一种延长噬菌体血液循环时间的多肽
阅读：1024发布：2020-05-16
专利汇可以提供一种延长噬菌体血液循环时间的多肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种延长 噬菌体 血液循环时间的多肽，携带该多肽的具有延长血液循环时间功能的噬菌体，以及筛选所述多肽的方法，以及这些多肽和噬菌体的应用等。本发明对于 噬菌体疗法 具有非常重要的意义。，下面是一种延长噬菌体血液循环时间的多肽专利的具体信息内容。
1.一种延长噬菌体血液循环时间的多肽，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO:1、2或
3所示的氨基酸序列或其类似物。
2.编码权利要求1所述的氨基酸序列或其类似物的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的多肽的应用，其特征在于，用于制备具有延长血液循环时间功能的噬菌体。
4.一种噬菌体，其特征在于，所述噬菌体携带有权利要求1所述的多肽。
5.权利要求4所述的噬菌体的应用，其特征在于，用于制备噬菌体抗菌药物。
6.一种药物组合物，其特征在于，包括至少一种权利要求1所述的多肽，以及至少一种疾病治疗有效剂量的药物活性蛋白、药物或材料。
7.一种噬菌体抗菌药物，其特征在于，包括权利要求4所述的噬菌体。
8.一种延时抗菌噬菌体，其特征在于，所述延时抗菌噬菌体携带有所述延长噬菌体血液循环时间的多肽以及抗菌蛋白BglII所对应的核苷酸序列。
9.一种筛选具有延长噬菌体体内循环时间能力的多肽的方法，其特征在于包括以下步骤：
a.将噬菌体库通过尾静脉注射入动物体内；
b.适当时间后从所述动物或人的循环系统、器官、组织及细胞中回收噬菌体颗粒；
c.扩增回收的噬菌体用于下一轮体内筛选；
d.重复上述a到c的步骤至少两次；
e.对回收的噬菌体挑去单克隆，分别扩增后验证其延时能力后测序，获得具有延长噬菌体体内循环时间能力的多肽。
一种延长噬菌体血液循环时间的多肽
技术领域
背景技术
[0002] 噬菌体疗法是利用噬菌体对抗细菌感染的一种治疗方法，自20世纪初开始被应 用于临床实践中。例如，1919年，d’Herelle尝试用噬菌体治疗禽类流感(沙门氏菌)、 家兔痢疾(志贺氏菌)和牛出血性败血症(巴氏杆菌)，这是使用噬菌体治疗的首次 尝试。1921年，Richard Bruynoghe和Joseph Maisin使用噬菌体来治疗金黄色葡萄球 菌引起的人类皮肤病。1932年应英国政府的要求，d’Herelle到达印度霍乱流行地区 尝试使用噬菌体进行防控，并很快控制了疫情的蔓延，同时有效遏制了疫情的二次爆 发。同年，东欧一些科研人员通过大量的动物和人类试验得出了噬菌体治疗的科学剂 量。1934年美国科学家报道了噬菌体对肠球菌感染的成功治疗。从1930～1939年间， 许多研究者和公司纷纷将噬菌体治疗商业化，如美国的帕克-戴维斯公司和礼来公司 等开始生产治疗葡萄球菌和大肠杆菌的噬菌体制剂，噬菌体研究进入快速发展时期。
[0003] 然而，随着二战期间青霉素等抗生素的出现，美国及西欧的科学家们基本放弃对 噬菌体疗法的深入研究，开始投入到抗生素研究的洪流。从1950～1980年间，鲜有 关于噬菌体治疗的研究文章发表。1980年后，抗生素耐药性问题日益加剧。实际上， 抗生素的耐药性问题现已严重影响全球公共健康。据统计，在美国每年有两百万人次 受抗生素耐药性感染的影响，并直接导致每年约23000人死亡。因此，开发一种新的 抗菌疗法已经变得越来越迫切。而噬菌体作为细菌病毒，在细菌感染、尤其是多重耐 药菌感染治疗方面具有抗生素无法比拟的优势，科学家们又重新将目光投回到噬菌体 治疗上，企盼从中获得有效的抗生素替代治疗方案，控制日益加剧的全球性耐药问题。
[0004] 尽管在解决日益恶化的抗生素耐药性危机方面有着巨大的潜力，噬菌体疗法目前 仍存在多方面的限制性因素。其中，阻碍其临床应用的首要问题是噬菌体给药后在血 液循环中被迅速清除，较短的血液滞留时间使其无法有效进入靶点进行治疗。因此， 如何延长血液循环时间的工程治疗噬菌体是研究的重点，它将是治疗现有细菌感染或 防止细菌再感染的更有效的噬菌体疗法。对此，相关研究报道的延长噬菌体血液循环 时间的策略包括：通过自然发生的突变、利用聚乙二醇对噬菌体表面进行化学修饰和 通过改变噬菌体衣壳蛋白来逃避补体介导的失活作用等等。尽管如此，上述方案仍存 在其局限性，应用更加创新的策略得到具有更好抗菌效果的长期循环的噬菌体有待突 破。
[0005] 噬菌体展示作为一种强大的技术已被用来筛选具有一定特性的多肽序列。通常噬 菌体文库(包含展示>109种不同序列多肽的噬菌体)通过体内或体外进行淘选，以 快速获得具有特异性相互作用的多肽，如材料相互作用、组织靶向、器官靶向和屏障 穿透作用等。特别地，体内噬菌体展示技术已被成功应用于肿瘤血管靶向肽，血脑屏 障穿透肽及透皮肽等的筛选。
发明内容
[0007] 因此，本发明的第一个方面，提供了一种延长噬菌体血液循环时间的多肽。
[0008] 根据本发明，所述延长噬菌体血液循环时间的多肽含有SEQ ID NO:1、2或3所 示的氨基酸序列或其类似物。
[0009] 本发明的第二个方面，提供了所述延长噬菌体血液循环时间的多肽的应用。
[0010] 根据本发明，所述延长噬菌体血液循环时间的多肽可用于制备具有延长血液循环 时间功能的噬菌体。
[0011] 本发明的第三个方面，提供了一种具有延长血液循环时间功能的噬菌体。
[0012] 根据本发明，所述具有延长血液循环时间功能的噬菌体携带有所述的延长噬菌体 血液循环时间的多肽。
[0013] 本发明的第四个方面，提供了所述具有延长血液循环时间功能的噬菌体的应用。
[0014] 根据本发明，所述具有延长血液循环时间功能的噬菌体可用于制备噬菌体抗菌药 物。
[0015] 本发明的第五个方面，提供了一种药物组合物。
[0016] 根据本发明，所述药物组合物包括至少一种所述的延长噬菌体血液循环时间的多 肽，以及至少一种疾病治疗有效剂量的药物活性蛋白、药物或材料。
[0017] 本发明的第六个方面，提供了一种噬菌体抗菌药物。
[0018] 根据本发明，所述噬菌体抗菌药物包含所述的具有延长血液循环时间功能的噬菌 体。
[0019] 本发明的第七个方面，提供了一种延时抗菌噬菌体。
[0020] 根据本发明，所述延时抗菌噬菌体携带有所述延长噬菌体血液循环时间的多肽以 及抗菌蛋白BglII所对应的核苷酸序列。
[0021] 本发明的第八个方面，提供了一种筛选具有延长噬菌体体内循环时间能力的多 肽的方法，包括以下步骤：
[0022] a.将噬菌体库通过尾静脉注射入动物体内；
[0023] b.适当时间后从所述动物或人的循环系统、器官、组织及细胞中回收噬菌体颗 粒；
[0024] c.扩增回收的噬菌体用于下一轮体内筛选；
[0025] d.重复上述a到c的步骤至少两次；
[0026] e.对回收的噬菌体挑去单克隆，分别扩增后验证其延时能力后测序，获得具有 延长噬菌体体内循环时间能力的多肽。
[0027] 本发明通过噬菌体展示技术筛选到了能够显著延长噬菌体体内循环时间的多肽， 并证明该功能具有序列特异性，其起作用的原理是通过与血小板结合达到的；利用基 因工程手段对展示该多肽的噬菌体进行工程化，使其同时表达抗菌蛋白BglII，得到 具有延时功能及抗菌活性噬菌体，其在体外及大鼠体内均具有较好的抗菌活性。
[0029] 图1显示了延时噬菌体BCP1的筛选过程，长循环噬菌体在体内筛选过程中的富 集，三轮富集产物尾静脉注射入大鼠体内后48h时每毫升血中噬菌体数量的平均值和 SEM(标准误差)(n＝3，**p<0.01，***p<0.001)。
[0030] 图2显示了长循环噬菌体单克隆体内延时能力的比较，等量(1×1011)三种BCP 噬菌体与随机噬菌体SC混合注射到大鼠体内，0h和72h时分别随机挑选30个噬菌 斑，通过测序确定四种噬菌体的重复次数(n＝3)。
[0031] 图3显示了延时噬菌体的长循环特性，等量(1×1011)BCP1与SC噬菌体分别通 过尾静脉注射入不同大鼠体内，不同时间点每毫升血液中噬菌体数量的平均值和 SEM。
[0032] 图4为BCP1与REW噬菌体1:1混合尾静脉注射大鼠，不同时间点每毫升血液 中两种噬菌体数量的平均值和SEM(n≥3，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
[0033] 图5显示了延时噬菌体的序列特异性，等量(1×1011)不同噬菌体BCP1、SC以 及三种BCP1突变噬菌体分别尾静脉注射不同大鼠，检测不同时间点每毫升血液中噬 菌体数量的平均值及SEM。
[0034] 图6为BCP1与三种BCP1突变噬菌体分别与REW噬菌体按1:1等比例混合后 分别尾静脉注射大鼠，检测不同时间点每毫升血液中噬菌体数量的平均值及SEM(蓝 白斑数量，n＝3，***p<0.001)。
[0035] 图7显示了补体系统介导的噬菌体的失活，BCP1和SC噬菌体(1×109)与预先 37℃或56℃处理后的血浆体外共孵育，检测不同时间点血浆内噬菌体数量的平均值 及SEM(n＝3)。
[0036] 图8显示了BCP1噬菌体与血细胞结合作用的初步验证，等量(1×108)预先与 PBC结合的BCP1和SC噬菌体以及未结合的BCP1和SC噬菌体通过尾静脉注射大 鼠，检测不同时间点血液中噬菌体的数量(平均值±SEM，n＝3，**p<0.01，***p< 0.001)。
[0037] 图9A-9C为不同噬菌体随着时间推移在血浆及血细胞中的分布规律；其中，图 9A、9B和9C分别对应的是等量(1×1011)SC、BCP1和TB2噬菌体分别注射大鼠 体内后不同时间点噬菌体在血浆与PBC中的分布(n＝3，*p<0.05，**p<0.01，***p <0.001)。
[0038] 图10A-10C为精细分离血液的三种组分评估BCP1，SC及TB2噬菌体的分布情 况；其中图10A为体内实验检测BCP1噬菌体在血液中的分布规律；图10B为体内 实验检测SC噬菌体在血液中的分布规律；图10C为体内实验检测TB2噬菌体在血 液中的分布规律(n＝3)。
[0039] 图11显示了BCP和SC短肽在体外实验中影响噬菌体对血细胞的体外结合情况，1×9
10BCP1噬菌体与1ml大鼠全血体外37℃孵育1.5h，评估在有BCP或SC短肽 (500μg/ml)及没有短肽存在的情况下噬菌体对不同血细胞的结合情况。
10BCP1噬菌体与1ml大鼠全血体外37℃孵育1.5h，评估在有BCP或SC短肽 (500μg/ml)及没有短肽存在的情况下噬菌体对不同血细胞的结合情况。
[0040] 图12显示了在MOI为10的情况下，BCP1、SC、BGL和BCP1-BGL四种噬菌 体的体外抗菌结果(n＝3)。
[0041] 图13显示了BCP1、SC、BGL和BCP1-BGL四种噬菌体体外抗菌过程中所释放 的内毒素水平(n＝3)。
[0042] 图14A和14B显示了4种噬菌体随时间推移在血液和腹腔中数量的平均值SEM (n＝3)；其中，图14A为BCP1、SC、BGL和BCP1-BGL四种噬菌体等量(1×1011) 尾静脉注射大鼠，不同时间点血液噬菌体的数量(平均值±SEM)；图14B为BCP1、 SC、BGL和BCP1-BGL四种噬菌体等量(1×1011)尾静脉注射大鼠，不同时间点腹 腔中噬菌体的数量(平均值±SEM，n＝3)。
[0043] 图15A和15B显示了BCP1-BGL的体内抗菌效果；其中，图15A和15B分别为 等量(1×1011)BCP1、SC、BGL和BCP1-BGL四种噬菌体分别尾静脉注射大鼠，18h 后通过腹腔注射感染细菌(1×108)，5h后腹水和肝脏中细菌的数量(平均值±S.E.M.， n＝3，**p<0.01，***p<
0.001)。
0.001)。
[0044] 图16显示了不同组合处理的大鼠血浆中IFN-γ的含量(平均值±S.E.M.，n＝3， *p<0.05，**p<0.01)。
[0045] 图17A和17B分别为不同组合处理的大鼠血浆中ALT(17A)和AST(17B)的 含量(平均值±S.E.M.，n＝3，**p<0.01，***p<0.001)。
具体实施方式
[0047] 本发明由以下关于其优选方案的详细描述以及包含在其中的例子作为参考，将更 易于理解。然而，在描述本发明中涉及的多肽、化合物、合成物及方法之前，有必要 了解本发明并不仅仅适用于某一种多肽、蛋白质、药物或其他材料，也不仅仅只适用 于某一种细胞类型、宿主细胞、条件和方法等。当然，照那样的话，可能会有所改变， 且此种大量的修改变化将会在此项成熟的技术中显现出来。另外，也要了解仅用于此 处描述专门设备的术语，这些限制并不是有意的。还要了解用在说明书和权利要求书 中的“一”可以一个或者更多，这取决于用该词的上下文。因此，例如，涉及到的“一 个细胞”可以指至少有一个细胞被利用。
[0048] 本发明描述的是这样一种方法，即利用噬菌体展示库筛选提高延长血液滞留时间 的展示肽。正如此处所用，“噬菌体展示库”是指经过基因工程化的噬菌体集合体通 过表达一系列的多肽在其表面展示出来。“展示肽”由一个氨基酸连续序列组成，它 包括在噬菌体表面展示的蛋白质。而术语“多肽”是指至少由三个氨基酸用肽键连接 起来的链，此链可以是线型的、有分支的、环形的或其结合物。
[0049] 噬菌体库的研究对象是用基因工程的方法表达不同氨基酸的大量展示肽，在使用 该对象之后，是收集和鉴定该研究对象中的噬菌体颗粒。此处，“研究对象”是指哺 乳动物，如老鼠、兔子、人等。噬菌体颗粒通常是从一个或多个器官组织、细胞、血 液、尿、或其他的各种体液中收集而来，在其中的一个首选方案中，噬菌体颗粒通过 尾静脉注射入动物体内，一段时间后从血液循环中收集残留的噬菌体颗粒，正是那些 包含多肽的噬菌体颗粒可以延长在血液中的循环时间。
[0050] 从实验动物身上收集到的噬菌体颗粒表面表达的肽序列，能够通过固体培养基平 板分离，即在纤毛阳性菌中，噬菌体颗粒能够在生物平板上进行体外繁殖。细菌不会 被噬菌体所溶解，反而会分泌多拷贝的噬菌体以展示插入肽。插入展示肽的氨基酸序 列是由噬菌体基因组中插入肽相对应的DNA序列决定。
[0051] 本发明的上下文中，所述多肽类似物是指噬菌体筛选得到的具有延时功能的其他 短肽，或将SEQ ID NO:1所示的多肽序列的氨基酸增加、缺失、变换顺序或替换获 得的多肽。
[0052] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明 本发明而非用于限制本发明的范围。
[0053] 实施例1：特异性延时短肽的筛选
[0054] 本实施例中，用来筛选特异性延时短肽的文库由New England Biolabs提供，为 含有二硫键的七肽文库(Ph.D.TM-C7C)。这个文库中的随机片段的两侧是半胱氨酸残 基，它们可以在噬菌体组装过程中被氧化形成二硫键的连接，这样就形成一个环肽和 靶对象相互作用。这个文库含有超过二十亿个克隆数。文库中随机肽在小外壳蛋白 pIII的氨基端，所以每个噬菌体颗粒都表达五个拷贝。Ph.D.TM-C7C文库中噬菌体表 达随机序列的位置之前是丙氨酸-半胱氨酸。在随机肽和pIII蛋白间含有短的连接序 列(甘氨酸-甘氨酸-甘氨TM酸-丝氨酸)。(Ph.D. -C7C噬菌体肽展示试剂盒， http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp)。
[0055] 将1×1011个噬菌体溶于300μl生理盐水中，尾静脉注射到150g SD大鼠体内，48 小时后体内取全血，铺在含有X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)和 IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactoside)的LB平板上，6只大鼠获得了300个噬菌斑。 将其全部挑取扩增，1×1011个噬菌体继续进行第二轮体内筛选，96小时后获得的500 个噬菌斑混合扩增进行第三轮筛选，时间延长到120小时。
[0056] 图1显示了三轮筛选48h后大鼠体内全血中噬菌体的数量，可以看到随着筛选的 进行，相同时间点每一轮噬菌体的数量都大幅增长，第三轮48h大鼠体内噬菌体可以 达到3.5×104个。
[0057] 从第二轮和第三轮筛选得到的噬菌斑中随机挑选30个进行测序，获得展示肽序 列。通过延时能力等系列测试后，最终优选出以下三种噬菌体展示肽：
[0058] BCP1：CNARGDMHC(SEQ ID NO:1)；
[0059] BCP2：CIVRGDNVC(SEQ ID NO:2)；
[0060] BCP6：CVPRGDMHC(SEQ ID NO:3)。
[0061] 实施例2：延时能力测试
[0062] 分别取1×1011个携带实施例1得到的展示肽BCP1、BCP2和BCP6的噬菌体， 与随机噬菌体SC(展示肽序列：CNATLPHQC，SEQ ID NO:4)混合后，尾静脉注射 到大鼠体内，分别在0h(3min)和72h取血铺板检测噬菌体。
[0063] 图2显示了0h和72h时噬菌体的数量。由图可见，0h时四种噬菌体的数量相近， 但在72h时SC噬菌体已经没有了，BCP1所占的比例最高，BCP6和BCP2次之。可 见携带实施例1获得的三种展示肽的噬菌体均具有显著的延长噬菌体在大鼠血液中 循环时间的能力。
[0064] 为了进一步确定BCP1的延时效果，我们将等量BCP1和SC噬菌体分别注射到 大鼠体内，在不同时间点检测血液中噬菌体的数量，结果如图3所示。
[0065] 同时，将BCP1与白斑噬菌体REW(展示肽序列：CTARSPWIC，SEQ ID NO:5) 1：1混合后注射到同只大鼠体内，在不同时间点检测血液中两者的比例，结果如图4 所示。
[0066] 图3的结果显示，相对于BCP1噬菌体，SC噬菌体的数量随时间下降的更快， 在48h时已经检测不到了，而BCP1噬菌体在144h时仍然可以检测到，进一步证实 了BCP1噬菌体在血液中的延时能力。
[0067] 图4的结果显示，BCP1/REW的比例在12h时达到100，36h时超过了1000，可 见排除了动物个体差异的影响因素，噬菌体仍然具有较好的延长血液循环时间的能 力。。
[0068] 实施例3：验证噬菌体的延时功能具有序列特异性
[0069] 在筛选过程中我们发现，随着噬菌体一轮一轮地富集，含有RGD序列的噬菌体 出现的频率不断升高，因此为了确定实施例1得到的噬菌体展示肽序列中RGD的重 要性，我们构建了三种BCP1噬菌体，具体如下：
[0070] TB1：CRNHDMGAC(SEQ ID NO:6，打乱了BCP1序列)；
[0071] TB2：CNAAGAMHC(SEQ ID NO:7，将RGD突变为AGA)；
[0072] TB3：CAARGDAAC(SEQ ID NO:8，保留RGD，将其余四个氨基酸突变为A)。
[0073] 随后将1×1011个TB1、TB2、TB3以及BCP1、SC噬菌体分别注射到不同大鼠体 内，或者与REW 1:1混合后注射到同只大鼠体内，检测在不同的时间点血液中噬菌 体的数量，结果如图5所示。
[0074] 图5的结果显示，TB1和TB2的血液滞留时间与SC相当，在48h时血液中几乎 检测不到，暗示其已经丧失了延时能力；而TB3也部分丧失了延时能力。
[0075] 图6的结果显示，三种突变噬菌体和BCP1在0h时与REW比例相近，而在48h 后，除了BCP1，其余噬菌体在体内与REW比例相近，不再具有延时能力。
[0076] 以上结果显示，RGD对于噬菌体在血液中的延时功能是必要的，但光有RGD还 不足以支撑其延时功能。
[0077] 实施例4：噬菌体延时功能不是通过抵抗补体系统实现
[0078] 将全血分离得到的血浆在56℃或者37℃孵育10minutes(56℃处理可以使血液中 的补体系统失活)。随后将1×109个BCP1和SC噬菌体分别与预先处理的血浆混合孵 育，检测不同时间后噬菌体的数量，结果如图7所示。
[0079] 图7的结果显示，在补体系统未失活的状态下，噬菌体数量随时间梯度减少，而 当补体系统失活后，这种下降速率减慢，暗示是血液中的补体系统导致了噬菌体的失 活；但更关键的是，BCP1与SC噬菌体数量的减少并没有显示出明显的差别，提示 BCP1噬菌体的延时功能并不是通过抵抗补体系统实现的。
[0080] 实施例5：噬菌体通过与血细胞相互作用达到延时目的
[0081] 分别将1×108个提前与血细胞PBC结合的BCP1和SC噬菌体与等量未结合的 BCP1和SC噬菌体分别尾静脉注射到大鼠体内，不同时间点取血检测血液中噬菌体 的数量，结果如图8所示。
[0082] 进一步的，为了检测BCP1噬菌体与血液哪一组分结合，分别将1×1011个BCP1、 SC和TB2噬菌体注射到大鼠体内，不同时间点取1ml血液与100μl抗凝剂CPD(16 mM柠檬酸，90mM柠檬酸钠，16mM NaH2PO4，142mM右旋葡萄糖，pH 7.4)混 合，室温静置15min后，25℃、
2000g离心10min，粗分血细胞与血浆，检测两部分 中噬菌体的数量，结果如图9A-图9C所示。
2000g离心10min，粗分血细胞与血浆，检测两部分 中噬菌体的数量，结果如图9A-图9C所示。
[0083] 图8的结果显示，相对于未结合血细胞的噬菌体，与血细胞结合后的SC与BCP1 噬菌体在血液中的延时能力都得到了提升，且BCP1的血液滞留时间延长的更久。
[0084] 图9A、9B和9C分别显示的是SC、BCP1和TB2噬菌体不同时间点在血浆和血 细胞中的数量，0h时BCP1噬菌体在血浆中的数量比与血细胞结合的噬菌体高出10 倍，24h时接近相同，但在36h时与血细胞结合的噬菌体的数量已经远远高于血浆中 的，并且一直持续到72h。
[0085] 以上结果提示，BCP1噬菌体的延时能力是因为与血细胞结合而实现的。
[0086] 实施例6：噬菌体通过与血细胞中血小板相互作用达到延时目的
[0087] 将BCP1噬菌体注射到大鼠体内后，在不同时间点从心脏取1ml血液，与100μl CPD混合，室温静置15min后，200g离心20min。样品分为三层，从上往下第一层 为血小板富集区域，第二层为白细胞富集区域，第三层为红细胞富集区域。白细胞层 与红细胞层可以直接检测滴度代表噬菌体结合数量。血小板通过将上清第一层2000g 离心10min后获得。
[0088] 进一步的，通过流式分选更准确的获得三种组分。将1×1011个BCP1、SC或者TB2噬菌体尾静脉注射到大鼠体内后，不同时间点从心脏取1ml血液，与100μl CPD 混合，室温静置15min后，200g离心20min。样品分为三层，从上往下第一层为血小 板富集区域，第二层为白细胞富集区域，第三层为红细胞富集区域。在上清血小板层 中加入0.2M三磷酸腺苷双磷酸酶防治血小板激活，2000g、4℃离心10min富集血小 板。中间层白细胞通过加入红细胞裂解液，去除红细胞后进一步富集回收。三种细胞 组分用含1％FBS的PBS重悬，加入CD16/32抗体，冰上静置10min后，分别标记 FITC-anti-rat CD45，PE-anti-rat Erythroid Cell和PerCP/Cy5.5-anti-mouse/rat CD42d抗 体进行分选回收。2000g、4℃离心5min回收富集分选后的细胞并检测其中噬菌体的 数量，结果如图10所示，其中的PLT代表血小板，WBC为白细胞，RBC为红细胞。
[0089] 图10A的结果显示，不同时间点相对于红细胞，BCP1噬菌体更多的与血小板与 白细胞相结合，而图10B和图10C的结果分别显示，SC和TB2与血细胞结合的数量 大大降低。
[0090] 实施例7：BCP1噬菌体通过展示肽与血小板相互作用
[0091] 1×109个BCP1噬菌体体外与1ml大鼠血液混合，另外两组加入合成的BCP短肽 (序列：ACNARGDMHCG，SEQ ID NO:9)或SC短肽(序列：ACNATLPHQCG， SEQ ID NO:10)，37℃孵育1.5h后，流式分选检测血液三种细胞组分中噬菌体结合的 数量，结果如图11所示。
[0092] 图11的结果显示，相对于SC短肽，BCP1短肽的加入显著降低了BCP1噬菌体 与血小板和白细胞的结合，证明了BCP1噬菌体是通过特异性展示肽与血小板或者白 细胞结合的。
[0093] 实施例8：延时抗菌噬菌体BCP1-BGL
[0094] 利用限制性内切酶EcoR I和Hind III将含有BglII R基因(杀菌基因，可特异性 识别并剪切宿主DNA的BglII位点5’-AGATCT-3’)的PCR产物进行酶切，回收后的 片段与M13KE载体(购自New England Biolabs)于16℃连接过夜，测定M13KE载 体上Eag I和Kpn I酶切位点间是否包含BCP1核酸序列，包含BCP1核酸序列的重 组噬菌体即为BCP1-BGL，未包含的即为BGL。
[0095] 其中，含有BglII R基因的PCR产物是采用以下引物：
[0096] 正向：5'-CCCAAGCTTAAATTAGACCGCACTTACATAGGCG-3'；
[0097] 反向：5'-CCGGAATTCTTAATATGTCACGATTGTTCCTCTTTTCC-3'；
[0098] 以PMRB1质粒为模板，通过以下PCR条件获得：
[0099] 94℃预变性10min；
[0100] 94℃变性30s；
[0101] 退火59℃30s；
[0102] 72℃延伸1min；
[0103] 72℃延伸10min；
[0104] 中间三步，重复30个循环。
[0105] 将重组子噬菌体BCP1-BGL转入含有PBM1质粒(包含BglII M基因，可使宿主 DNA的BglII位点甲基化从而不被BglII蛋白剪切)的ER2738感受态细胞中，进行 扩增纯化噬菌体，以用于后续实验。其中PMRB1质粒及PBM1质粒皆由维也纳大学 的Armin Resch教授。
[0106] 实施例9：抗菌噬菌体BGL和BCP1-BGL的体外抗菌能力
[0107] 将OD600培养到0.2的大肠杆菌MC4100F'与不同比例MOI(大肠杆菌数量/噬 菌体数量)的BCP1、SC、BGL和BCP1-BGL四种噬菌体在含有0.003mol/L IPTG的 LB培养基中继续培养，同时以PBS作为对照，在不同的时间点检测培养液中大肠杆 菌的数量，以验证4种噬菌体的体外抗菌能力，结果如图12所示。
[0108] 图12的结果显示，在MOI＝10的情况下，培养4h后，相对于其他组，BGL和 BCP1-BGL组的大肠杆菌数量并没有呈一直增加的趋势，说明构建的噬菌体BGL和 BCP1-BGL是具有抗菌活性的。
[0109] 实施例10：抗菌噬菌体BGL及BCP1-BGL的体外抗菌释放内毒素的水平[0110] 将OD600培养到0.2的大肠杆菌MC4100F'在MOI＝10的条件下，加入BCP1、 SC、BGL和BCP1-BGL四种噬菌体，在含有0.003mol/L IPTG的LB培养基中继续培 养，同时以PBS作为对照。通过内毒素检测试剂盒(ToxinSensorTM Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit)，分别在0、1、2和4小时检测培养液上清中内毒素的含量，结 果如图13所示。
[0111] 图13的结果显示，在MOI为10的情况下，相对于阴性对照，四种噬菌体的感 染并未导致内毒素的释放增加，说明四种噬菌体是安全的。
[0112] 实施例11：检测抗菌噬菌体BGL及BCP1-BGL的体内延时能力
[0113] 将1×1011个BCP1、SC、BGL和BCP1-BGL噬菌体分别尾静脉注射到大鼠体内， 在不同时间点取血，检测血液中噬菌体的含量；同时在各个时间点将10ml生理盐水 注射到大鼠腹腔，回收检测腹水中噬菌体的数量。检测结果如图14A和14B所示。
[0114] 图14A和14B分别为四种噬菌体不同时间点血液和腹水中噬菌体的数量，可以 看到，相对于SC和BGL噬菌体，含有BCP1的BCP1-BGL的噬菌体在血液与腹水 中依然具有较长的延时时间，说明BGL的加入并未破坏BCP1的延时功能。
[0115] 实施例12：检测BGL及BCP1-BGL的体内抗菌能力
[0116] 将1×1011个BCP1、SC、BGL和BCP1-BGL噬菌体分别尾静脉注射到大鼠体内， 同时以PBS作为对照，18h后腹腔注射1×108个大肠杆菌MC4100F'，1h后注射2μM 的IPTG。5h后通过10ml生理盐水清洗腹腔，回收腹水。另取1g肝脏重悬在1ml生 理盐水中充分研磨。分别检测腹水与肝脏中大肠杆菌的数量，结果如图15A和图15B 所示。
[0117] 图15A和图15B的结果显示，同时具有延时以及抗菌能力的BCP1-BGL噬菌体 处理组，腹水以及肝脏中大肠杆菌的数量最少，代表其具有抗菌能力。
[0118] 实施例13：检测BCP1-BGL处理对感染细菌后大鼠血液中IFN-γ的影响[0119] 将1×1011个BCP1、SC、BGL和BCP1-BGL噬菌体分别尾静脉注射到大鼠体内， 同时以PBS作为对照，18h后腹腔注射1×108个大肠杆菌MC4100F'，同时以注射PBS 到SC和BCP1-BGL噬菌体大鼠作为对照，1h后注射2μM的IPTG，5h后通过ELISA 试剂盒检测大鼠血浆中的IFN-γ含量，结果如图16所示。
[0120] 图16的结果显示，BCP1-BGL处理可以显著降低感染细菌后大鼠血液中IFN-γ 的含量，说明其具有一定的抗菌效果。
[0121] 实施例14：BCP1-BGL处理对感染细菌后大鼠肝功能的影响
[0122] 将1×1011个BCP1、SC、BGL和BCP1-BGL噬菌体分别尾静脉注射到大鼠体内， 同时以PBS作为对照；18h后腹腔注射1×108个大肠杆菌MC4100F'，同时以PBS注 射PBS噬菌体作为对照；1h后注射2μM的IPTG；5h后通过自动生化仪检测血浆中 ALT和AST的含量，结果如图17A和图17B所示。
[0123] 另取1g肝脏组织用石蜡包被，5mm左右的切片进行H&E染色，结果如图18所 示。
[0124] 图17A和17B的结果显示，同时具有延时以及抗菌能力的BCP1-BGL处理组在 感染细菌后，相对于其余三种噬菌体，血液中ALT和AST值上升较少，说明该组大 鼠肝功能破坏水平较少。
[0125] 图18的肝组织切片结果显示出相同的结果，说明BCP1-BGL在体内具有一定的 抗菌活性。
[0126] 虽然以上实施例对于本发明的延长噬菌体血液循环时间的多肽、携带该多肽的噬 菌体、同时携带该多肽和抗菌蛋白BGL的延时抗菌噬菌体，及其作用机理进行了详 细的描述。然而，本领域的技术人员容易理解，在本发明公开的技术内容的范围内， 对其进行适当的改变是可能的。例如对本发明的多肽序列进行适当的修改，包括删除、 增加、替换、变换顺序等，因此这些修改同样属于本发明的范围。此外，对于编码这 些氨基酸序列的核苷酸序列，毫无疑问也同样属于本发明的范围。
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