活生物体的必需过程。在细菌中，IV型分泌系统（T4SS）用于将DNA以及蛋白质底物从供体递送到靶细胞。T4SS是由一打或更多膜蛋白质响应于环境信号组装而成的结构复杂的布局（机器，machine）。DNA跨生物膜的易位是许多活生物体的必需过程。在细菌中，IV型分泌系统（T4SS）用于将DNA以及蛋白质底物从供体递送到靶细胞。T4SS是由一打或更多膜蛋白质响应于环境信号组装而成的结构复杂的布局（机器））。
[0089] 2.噬菌体整合酶—在溶原性循环中催化细菌噬菌体的位点特异性整合和切除。
[0090] 3.毒素，磷脂酶—降解磷脂，蛋白酶—降解蛋白质。
[0091] 表1
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[0145]
[0146]
[0147]
[0148] 如本文上面所述，本发明也考虑了与本文上面所述的分离多核苷酸杂交的分离多核苷酸。此种多核苷酸可用于监测布鲁氏菌噬菌体基因表达，最终允许检测细菌污染的环境中的布鲁氏菌菌株（即，诊断）。
[0149] 此种多核苷酸通常包含在实验条件下与布鲁氏菌噬菌体序列的至少约8个、10个、13个、15个、18个、20个、22个、25个、30个、40个、50个、55个、60个、65个、70个、80个、90个、
100个、120个（或其间任何其他数目），或更多个连续核苷酸杂交的互补核苷酸序列的区域。
100个、120个（或其间任何其他数目），或更多个连续核苷酸杂交的互补核苷酸序列的区域。
[0150] 该多核苷酸（或其多个）可被固定至固体载体（例如，在阵列中），并可用于监测布鲁氏菌样品中的噬菌体表达。
[0151] 替换地，该多核苷酸可用作引物对中的引物，并可以用于扩增反应中（例如，PCR）鉴定布鲁氏菌噬菌体。
[0152] 对条件加以选择，使其有利于该多核苷酸与布鲁氏菌噬菌体序列的杂交，并将该多核苷酸与其他非布鲁氏菌噬菌体核酸序列的杂交减至最低。
[0153] 例如，短核酸（长度在200bp以下，例如，长度为13-50bp）的杂交可以根据所需的严格度通过下列杂交方案实现；（i）杂交液为6x SSC和1%SDS或3M TMACl，0.01M磷酸钠（pH 6.8），1mM EDTA（pH 7.6），0.5%SDS，100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和0.1%脱脂干奶粉，杂交温度低于Tm 1-1.5°C，最后的洗涤液为3M TMACl,0.01M磷酸钠（pH 6.8），1mM EDTA（pH 7.6），
0.5%SDS，低于Tm 1-1.5°C洗涤（严格杂交条件）；（ii）杂交液为6x SSC和0.1%SDS或3M TMACI，0.01M磷酸钠（pH 6.8），1mM EDTA（pH 7.6），0.5%SDS，100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和
0.1%脱脂干奶粉，杂交温度低于Tm 2-2.5°C，最后的洗涤液为3M TMACl，0.01M磷酸钠（pH
6.8），1mM EDTA（pH 7.6），0.5%SDS，低于Tm 1-1.5°C洗涤，以及最后的洗涤液6x SSC，最后在22°C洗涤（严格至中等的杂交条件）；和（iii）杂交液为6x SSC和1%SDS或3MTMACI，0.01M磷酸钠（pH 6.8），1mM EDTA（pH 7.6），0.5%SDS，100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和0.1%脱脂干奶粉，杂交温度低于Tm 2.5-3°C，最后的洗涤液为6x SSC，22°C（中等杂交方案）。
0.5%SDS，低于Tm 1-1.5°C洗涤（严格杂交条件）；（ii）杂交液为6x SSC和0.1%SDS或3M TMACI，0.01M磷酸钠（pH 6.8），1mM EDTA（pH 7.6），0.5%SDS，100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和
0.1%脱脂干奶粉，杂交温度低于Tm 2-2.5°C，最后的洗涤液为3M TMACl，0.01M磷酸钠（pH
6.8），1mM EDTA（pH 7.6），0.5%SDS，低于Tm 1-1.5°C洗涤，以及最后的洗涤液6x SSC，最后在22°C洗涤（严格至中等的杂交条件）；和（iii）杂交液为6x SSC和1%SDS或3MTMACI，0.01M磷酸钠（pH 6.8），1mM EDTA（pH 7.6），0.5%SDS，100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和0.1%脱脂干奶粉，杂交温度低于Tm 2.5-3°C，最后的洗涤液为6x SSC，22°C（中等杂交方案）。
[0154] 该多核苷酸可以进一步用可检测部分标记。标记核酸分子的方法在本领域中是熟知的。对于标记方案、标记检测技术、和本领域研究现状的综述参见，例如，L.J.Kricka,Ann.Clin.Biochem.2002,39:114-129；R.P.vanGijlswijk等人,Expert Rev.Mol.Diagn.2001,1:81-91；和S.Joos等人,J.Biotechnol.1994,35:135-153。
[0155] 如所描述的，本发明人已在布鲁氏菌噬菌体基因组中鉴定出充当布鲁氏菌和其他细菌中的调节序列的区域—参见本文下面实施例部分的表3。
[0156] 因而，根据本发明的另一个方面，提供了下调细菌中目的基因的表达的方法，该方法包括用包含布鲁氏菌噬菌体调节序列的核酸构建体转化细菌，从而下调目的基因的表达。
[0157] 如本文所使用的，短语“布鲁氏菌属细菌”是指布鲁氏菌属的所有菌株，包括但不限于，流产布鲁氏菌菌株544、猪布鲁氏菌菌株1330和羊布鲁氏菌菌株16M。根据特定的实施方式，在布鲁氏菌属的猪布鲁氏菌或羊布鲁氏菌中实现所述下调。
[0158] 细菌构建体的实例包括大肠埃希氏菌表达载体的pET系列[Studier等人,(1990)Methods in Enzymol.185:60-89]。使布鲁氏菌属细菌中的表达能够进行的细菌构建体的实例为质粒pBBR1mcs-4（（Kovach等人,1995,Gene 1995;166:175-176)，其内容以引用方式并入），和pNSGroE质粒（Seleem等人,BioTechniques 37:740-744(2004年11月)，其内容以引用方式并入）。
[0159] 应理解，本发明这个方面的方法可用于下调对细菌内源的基因的表达或包括在细菌中的对噬菌体内源的基因的表达。
[0160] 优选使目的基因下调至少10%。根据一个实施方式，使目的基因下调约50%。根据另一个实施方式，使目的基因下调约90%。
[0161] 目的基因的实例包括编码对于细菌存活重要的多肽的基因。通过下调此种基因，该方法可以用来灭杀布鲁氏菌属细菌，从而治疗布鲁氏菌感染。
[0162] 本发明考虑了，在调节区的任一侧插入转座子序列，使得它可以经由转座事件随机地插入到细菌基因组或位点特异性设计的突变中。
[0163] 如本文所使用的，术语“转座事件”是指转座子从供体位点移动到靶位。
[0164] 如本文所使用的，术语“转座子”是指基因元件，包括但不限于可从一个染色体位点移动到另一个染色体位点的DNA或RNA区段。
[0165] 示例性转座子序列提供在SEQ ID NO:398（ME1转座子序列）和SEQID NO:399（ME2转座子序列）中。为了定向下调特定基因，可以将细菌序列添加到调节区的任一侧上，从而使重组事件容易进行。
[0166] 根据一个实施方式，该调节区包含SEQ ID NO:396（19630-18579）中列出的核酸序列中的从100个至所有核苷酸。
[0167] 任选地，该核酸构建体包含另外的调节区，如SEQ ID NO:397（16509-15500）中列出的调节区。
[0168] 根据特定实施方式，该核酸构建体进一步包含异源性核酸序列和位于其上游的启动子序列，该启动子序列引导（指导）异源性核酸序列的表达。对该启动子序列进行选择，以使它允许异源性核酸序列在细菌中的转录进行。因而，可用于布鲁氏菌中的示例性启动子为SEQ ID NO:400中列出的启动子。可用于在布鲁氏菌中表达异源性核酸序列的另一个启动子包括groE启动子[Saleem等人，BioTechniques 37:740-744(November 2004)]。本发明也考虑了本领域中已知的另外的原核启动子。
[0169] 该调节区（例如，SEQ ID NO:396）通常紧接异源性序列的下游放置以便下调它的表达。
[0170] 本发明所考虑的可用来证明SEQ ID NO:396具有调节活性的示例性构建体可包括：
[0171] i.编码可操作地融合到布鲁氏菌启动子上的目的基因（例如，可检测部分）的多核苷酸；和
[0172] ii.融合到目的基因3’端的布鲁氏菌噬菌体序列，该调节序列包含SEQ ID NO:396中列出的核酸序列中的从100个核苷酸至所有核苷酸。
[0173] 任选地，该构建体也可以包含：
[0174] iii.融合到该启动子5’端上的布鲁氏菌噬菌体序列，该序列包含SEQID NO:397中列出的核酸序列中的从100个核苷酸至所有核苷酸。
[0175] 应理解，当异源性核酸序列编码可检测部分时，它可以用于确定布鲁氏菌菌株。本发明人已证明包含紧接可检测部分下游放置的SEQ IDNO:396的质粒构建体可以菌株特异性方式下调可检测部分的表达。因而，可检测部分在猪布鲁氏菌中的表达几乎完全下调，而在羊布鲁氏菌中的表达仅部分下调。此种构建体也可以用于确定哪种细菌对布鲁氏菌噬菌体调节区敏感和通过下调基因来（工程化）改造这些细菌。另外，该构建体可用作译解通过分析可检测信号改良启动子活性的新因子的工具。
[0176] 该可检测部分通常包含在发出可检测信号的报告多肽中。它可以是荧光信号（例如，绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）或黄色荧光蛋白（YFP））；发光信号（如荧光素酶-LUX）或颜色信号（如β-葡萄糖醛酸酶（GUS）和β-半乳糖苷酶）。另外，该多肽的转录RNA可以用作该体系的报告产物。
[0177] 根据本发明这个方面的具体实施方式，该异源性核酸序列编码LUX操纵子。此种操纵子被SEQ ID NO:401中列出的序列编码。有关LUX操纵子的进一步信息可以在Winson MK,Swift S,Hill PJ,Sims CM,Griesmayr G，Bycroft BW，Williams P，Stewart GSAB.1998,Engineering the luxCDABE genes from Photorhabdus luminescens to provide a bioluminescent reporter for constitutive and promoter probe plasmids and mini-Tn5 constructs.FEMS Microbiol Letteres 163:193-202;Craney A Hohenauer T,Xu Y，Navani NK,Li Y，Nodwell J.2007.A synthetic luxCDABE gene cluster optimized for expression in high-GC bacteria.Nuc Acid Res 35:No.6e46中找到，这两篇文献都以引用的方式并入。
[0178] 本发明人在布鲁氏菌噬菌体基因组中鉴定出缺乏开放阅读框的序列，并产生使目的基因（例如，编码可检测部分的那些）容易在那些位置插入到布鲁氏菌噬菌体中以便不影响该噬菌体的重要（vital）生命周期的构建体。
[0179] 因而，根据本发明的又一个方面，提供了核酸构建体，其包含：
[0180] i.编码可操作地融合到布鲁氏菌启动子上的目的基因的多核苷酸；
[0181] ii.融合到该启动子5’端上的第一布鲁氏菌噬菌体序列，该第一序列包含SEQ ID NO:394中列出的核酸序列中的100个核苷酸至所有核苷酸；和
[0182] iii.融合到目的基因3’端上的第二布鲁氏菌噬菌体序列，该第二序列包含SEQ ID NO:395中列出的核酸序列中的100个核苷酸至所有核苷酸。
[0183] 因为在目的基因（即，SEQ ID NO:394和SEQ ID NO:395）周围的旁侧序列是布鲁氏菌噬菌体序列，所以可利用此种构建体通过重组将目的基因插入到布鲁氏菌噬菌体基因组中。
[0184] 如果需要可用于鉴定布鲁氏菌属细菌（和诊断感染）的噬菌体，则目的基因可编码可检测部分。可检测部分在本文以上部分有进一步描述。
[0185] 如果需要可用于灭杀布鲁氏菌属细菌的噬菌体，则目的基因可编码对布鲁氏菌属细菌有致死性的多肽。此种多肽可包括抗细菌毒素（细菌素）等。另外，可以利用非翻译序列下调重要的细菌功能，并可以利用影响这些序列的因子控制细菌功能。
[0186] 本文以下的实施例部分中的实施例3和4描述了产生携带作为共同存在（共同居住，co-residence）的重组菌株的噬菌体的布鲁氏菌属细菌的方法。此种载体布鲁氏菌克隆提供了获得发生于存在的（包含的，harbored）外来DNA和布鲁氏菌噬菌体之间的直接重组事件的无限机会的方式。
[0187] 应理解，可以利用通过输出可检测信号（或包含可检测信号的载体布鲁氏菌克隆）鉴定布鲁氏菌属细菌的噬菌体以诊断受验者的布鲁氏菌感染。
[0188] 根据本发明的这个方面，该诊断方法包括使受验者样品与本文上面所述的重组布鲁氏菌噬菌体接触。用重组布鲁氏菌噬菌体感染布鲁氏菌属细菌可以使可检测部分的表达增大，从而提供由于布鲁氏菌属细菌感染引起的信号。该受验者通常为哺乳动物受验者，例如，绵羊、牛、山羊和人。
[0189] 通常，所分析的样品是来自受验者的血液、尿、粪便、子宫、胎膜以及胎盘膜和流体、乳腺、淋巴结、肉芽肿、精子、睾丸、脑、心和肾脏器官、脑脊液（CSF）、乳、乳制品的细胞样品。也考虑了环境样品（土壤、气溶胶、水）。
[0190] 术语“包含”、“含有”、“包括”、“包括的”、“具有”，和它们的词形变化形式表示“包括但不限于”。
[0191] 术语“由……组成”表示“包括但局限于”。
[0192] 术语“基本由……组成”意思是指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，条件是所述另外的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新特征。
[0193] 贯穿本申请，本发明的各种实施方式可以范围形式呈现。应当理解范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应该理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应视为已具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的各个数值。例如，如从1至6的范围描述应视为已具体地公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等的子范围，以及在此范围中的各个数值，例如，1、2、3、4、5和6。不论范围宽度如何，这都能适用。
[0194] 无论何时当本文中指出了数值范围时，其意在包括在所指范围内的任何提及的数字（小数或整数）。如在本文中所使用的，表达在第一个指定数和第二个指定数之间的“范围”与“从”第一个指定数“至”第二个指定数的“范围”可互换使用，意在包括第一个和第二个指定数及其间的所有小数和整数。
[0195] 如本文所使用的，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、方法、技术和程序，包括但不限于，化学、药学、生物学、生物化学和医学领域技术人员已知的，或易于从已知的方式、方法、技术和程序开发出的那些方式、方法、技术和程序。
[0196] 应理解，为清楚起见而在单独实施方式的上下文中描述的本发明某些特征，也可结合提供在单个实施方式中。相反，为简洁起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发明的多种特征，也可单独地或以任何合适的子组合形式，或作为适合于本发明的任何其他被描述的实施方式提供。在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实施方式的实质特征，除非这些实施方式没有这些要素时是无效的。
[0198] 实施例
[0199] 现参考下面的实施例，结合上面的描述以非限制方式阐述本发明的一些实施方式。
[0200] 一般而言，本文中使用的术语和本发明采用的实验操作程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook等人,(1989);"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994);Ausubel等人,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989);
Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley & Sons,New York(1988);Watson等人,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York;Birren等人(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如美国专利No.4,666,828;4,683,202;4,
801,531;5,192,659和5,272,057中列出的方法；"Cell Biology:A Laboratory
Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994);"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition;"Current Protocols in Immunology"Volumes I-IIIColigan J.E.,ed.(1994);Stites等人(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York (1980)；可用的免疫分析法详述在下列专利和科学文献中，参见，例如，美国专利No.3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,
867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;4,098,
876;4,879,219;5,011,771和5,281,521;"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984);“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985);"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984);"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986);"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986);"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press;"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990);Marshak et al.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory
CourseManual"CSHL Press (1996)；所有这些文献都通过引用合并在此如同全部列出在此。其他一般性参考文献遍及本文。其中的程序被认为是本领域熟知的，仅为了便于读者阅读而提供。包含在其中的所有信息都通过引用合并在此。
Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley & Sons,New York(1988);Watson等人,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York;Birren等人(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如美国专利No.4,666,828;4,683,202;4,
801,531;5,192,659和5,272,057中列出的方法；"Cell Biology:A Laboratory
Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994);"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition;"Current Protocols in Immunology"Volumes I-IIIColigan J.E.,ed.(1994);Stites等人(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York (1980)；可用的免疫分析法详述在下列专利和科学文献中，参见，例如，美国专利No.3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,
867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;4,098,
876;4,879,219;5,011,771和5,281,521;"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984);“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985);"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984);"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986);"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986);"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press;"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990);Marshak et al.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory
CourseManual"CSHL Press (1996)；所有这些文献都通过引用合并在此如同全部列出在此。其他一般性参考文献遍及本文。其中的程序被认为是本领域熟知的，仅为了便于读者阅读而提供。包含在其中的所有信息都通过引用合并在此。
[0201] 一般材料和方法
[0202] 噬菌体Iz1纯化和基因组DNA抽提：使噬菌体Iz1在流产布鲁氏菌参照菌株544上连续繁殖，方法是将常规测试稀释（RTD）浓度的噬菌体Iz1悬浮液液滴接种在胰蛋白酶大豆琼脂平板上，该胰蛋白酶大豆琼脂平板上散布有0.1ml流产布鲁氏菌菌株544悬浮液的等分试样。在37°C，5%CO2的气氛下培育过夜之后，将噬菌斑（plaque）收集到胰蛋白酶大豆肉汤中并进行计数，以便进一步配制用于布鲁氏菌分离物的噬菌体分型的RTD悬浮液。
[0203] 运用相同的操作程序以便纯化用于DNA抽提的噬菌体Iz1颗粒。但在TMGS缓冲液中配制噬菌体悬浮液并过滤两次，首先通过0.45μm过滤器过滤，随后通过0.2μm过滤器过滤，以便获得无布鲁氏菌污染的噬菌体悬浮液。
[0204] 使用Sorvall RC M100超速离心（Du-Pont）对每管中的2ml噬菌体悬浮液进行离心。超速离心在10°C下以60,000rpm的转速进行4小时，并根据制造商说明书（Qiagen GmbH,Hilden,Germany）使用QIAamp DNAMini Kit从噬菌体球粒中抽提DNA。
[0205] 克隆噬菌体Iz1 HindIII DNA片段——大肠埃希氏菌质粒pBlueScript中噬菌体Iz1 HindIII片段克隆的构建：根据制造商说明书（Fermentas Inc.,Maryland,USA）用HindIII消化噬菌体Iz1DNA。HindIII消化曲线（profile）与先前公开的数据（Rigby等人,Can J Vet Res.1989;53:319-325）一致。使用 SV Gel system（Promega）从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段。质粒pBlueScript用HindIII消化并使用 SV Gelsystem（Promega）从琼脂糖凝胶中纯化。将纯化的pBlueScript质粒和噬菌体Iz1DNA片段混合，并使其连接和转化到埃希氏大肠杆菌JM109（Promega）中。使用HiYield Plasmid Mini Kit（台湾台北县RBCBioscience）抽提质粒DNA。
[0206] DNA-DNA杂交：根据制造商说明书（德国，曼海姆，Roche Diagnostics GmbH）使用DIG非放射性核酸标记和检测系统执行杂交。
[0207] 构建质粒pBBR1mcs-4.1-II1053LuxCDABE：通过将发冷光杆菌（Photorhabdus luminescens）LuxCDABE操纵子（Winson等人,1998,FEMSMicrobiol Letters 1998;163:193-202，以引用方式并入）插入质粒pBBR1mcs-4（Kovach等人,1995,Gene 1995;166:175-
176）中，构建质粒pBBR1mcs-41-II1053LuxCDABE。
176）中，构建质粒pBBR1mcs-41-II1053LuxCDABE。
[0208] 构建质粒pBBR1mcs-4.1-II1053LuxCDAB（E 分别为15B-18B和15A-18A)：将特定噬菌体Iz1序列用作质粒构建体的支架。对引物进行设计，使其分别包括Tn5镶嵌端（mosaic ends）1和2。将KpnI::PstI序列添加到噬菌体Iz1扩增子的片段15500-16509的5’端，并将PvuII::ME-1::KpnI序列添加到它的3’端。将SacI::ME-2::PvuII序列添加到噬菌体Iz1扩增子的片段18579-19630的5’端，并将SalI::SacI添加到它的3’端（PvuII、KpnI、SacI、SalI是这些酶的限制性核酸内切酶限制位点的核苷酸序列；用于产生这些构建体的引物位置在图4中示出）。
[0209] 噬菌体Iz1裸DNA用作用于获取期望扩增子的单独PCR DNA扩增反应中的底物。用SacI消化第一片段[SacI::ME-2::PvuII-Iz(18579-19630)-SalI::SacI]，然后将其连接到SacI线性化质粒pBBR1mcs-4.1-II1053LuxCDABE中从而在取向A和B（图3B）上产生中间质粒pBBR1mcs-4.1-II1053LuxCDABE::SacI::ME-2::PvuII-Iz(18579-19630)-SalI::SacI。然后使用这些质粒以构建图3B中所示的两个完整质粒结构，方法是用KpnI线性化这些构建体并使其与建立图3B中所示两个完整构建体的片段连接。重要的是，质粒15A-18A建立包括位于pLux侧面的噬菌体Iz1基因组序列的完整无损的Tn5转座子构建体。相比之下，质粒15B-18B包括pLux作为完整无损的Tn5转座子、和正确地取向于完整无损的Tn5::pLux构建体侧翼端的噬菌体Iz1序列。
[0210] 建立噬菌体Iz1预感染的电感受态猪布鲁氏菌菌株1330细胞：将猪布鲁氏菌菌株1330在补充有血清葡萄糖的胰蛋白酶大豆琼脂上在37°C，5%CO2气氛下培育2天（Alton GG，Jones LM,Angus RD,Verger JM.Techniques for the brucellosis
laboratory.Institute National de la Recherche Agronomique,Paris.1988）。通过平板接种环（plating loop）收集细胞，将其转移到6ml胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中，从而制得
7 8
浓度大约为10-10个细胞/ml的细胞悬浮液。然后，将1ml细胞悬浮液接种到含有22ml TSB的250ml锥形容器（Erlenmeyer vessel）中，并放置在冰箱中冷冻2小时。总共制得4种此类猪布鲁氏菌菌株1330细胞悬浮液。通过从培养箱中取出每个容器置于室温下来终止温育，并将1ml以x104常规测试稀释（RTD,Alton等人,1988）浓度的噬菌体Iz1的TSB悬浮液加入到布鲁氏菌细胞悬浮液中。使布鲁氏菌经过4小时完成单个细胞复制循环，使得布鲁氏菌噬菌体感染最低2小时，方法是将该细胞悬浮液在37°C，5%CO2气氛下温育并在冰上温育之后立即冷冻该细胞悬浮液。然后，将4种细胞悬浮液在单独的管中在固定角转头上以6500rpm，在
4°C下离心13分钟。使上清液流出，将每两种细胞球粒汇集在一起，并将其重悬于预先冷却至4°C的12ml10%的在重蒸馏水中的甘油溶液中。在冷溶液中进行洗涤（包括预先冷却的吸液管和微量吸头）重复4次，每次都通过重悬球粒和重复执行在8000rpm下离心的操作来进行。重悬该两种细胞球粒，将其汇集在3ml 10%甘油中，并于4°C在8000rpm下减速旋转10分钟。然后将最终的细胞球粒重悬在0.5ml预先冷却的10%甘油溶液中，并进一步分成50μl各自在预先冷却的埃彭道夫管（eppendorftube）中的等分试样，立即使用液氮将该等分试样冷却至冻结，然后在使用前保存在-80°C。
laboratory.Institute National de la Recherche Agronomique,Paris.1988）。通过平板接种环（plating loop）收集细胞，将其转移到6ml胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中，从而制得
7 8
浓度大约为10-10个细胞/ml的细胞悬浮液。然后，将1ml细胞悬浮液接种到含有22ml TSB的250ml锥形容器（Erlenmeyer vessel）中，并放置在冰箱中冷冻2小时。总共制得4种此类猪布鲁氏菌菌株1330细胞悬浮液。通过从培养箱中取出每个容器置于室温下来终止温育，并将1ml以x104常规测试稀释（RTD,Alton等人,1988）浓度的噬菌体Iz1的TSB悬浮液加入到布鲁氏菌细胞悬浮液中。使布鲁氏菌经过4小时完成单个细胞复制循环，使得布鲁氏菌噬菌体感染最低2小时，方法是将该细胞悬浮液在37°C，5%CO2气氛下温育并在冰上温育之后立即冷冻该细胞悬浮液。然后，将4种细胞悬浮液在单独的管中在固定角转头上以6500rpm，在
4°C下离心13分钟。使上清液流出，将每两种细胞球粒汇集在一起，并将其重悬于预先冷却至4°C的12ml10%的在重蒸馏水中的甘油溶液中。在冷溶液中进行洗涤（包括预先冷却的吸液管和微量吸头）重复4次，每次都通过重悬球粒和重复执行在8000rpm下离心的操作来进行。重悬该两种细胞球粒，将其汇集在3ml 10%甘油中，并于4°C在8000rpm下减速旋转10分钟。然后将最终的细胞球粒重悬在0.5ml预先冷却的10%甘油溶液中，并进一步分成50μl各自在预先冷却的埃彭道夫管（eppendorftube）中的等分试样，立即使用液氮将该等分试样冷却至冻结，然后在使用前保存在-80°C。
[0211] 实施例1
[0212] 译解完整噬菌体Iz1基因组序列
[0213] 结果
[0214] 噬菌体Iz1的完整基因组序列已使用454Life SciencesTM RocheGS-FLX测序平台（DYN Labs,LTD,Israel）译解。所鉴定出的最大重叠群（contig）包括38,254bp（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）。在这个重叠群中，当前的数据表明两个布鲁氏菌噬菌体Iz1基因组群体的差异在于SNP或杂合子核苷酸（核苷酸5546被记为N，但实际上它最后被鉴定为C，并且多态性分别同等地分配在核苷酸5549处C或A之间的8个重叠群中（图1））。
[0215] 为了进一步证实该噬菌体的序列，将来自噬菌体Iz1的8HindIII DNA消化区段（1.1,2.1;3.1;4.1,5.1;5.2;5.3;7.3）亚克隆到质粒pBS中并进行测序，从而证实所确定的噬菌体Iz1基因组中相同重叠片段的序列。依照这些结果，噬菌体Iz1的全基因组裸DNA与这些克隆中的每个杂交。两个另外的克隆，例如，5.4和71_3和71_5_I包括部分序列测定（图2）。
[0216] 使用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）软件分析该噬菌体的序列。
[0217] 结果在本文以下表2中给出。
[0218] 表2
[0219]
[0220] CpG岛分析的结果表明，虽然观测比率/预期比率>0.60，但实际的C百分比+G百分比>50.00，表明该噬菌体包含不同于布鲁氏菌的序列。
[0221] 在揭示复制原点推测位点的位置5088-5179和5405-5310处发现反向重复。
[0222] 利用基于互联网的启动子寻找工具（worldwidewebdotfruitflydotorg/seq_tools/promoter），本发明人在正向链上鉴定出183个潜在启动子，并在反向链上鉴定出201个潜在启动子。这些启动子的序列对于正向链在SEQ ID NO:3-185中列出，对于反向链在186-386中列出。
[0223] 实施例2
[0224] 通过噬菌体Iz1序列调节布鲁氏菌基因
[0225] 设计包括所选择的来自噬菌体Iz1基因组的序列的质粒构建体，并将其转化到大肠埃希氏菌JM109中，该大肠埃希氏菌JM109包括本文下面的图3B和表3中指出的那些。然后将该质粒构建体转化到大肠埃希氏菌S17中，因为这种菌株支持质粒通过接合作用转移到布鲁氏菌中、并通过在氨苄青霉素上生长选择布鲁氏菌克隆。带有这些构建体的转移接合子（转化结合子）布鲁氏菌菌株赋予特定克隆Lux活性，该Lux活性取决于噬菌体Iz1插入物和用这些质粒转化的特定布鲁氏菌菌株。当带有（包含，harbor）质粒pBBR1mcs4.1II1053LuxCDABE/15B-18B时，猪布鲁氏菌参照菌株1330、马尔他布鲁氏菌型菌株
16M和流产布鲁氏菌参照菌株544基于位于Lux操纵子上游的启动子表现出相似的强组成型Lux表达（参见图3B）。与之相反，质粒pBBR1mcs4.1II1053LuxCDABE/15A-18A对流产布鲁氏菌菌株544具有致死性（无法利用这种构建体建立转移接合子克隆，即使将氨苄青霉素减少至
25μg/ml，即，对于猪布鲁氏菌菌株1330使用的正常选择性浓度的四分之一）。不太严格地向马尔他布鲁氏菌菌株16M施加相同的物质，该马尔他布鲁氏菌菌株16M是用浓度为50μg/ml的氨苄青霉素在琼脂平板上选择的。使用浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，用质粒构建体仅成功地转化猪布鲁氏菌菌株1330。这证明，噬菌体Iz1序列为布鲁氏菌属种赋予不同的致死活性，因为不包含噬菌体序列的相同质粒可以成功地转化到这些布鲁氏菌菌株中的每个中。
16M和流产布鲁氏菌参照菌株544基于位于Lux操纵子上游的启动子表现出相似的强组成型Lux表达（参见图3B）。与之相反，质粒pBBR1mcs4.1II1053LuxCDABE/15A-18A对流产布鲁氏菌菌株544具有致死性（无法利用这种构建体建立转移接合子克隆，即使将氨苄青霉素减少至
25μg/ml，即，对于猪布鲁氏菌菌株1330使用的正常选择性浓度的四分之一）。不太严格地向马尔他布鲁氏菌菌株16M施加相同的物质，该马尔他布鲁氏菌菌株16M是用浓度为50μg/ml的氨苄青霉素在琼脂平板上选择的。使用浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，用质粒构建体仅成功地转化猪布鲁氏菌菌株1330。这证明，噬菌体Iz1序列为布鲁氏菌属种赋予不同的致死活性，因为不包含噬菌体序列的相同质粒可以成功地转化到这些布鲁氏菌菌株中的每个中。
[0226] 进一步地，光活性在猪布鲁氏菌菌株1330中完全沉默，而它部分地表达在马尔他布鲁氏菌16M中（无法用流产布鲁氏菌显示结果，因为该质粒对这种菌株具有致死性，如上面解释的）。当赞同噬菌体Iz1序列的沉默活性时，这可以通过将外部正癸醛添加到布鲁氏菌悬浮液中来证明。五顺反子（pentacistronic）Lux操纵子由luxAB组分组成，该luxAB组分对在分子氧的存在下氧化FMNH2和长链脂肪醛（正癸醛底物）的细菌荧光素酶编码从而产生490-nm光学标记。该醛随后通过被luxC、luxD和luxE基因编码的多酶还原酶复合体再生。因此，Lux操纵子编码两个单独的功能，分别通过基因A和B以及底物，通过基因C、D和E表达萤光素酶。外部正癸醛可以用作天然底物的替代品。因为向细胞悬浮液中加入外部正癸醛完全恢复了猪布鲁氏菌菌株1330pBBRImcs4.1II1053LuxCDABE/15A-18A和马尔他布鲁氏菌菌株
16M pBBRImcs4.1II1053LuxCDABE/15A-18A中的光，因此这表明莹光素酶此时存在于反应混合物中，推断它借助存在（居住）于噬菌体Iz115A和LuxC和Lux D序列上游的启动子完全表达。因此，很可能位于LuxA和LuxB下游的基因LuxE受到3'取向的噬菌体Iz118A序列的独特调节。这进一步得到以下事实的支持，即，这种调节以在猪布鲁氏菌菌株1330（无Lux活性）和马尔他布鲁氏菌菌株16M（部分Lux活性）之间的不同强度施加。因为噬菌体Iz1完全裂解（溶解）流产布鲁氏菌和猪布鲁氏菌菌株，但对马尔他布鲁氏菌菌株仅有部分裂解（溶解）作用，我们的数据证实历史的布鲁氏菌属种噬菌体分型方法并支持我们的发明，即18A噬菌体Iz1序列调节布鲁氏菌基因表达。
16M pBBRImcs4.1II1053LuxCDABE/15A-18A中的光，因此这表明莹光素酶此时存在于反应混合物中，推断它借助存在（居住）于噬菌体Iz115A和LuxC和Lux D序列上游的启动子完全表达。因此，很可能位于LuxA和LuxB下游的基因LuxE受到3'取向的噬菌体Iz118A序列的独特调节。这进一步得到以下事实的支持，即，这种调节以在猪布鲁氏菌菌株1330（无Lux活性）和马尔他布鲁氏菌菌株16M（部分Lux活性）之间的不同强度施加。因为噬菌体Iz1完全裂解（溶解）流产布鲁氏菌和猪布鲁氏菌菌株，但对马尔他布鲁氏菌菌株仅有部分裂解（溶解）作用，我们的数据证实历史的布鲁氏菌属种噬菌体分型方法并支持我们的发明，即18A噬菌体Iz1序列调节布鲁氏菌基因表达。
[0227] 本文下表3提供了包含能够下调紧接布鲁氏菌和其他细菌下游放置的基因的噬菌体Iz1序列的另外质粒。
[0228] 表3
[0229]
[0230] pII1053以组成型方式强有力地表达于三种布鲁氏菌物种，猪布鲁氏菌、马尔他布鲁氏菌和流产布鲁氏菌。这个启动子不太强烈地表达于大肠埃希氏菌中。
[0231] 构建体18A下调大肠埃希氏菌和布鲁氏菌中的Lux表达，最可能通过沉默LuxE下调。
[0232] 实施例3
[0233] 建立噬菌体Iz1预感染的电感受态猪布鲁氏菌菌株1330细胞
[0234] 在这个实施例中，目标是开发延长布鲁氏菌的噬菌体Iz1感染的存在时间至无限期以便在此时能够通过重组DNA技术工程化改造噬菌体基因组的方法。
[0235] 继噬菌体DNA侵入细菌包膜后的噬菌体感染之后，裸噬菌体DNA立即生存于细菌胞质溶胶中。进一步随之发生由于控制细菌基因表达和调整（使适合，gear）细菌DNA复制机制以使其适合于噬菌体系统所产生的噬菌体复制。因而，阻止DNA包装到完整无损的噬菌体颗粒中，将使得噬菌体基因组的基因工程化改造能够通过用促进基因转座或基因重组的重组DNA构建体对这个期间的细菌宿主进行电穿孔而实现。因此，本发明的发明人假定噬菌体感染可以通过以下方法遏制：在感染之后立即冷冻布鲁氏菌宿主细胞，然后使用水-甘油洗涤布鲁氏菌细胞数次并将该细胞冷冻在-80°C直至需要供电穿孔使用。
[0236] 结果
[0237] 从-80°C的制冷器（冰箱）中取出一个包含如上所描述的噬菌体遏制的感染的埃彭道夫管，将细胞在冰上解冻，并通过加入0.95ml的SOC-B溶液（Lai F,Microb Pathog 1990;9:363-368）稀释至1ml。然后，在冷的生理盐水溶液中按1:10稀释来配制细胞悬浮液，直至稀释至10-7。然后将10μl液滴接种在流产布鲁氏菌菌株544上，该流产布鲁氏菌菌株544（0.1ml的TSB重细胞悬浮液）通过细菌Drigalski散布器散布在TSA板上。
[0238] 为了比较，使SOC-B细胞悬浮液的等分试样通过0.45μm注射器式过滤器以便确定细胞悬浮液中不存在游离的Iz1噬菌体颗粒。类似地，将滤出液按1:10稀释在生理盐水溶液中，并将每种稀释液的10μμl液滴接种在流产布鲁氏菌菌株544平板上（参见上面）。
[0239] 将这两个平板在37°C，5%CO2气氛下温育过夜。第二天，在全细胞悬浮液和细胞滤出液的每种稀释液中寻找噬菌斑。产生噬菌体噬菌斑的细胞滤出液的最后一种稀释液是10-2，在其中仅鉴定出两个噬菌斑。与该稀释液一致，在10-1稀释液中鉴定出约200个噬菌斑，表明过滤之前的全细胞悬浮液中存在极少的游离噬菌体颗粒。相比之下，产生噬菌体噬菌斑的全细胞悬浮液的最后一种稀释液是10-6，在其中鉴定出单个噬菌斑。与该稀释液一致，在10-5稀释液下鉴定出10个噬菌斑，并在10-4及以下的稀释液中发现密集的噬菌斑，表明与细胞滤出液相比细胞悬浮液中存在接近高出4个对数级的噬菌体颗粒。这些数据一起支持了工作假定（前提，hypothesis），即尽管冷却细胞悬浮液、冷洗涤和在-80°C下冷冻干扰了噬菌体复制，但在解冻和重新培养该细胞时噬菌体感染完全恢复。当在1小时和15分钟之后中止噬菌体感染时，获得相似的结果。
[0240] 实施例4
[0241] 布鲁氏菌报道克隆的开发
[0242] 本实施例描述了如何利用前噬菌体感染状态（预噬菌体感染状态，pre-phage infection state）开发诱导布鲁氏菌物种中的Lux活性的重组噬菌体Iz1克隆。此种重组克隆可以用作高度敏感的报道基因（reporter）以通过在宿主样品、它的组织（如流产的胎盘和胎膜和流体）样品或乳样品中的光测量指示可疑样本中活布鲁氏菌细胞的存在。
[0243] 方法
[0244] 该方法包括两个步骤（参见图5）。首先，在噬菌体Iz1基因组DNA和质粒pBBR1mcs4.1-II1053LuxCDABE/15B-18B之间建立杂种DNA。然后，将这种杂种DNA电穿孔到电感受态噬菌体Iz1预感染的猪布鲁氏菌菌株1330细胞中，并对该细胞的氨苄青霉素抗性进行选择。在生长的克隆中鉴定出噬菌体Iz1载体克隆。
[0245] 1.建立杂种DNA
[0246] 在等量的噬菌体Iz1和质粒pBBR1mcs4.1-II1053LuxCDABE/15B-18BDNA之间施加短变性和退火过程，后者与噬菌体基因组（图3A-B）共享同源序列。最后的退火步骤通过将该反应置于4°C来中止，以便在这两个实体的杂交单链DNA之间建立杂种DNA分子。
[0247] 使用德国的Biometra,T-Gradient,thermocycler，在总体积为25μl的反应混合物中执行DNA变性和退火。热循环反应如下：
[0248] 预热：95°C-1.30'
[0249] 6个循环：95°C–1.15'、55.5°C–2.00'、72°C–2.00'
[0250] 最后的退火：55.5°C–7.00'
[0251] 于4°C中止。
[0252] 2.电穿孔
[0253] 使用电感受态前噬菌体Iz1感染（预噬菌体Iz1感染，pre-phage Iz1infected）的猪布鲁氏菌细胞。使用MicroPulserTM,BIO-RAD,Hercules,CA,USA（2.49Kv,4.9ms）的细菌模式，通过加入2μl最后的热循环反应混合物对40μl的电感受态细胞进行电穿孔。紧接在电穿孔之后，将细胞悬浮在1ml SOC-B（参见上面）中并在37°C下振荡1小时和30分钟来温育。按1:10稀释配制SOC-B电穿孔细胞悬浮液，并将未稀释和1:10稀释的SOC-B悬浮液的10μl等分试样接种在包括50μg/ml氨苄青霉素作为选择抗生素的TSA平板上。
[0254] 作为对照，将10μl电穿孔细胞的SOC-B悬浮液和1:10稀释液的液滴接种到预先散布在TSA琼脂平板上的流产布鲁氏菌菌株544细胞上，以便证明电穿孔猪布鲁氏菌菌株1330细胞的噬菌体Iz1感染。
[0255] 结果
[0256] 非电穿孔的细胞悬浮液成功地生长在TSA平板上，但没有生长在包括50μg/ml氨苄青霉素的TSA平板上。电穿孔之后，约90个菌落（colony）生长在来自非稀释SOC-B细胞悬浮液的选择性琼脂上，并且约9个菌落生长在来自1:10细胞稀释液的选择性琼脂上。从每种稀释液中选择4个菌落用于进一步分析，将每个菌落均转移到包括50μg/ml氨苄青霉素的TSA平板上。本文以下表4概括了电穿孔克隆的发光和噬菌体活性。
[0257] 表4
[0258] 克隆号 发光 噬菌体活性
1 338,600RLU +
2 943,500RLU 阴性
3 1.8x106RLU 阴性
4 3.4x106RLU 阴性
11 1.8x106RLU +
6
12 7.2x10RLU +
13 4.9x106RLU +
14 5.7x106RLU +
1 338,600RLU +
2 943,500RLU 阴性
3 1.8x106RLU 阴性
4 3.4x106RLU 阴性
11 1.8x106RLU +
6
12 7.2x10RLU +
13 4.9x106RLU +
14 5.7x106RLU +
[0259] 这些结果表明：1.质粒pBBR1mcs4.1-II1053LuxCDABE成功地转化到这些克隆中。2.光滑型克隆（2、3和4）没有分泌噬菌体活性，而粗糙型克隆是噬菌体载体（图5）。
[0260] 虽然本发明已结合其特定的实施方式进行了描述，但显然，对于本领域技术人员而言，许多替换、修改和变更都是显而易见的。因此，本发明旨在包括落在附属权利要求的精神和宽范围内的所有此类替换、修改和变更。
[0261] 本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用完整地合并在本说明书中，如同每篇单独的出版物、专利或专利申请单独地明确被指出通过引用合并在此。另外，本申请中任何参考文献的引用或列出不应该被解释为承认此类参考文献作为本发明的现有技术。对于使用的章节标题，它们不应该被解释为限制性的。
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