一种与生殖支原体粘附素蛋白MgPa特异性结合的多肽及其用途
阅读：1023发布：2020-06-30
专利汇可以提供一种与生殖支原体粘附素蛋白MgPa特异性结合的多肽及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种能够与生殖支原体粘附素蛋白MgPa特异性结合的多肽，该多肽的 氨 基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的多肽的DNA插入于 噬菌体 中，扩增后用ELISA测定能否与MgPa发生特异结合。ELISA结果说明：噬菌体克隆与MgPa的结合能 力 较高(OD450值大于1.5)，因此该噬菌体为阳性噬菌体克隆，说明该噬菌体表面插入的多肽能特异性识别MgPa重组蛋白，为与MgPa重组蛋白特异结合的多肽。本发明中所提供的多肽能够与生殖支原体MgPa特异性结合，能够用于制备 预防 生殖支原体感染的 疫苗 及 治疗 因生殖支原体感染而引起的生殖系统 疾病 的药物中，具有显著的效果。，下面是一种与生殖支原体粘附素蛋白MgPa特异性结合的多肽及其用途专利的具体信息内容。
一种与生殖支原体粘附素蛋白MgPa特异性结合的多肽及其
用途
技术领域
背景技术
[0002] 支原体介于病毒与细菌之间，缺乏细胞壁、呈高度多型性，可通过除菌过滤器，可在无细胞的培养基中繁殖，在固体培养基平板上培养可成“油煎蛋”样的独特菌落，是广泛存在于自然界的条件致病微生物。生殖支原体(Mycoplasma genitalium，Mg)是支原体属中的一种，首次发现是从一名非淋菌性尿道炎患者尿道分泌物中分离出的。临床调查研究表明，女性Mg感染可引起宫颈炎，盆腔炎，不孕等；而男性感染则可引起急慢性非淋菌性尿道炎(NGU)，不育等；更值得注意的是，随着更深入的研究显示，Mg感染与人类免疫缺陷疾病(HIV)的机会感染密切相关，能选择性的激活CD4+T细胞促使HIV的复制，是HIV的协同因子之一。
[0003] 病原体和宿主细胞膜上相应受体的结合是病原体感染宿主的第一步，对其能否感染宿主细胞至关重要。有研究表明，Mg必须先黏附于泌尿生殖道或呼吸道黏膜细胞才能感染宿主并定植于感染部位或侵入细胞内，失去黏附能力的突变株则缺乏感染能力。支原体缺乏细胞壁，但Mg细胞膜上存在较多的外膜蛋白，Mg通过酰基锚定在其细胞膜上的膜蛋白介导Mg定植到宿主细胞表面而感染致病。Burgos等研究表明Mg膜蛋白能刺激机体发生持续的免疫反应。Mg通过粘附感染宿主细胞最主要的外膜蛋白为生殖支原体粘附素蛋白(MgPa)，而自发性的无细胞黏附活性的Mg突变株则缺乏MgPa。MgPa的基因编码含有三个操纵子分别为mg190(mgpA)，mg191(mgpB)和mg192(mgpC)，其中编码MgPa的基因为mgpB，由其编码的MgPa蛋白主要集中在Mg烧瓶状的顶尖部位，这一特殊位置对Mg的粘附感染宿主起至关重要的作用。Mernaugh等研究表明Mg可凭借其尖形结构主动靠近并黏附于人胚肺成纤维细胞表面，并通过微管将核酸、酶等输入宿主细胞内，将某些酶解产物吸入细胞内供Mg利用，由此影响宿主的代谢及生物合成。
发明内容
[0005] 本发明解决了背景技术中的不足，提供了一种能够与生殖支原体粘附素蛋白MgPa特异性结合的多肽，该多肽的的氨基酸序列为：Val-His-Trp-Asp-Phe-Arg-Gln-Trp-Trp-Gln-Pro-Ser，其氨基酸序列表如SEQ ID NO：1所示。
[0006] 本发明筛选到的阳性噬菌体扩增后用ELISA测定其能否与MgPa发生特异结合。ELISA结果说明：阳性噬菌体与MgPa的结合能力较高(OD450值大于1.5)，说明该噬菌体表面插入的上述多肽能特异性识别MgPa重组蛋白，为与MgPa重组蛋白特异结合的多肽。
[0007] 为进一步证实上述阳性噬菌体克隆能与MgPa重组蛋白发生特异性结合，将阳性噬菌体进行竞争抑制性ELISA试验。结果表明这些噬菌体与MgPa重组蛋白发生的特异性结合能不同程度的被不同稀释度的抗MgPa抗体抑制，且随着抗体稀释比例的升高其抑制效果相应的下降。这些结果说明上述阳性噬菌体与MgPa重组蛋白的特异结合能被MgPa的抗体所抑制，进一步说明了阳性噬菌体克隆能与MgPa重组蛋白发生特异性结合。
[0008] 为更进一步证明上述阳性噬菌体克隆能与MgPa重组蛋白发生特异性结合，取经扩增后的阳性噬菌体于硝酸纤维素膜上，分别与MgPa重组蛋白及其抗MgPa抗体孵育后，采用常规斑点印迹法进行阳性噬菌体克隆的鉴定。斑点印迹图表明，上述阳性噬菌体克隆显示有明显的斑点，而在阴性对照处无明显斑点。说明筛选出来的阳性噬菌体能与MgPa蛋白发生特异结合。
[0010] 图1和图2为本发明中琼脂糖电泳分析提取的噬菌体单链DNA结果图；
[0012] 图4为本发明中抗MgPa抗体与阳性噬菌体的竞争抑制ELISA试验结果图；
[0013] 图5为本发明中阳性噬菌体克隆斑点印迹鉴定结果图。
具体实施方式
[0014] 下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
[0015] 本实施例中所提供的多肽为以MgPa为靶分子，从噬菌体展示12肽库筛选而得，具体的筛选方法本发明中不需进行过多阐述，现针对所筛选得到的噬菌体进行鉴定及分析。
[0016] 1、噬菌体肽库滴度测定
[0017] 噬菌体肽库用无菌LB液体培养基从107稀释至1014后，将处于对数生长期的噬菌体菌株ER2738与每个稀释度的噬菌体混匀后铺于含IPTG和X-gal的固体培养基培养，由于噬菌体展示库中的噬菌体含特有的lacZα基因，因此当噬菌斑生长在含有IPTG和X-gal的培养平板上时，颜色呈现出蓝色，而外界污染的噬菌斑并无特定的lacZα基因，颜色则为白色。
[0018] 2、噬菌体特异性结合的富集分析
[0019] 以纯化浓缩好的MgPa重组蛋白为靶分子，对噬菌体随机12肽库进行3轮淘选。在淘选过程中，为得到与MgPa重组蛋白能特异性结合的噬菌体，在淘选时逐一降低了靶蛋白的包被量(100μg/mL、60μg/mL、30μg/mL)，同时提高了TBST中Tween-20的浓度(第一轮为0.1％、第二、三轮0.5％)，另外，在后面两轮的淘选中增加了洗涤次数、减少了靶分子与噬菌体的孵育时间。测滴度时，每一个稀释度取20μl，做两个平板，计算少于100个的噬菌斑平板，取两平行平板的平均值。在计算产率(Ratio)时，以每一轮生物淘选时加入噬菌体的量作为投入量(Input)，洗脱后测滴度的平板上蓝色噬菌斑的量为产出的量(Output)，产率的计算＝产出量/投入量×100％。
[0020] 由表1可知，第1轮淘洗时其产率仅为1.78×10-6，而第3轮淘洗时其产率达到了7.30×10-5，说明具有特异性结合活性的噬菌体克隆得到明显富集。
[0021] 表1亲和筛选的产出与投入比
[0022]筛选轮数 第一轮 第二轮 第三轮
投入(pfu) 4×1010 4×1010 4×1010
产出(pfu) 7.1×104 3.2×105 2.9×106
产出投入比 1.78×10-6 8.0×10-6 7.3×10-5
投入(pfu) 4×1010 4×1010 4×1010
产出(pfu) 7.1×104 3.2×105 2.9×106
产出投入比 1.78×10-6 8.0×10-6 7.3×10-5
[0023] 3、阳性噬菌体克隆单链DNA的提取
[0024] 对阳性噬菌体克隆单链DNA的提取采用碘化钠法进行。从第三轮洗脱下来的产物进行培养后，随机挑取了噬菌体克隆进行扩增，提取其单链DNA，其结果如图1和图2所示，在DNA Marker分子量3,000bp以上有一条清晰明显的条带，而噬菌体M13的整个基因大小含有6,407个核苷酸，但本发明提取的M13噬菌体的DNA为单链DNA，因此，所提取的DNA在琼脂糖凝胶电泳泳道中大于3000bp，说明噬菌体克隆单链DNA的提取成功。
[0025] 4、阳性噬菌体单链DNA测序及外源性氨基酸序列分析
[0026] 将提取的噬菌体单链DNA送某基因公司测序，根据所测序列的反向互补序列，推导出其外源氨基酸序列。得到一条重复出现17次的完全一致的噬菌体序列，如表2所示，即：Val-His-Trp-Asp-Phe-Arg-Gln-Trp-Trp-Gln-Pro-Ser，如SEQ ID NO：1所示。该肽序列为能与MgPa重组蛋白特异结合的多肽。
[0027] 表2噬菌体展示肽序列的分组与比对分析
[0028]
[0029] 5、阳性噬菌体能与.MgPa特异性结合
[0030] 选择所筛选到的上述肽序列的噬菌体，扩增后用ELISA测定能否与MgPa发生特异结合。阳性孔为包被目的蛋白组，阴性孔为不包被蛋白只用BSA封闭，包被蛋白不加噬菌体和包被蛋白加噬菌体不加HPR标记的抗噬菌体抗体的孔为空白对照孔。用MgPa包被96孔板，封闭后加入扩增的噬菌体，洗板后加入HPR标记的抗M13单抗，孵育后加入显色液显色，测OD450值。ELISA结果如图3所示，结果说明上述噬菌体克隆与MgPa的结合能力较高(OD450值大于1.5)，因此为阳性噬菌体克隆，说明上述噬菌体表面的多肽能特异性识别MgPa重组蛋白，为MgPa重组蛋白特异结合的多肽。
[0031] 6、抗MgPa抗体能抑制噬菌体与MgPa的结合
[0032] 为进一步证实阳性噬菌体克隆能与MgPa重组蛋白发生特异性结合，我们将上述噬菌体阳性克隆进行竞争抑制性ELISA试验。结果如图4所示，所述噬菌体与MgPa重组蛋白发生的特异性结合能被不同稀释度的抗MgPa抗体部分抑制，且随着抗体稀释比例的升高其抑制效果相应的下降。不同稀释比例的抗体对噬菌体与MgPa重组蛋白结合的抑制率见图4与表3，结果表明随着抗体稀释比例从1:1000稀释到1:3000，其对噬菌体与MgPa重组蛋白结合的抑制率降低了。这些结果说明筛选到的阳性噬菌体与MgPa重组蛋白的特异结合能被MgPa的抗体所抑制，进一步说明了阳性噬菌体克隆能与MgPa重组蛋白发生特异性结合。
[0033] 表3不同稀释比例的抗-MgPa抗体对阳性噬菌体与MgPa结合的抑制率(％)[0034]
[0035] 7、阳性噬菌体克隆的斑点印迹实验验证
[0036] 为更进一步证明阳性噬菌体克隆能与MgPa重组蛋白发生特异性结合，取经扩增后的阳性噬菌体20μL于硝酸纤维素膜上，分别与MgPa重组蛋白及其抗MgPa抗体孵育后，采用常规斑点印迹法进行阳性噬菌体克隆的鉴定。斑点印迹图如图5所示，图5中，Lanes:1：P1阳性噬菌体克隆，2-3：BSA空白对照，4：野生型vcsM13噬菌体阴性对照。图4中表明，阳性噬菌体克隆处显示有明显的斑点，而在阴性对照处无明显斑点。说明筛选出来的阳性噬菌体能与MgPa蛋白发生特异结合。
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