一种包含噬菌体溶菌酶的表达系统及其运用
阅读：1028发布：2020-05-27
专利汇可以提供一种包含噬菌体溶菌酶的表达系统及其运用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种包含λ 噬菌体 溶菌酶的表达系统，通过在大肠杆菌内诱导表达λ噬菌体溶菌酶，实现细菌快速、高效裂解的方法和运用。含有该表达系统的菌株经过冻融或低浓度氯仿处理后，能高效裂解大肠杆菌细胞并释放其菌内蛋白，所得蛋白相比常用的细菌裂解方法，如超声破壁和蛋清溶菌酶消化方法，得到的蛋白具有更高的活性。，下面是一种包含噬菌体溶菌酶的表达系统及其运用专利的具体信息内容。
一种包含噬菌体溶菌酶的表达系统及其运用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种包含表达λ噬菌体溶菌酶的基因表达系统及其在细菌裂解和蛋白释放中的运用。
背景技术
[0002] 革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌，是基因工程中常用的微生物。它们的主要结构包括细胞壁、细胞膜和细胞质，其中细胞质内含有大量可溶性蛋白质。通过将需要表达成蛋白的基因放在质粒载体上，转化到细菌中，人们能利用细菌内部的转录、翻译系统生产大量蛋白。然而要释放表达在细菌内部的蛋白，必须先破坏细胞壁，而革兰氏阴性细菌的细胞壁又相当稳固。目前最常用的破壁方法是超声波。超声破碎一般是将破碎仪的超声发射探头直接放入菌液里进行，效率较高，可达60％以上。但由于超声探头设计的限制，常规的超声破碎仪能有效处理体积为1至500毫升菌液，而处理体积太小或太大的菌液，都需要特殊制备的破碎仪。另外超声处理不可避免地会引起菌液高速对流，容易产生气泡，导致蛋白质变性。
[0003] 另一种常用的破壁方法是用溶菌酶消化细菌的细胞壁。很多生物，如动物细胞、细菌、噬菌体都能产生溶菌酶。将这些酶，如常用的蛋清溶菌酶，加到菌液中，它们能通过消化细菌细胞壁中的肽聚糖，导致细菌破裂。与超声破壁相比，溶菌酶处理的条件比较温和，能有效降低蛋白变性，但缺点是成本较高，而且破壁效率偏低，一般不超过40％。主要原因是当少量细菌发生破壁裂解后，它们所释放出的蛋白和DNA形成粘稠的溶液，将其它未破壁的细菌紧密包裹，阻碍了溶液中的溶菌酶对它们的细胞壁进行进一步消化。
[0004] 在已有的发明专利中，CN102286519A公开了一种用于控制宿主自裂解的大肠杆菌表达载体，试图简化基因工程中的细菌裂解步骤。该载体含有T4噬菌体溶菌酶基因。将它在细菌的细胞质里表达后，可以提高细菌对金属离子螯合剂EDTA的敏感度，使它们在EDTA溶液里裂解，并释放出菌内蛋白。该方法虽然与直接加蛋清溶菌酶消化的方法相比，效率上有一定的提升，但与超声方法相比，还是有多个缺点：1.比较费时。一般需要2个小时，而超声处理一般只需要几分钟；2.破壁效率并不是很高。从发明人所公布的数据来看，该方法的破壁效率是超声的83％。因此，目前该方法还难以成为生物工程中细菌裂解的主流技术。
发明内容
[0005] 本发明的目的是为了解决目前细菌裂解效率偏低而且容易引起蛋白变性的问题。为此，本发明提供一种处理条件温和，而效率与超声破壁相当的细菌裂解方案。所述方案的原理是将λ噬菌体的溶菌酶(LamR，以下简称λ溶菌酶)表达在革兰氏阴性细菌的细胞质中。
由于细胞质中的溶菌酶并不直接接触细胞膜外的细胞壁，它不会对细菌的正常生长产生明显的不利影响。但经冻融或低浓度有机溶剂如氯仿处理后，细菌的细胞膜会发生轻微破裂，使细胞质中的部分溶菌酶转移进入细胞膜和细胞壁之间的缝隙里，消化细胞壁，引起细菌的完全裂解。该方案在菌体裂解速度、蛋白释放效率以及所获得的目标蛋白活性等各方面都明显优于常用的超声破碎方法和前述的T4溶菌酶表达方法。
由于细胞质中的溶菌酶并不直接接触细胞膜外的细胞壁，它不会对细菌的正常生长产生明显的不利影响。但经冻融或低浓度有机溶剂如氯仿处理后，细菌的细胞膜会发生轻微破裂，使细胞质中的部分溶菌酶转移进入细胞膜和细胞壁之间的缝隙里，消化细胞壁，引起细菌的完全裂解。该方案在菌体裂解速度、蛋白释放效率以及所获得的目标蛋白活性等各方面都明显优于常用的超声破碎方法和前述的T4溶菌酶表达方法。
[0006] 具体地说，本发明提供了一种包含λ溶菌酶的表达载体(本文也称为“表达系统”)，和对表达了该λ溶菌酶的革兰氏阴性细菌的处理方法及其相关用途。更具体地，本发明涉及用于埃氏大肠杆菌中与基因工程蛋白共表达的λ溶菌酶，包含该λ溶菌酶的任何基因表达元件及组合，及其应用于表达基因工程蛋白的埃氏大肠杆菌，并用于下游蛋白纯化工艺的细菌裂解方法及其用途。
[0007] 在一实施方案中，本发明的一种包含λ溶菌酶(其蛋白序列号为NP_040645.1)的表达载体，其核苷酸序列号为SEQ ID NO：1，包括一个由四环素启动子控制的λ溶菌酶基因和一个组成型启动子控制的四环素抑制蛋白(Tetracycline repressor protein，简称TetR)基因，所述表达载体通过诱导，在革兰氏阴性细菌中表达λ溶菌酶，其中，所述λ溶菌酶基因为λ噬菌体的R基因LamR。
[0008] 具体来说，本发明的一种包含λ溶菌酶(其蛋白序列号为NP_040645.1)的表达载体，其核苷酸序列号为SEQ DI NO：1，主要由四环素启动子(PLtetO)、λ溶菌酶基因(LamR)、组成性色氨酸启动子(Ptrp)和四环素抑制蛋白基因TetR组成，所述表达载体通过诱导，在革兰氏阴性细菌中表达λ溶菌酶。
[0009] 在另一实施方案中，本发明的包含λ溶菌酶基因的表达载体在革兰氏阴性细菌中诱导表达λ溶菌酶、裂解菌体、释放其内部蛋白中的运用。所述的运用，在革兰氏阴性细菌中诱导表达λ溶菌酶，经冰冻融化，或经低浓度氯仿(0.1-1％，优选1％)处理后，细菌快速高效裂解，释放出内部蛋白。
[0010] 在又一具体实施方案中，本发明提供了一种能在革兰氏阴性细菌中诱导表达溶菌酶的DNA片段。该DNA片段主要由两部分组成：1、由细菌组成性启动子和四环素抑制蛋白TetR组成的TetR表达模块；2、由四环素诱导启动子与λ溶菌酶基因LamR组成的LamR表达模块。将该DNA片段通过质粒转化入细菌后能产生TetR，而TetR通过结合四环素启动子抑制LamR的表达。当在菌液中加入四环素的类似物去水四环素(anhydrotetracycline，简称ATc)时，ATc与TetR结合并改变它的构象，使它脱离四环素启动子，导致LamR表达。
[0011] 其次，确定了λ溶菌酶对大肠杆菌细胞壁的可控裂解条件，即采用低温冻融或者低浓度氯仿处理的方法改变细胞膜通透性，使λ溶菌酶进入膜壁间隙，实现对细胞壁的降解，所述低浓度氯仿的浓度为0.1-1％,优选为1％。
[0012] 本发明要解决的技术问题也包括采用何种技术将λ噬菌体的溶菌酶共表达于基因工程菌中，并且实现菌体可控、快速且高效的自裂解。本发明的λ噬菌体溶菌酶共表达于基因工程菌中，获得蛋白表达菌株，经冷冻融化或低浓度氯仿处理即可实现菌体可控、快速且高效的细胞自裂解，释放菌内部蛋白质，为酶制剂和蛋白质药物的提取、纯化提供一种既有较高回收率，又最大程度地保存蛋白活性的新方法。附图说明
[0013] 图1.为λ溶菌酶诱导表达系统的结构示意图；
[0014] 图2.为运用λ溶菌酶表达方法和常规破壁方法裂解BL21(DE3)及其衍生菌株后可溶性蛋白的释放状况比较,其中，图中M表示蛋白分子量标准，1、2、3、4分别表示超声破壁、蛋清溶菌酶消化、冻融处理、氯仿处理得到的样品；
[0015] 图3.为运用λ溶菌酶表达方法和常规破壁方法进行荧光素酶表达纯化的效率比较，其中，
[0016] 3A.为SDS-PAGE分析通过不同裂解方法所纯化出的荧光素酶，图中M表示蛋白分子量标准，1、2、3、4分别表示超声破壁、蛋清溶菌酶消化、冻融处理、氯仿处理得到的样品；
[0017] 3B.为Bradford法定量通过不同裂解方法所纯化出的荧光素酶量；
[0018] 图4.为运用λ溶菌酶表达方法和常规破壁方法所纯化出的荧光素酶活力比较；
[0019] 图5.为运用λ溶菌酶表达方法裂解克隆用大肠杆菌后的可溶性蛋白释放状况，其中，图中1、2分别表示超声破壁、冻融处理的样品。
具体实施方式
[0020] 以下实施例用以进一步说明和理解本发明的实质，但不以任何方式限制本专利的范围。以下实施例中的试验方法为常规方法，也可参考CN102286519A，全文引入参考。
[0021] 实施例1λ溶菌酶表达载体的构建、诱导表达、细菌裂解
[0022] 1)载体的构建：
[0023] λ溶菌酶的表达系统的结构见图1，图中符号意义如下：PLtetO：四环素启动子；TetO：四环素调节序列；LamR：λ溶菌酶基因；Ptrp：色氨酸启动子；TetR：四环素抑制蛋白基因。
[0024] 该表达载体(表达系统)由四环素启动子(PLtetO)、λ溶菌酶基因(LamR)、组成性色氨酸启动子(Ptrp)和四环素抑制蛋白基因TetR组成。其中，四环素启动子用的是半合成的PLtetO启动子，而组成性启动子用的是大肠杆菌的色氨酸启动子Ptrp。每个元件DNA片段都是通过用PCR扩增后，酶切克隆到相应的酶切位点之间。
[0025] PLtetO-LamR-Ptrp-TetR表达系统(DNA片段)的测序结果如Seq ID No.1。
[0026] 为了便于将该表达系统转运入细菌，可将含有PLtetO-LamR-Ptrp-TetR的DNA片段克隆到合适的质粒中，如pACYC、pCDF质粒中，克隆的方法为常规方法，不再详述。
[0027] 2)λ溶菌酶的诱导表达：
[0028] 将含有以上λ溶菌酶表达系统的质粒(pACYC-PLtetO-LamR-Ptrp-TetR)转化到大肠杆菌基因工程菌中，挑取单克隆菌落接种到含有氯霉素(34μg/ml)的培养液中。当细菌生长到合适浓度，在菌液中1-10ng/ml的去水四环素(ATc)，诱导LamR表达2小时以上。
[0029] 3)表达λ溶菌酶细菌的裂解
[0030] 将已表达LamR的细菌离心收集，悬浮到PBS溶液中。将细菌悬浮液放在-20℃冰箱冰冻，然后转移到室温水浴中融化，细菌即可裂解。另一种方法是在细菌悬浮液中加入有机溶剂，如1％的氯仿，轻摇菌液1分钟，也可引起细菌的裂解。
[0031] 实施例2λ溶菌酶对基因工程菌株BL21(DE3)及其衍生菌株的裂解效应[0032] 1)BL21(DE3)是最常用的蛋白表达菌株。由于它的染色体中含有可诱导的T7RNA多聚酶基因，它可用于表达由T7启动子控制的外源目标基因。目前多家公司也提供BL21(DE3)的衍生菌株，如New England Biolabs的SHuffle T7 Express和Merck Millipore的Origami 2(DE3)，它们的诱导表达功能与BL21(DE3)相似。在本实例中，荧光素酶基因(Firefly Luciferase，简称FLuc)被克隆到含有T7启动子的pET28a载体上，得到pET28a-FLuc质粒。该FLuc基因的3’端与载体中的6xHis标签序列连接，形成融合基因，因此所产生的荧光素酶蛋白能用Ni离子柱结合6xHis标签进行纯化。
[0033] 2)将pET28a-FLuc与作为对照的pACYC空载体或λ溶菌酶表达载体pACYC-PLtetO-LamR-Ptrp-TetR质粒共转到BL21(DE3)或其衍生菌株中，用同时含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的培养板选择共转化的单菌落。
[0034] 3)挑取含有pET28a-FLuc/pACYC或pET28a-FLuc/pACYC-PLtetO-LamR-Ptrp-TetR的共转化菌落，分别接种到含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的液体LB培养基中。当OD600值达到0.6时，加入IPTG、ATc分别诱导荧光素酶和LamR的表达。3小时后，离心收取细菌，重新悬浮到PBS溶液。
[0035] 4)将每种菌平均分成4部分，分别用超声、蛋清溶菌酶消化、-20℃冻融和1％氯仿等4种方法处理，取25μl裂解后的可溶性蛋白，用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色法检测所释放的可溶性蛋白水平(见图2)；用Ni离子柱对裂解液中的带有6xHis标签的荧光素酶进行亲和纯化，测定不同方法裂解后的蛋白纯化效率(图3)。
[0036] 图2显示采用不同方法裂解大肠杆菌BL21(DE3)、SHuffle T7 Express和Origami 2(DE3)后细菌内部可溶性蛋白的释放状况。将表达荧光素酶或同时表达荧光素酶和λ溶菌酶的大肠杆菌通过超声、蛋清溶菌酶消化、-20℃冻融或1％氯仿处理以后，用SDS-PAGE分析细菌所释放的可溶性蛋白水平。λ溶菌酶通过携带有PLtetO-LamR-Ptrp-TetR的pACYC载体来表达。共表达的诱导条件：挑取含有pET28a-FLuc/pACYC或pET28a-FLuc/pACYC-PLtetO-LamR-Ptrp-TetR的双转化菌落，分别接种到含有卡那霉素/氯霉素的液体LB培养基中。当OD600值达到0.6时，加入IPTG(1mM)、ATc(5ng/ml)分别诱导荧光素酶和LamR的表达，3小时后，离心收取细菌。
[0037] 裂解前总蛋白是在菌体沉淀上加入SDS裂解液(50mM Tris pH6.8，1％SDS,10％甘油，5％β-巯基乙醇,0.1％溴酚蓝)，95℃加热10分钟，离心获得的可溶性部分，作为对照。裂解上清是裂解实验后高速离心10分钟获得的可溶性蛋白。蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后，用考马斯亮蓝染色显示不同蛋白条带。星号表示荧光素酶条带(分子量63Kd)。结果表明低温冻融或1％氯仿处理能引发表达了λ溶菌酶的细菌裂解，所释放的可溶性蛋白水平与超声破壁法相近。
[0038] 图3显示采用不同方法裂解细菌后的荧光素酶纯化结果。将50OD600的菌液用超声、蛋清溶菌酶消化、低温冻融或1％氯仿处理后，获得的裂解上清液，然后用Ni离子柱对带有6xHis标签的荧光素酶进行亲和纯化。纯化后的荧光素酶通过SDS-PAGE电泳分离，用考马斯亮蓝染色进行检测(图3-A)，或直接通过Bradford法进行定量(图3-B)。结果表明当细菌内表达λ溶菌酶时，低温冻融或1％氯仿处理都能有效释放荧光素酶，纯化所得荧光素酶水平显著高于蛋清溶菌酶消化法，与超声破碎法相近。
[0039] 实施例3运用λ溶菌酶方法和常规方法裂解细菌所得到的荧光素酶活力测试[0040] 取实施例2中经不同裂解方法纯化所得的荧光素酶各0.5μg，用化学发光法测定它们的酶活力。反应体系:在96孔板上将20μl荧光素酶溶液(浓度25μg/ml)与100μl底物混合，置于室温15分钟，然后用酶标仪检测相对荧光强度(Relative Fluorescence Units，简称RFU)，计算比活力，即每毫克荧光素酶的RFU水平(RFU/mg)。用Promega公司的荧光素酶样品作为对照。
[0041] 图4结果表明超声破碎后纯化的荧光素酶活力是对照样品的68.3％，而λ溶菌酶共表达结合冻融或氯仿处理所获得的荧光素酶活力则分别比对照样品高13.4％和4.5％，分别比超声破碎所获得的荧光素酶高53.3％和41.2％。因此，通过表达λ溶菌酶来裂解细菌有助于降低蛋白纯化过程中的活力下降。
[0042] 实施例4λ溶菌酶表达对常用克隆菌株的裂解效应
[0043] 除了BL21(DE3)、SHuffle T7 Express、Origami 2(DE3)等常用蛋白表达菌株以外，不少菌株，如DH5α、XL-1Blue、Top10，主要被用于载体构建，俗称克隆菌株。这些菌株也能用来表达外源蛋白，但往往比常用蛋白表达菌株更难裂解。因此本发明也测试了这些菌株是否能通过λ溶菌酶表达结合冻融方法进行裂解。
[0044] 在DH5α、XL-1Blue、Top10菌株中分别转入pACYC或pACYC-PLtetO-LamR-Ptrp-TetR质粒，在含有34μg/ml氯霉素板上培养，获得单菌落。挑取每种菌落，接种到含有34μg/ml氯霉素的LB培养液中，当OD600到达0.6时，加入5ng/ml ATc诱导λ溶菌酶表达3小时。将每种菌平均分成2份，分别用超声和低温冻融方法处理菌体，取25μl裂解上清，用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测所释放的可溶性蛋白水平(图5)。
[0045] 图5为λ溶菌酶表达对常用克隆菌株的裂解效果。每个菌株都转化pACYC对照空载体或λ溶菌酶表达载体pACYC-PLtetO-LamR-Ptrp-TetR，经ATc诱导后，通过超声和低温冻融处理，取裂解上清进行SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色分析。裂解前总蛋白作为对照。共表达的诱导条件、总蛋白和裂解上清制备、考马斯亮蓝染色方法同实施例2。结果表明表达λ溶菌酶的DH5α、XL-1Blue、Top10菌株也均能通过冻融高效裂解。因此，本发明的λ溶菌酶表达系统也适用于裂解其它大肠杆菌。
[0046]
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 噬菌体菌株及其应用 | 2020-05-12 | 290 |
| 一株痤疮丙酸杆菌噬菌体及其应用 | 2020-05-11 | 112 |
| 重组噬菌体 | 2020-05-11 | 778 |
| 二聚噬菌体溶素 | 2020-05-11 | 75 |
| A25噬菌体溶解酶 | 2020-05-11 | 702 |
| 重组噬菌体流感疫苗 | 2020-05-13 | 790 |
| 重组噬菌体 | 2020-05-11 | 86 |
| 抗菌噬菌体、噬菌体肽及其使用方法 | 2020-05-12 | 507 |
| 噬菌体疗法 | 2020-05-11 | 217 |
| 一种富集噬菌体的方法 | 2020-05-12 | 394 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈