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噬菌体菌株及其应用

阅读：290发布：2020-05-12

专利汇可以提供噬菌体菌株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了新的噬菌体菌株及其应用，尤其用于鱼类养殖。，下面是噬菌体菌株及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.噬菌体，其用于预防和治疗由对这些噬菌体敏感的致病性细菌菌株引起的农场动物，特别是鱼类的感染的用途，其中旨在有利地以24小时的时间间隔经由浸泡给予有生命危险的动物所述噬菌体。
2.根据权利要求1所述用途的噬菌体，其中鱼类养殖中的感染是气单胞菌和假单胞菌的致病性菌株，尤其是嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的菌株的感染，其中所用的噬菌体是选自以下述保藏号保藏于波兰微生物保藏中心的组的噬菌体菌株：F/00096(25AhydR2PP菌株)、F/00094(50AhydR13PP菌株)、F/00098(22PfluR64PP菌株)、F/00099(67PfluR64PP菌株)、F/00100(71PfluR64PP菌株)、F/00095(98PfluR60PP菌株)和F/00101(60AhydR15PP菌株)。
3.噬菌体，其用于通过刺激先天免疫系统和体液免疫系统两者来刺激鱼类对感染的免疫力的用途。
4.根据权利要求3所述用途的噬菌体，其中所用的噬菌体菌株选自以下述保藏号保藏于波兰微生物保藏中心的组：F/00096(25AhydR2PP菌株)、F/00094(50AhydR13PP菌株)、F/
00098(22PfluR64PP菌株)、F/00099(67PfluR64PP菌株)、F/00100(71PfluR64PP菌株)、F/
00095(98PfluR60PP菌株)和F/00101(60AhydR15PP菌株)。
5.噬菌体菌株，其选自以下述保藏号保藏于波兰微生物保藏中心的组：F/00096(25AhydR2PP菌株)、F/00094(50AhydR13PP菌株)、F/00098(22PfluR64PP菌株)、F/00099(67PfluR64PP菌株)、F/00100(71PfluR64PP菌株)、F/00095(98PfluR60PP菌株)和F/00101(60AhydR15PP菌株)。

说明书全文

噬菌体菌株及其应用

[0001] 本发明涉及新型噬菌体菌株及其尤其用于鱼类养殖中的应用。

[0002] 水产养殖是全球食品生产增长最快的行业。然而，阻碍其有效使用的主要障碍之一是鱼类中传染病的发展，其导致每年估计数十亿美元的巨大经济损失。导致这些感染发展的主要病因是细菌，诸如气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森菌属(Yersinia)、爱德华菌属(Edwardsiella)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococus)和肾杆菌属(Renibacterium)[Pridgeon JW,2012，Sudheesh PS,2012]。作为常规做法，饲料中添加抗生素来治疗养殖的鱼类的细菌感染。然而，由于生病个体的采食量较小以及不同环境因素的影响，这种药物施用方式并不总是令人满意。此外，抗生素的密集应用导致抗生素抗性细菌菌株的出现，其充当抗生素抗性基因的储库。由于水平基因转移，这些基因可能会被转移到其他病原体(包括人类病原体)中并直接影响人类健康。WHO将许多广泛用于水产养殖的抗微生物试剂归类为对人类健康具有至关重要的影响[Almeida A,2009，Heuer OE,2009]。由于世界许多地区鱼类产业的密集发展和重要性以及该领域广泛和不受管制的抗生素应用，需要采取旨在预防抗生素抗性传播并最小化潜在的对人类健康有副作用的风险的行动[Heuer O,2009]。噬菌体制剂的应用可能是应对细菌抗生素抗性增加的替代解决方案。噬菌体是在环境中天然存在的细菌病毒，并对某些细菌菌株或属展现出特异性[Richards GP,2014]。过去，它们被用于治疗和预防人类传染病[Eyer L.,2007]。近年来，观察到对噬菌体感兴趣的增长趋势，以及它们在现代生物技术中作为疫苗中的蛋白质和DNA载体以及作为抗生素的替代物的用途[Clark J，
2006]。在过去几年中进行的临床试验和体内研究的结果证实了噬菌体制剂的高效率和安全性[Pirnay JP,2012，Eyer J,2007]。与广泛使用的抗生素相比，噬菌体疗法的主要优点是：仅针对某些细菌菌株或属的特异性作用，由于病毒的快速突变率导致噬菌体对病原体的高活性而不会使细菌获得噬菌体抗性，同与新抗生素制剂相关的成本相比相对低的治疗成本，以及该疗法缺乏副作用[Atterbury RJ,2007，Bhardwaj SB,2014]。

[0003] 使用基于噬菌体的疫苗具有许多优点：不具有抗生素抗性基因，保护病毒DNA免于降解，此类疫苗的口服应用模式，相对便宜，容易且非常快速地大规模生产噬菌体[Clark J,2006]。

[0004] 有一些数据显示噬菌体对先天细胞和体液免疫功能(即吞噬作用、吞噬细胞的呼吸爆发和细胞因子产生)的免疫调节作用[Górski A,2012]。Weber- 等人的研究已经显示了噬菌体对血细胞产生细胞因子的控制的影响[Weber- B,2000]。

[0005] 已经公布的结果和专利解决方案主要集中在噬菌体的分离方法和分子表征，并且在小得多的程度上集中在应用噬菌体来处理水产养殖中的细菌病原体。结果显示VP-1噬菌体对鳗弧菌(Vibro anguillarum)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)具有特异性)[Pereira C,2011]。裂解性噬菌体PAS-1和ASP-1引起虹鳟鱼中杀鲑气单胞菌感染的减少[Kim JH,2012，专利申请公布US 2013/0323209A1]，而属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)家族的phiAS5噬菌体展现出对气单胞菌科(Aeromonadaceae)和抗生素抗性杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.salmonicida subsp.Salmonicida)菌株的广谱活性[Kim JH,2012]。通过在用香鱼假单胞菌(P.plecoglossicida)实验性感染的鱼类香鱼(Plecoglossus altivelis)上进行的研究证实了经口施用的噬菌体的保护作用[Park S,2000]。由从感染的鱼类分离的噬菌体PFP1和PFP12组成的混合物在体外对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)具有强烈的裂解活性[Prasad Y,2010]。三种或更多种噬菌体的组合引起了对单一噬菌体的作用不易感的杀鲑气单胞菌HER 1107的突变体的裂解。它显示了使用噬菌体以保护褐鳟免于疖病发展的可能性[Imbeault S,2006]。可以将对来自弧菌(Vibrio)属的细菌具有特异性的一些噬菌体的混合物应用于治疗大西洋鲑鱼中的由鳗弧菌引起的感染[专利申请公布US 2014/0105866A]。在鱼类尼罗口孵非鲫(Oreochromis niloticus)中使用噬菌体UP87，与用土霉素获得的结果相比，减少了血液中嗜水气单胞菌(A.hydrophila)的总数并且不会引起鱼类死亡率增加[Cruz-Papa D,2014]。噬菌体AH1完全消除了用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)实验性感染的鱼类的死亡[Wu JL,1981]。在用柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)的抗生素抗性菌株实验性感染的鲶鱼中应用裂解性噬菌体FCP1抑制了感染症状并降低鱼的死亡率[Prasad Y,2011]。

[0006] 剩下的问题是此类制剂施用将能够预防和治疗用气单胞菌和假单胞菌的菌株感染的鱼类。还希望制造的制剂将易于在养殖实践中应用，将不会引起副作用并且将具有额外的促进健康的作用。

[0007] 出乎意料地是，本发明的应用为上述问题提供了解决方案。

[0008] 本发明涉及噬菌体，其用于预防和治疗由对这些噬菌体敏感的致病性细菌菌株引起的农场动物(特别是鱼类)的感染的用途，其中旨在有利地以24小时的时间间隔经由浸泡给予有生命危险的动物所述噬菌体。

[0009] 有利地，鱼类养殖中的经治疗的感染是气单胞菌和假单胞菌的致病性菌株(尤其是嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的菌株)的感染，其中所用的噬菌体是选自以下述保藏号保藏于波兰微生物保藏中心(Polish Collection of Microorganisms)的组的噬菌体菌株：F/00096(25AhydR2PP菌株)、F/00094(50AhydR13PP菌株)、F/00098(22PfluR64PP菌株)、F/00099(67PfluR64PP菌株)、F/00100(71PfluR64PP菌株)、F/00095(98PfluR60PP菌株)和F/00101(60AhydR15PP菌株)。

[0010] 本发明的另一方面是噬菌体，其用于通过刺激先天和体液免疫系统两者来刺激鱼类对感染的免疫力的用途。

[0011] 有利地，所用的噬菌体菌株选自以下述保藏号保藏于波兰微生物保藏中心的组：F/00096(25AhydR2PP菌株)、F/00094(50AhydR13PP菌株)、F/00098(22PfluR64PP菌株)、F/
00099(67PfluR64PP菌株)、F/00100(71PfluR64PP菌株)、F/00095(98PfluR60PP菌株)和F/
00101(60AhydR15PP菌株)。

[0012] 本发明还提供了选自以下述保藏号保藏于波兰微生物保藏中心的组的噬菌体菌株：F/00096(25AhydR2PP菌株)、F/00094(50AhydR13PP菌株)、F/00098(22PfluR64PP菌株)、F/00099(67PfluR64PP菌株)、F/00100(71PfluR64PP菌株)、F/00095(98PfluR60PP菌株)和F/00101(60AhydR15PP菌株)。

[0013] 发明详述

[0014] 本发明提供了产生用于预防和治疗鱼类养殖中细菌感染的噬菌体制剂的方法，并且其特征在于以下步骤：

[0015] a)建立了对选定的细菌菌株具有特异性的噬菌体菌株的集合，

[0016] b)在固体生长培养基上进行选定的细菌菌株的划线，在25℃孵育48±3h(将每种菌株分开繁殖)，

[0017] c)准备两个96孔板：一个具有液体生长培养基(平板I)并且第二个具有固体生长培养基(平板II)，

[0018] d)用接种环从划线平板收集单个细菌菌落并转移到平板I的第一孔，剧烈摇动并用相同的接种环置于平板II的第一孔的固体培养基中；同样地，填充其他对的孔，为每对选择新的菌落并留下三个未填充的孔以控制培养基的无菌性，

[0019] e)将平板I置于微板读取仪(25℃)中并孵育直至光密度OD620的值达到0.2-0.3；然后向该平板的每个孔中加入所需的噬菌体(为其搜索生产细菌菌株)悬浮液，将其再次在微板读取仪(25℃)中孵育并记录光密度值直至获得噬菌体增殖的动力学曲线，基于其选择作为病毒增殖的最佳宿主的细菌菌落，

[0020] f)将平板II在25℃孵育24±2h，并将基于来自平板I的结果指示的细菌菌落用来制备用于给定噬菌体菌株的细菌生产菌株的接种物，

[0021] g)在无菌生长培养基中从制备的接种物培养选定的细菌菌株，在25℃孵育直至达到适合的光密度(OD620)，然后加入适当的噬菌体菌株的悬浮液并在25℃孵育4h，[0022] h)在噬菌体繁殖后，经由微滤过程从发酵液中去除细菌生命体，获得噬菌体制剂的即用成分。

[0023] 有利地是，选定的细菌菌株是：嗜水气单胞菌33658、嗜水气单胞菌7966、嗜水气单胞菌49140、荧光假单胞菌4B/UWM/03/13和荧光假单胞菌8B/UWM/03/13。

[0024] 本方法适用于快速和容易地筛选适合于非常有效繁殖噬菌体的细菌菌落，这是工业应用中的重要特征。

[0025] 本发明的另一方面是含有噬菌体混合物的噬菌体制剂在预防和治疗鱼类养殖中的细菌感染中的应用，所述细菌感染由来自气单胞菌属和假单胞菌属的细菌引起。旨在将本发明的噬菌体制剂经由浸泡给予有生命危险的动物。

[0026] 有利地，所制造的制剂显示出强的治疗效果，因为它降低了用荧光假单胞菌实验性感染的鱼的死亡率。

[0027] 有利地，鱼类养殖中的经治疗的感染是嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌和荧光假单胞菌的致病性菌株感染。为了产生噬菌体制剂，适当的噬菌体菌株选自2015年12月17日以下述保藏号保藏于波兰微生物保藏中心的组：F/00096(25AhydR2PP菌株)、F/00094(50AhydR13PP菌株)、F/00098(22PfluR64PP菌株)、F/00099(67PfluR64PP菌株)、F/00100(71PfluR64PP菌株)、F/00095(98PfluR60PP菌株)以及2016年1月15日以保藏号F/00101(60AhydR15PP菌株)保藏的菌株。

[0028] 本发明还提供了适用于预防或治疗嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌和荧光假单胞菌的致病性菌株的感染的噬菌体菌株，其选自的：60AhydR15PP、25AhydR2PP、50AhydR13PP、22PfluR64PP、67PfluR64PP、71PfluR64PP和98PfluR60PP。

[0029] 本发明的噬菌体制剂是基于生态系统的天然成分，因此它不会对除了具体限定的致病性细菌之外的其它生物体产生负面影响。它保证只选择性地减少气单胞菌和假单胞菌的致病性菌株。

[0030] 出乎意料地是，本发明的噬菌体制剂是安全的并且鱼类对其是耐受良好的，这通过对鲤鱼和虹鳟鱼群体的血液学和生物化学研究得到证实。

[0031] 有利地，本发明的噬菌体制剂显示出强免疫活性，因为它通过刺激先天和体液免疫系统两者影响鱼类对感染的免疫力。

[0032] 旨在将该制剂用于畜牧业生产，尤其是用于对抗水产养殖中嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌和荧光假单胞菌的致病性菌株。

[0033] 根据本发明的方法鉴定本申请中揭示的噬菌体菌株。出乎意料地是，它们展现出广泛的特异性，能够裂解至少荧光假单胞菌的4种菌株、嗜水气单胞菌的11种菌株和杀鲑气单胞菌的5种菌株。噬菌体菌株在冷/冷藏温度下至少3个月的储存是稳定的。此外，可以在不损失其活性的情况下成功地以工业规模进行这些菌株的繁殖。

[0034] 为了使本发明变得更加明显，在附图中予以说明。

[0035] 图1呈现了嗜水气单胞菌7966菌株对噬菌体和噬菌体制剂的易感性的分析结果。1–嗜水气单胞菌7966与25AhydR2PP；2–嗜水气单胞菌7966与BAFADOR II；3–嗜水气单胞菌
7966与BAFADOR III；4–嗜水气单胞菌7966与BAFADOR IV；5-嗜水气单胞菌7966的生长对照。

[0036] 图2呈现了嗜水气单胞菌7965菌株对噬菌体和噬菌体制剂的易感性的分析结果。1–嗜水气单胞菌7965与13AhydR10PP；2–嗜水气单胞菌7965与14AhydR10PP；3–嗜水气单胞菌7965与85AhydR10PP；4–嗜水气单胞菌7965与BAFADOR II；5–嗜水气单胞菌7965的生长对照。

[0037] 图3呈现了嗜水气单胞菌49140菌株对噬菌体和噬菌体制剂的易感性的分析结果。1–嗜水气单胞菌49140与50AhydR13PP；2–嗜水气单胞菌49140与BAFADOR II；3–嗜水气单胞菌49140与BAFADOR III；4–嗜水气单胞菌49140与BAFADOR IV；5–嗜水气单胞菌49140的生长对照。

[0038] 图4呈现了嗜水气单胞菌33658菌株对噬菌体和噬菌体制剂的易感性的分析结果。1–嗜水气单胞菌33658与60AhydR15PP；2–嗜水气单胞菌33658与BAFADOR II；3–嗜水气单胞菌33658与BAFADOR III；4–嗜水气单胞菌33658与BAFADOR IV；5–嗜水气单胞菌33658的生长对照。

[0039] 图5呈现了荧光假单胞菌8B/UWM菌株对噬菌体和噬菌体制剂的易感性的分析结果。1–荧光假单胞菌8B/UWM与22PfluR64PP；2–荧光假单胞菌8B/UWM与67PfluR64PP；3–荧光假单胞菌8B/UWM与71PfluR64PP；4–荧光假单胞菌8B/UWM与BAFADOR II；5–荧光假单胞菌8B/UWM与BAFADOR III；6-荧光假单胞菌8B/UWM与BAFADOR IV；7–荧光假单胞菌8B/UWM的生长对照。

[0040] 图6-9显示了选定的噬菌体的限制性图谱。

[0041] 图6呈现了用以下限制酶消化后获得的噬菌体60AhydR15PP的限制性图谱：DraI(第2泳道)、SspI(第4泳道)、AseI(第6泳道)。第1泳道和第8泳道-DNA梯(DNA ladder)(1kb)。

[0042] 图7呈现了用EcoRI限制酶消化后获得的噬菌体22PfluR64PP(第2泳道)、67PfluR64PP(第3泳道)和71PfluR64PP(第4泳道)的限制性图谱。第1泳道-DNA梯(1kb)。

[0043] 图8呈现了用SspI限制酶消化后获得的噬菌体50AhydR13PP的限制性图谱(第2泳道)和用EcoRI限制酶消化后获得的噬菌体98PfluR60PP的限制性图谱(第3泳道)。第1泳道-DNA梯(1kb)。

[0044] 图9呈现了用EcoRI限制酶消化后获得的噬菌体25AhydR2PP(第2泳道)的限制性图谱。第1泳道-DNA梯(1kb)。

[0045] 实施例1.噬菌体的分离和特征

[0046] 制备从人和农场动物分离的气单胞菌和假单胞菌属的细菌菌株集合[0047] 最初，制备了气单胞菌和假单胞菌的82种细菌菌株的集合(表1)。将这些菌株用于测试分离的噬菌体的特异性。该集合包括在公共存储库中可获得的参照菌株一以及从波兹南的亚当密兹凯维奇大学(Adam Mickiewicz University in Poznań)，从奥尔什丁的内陆渔业研究所的鱼类病理学和免疫学系(Department of Fish Pathology and Immunology of Inland Fisheries Institute in Olsztyn)和从奥尔什丁的瓦尔米亚和马祖里大学(University of Warmia and Mazury in Olsztyn)获得的分离物(表2)。

[0048] 表1.气单胞菌、假单胞菌、耶尔森菌、肾杆菌和肠球菌的细菌菌株集合[0049]

[0050]

[0051]

[0052]

[0053] 表2.气单胞菌、假单胞菌、耶尔森菌、肾杆菌和肠球菌的细菌菌株[0054]

[0055] 从环境样品分离对选定的气单胞菌和假单胞菌的菌株有活性的噬菌体。

[0056] 从取自进气歧管的样品(其代表废水处理过程的初始阶段，接收自罗兹市的主要污水处理厂 (Main Sewage Treatment Plant in Lodz))或从的内陆渔业研究所(Inland Fisheries Institute，IRS)获得的水样分离噬菌体(表3)。

[0057] 表3.分离的噬菌体及其宿主。

[0058]

[0059] 通过在具有Luria-Bertani(LB)培养基的平板上连续传代至单个噬菌斑来纯化用于进一步实验的所有噬菌体。该程序需要至少5倍的传代。

[0060] 用平板法分离的噬菌体的特异性最初是基于噬菌体对从患病鱼类中分离的气单胞菌和假单胞菌的选定菌株(获自奥尔什丁的内陆渔业研究所(IRS)的鱼类病理学和免疫学系以及奥尔什丁的瓦尔米亚和马祖里大学)的以及对构成从患者分离的示例性菌株集合延伸的气单胞菌和假单胞菌的选定菌株(获自波兹南的亚当密兹凯维奇大学)的裂解能力来确定的。

[0061] 为了证实结果，将分离的噬菌体的特异性研究重复3次(表4和5)。表4.选定的噬菌体对气单胞菌的选定模型和环境菌株(蛋白制药公司(Proteon Pharmaceuticals)细菌菌株集合)的特异性。

[0062]

[0063] ，，cl”–完全裂解；，，+”生长抑制；，，-”–没有作用

[0064] 表5.选定的噬菌体对假单胞菌的选择的环境菌株(蛋白制药公司细菌菌株集合)的特异性。

[0065]

[0066] ，，cl”–完全裂解；，，+”生长抑制；，，-”–无效应

[0067] 使用宿主菌株作为生产菌株繁殖分离的噬菌体。基于Su等人的改进方法[MT Su,1998]，对这些样品进行噬菌体的基因组DNA分离。

[0068] 噬菌体的遗传特征

[0069] 将分离的噬菌体DNA用于用以下酶进行的限制性分析：AseI、DraI、SspI和EcoRI。获得的限制谱允许限定噬菌体的最初的遗传特征(图6、7、8和9)。随后，在基因组测序后，完成了更为详细的噬菌体的遗传特征。通过与BLAST数据库中可获得的噬菌体的基因组进行比较，然后通过在Artemis程序中指定潜在的开放阅读框并通过使用blastp 算法搜索描述的噬菌体蛋白的同源性来分析接收的序列。

[0070] 在进行分析的基础上，表明了：

[0071] -被分类为肌尾噬菌体科(有尾噬菌体目)的噬菌体60AhydR15PP含有大小约为165kbp的线性双链DNA(环状基因组形式)，并且显示出与裂解噬菌体T4组的高度相似性，对来自气单胞菌的许多细菌具有特异性。

[0072] -噬菌体25AhydR2PP显示出与噬菌体AS7的高度同源性，属于T7样家族。其特征在于大小约为42kbp的线性双链DNA。它属于裂解噬菌体。

[0073] -噬菌体50AhydR13PP显示出与噬菌体AS7的高度同源性，属于T4样家族。它的基因组大小约为165kbp。

[0074] -噬菌体22PfluR64PP、67PfluR64PP、71PfluR64PP被分类为短尾噬菌体科(有尾噬菌体目)，其具有短的不收缩的尾和含有大小约为40kbp的线性双链DNA的二十面体(icosaedral)衣壳。它们显示出与对假单胞菌的许多细菌具有特异性的T7组的裂解性噬菌体的高度相似性。

[0075] -噬菌体98PfluR60PP的序列未显示与先前已知的噬菌体家族的相似性。然而，对特定蛋白质的详细比较分析允许发现与进行裂解循环所必需的典型噬菌体蛋白质的同源性。98PfluR60PP的基因组大小为74kb。

[0076] 实施例2.制剂产生

[0077] 实验室规模的噬菌体繁殖条件的确定和优化。

[0078] 使用宿主细菌菌株对每种噬菌体菌株进行优化。

[0079] 优化以下培养条件：细菌和噬菌体培养物的接种体积，纯培养物的培养时间和感染培养物的孵育时间，培养温度，通气速率和生长培养基的类型。选择pH 7.0的YES培养基作为生长培养基。估计细菌接种物的最佳体积为每0.5升培养基2x109CFU。根据噬菌体菌株，将培养物调节至光密度OD620＝0.2-0.8。将细菌培养物的最佳生长温度设定为25℃。在Infors公司的摇床Ecotron中，以140rpm达到优化的培养通气速率。在优化过程中，观察到以滴度109PFU/ml(每0.5l培养物5ml)添加1体积％的噬菌体是噬菌体的最佳接种。

[0080] 开发用于生产和纯化噬菌体悬浮液的技术。

[0081] 产生阶段

[0082] 1.在生物反应器中扩增

[0083] 生产线的第一步是噬菌体颗粒的扩增，所述噬菌体颗粒特异性地破坏气单胞菌或假单胞菌的选定菌株的细菌细胞。这是通过用细菌生产菌株接种生长培养基并且培养直至获得适当的光密度，然后加入噬菌体接种物并进行噬菌体颗粒的增殖过程(以上讨论的条件)来实现的。一旦扩增过程结束，使用蠕动泵以无菌方式将培养物转移至生产过程的下一阶段。将噬菌体的每种菌株扩增为单独的培养物。在我们的研究中，我们使用了5升(4升工作容积)的气升式生物反应器，其主要优点是使用现代的一次性扩增袋。

[0084] 2.去除生命体

[0085] 完成噬菌体的扩增过程需要从培养液中除去细菌残留物。为此目的，使用孔径为0.45μm的膜进行切向微滤，然后使用孔径为0.22μm的膜进行微滤。该程序确保获得无菌悬浮液，其中噬菌体颗粒的滴度几乎没有下降。

[0086] 3.测定制造成分的活性

[0087] 在完成过滤过程后，对噬菌体悬浮液进行活性测定，表示为PFU/ml单位(噬斑形成单位/ml)。根据蛋白制药公司(Proteon Pharmaceuticals SA)(第10/2015/DPL号的优良实验室实践证书(Certificate of Good Laboratory Practice No.10/2015/DPL))中验证的程序"通过双琼脂覆盖噬斑测定的悬浮液中的噬菌体计数(Enumeration of Bacteriophages in Suspension by Double Agar Overlay Plaque Assay)"进行活性测定。

[0088] 4.最终噬菌体制剂的产生

[0089] 在该步骤中，混合制造的成分。在混合之前，计算各成分的体积，确保制剂中各成分的量相等。计算是基于先前确定的活性(PFU/ml)。然后将最终制剂等分并在温度2-8℃下储存。

[0090] 实施例3.噬菌体制剂的效能和安全性的研究

[0091] 在进行的研究中，使用以下组分的3种噬菌体制剂：

[0092] -BAFADOR II：60AhydR15PP、62AhydR11PP、13AhydR10PP、14AhydR10PP、85AhydR10PP、22PfluR64PP、67PfluR64PP、71PfluR64PP，

[0093] -BAFADOR III：60AhydR15PP、25AhydR2PP、50AhydR13PP、22PfluR64PP、67PfluR64PP、71PfluR64PP、98PfluR60PP

[0094] -BAFADOR IV：60AhydR15PP、25AhydR2PP、50AhydR13PP、22PfluR64PP、98PfluR60PP

[0095] 所有上述制剂的特征在于等量的组分和108PFU/ml的活性。

[0096] 以这样的方式制备噬菌体制剂，使得每种噬菌体体经历优化的扩增程序，通过微滤去除细菌生命体并测定其以PFU/ml计的活性。等量混合制造的噬菌体的悬浮液，获得最终的噬菌体制剂。测试微生物纯度的这些制剂并未表明存在细菌。

[0097] 体外研究

[0098] 基于细菌菌株的光密度(OD620)的测量，测试了开发的噬菌体制剂和噬菌体成分减少细菌细胞数量的能力。

[0099] 在该研究中使用了3种噬菌体制剂(BAFADOR II、BAFADOR III和BAFADOR IV)和11种不同的噬菌体(13AhydR10PP、14AhydR10PP、25AhydR2PP、50AhydR13PP、60AhydR15PP、62AhydR11PP、85AhydR10PP、22PfluR64PP、67PfluR64PP、71PfluR64PP和98PfluR60PP)。

[0100] 将5种细菌菌株用作测试系统：嗜水气单胞菌7966、嗜水气单胞菌7965、嗜水气单胞菌49140、嗜水气单胞菌33658和荧光假单胞菌8B/UWM。

[0101] 在96孔板上一式三份进行所有实验。将光密度约为0.2的细菌培养物与噬菌体悬浮液以1:1的体积比(100μl:100μl)混合。将混合物在25℃下孵育21小时。每20min记录OD620值。

[0102] 在图1-5上呈现了获得的结果。

[0103] 基于获得的结果，发现噬菌体的混合物在根除细菌菌株方面比单独的噬菌体成分更有利。此外，这些研究证实BAFADOR III和BAFADOR IV制剂的效率优于BAFADOR II制剂。

[0104] 体内研究

[0105] 评估原型噬菌体制剂在保护养殖的鱼类对抗细菌病原体方面的安全性。

[0106] 该研究是与瓦尔米亚和马祖里大学合作进行的。

[0107] 实验程序1

[0108] 实验材料为20条鲤鱼、20条虹鳟鱼和20条欧洲鲶鱼，其保存在分开的罐中并用浓度为105PFU/ml的噬菌体制剂BAFADOR II经由浸泡处理1小时。在施用噬菌体制剂BAFADOR II之前和应用后1、2和3天，对鱼血中选定的血液学参数和生物化学参数进行评估。

[0109] 表6.经由浸泡施用的噬菌体制剂对鲤鱼的选定的血液学参数和生物化学参数的影响(n＝20，平均值±标准偏差；*统计显著性p<0.05)

[0110]

[0111] 表7.经由浸泡施用的噬菌体制剂对虹鳟鱼的选定的血液学参数和生物化学参数的影响(n＝20，平均值±标准偏差；*统计显著性p<0.05)。

[0112]

[0113]

[0114] 表8.经由浸泡施用的噬菌体制剂对鲶鱼的选定的血液学参数和生物化学参数的影响(n＝20，平均值±标准偏差；*统计显著性p<0.05)。

[0115]

[0116] 基于获得的结果，证明在鲤鱼(表6)、虹鳟鱼(表7)和鲶鱼(表8)中，噬菌体制剂BAFADOR II对施用后长达3天内的选定血液学参数(红细胞计数、血细胞比容、血红蛋白)、肝脏酶活性(AST、ALT和葡萄糖水平)没有负面影响。并且没有观察到皮质醇水平(应激期间分泌的激素)的显著变化。

[0117] 实验程序2

[0118] 实验材料为20条鲤鱼、20条虹鳟鱼和20条欧洲鲶鱼，其保存在分开的罐中并用浓度为105PFU/ml的噬菌体制剂BAFADOR II经由浸泡处理1小时。在施用噬菌体制剂BAFADOR II之前和应用后3、5和7天，对鱼血中选定的体液免疫和细胞免疫的参数进行评估。

[0119] 表9.经由浸泡施用的噬菌体制剂对鲤鱼的选定的免疫参数的影响(n＝20，平均值±标准偏差；*统计显著性p<0.05)

[0120]

[0121]

[0122] 表10.经由浸泡施用的噬菌体制剂对虹鳟鱼的选定的免疫参数的影响(n＝20，平均值±标准偏差；*统计显著性p<0.05)

[0123]

[0124] 表11.经由浸泡施用的噬菌体制剂对鲶鱼的选定的免疫参数的影响(n＝20，平均值±标准偏差；*统计显著性p<0.05)

[0125]

[0126] 基于获得的结果，证明制剂BAFADOR II引起经处理的鱼的种类的先天细胞免疫(吞噬细胞的呼吸爆发活性和潜在杀伤活性、淋巴细胞的增殖活性)和体液免疫(溶菌酶和血浆铜蓝蛋白活性、总血清蛋白和血清中的Ig)的测量参数的统计学显著增加。正好在施用噬菌体制剂3天后观察到这些变化。

[0127] 评估原型噬菌体制剂在保护养殖的鱼类对抗细菌病原体方面的有效性。

[0128] 该研究是与瓦尔米亚和马祖里大学合作进行的。

[0129] 研究目的：评估应用噬菌体以预防由假单胞菌引起的鱼类中的细菌感染的可能性[0130] 实验材料为鲤鱼，将其通过腹膜内注射从感染的鱼中分离并通过API测试在生物化学水平上鉴定的环境菌株荧光假单胞菌进行实验性感染。用浓度为6×108CFU/ml(每条鱼0.2ml的剂量)的细菌悬浮液感染鱼。经由浸泡1小时施用噬菌体制剂(BAFADOR II、III和IV)。

[0131] 实验程序3

[0132] 实验材料是100条鲤鱼，随机分成5个相等的组，保存在分开的罐中。将来自第2、3、4和5组的鱼通过腹膜内注射从感染的鱼中分离并使用API测试鉴定的环境菌株荧光假单胞菌进行实验性感染。用浓度为6×108CFU/ml(每条鱼0.2ml的剂量)的细菌悬浮液感染鱼。经由以105PFU/ml的浓度浸泡1小时施用噬菌体制剂(BAFADOR II)。

[0133] 表12.细菌和噬菌体的应用方案。

[0134]

[0135] 在实验期间估计鱼的死亡率(表13)。基于获得的结果，证明噬菌体制剂引起了在用荧光假单胞菌实验性感染后24小时(第3组)和48小时(第4组)后用噬菌体处理的组中鱼的死亡率降低(分别为20和30％的死亡)。在感染后24小时和48小时，通过浸泡双重施用制剂后观察到最强的治疗效果(第5组；15％的死亡)。

[0136] 表13.用荧光假单胞菌实验性感染和施用噬菌体制剂(BAFADOR II)后养殖的鲤鱼的死亡率。

[0137]

[0138] 实验程序4

[0139] 实验材料是100条鲤鱼，随机分成5个相等的组，保存在分开的罐中。将来自第2、3、4和5组的鱼通过腹膜内注射从感染的鱼中分离并使用API测试鉴定的环境菌株荧光假单胞菌进行实验性感染。用浓度为6×108CFU/ml(每条鱼0.2ml的剂量)的细菌悬浮液感染鱼。通
5
过以10PFU/ml的浓度浸泡1小时施用噬菌体制剂(BAFADOR III)。

[0140] 表14.细菌和噬菌体的应用方案

[0141]

[0142] 在实验期间估计鱼的死亡率(表15)。获得的结果表明，本发明的噬菌体制剂降低了在用荧光假单胞菌实验性感染后24小时(第3组)和48小时(第4组)后用噬菌体处理的组中鱼的死亡率(分别为15和25％的死亡)。在感染后24小时和48小时，通过浸泡双重施用制剂后观察到最强的治疗效果(第5组；10％的死亡)。

[0143] 表15.用荧光假单胞菌实验性感染和用噬菌体制剂(BAFADOR III)处理后鲤鱼养殖的死亡率。

[0144]

[0145] 实验程序5

[0146] 实验材料是100条鲤鱼，随机分成5个相等的组，保存在分开的罐中。将来自第2、3、4和5组的鱼通过腹膜内注射从感染的鱼中分离并使用生物化学测试API鉴定的环境菌株荧光假单胞菌进行实验性感染。用浓度为6×108CFU/ml(每条鱼0.2ml的剂量)的细菌悬浮液
5
感染鱼。经由以10PFU/ml的浓度浸泡1小时施用噬菌体制剂(BAFADOR IV)。

[0147] 表16.细菌和噬菌体的应用方案

[0148]

[0149]

[0150] 在实验期间估计鱼的死亡率(表17)。获得的结果表明，本发明的噬菌体制剂降低了在用荧光假单胞菌实验性感染后24小时(第3组)和48小时(第4组)后用噬菌体处理的组中的鱼的死亡率(分别为15和25％的死亡)。在感染后24小时和48小时，通过浸泡双重施用制剂后观察到最强的治疗效果(第5组；10％的死亡)。

[0151] 表17.用荧光假单胞菌实验性感染和用噬菌体制剂(BAFADOR IV)治疗后养殖的鲤鱼的死亡率。

[0152]

[0153] 基于进行的实验，证明在用荧光假单胞菌实验性感染后24小时和48小时内，用噬菌体处理的组中鱼的死亡率显著降低。在感染后24小时和48小时，通过浸泡双重施用制剂后观察到最强的治疗效果。此外，在应用噬菌体制剂BAFADOR III和BAFADOR IV的实验中观察到鱼的死亡率最小。在这些研究中，双重施用制剂后的死亡率在10％的水平，而在BAFADOR II的情况下在15％的水平。

[0154] 关于养殖的鱼类中噬菌体制剂安全性和效能的结果概述。

[0155] 1.噬菌体制剂不影响养殖的鱼类的生物化学和血液学血液参数。

[0156] 2.噬菌体制剂刺激养殖的鱼类的先天细胞和体液免疫系统。

[0157] 3.噬菌体制剂降低了用致病性细菌菌株感染的养殖的鱼类的死亡率。

[0158] 参考文献

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