[0001] 本发明属于食品蛋白质加工技术领域，主要涉及一种用于玉米醇溶蛋白酶解的纳米乳的制备方法。

[0002] 随着消费者对更环保、更经济的饮食需求的扩大及素食主义的兴起，植物蛋白逐渐被人们探索研究，并成为食品科学研究的重点。玉米醇溶蛋白是一种广泛存在于玉米中的植物蛋白，约占总蛋白含量的50％。作为一种很有前景的食物蛋白来源，其具有环境友好、可生物降解、无毒等优点，并被美国食品和药物管理局认为是安全食品成分。然而由于其一半以上的氨基酸属于非极性氨基酸(亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸等)，使得它水溶性很差，属于水难溶性蛋白，在食品中的应用大受限制。

[0003] 酶水解是一种作用条件温和、效果明显、能够得到天然且具有特定感官特性产物的改性方式。通过酶解玉米醇溶蛋白，可以使其功能化，拓宽其在食品中的应用。目前，疏水底物的酶解通常在有机溶剂中进行，但酶通常是水溶性的，在适用于水溶性蛋白的反应条件下，实现玉米醇溶蛋白的均相酶解存在一定难度。因此，有必要构建一个既能使蛋白酶发挥作用、水解程度提高又能使玉米醇溶蛋白分散均匀的反应体系。

[0004] 微乳液作为纳米乳体系，其通常是透明、均匀、各向同性、热力学稳定的，由于其界面张力超低，可以自发形成，常由表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相组成，其直径通常介于1—100nm之间。具有易于制备、稳定性好、可提高难溶性药物的溶解度、改善药物口服吸收等优点。微乳液可分为水包油型、油包水型和双连续型。其中双连续微乳可将酶与底物限制在相同的结构中，提高扩散速率，改善酶与底物之间的接触，相对于普通微乳液是更好的反应介质。在纳米乳液等低含水量介质中使用蛋白酶有三个主要的潜在优势。首先，它能提高非极性反应物的溶解度。其次，它可以增加热力学平衡向冷凝转变的可能性。最后，它可以增强酶的热稳定性，允许反应在更高的温度下进行。

[0005] 本发明通过优化微乳液的各组分配方，确定最佳组成比例，构建了一种既有水相又有有机相的酶解反应体系即纳米乳体系，用于玉米醇溶蛋白的酶水解，提高玉米醇溶蛋白的水分散性，同时使得碱性蛋白酶能够稳定发挥作用，显著提高水解度。本发明涉及的水解度在120min后可达12.1％，具有反应条件温和，操作简便等优点。

[0006] 本发明的目的是，通过水滴定法制备一种稳定的纳米乳液，将其作为碱性蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的反应体系，通过实验验证在此反应介质中，玉米醇溶蛋白的水分散性和水解程度均显著提高。

[0007] 本发明的产品及制备方法如下：

[0008] 一种用于玉米醇溶蛋白酶解的纳米乳的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)利用不同的组份，表面活性剂包括吐温‑20、吐温‑40、吐温‑60、吐温‑80、司盘‑80，助表面活性剂包括无水乙醇、丙三醇、聚乙二醇‑200、聚乙二醇‑400、聚乙二醇‑600，油相包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、油酸乙酯、蓖麻油、橄榄油、正辛醇，表面活性剂与助表面活性剂质量比1:1、1:2、1:3，优化微乳液的最佳配方；(2)将步骤(1)得到的最佳配方中表面活性剂、助表面活性剂和油相，按质量比为9:27:4混合均匀，在25℃磁力搅拌下，缓慢加入蒸馏水，直到形成澄清透明的微乳液；(3)每滴加0.1g的蒸馏水，用电导率仪测定一次微乳的电导率，并用马尔文粒度仪测定微乳液的粒度分布；(4)使玉米醇溶蛋白浓度分别为1％、2％、3％和4％(w/v)，碱性蛋白酶:玉米醇溶蛋白＝10:100(w/w)，在微乳体系中于50℃、pH为9的条件下进行水解。水解过程中不断用0.5mol/L的氢氧化钠调节pH，水解一定时间后取样，于
95℃下加热5min灭酶，得到玉米醇溶蛋白水解产物；(5)通过邻苯二甲醛法测定水解度，水解度即为水解的氨基占玉米醇溶蛋白总肽键的比值。

[0009] 所述的微乳液的最佳配方为吐温‑80为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，正辛醇为油相，表面活性剂与助表面活性剂质量比为1:3，吐温‑80:无水乙醇:正辛醇＝9:27:4(w/w/w)，水的质量分数为40％。该微乳液外观澄清透明，淡黄清亮。

[0010] 所述的电导率结果为30μs/cm，表明其属于双连续微乳液，平均粒径结果为18.23nm，说明其属于纳米乳体系，可以作为蛋白酶水解的良好反应介质。

[0011] 所述的最佳玉米醇溶蛋白浓度为4％(w/v)。水解度随水解时间不断增加，水解120min后趋于平缓仍有增加，最高可达12.1％。

[0012] 本发明方法的特点：操作方便简单，水解效果好，能够提高玉米醇溶蛋白的水分散性，实现玉米醇溶蛋白在水溶性蛋白酶中的酶解反应。附图说明

[0013] 图1是本发明的技术流程图；

[0014] 图2是本发明所形成的微乳液的伪三元相图；

[0015] 图3是在本发明体系下酶解的水解曲线图。

[0016] 下面结合附图对具体实施例进一步描述。

[0017] 一种用于玉米醇溶蛋白酶解的纳米乳的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)利用不同的组份，表面活性剂包括吐温‑20、吐温‑40、吐温‑60、吐温‑80、司盘‑80，助表面活性剂包括无水乙醇、丙三醇、聚乙二醇‑200、聚乙二醇‑400、聚乙二醇‑600，油相包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、油酸乙酯、蓖麻油、橄榄油、正辛醇，表面活性剂与助表面活性剂质量比1:1、1:2、1:3，优化微乳液的最佳配方；(2)将步骤(1)得到的最佳配方中表面活性剂、助表面活性剂和油相，按质量比为9:27:4混合均匀，在25℃磁力搅拌下，缓慢加入蒸馏水，直到形成澄清透明的微乳液；(3)每滴加0.1g的蒸馏水，用电导率仪测定一次微乳的电导率，并用马尔文粒度仪测定微乳液的粒度分布；(4)使玉米醇溶蛋白浓度分别为1％、2％、3％和4％(w/v)，碱性蛋白酶:玉米醇溶蛋白＝10:100(w/w)，在微乳体系中于50℃、pH为9的条件下进行水解。水解过程中不断用0.5mol/L的氢氧化钠调节pH，水解一定时间后取样，于
95℃下加热5min灭酶，得到玉米醇溶蛋白水解产物；(5)通过邻苯二甲醛法测定水解度，水解度即为水解的氨基占玉米醇溶蛋白总肽键的比值。

[0018] 所述的微乳液的最佳配方为吐温‑80为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，正辛醇为油相，表面活性剂与助表面活性剂质量比为1:3，吐温‑80:无水乙醇:正辛醇＝9:27:4(w/w/w)，水的质量分数为40％。该微乳液外观澄清透明，淡黄清亮。

[0019] 所述的电导率结果为30μs/cm，表明其属于双连续微乳液，平均粒径结果为18.23nm，说明其属于纳米乳体系，可以作为蛋白酶水解的良好反应介质。

[0020] 所述的最佳玉米醇溶蛋白浓度为4％(w/v)。水解度随水解时间不断增加，水解120min后趋于平缓仍有增加，最高可达12.1％。

[0021] 实施例1

[0022] (1)采用控制变量法，使用表面活性剂为吐温‑20，助表面活性剂为无水乙醇，油相为乙酸乙酯，表面活性剂与助表面活性剂质量比为1:1，制备微乳液，根据绘制的伪三元相图选取形成微乳区域面积最大的各组分作为最佳配方。

[0023] (2)将步骤(1)得到的最佳配方中表面活性剂、助表面活性剂和油相，按质量比为9:27:4混合均匀，在25℃磁力搅拌下，缓慢加入蒸馏水，直到形成澄清透明的微乳液。

[0024] (3)测定步骤(2)中微乳液的电导率和粒度分布，确定其属于纳米乳体系。

[0025] (4)使玉米醇溶蛋白浓度为3％(w/v)，碱性蛋白酶:玉米醇溶蛋白＝10:100(w/w)，在微乳体系中于50℃、pH为9的条件下进行水解。水解过程中不断用0.5mol/L的氢氧化钠调节pH，水解一定时间后取样，于95℃下加热5min灭酶，得到玉米醇溶蛋白水解产物。

[0026] (5)通过邻苯二甲醛法测定水解度，水解度即为水解的氨基占玉米醇溶蛋白总肽键的比值。

[0027] (6)水解120min后得到水解度约为6.7％的酶解产物。

[0028] 实施例2

[0029] (1)采用控制变量法，使用表面活性剂为吐温‑80，助表面活性剂为无水乙醇，油相为正辛醇，表面活性剂与助表面活性剂质量比为1:3，制备微乳液，根据绘制的伪三元相图选取形成微乳区域面积最大的各组分作为最佳配方。

[0030] (2)将步骤(1)得到的最佳配方中表面活性剂、助表面活性剂和油相，按质量比为9:27:4混合均匀，在25℃磁力搅拌下，缓慢加入蒸馏水，直到形成澄清透明的微乳液。

[0031] (3)测定步骤(2)中微乳液的电导率和粒度分布，确定其属于纳米乳体系。

[0032] (4)使玉米醇溶蛋白浓度为4％(w/v)，碱性蛋白酶:玉米醇溶蛋白＝10:100(w/w)，在微乳体系中于50℃、pH为9的条件下进行水解。水解过程中不断用0.5mol/L的氢氧化钠调节pH，水解一定时间后取样，于95℃下加热5min灭酶，得到玉米醇溶蛋白水解产物。

[0033] (5)通过邻苯二甲醛法测定水解度，水解度即为水解的氨基占玉米醇溶蛋白总肽键的比值。

[0034] (6)水解120min后得到水解度约为12.1％的酶解产物。