技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术和
微生物制品领域，具体地，涉及一种噬菌体的保存方法。
背景技术
[0002] 噬菌体是一类能感染细菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒的总称，对一些细菌具有高度的专一性，当噬菌体侵染这些细菌时，可在细菌中繁殖并杀死细菌，而它对动
植物没有毒性。随着分子生物学技术的发展，噬菌体已经广泛用于
疾病诊断、
水处理等多个领域。由于噬菌体可以将基因插入宿主DNA内的特性，使得它还成为了重要的分子和遗传学研究工具。利用噬菌体，可以设计很多精巧的实验。
[0003] 然而在上述过程中，都需要对噬菌体进行保存，
现有技术的保存方案中噬菌体的保存效果差，噬菌体的保存时间短，存活率低，噬菌体容易被污染，并且必须在低温条件下进行保存，严重制约了对噬菌体应用的发展。
发明内容
[0004] 发明目的：为了克服以上不足，本发明提供了一种噬菌体的保存方法。
[0005] 技术方案：本发明提供了一种噬菌体的保存方法，包括以下步骤：
[0006] 1)噬菌体溶液于2-7℃静置4-8h，出现絮状沉淀，经过8000-12000r/min离心20-40min；
[0007] 2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；
[0008] 3)噬菌体液体积1-2.5倍的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂所述
氨基酸以重量组分计，包括以下组分：
脱脂奶粉5-12份、蛋白胨3-5份、
蔗糖0.5-1.2份、海藻糖0.8-1.5份、香菇多糖1-1.6份、
硫酸镁0.2-0.5份、氯化
钙0.6-1.2份、硫酸钠0.6-0.8份、明胶0.05-0.2份、甘露醇0.8-1.2份、聚乙烯吡咯烷
酮0.1-0.3份、
淀粉0.5-0.8份、滑石粉0.3-0.5份、甲壳素0.08-0.2份、
磷酸二氢
钾0.03-0.3份、磷酸氢二钠
0.05-0.2份、甘油1-3份、吐温-80 0.02-0.1份和水100份；
[0009] 4)将上述噬菌体原液分装于安瓿中密封，于室温或者2-7℃进行冻存。
[0010] 本发明所述的噬菌体的保存方法，方法合理，应用方便，噬菌体原液中加入保存保护剂，可以在室温保存或者冷藏，对保存环境要求低，适应性好，可以长期保存。其中噬菌体保存保护剂的组分合理，其中脱脂奶粉、蛋白胨、明胶、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉等形成整个保存保护剂的骨架，防止低分子物质的
碳化和
氧化，同时保护活性物质不受
温度影响，使保护剂形成多孔性、疏松的海绵状物且具有一定的
含水量，在冻存过程中保持原有的构架，从而增加
溶解度。此外，多种糖类和盐噬菌体保持存活状态以及对水分起缓解作用，并且保持
电解质浓度。噬菌体保存保护剂可以使噬菌体免受溶液损伤和
冰晶损伤等物理因素的损伤，并且维持噬菌体极高的存活率和活性，使噬菌体的活动处于半静止或静止状态。此外，多种糖类和盐使噬菌体保持存活状态以及对水分起缓解作用，并且保持
电解质浓度。噬菌体保存保护剂可以使噬菌体低温保存下免受溶液损伤和冰晶损伤等物理因素的损伤，并且维持噬菌体极高的存活率和活性，使噬菌体的活动处于半静止或静止状态。此外，保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时
冷冻保护剂可以通过在噬菌体内外维持一定的摩尔浓度，降低内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。此外，保护剂还可以在室温条件下用于多种噬菌体的保存，适应性好。
[0011] 进一步的，上述的噬菌体的保存方法，所述噬菌体保存保护剂以重量组分计，还包括0.3-0.8份的氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：聚谷氨酸1-4份、天
门冬氨酸3-5份、苯丙氨酸2-8份、丝氨酸2-5份、半胱氨酸0.5-2份、蛋氨酸3-5份、赖氨酸2-4份、亮氨酸0.3-0.8份和异亮氨酸0.2-0.6份。通过增加
营养液，使噬菌体保持存活状态以及对水分起缓解作用。
[0012] 进一步的，上述的噬菌体的保存方法，所述安瓿放入装有无水
氯化钙或无水甲醇或
硅胶的密封容器中于室温或2-7℃保存。在干燥的条件下保存效果更佳，保存时间更久。
[0013] 进一步的，上述的噬菌体的保存方法，所述步骤在4-6％的湿度条件下完成。4-6％的湿度条件下溶菌活性最佳，保存效果最好。
[0014] 进一步的，上述的噬菌体的保存方法，所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷
盐酸盐8-15份、
氯化钠0.05-0.2份、
氯化钾1-5份、
硫酸镁5-20份、
磷酸氢二钾1-3份、磷酸二氢钠8-12份、明胶0.05-0.1份和水100份，并且调节pH到7-7.5。噬菌体缓冲液组分合理，使用方便，可以用于噬菌体的溶解和重悬，并且不影响噬菌体的活性。
[0015] 进一步的，上述的噬菌体的保存方法，所述淀粉为
马铃薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、绿豆淀粉或羟乙基淀粉的一种。淀粉的原料来源广，选择性好，应用成本低。
[0016] 进一步的，上述的噬菌体的保存方法，所述蛋白胨为植物蛋白胨。植物蛋白胨中植物细胞的细胞壁中的
纤维素含量多，可以形成较好的骨架结构，并且植物来源的原料相比动物来源的原料便宜，应用成本低。
[0017] 进一步的，上述的噬菌体的保存方法，所述甘油为20％-40％的甘油。20％-40％的甘油流动性好，易于应用。
[0018] 进一步的，上述的噬菌体的保存方法，所述的水为去离子水或纯化水。去离子水或纯化水可以保证噬菌体保存过程中
质量稳定、可控。
[0019] 进一步的，上述的噬菌体的保存方法的制备方法，使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节溶液pH。原料来源广，调节十分方便，并且应用成本低。
[0020] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所述的噬菌体的保存方法，方法合理，应用方便，噬菌体可以在室温保存或者冷藏，对保存环境要求低，适应性好，并且可以长期保存。
附图说明
[0021] 图1为本发明所述使用
实施例1-5保存方法保存的噬菌体存活率图。
具体实施方式
[0022] 下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
[0023] 实施例1
[0024] 一种大肠杆菌噬菌体的保存方法，在4％的湿度条件下完成，包括以下步骤：
[0025] 1)大肠杆菌噬菌体溶液于2℃静置4h，出现絮状沉淀，经过8000r/min离心20min；
[0026] 2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐8份、氯化钠0.05份、氯化钾1份、硫酸镁5份、磷酸氢二钾1份、磷酸二氢钠8份、明胶0.05份和去离子水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7；
[0027] 3)噬菌体液等体积的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：脱脂奶粉5份、植物蛋白胨3份、蔗糖0.5份、海藻糖0.8份、香菇多糖1份、硫酸镁0.2份、氯化钙0.6份、硫酸钠0.6份、明胶0.05份、甘露醇0.8份、聚乙烯吡咯烷酮0.1份、马铃薯淀粉0.5份、滑石粉0.3份、甲壳素0.08份、磷酸二氢钾0.03份、磷酸氢二钠0.05份、20％的甘油1份、吐温-80 0.02份和去离子水100份；
[0028] 此外，还包括0.3份的氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：聚谷氨酸1份、天门冬氨酸3份、苯丙氨酸2份、丝氨酸2份、半胱氨酸0.5份、蛋氨酸3份、赖氨酸2份、亮氨酸0.3份和异亮氨酸0.2份；
[0029] 4)将上述噬菌体原液分装于安瓿中密封，所述安瓿放入装有无水氯化钙的密封容器中于15℃保存。
[0030] 实施例2
[0031] 一种分歧杆菌噬菌体的保存方法，在6％的湿度条件下完成，包括以下步骤：
[0032] 1)分歧杆菌噬菌体溶液于7℃静置8h，出现絮状沉淀，经过12000r/min离心40min；
[0033] 2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐15份、氯化钠0.2份、氯化钾5份、硫酸镁20份、磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钠12份、明胶0.1份和纯化水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7.5。
[0034] 3)噬菌体液体积2.5倍的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：脱脂奶粉12份、植物蛋白胨5份、蔗糖1.2份、海藻糖1.5份、香菇多糖1.6份、硫酸镁0.5份、氯化钙1.2份、硫酸钠0.8份、明胶0.2份、甘露醇1.2份、聚乙烯吡咯烷酮0.3份、木薯淀粉0.8份、滑石粉0.5份、甲壳素0.2份、磷酸二氢钾0.3份、磷酸氢二钠0.2份、40％的甘油3份、吐温-80 0.1份和纯化水100份；
[0035] 此外，还包括0.8份的氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：聚谷氨酸4份、天门冬氨酸5份、苯丙氨酸8份、丝氨酸5份、半胱氨酸2份、蛋氨酸5份、赖氨酸4份、亮氨酸0.8份和异亮氨酸0.6份；
[0036] 4)将上述噬菌体原液分装于安瓿中密封，所述安瓿放入装有无水甲醇的密封容器中于2℃保存。
[0037] 实施例3
[0038] 一种溶藻弧菌噬菌体的保存方法，在5％的湿度条件下完成，包括以下步骤：
[0039] 1)溶藻弧菌噬菌体溶液于5℃静置6h，出现絮状沉淀，经过10000r/min离心30min；
[0040] 2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐12份、氯化钠0.1份、氯化钾3份、硫酸镁10份、磷酸氢二钾2份、磷酸二氢钠10份、明胶0.08份和去离子水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7.2；
[0041] 3)噬菌体液体积2.2倍的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：脱脂奶粉8份、植物蛋白胨4份、蔗糖0.8份、海藻糖0.9份、香菇多糖1.2份、硫酸镁0.3份、氯化钙0.8份、硫酸钠0.7份、明胶0.1份、甘露醇1份、聚乙烯吡咯烷酮0.2份、玉米淀粉0.6份、滑石粉0.4份、甲壳素0.09份、磷酸二氢钾0.1份、磷酸氢二钠0.15份、30％的甘油2份、吐温-80 0.08份和去离子水100份；
[0042] 此外，还包括0.5份的氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：聚谷氨酸3份、天门冬氨酸4份、苯丙氨酸6份、丝氨酸4份、半胱氨酸0.8份、蛋氨酸4份、赖氨酸3份、亮氨酸0.5份和异亮氨酸0.5份；
[0043] 4)将上述噬菌体原液分装于安瓿中密封，所述安瓿放入装有硅胶的密封容器中于7℃保存。
[0044] 实施例4
[0045] 一种乳杆菌噬菌体的保存方法，在4％的湿度条件下完成，包括以下步骤：
[0046] 1)乳杆菌噬菌体溶液于5℃静置5h，出现絮状沉淀，经过12000r/min离心20min；
[0047] 2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐8份、氯化钠0.2份、氯化钾3份、硫酸镁15份、磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钠8份、明胶0.05份和纯化水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7；
[0048] 3)噬菌体液体积1.5倍的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：脱脂奶粉5份、植物蛋白胨5份、蔗糖1份、海藻糖0.8份、香菇多糖1.6份、硫酸镁0.3份、氯化钙0.8份、硫酸钠0.8份、明胶0.08份、甘露醇0.8份、聚乙烯吡咯烷酮0.3份、绿豆淀粉0.7份、滑石粉0.5份、甲壳素0.15份、磷酸二氢钾0.2份、磷酸氢二钠0.2份、25％的甘油1份、吐温-80 0.06份和纯化水100份；
[0049] 此外，还包括0.7份的氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：聚谷氨酸4份、天门冬氨酸3份、苯丙氨酸4份、丝氨酸3份、半胱氨酸0.9份、蛋氨酸3份、赖氨酸2份、亮氨酸0.8份和异亮氨酸0.6份；
[0050] 4)将上述噬菌体原液分装于安瓿中密封，所述安瓿放入装有无水甲醇的密封容器中于4℃保存。
[0051] 实施例5
[0052] 一种噬菌体的保存方法，在6％的湿度条件下完成，包括以下步骤：
[0053] 1)噬菌体溶液于7℃静置5h，出现絮状沉淀，经过8000r/min离心20min；
[0054] 2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐15份、氯化钠0.2份、氯化钾1份、硫酸镁20份、磷酸氢二钾2份、磷酸二氢钠10份、明胶0.06份和去离子水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7.5；
[0055] 3)噬菌体液体积1.2倍的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：脱脂奶粉12份、植物蛋白胨5份、蔗糖0.5份、海藻糖0.8份、香菇多糖1.2份、硫酸镁0.4份、氯化钙0.6份、硫酸钠0.6份、明胶0.2份、甘露醇1.2份、聚乙烯吡咯烷酮0.2份、羟乙基淀粉0.7份、滑石粉0.5份、甲壳素0.2份、磷酸二氢钾0.03份、磷酸氢二钠0.05份、40％的甘油3份、吐温-80 0.1份和去离子水100份；
[0056] 此外，还包括0.4份的氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：聚谷氨酸3份、天门冬氨酸3份、苯丙氨酸2份、丝氨酸5份、半胱氨酸2份、蛋氨酸4份、赖氨酸3份、亮氨酸0.3份和异亮氨酸0.2份；
[0057] 4)将上述噬菌体原液分装于安瓿中密封，所述安瓿放入装有无水氯化钙的密封容器中于25℃保存。
[0058] 对使用实施例1-5的噬菌体保护剂的保存1、3、6、9个月后的噬菌体污染情况以及存活率分别进行考察，如表1所示，噬菌体均未污染，并且如图1所示，噬菌体在9个月内保持60％以上的存活率。
[0059] 表1噬菌体污染情况
[0060]
[0061]
[0062] 以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
