药物缀合物及其应用 |
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| 申请号 | CN202080091221.8 | 申请日 | 2020-12-31 | 公开(公告)号 | CN115175917A | 公开(公告)日 | 2022-10-11 |
| 申请人 | 启德医药科技(苏州)有限公司; | 发明人 | 秦刚; 姜鹭; 时丽丽; 袁金铎; 刘冲; 胡乐华; | ||||
| 摘要 | 一种靶向分子‑药物缀合物的连接分子，其结构为式(I):A1p―D1q―Y―Lk―W―A2q―D2p(I)。一种缀合物，其结构为式(III):A―((式(I)的化合物)―PLt)z(III)。所述缀合物可用于制备 治疗 疾病 的药物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.式(I)的化合物： |
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| 说明书全文 | 药物缀合物及其应用技术领域背景技术[0002] 靶向分子‑药物缀合物是近年发展起来的一类靶向药物，是由负载物及靶向分子通过连接单元/连接子连接而成的。目前已在FDA获批上市的靶向分子‑药物缀合物主要是 抗体‑药物缀合物(Antibody‑Drug Conjugate，ADC)，包括Gemtuzumab ozogamicin( Pfizer/Wyeth)、Inotuzumab ozogamicin( Pfizer)、Brentuximab vedotin( Seattle Genetics)、Ado‑trastuzumab emtansine( Genentech/Roche)和Polatuzumab vedotin‑piiq( Roche)。这些已上市及大部分 处于临床试验中的ADC药物均是通过化学偶联获得的。 [0003] 化学偶联普遍存在偶联位点不确定的缺陷。连接单元与抗体发生偶联反应具有高度随机性，导致不同抗体分子上偶联的负载物的数目和位点差异较大，得到的ADC药物呈现高度异质性。虽然通过工艺控制可以将药物/抗体比(Drug antibody ratio,DAR)控制在一 定的范围内，但实际上制备ADC分子时得到是结构、成分不均一的混合物。异质性不仅对药物的生产、质量控制造成很大挑战，而且对药物的活性、体内分布与代谢、安全性造成很大影响。 [0004] ADC药物还存在另一个问题：非靶点脱落。这种情况一方面会对正常组织造成毒性，另一方面也减少了到达靶点发挥抗肿瘤作用的ADC药物数量，导致药效降低。目前已上市及处于临床期的ADC药物中，超过半数都是通过巯基与马来酰亚胺形成的硫代琥珀酰亚 胺结构(琥珀酰亚胺连接)将小分子药物与靶向性的抗体或蛋白偶联。但硫代琥珀酰亚胺结 构并不稳定，在生物体内会发生逆迈克尔加成或与其它巯基进行交换，直接导致ADC药物中的细胞毒素从抗体上脱落，造成脱靶毒性。不仅影响用药安全，而且也限制了ADC药物的临床应用。 发明内容[0005] 在一方面，本发明提供式(I)的化合物： [0006] A1p―D1q―Y―Lk―W―A2q―D2p (I) [0007] 其中， [0008] D1和D2独立地为包含连接酶受体或供体底物识别序列的部分； [0009] A1和A2独立地为包含能够与负载物连接的活性基团的部分； [0010] Lk为L1‑L2‑L3； [0011] L1和L3各自独立地选自： [0012] ‑CH2‑、‑NH‑、‑(CO)‑、‑NH(CO)‑和‑(CO)NH‑之一；以及C1‑4亚烷基与以下基团之一的组合：‑CH2‑、‑NH‑、‑(CO)‑、‑NH(CO)‑、‑(CO)NH‑； [0013] L2不存在，或为C7‑34亚烷基，并且任选地，所述亚烷基中的一个或多个(‑CH2‑)结构被‑O‑代替； [0014] L1、L2和L3各自独立且任选地被1、2或3个选自‑OR1和‑NR1R2的取代基取代； [0015] R1和R2各自独立地选自：氢、‑C1‑6烷基、‑(CO)‑C1‑6烷基和‑S(＝O)2‑C1‑6烷基； [0016] Y和W各自独立地不存在，或选自：可裂解序列、间隔子Sp1及其组合； [0017] 所述可裂解序列包含能够在酶的作用下被裂解的氨基酸序列，并且所述可裂解序列包含1‑10个氨基酸； [0018] Sp1选自：含有1‑20个氨基酸的间隔序列、PAB及其组合； [0019] p为0或1，q为0或1，条件是p和q不同。 [0020] 在又一方面，本发明提供化合物，其具有式(II)的结构： [0021] (式(I)的化合物)―PLt (II) [0022] 其中 [0023] PL为负载物，其与式(I)的化合物中的A1或A2部分相连； [0024] t为1‑20的整数。 [0025] 在另一方面，本发明提供一种缀合物，其具有式(III)的结构 [0026] A―((式(I)的化合物)―PLt)z (III) [0027] 其中 [0028] PL为负载物(Payload)，其与式(I)的化合物中的A1或A2部分相连； [0029] A为靶向分子，其与式(I)的化合物中的D1或D2部分相连； [0030] z为1‑20整数； [0031] t为1‑20的整数。 [0033] 图1示出修饰的抗体P‑LCCTL‑HC和DG102的SDS‑PAGE检测结果。 [0034] 图2示出Pertuzumab抗体、P‑LCCTL‑HC及DG102与HCC1954细胞的亲和力(FACS检测)。 [0035] 图3示出Pertuzumab抗体、P‑LCCTL‑HC及DG102与SK‑BR‑3细胞亲和力(FACS检测)。 [0036] 图4示出Pertuzumab抗体、P‑LCCTL‑HC及DG102与SK‑BR‑3细胞亲和力(FACS检测)。 [0037] 图5示出ADC对MDA‑MB‑231细胞增殖影响。 [0038] 图6示出ADC对MDA‑MB‑468细胞增殖影响。 [0039] 图7示出DG102对肿瘤体积的影响(n＝6，Mean±SEM.)。 [0040] 图8示出DG202对肿瘤体积的影响(n＝6，Mean±SEM.)。 [0041] 图9示出DG1002对肿瘤体积的影响(n＝6，Mean±SEM.)。 具体实施方式[0042] 以下通过特定的具体实施例说明本发明的技术内容，本领域技术人员可由本说明书公开的内容容易地了解本发明的其他优点与功效。本发明也可以通过其他不同的具体实 施例加以施行或应用。本领域技术人员在不背离本发明的精神前提下，进行各种修饰与变 更。 [0043] 一般术语和定义 [0044] 除非在下文中另有定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的 技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。虽然相信以 下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。当本文 中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。本文引用的所有专利、已经公开的专利申请和出版物均通过引用并入到本文中。 [0045] 当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及优选的数值下限的形式表述某个量、浓度或其他值或参数的时候，应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或 优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围，而不考虑该范围是否具体揭 示。除非另有说明，本文所列出的数值范围旨在包括范围的端点和该范围内的所有整数和 分数(小数)。例如表述“i为2‑20的整数”应理解为i为2到20之间的任一整数，例如i可以为 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。其他类似的表述也应以类似的方式理解。 [0046] 除非文中另有说明，单数形式指代如“一种”、“该”，包含复数指代。表述“一种(个)或多种(个)”或者“至少一种(个)”可以表示1、2、3、4、5、6、7、8、9种(个)或更多种(个)。 [0049] 术语“任选”或“任选存在”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。 [0050] 表述“包含”或与其同义的类似表述“包括”、“含有”和“具有”等是开放性的，不排除额外的未列举的元素、步骤或成分。表述“由…组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由…组成”指范围限制在指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新的特征的元素、步骤或成分。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由…组成”和“由…组成”。 [0051] 术语“靶向分子”是指对特定目标(如受体、细胞表面蛋白、细胞因子等)具有亲和性的分子。靶向分子能够将负载物靶向性地运送到体内的特异位点。靶向分子可以识别一种或多种标靶，其靶向的特异位点由其识别的标靶限定。例如，以受体为标靶的靶向分子能够将细胞毒素递送至含有大量所述受体的位点。靶向分子的实例包括但不限于抗体、抗体 片段、给定抗原的结合蛋白、拟抗体、对指定标靶具有亲和性的支架蛋白、配体等。 [0052] 如本文中所用的，术语“抗体”的含义为广义，且特别包含完整的单克隆抗体、多克隆抗体、单特异抗体、多特异抗体(如双特异抗体)，以及抗体片段，只要它们均具有所需的生物学活性。抗体可以是任何亚型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类，可以源自任何合适的物种。在一些实施方式中，抗体是人或鼠源的。抗体还可以是重组制备的全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。 [0053] “单克隆抗体”用于本文是指从基本上均一的抗体群获得的抗体，即构成该群的各抗体相同，除了可能存在的少量天然突变。单克隆抗体针对单一抗原性位点是高度特异性的。修饰词“单克隆”是指抗体的特性来自基本上均一的抗体群，不应理解为需要通过特定方法生产的抗体。 [0054] “完整抗体”或“全长抗体”基本包含抗原结合可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)。重链恒定区可包含CH1、CH2、CH3和CH4，具体因抗体种类而异。可变区(又可称作Fv片段)通常包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。恒定区可以是天然序列恒定区(如人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。可变区识别靶抗原并与之相互作用，恒定区可以通过免疫系统识别并与免疫系统相互作用。 [0055] 抗体片段可以包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和由VH及CH1结构域组成的Fd片段、Fv片段、单结构域抗体(dAb)片段，以及分离的互补决定区(CDR)。Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的抗体片段，或者例如通过重组表达产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链 (包含VL和CL)和另一条链，其中所述另一条链包含重链的可变结构域(VH)和重链的一个恒 定区结构域(CH1)。F(ab’)2片段是在pH 4.0‑4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所获得的抗体片段，或者例如通过重组表达产生的具有相同结构的片段。F(ab’)2片段基本上包含两个Fab片段，其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸，包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸。Fab’片段是包含F(ab’)2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。所述抗体片段可以包含连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头连接。抗体片段的实例还包括单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段，包括修饰的片段。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型地至少或约200个氨基酸。抗原结合片段可以包括任何这样的抗体片段：其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时可以获得免疫特 异性地结合抗原的抗体。 [0056] 本发明的抗体可用本领域熟知的技术生产，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或这些技术的组合或其他本领域已知的技术。例如，可以通过合适的培养体系(例如，大肠杆菌或哺乳动物细胞)表达经过基因工程改造的重组抗体(或类抗体(antibody mimic))。所述改造可以是指，例如，在其末端引入连接酶特异识别序列。 [0057] HER2是指人表皮生长因子受体‑2，属于表皮生长因子(EGFR)受体酪氨酸激酶家族。本申请中，术语“ErbB2”及“HER2”含义相同，并可以互换使用。 [0059] 在本文中，术语“靶向分子‑药物缀合物”简称“缀合物”。缀合物的实例包括但不限于抗体‑药物缀合物。 [0060] “小分子化合物”是指大小与通常用于药物的有机分子相当的分子。该术语不涵盖生物大分子(例如蛋白质、核酸等)，但是涵盖低分子量肽或其衍生物，例如二肽、三肽、四肽、五肽等。通常小分子化合物的分子量例如可以为约100‑约2000Da、约200‑约1000Da、约200‑约900Da、约200‑约800Da、约200‑约700Da、约200‑约600Da、约200‑约500Da。 [0061] “细胞毒素”指抑制或阻止细胞的表达活性、细胞功能，和/或导致细胞破坏的物质。目前在ADC中通常使用的细胞毒素与化疗药物相比毒性较大。细胞毒素的实例包括但不限于靶向以下靶点的药物：微管细胞骨架、DNA、RNA、驱动蛋白介导的蛋白质转运、细胞凋亡的调节。靶向微管细胞骨架的药物例如可以为微管稳定剂或微管蛋白聚合抑制剂。微管稳 定剂的实例包括但不限于紫杉烷类。微管蛋白聚合抑制剂的实例包括但不限于美登木素类 (maytansinoids)、奥利斯他汀类(auristatins)、长春碱类、秋水仙碱类、海兔毒素类。靶向DNA的药物例如可以为直接破坏DNA结构的药物或拓扑异构酶抑制剂。直接破坏DNA结构的 药物的实例包括但不限于DNA双链破坏剂(DNAdouble strand breaker)、DNA烷化剂、DNA嵌入剂(DNA intercalator)。DNA双链破坏剂例如可以为烯二炔类抗生素，包括但不限于达内霉素、埃斯培拉霉素、新制癌菌素、uncialamycin等。DNA烷化剂例如可以为DNA双烷化剂 (bis‑alkylator，即DNA交联剂(DNA‑cross linker))或DNA单烷化剂(mono‑alkylator)。 DNA烷化剂的实例包括但不限于吡咯并[2,1‑c][1,4]苯二氮 类(PBD)二聚体、1‑(氯甲 基)‑2,3‑二氢‑1H‑苯并[e]吲哚(CBI)二聚体、CBI‑PBD异二聚体、二氢吲哚并‑苯二氮(IGN)二聚体、duocarmycin类化合物(duocarmycin‑like compounds)等。拓扑异构酶抑制剂的实例包括但不限于喜树碱类、蒽环类抗生素(anthracycline)。靶向RNA的药物例如可 以为抑制剪接的药物，其实例包括但不限于普拉地内酯(pladienolide)。靶向驱动蛋白介 导的蛋白质转运的药物例如可以为有丝分裂驱动蛋白抑制剂，包括但不限于纺锤体驱动蛋 白(KSP)抑制剂。 [0062] “间隔子”是指位于不同结构模块之间，可以从空间上将结构模块间隔开的结构。间隔子的定义并不限定是否具有一定的功能，也不限定是否能在体内被裂解或降解。间隔 子的实例包括但不限于氨基酸和非氨基酸结构，其中非氨基酸结构可以但不限于是氨基酸 衍生物或类似物。“间隔序列”是指作为间隔子的氨基酸序列，其实例包括但不限于单个氨基酸例如Leu、Gln等，含有多个氨基酸的序列，例如含有两个氨基酸的序列，如GA等，或者例如GGGS、GGGGSGGGGS等。间隔子的其他实例包括例如自切除式间隔基(self‑immolative spacer)，如PAB(p‑aminobenzyl)等。 [0063] 术语“烷基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的饱和的脂肪烃基团，其通过单键与分子的其余部分连接。“烷基”可以具有1‑20个碳原子，即“C1‑C20烷基”，例如C1‑C4烷基、C1‑C3烷基、C1‑C2烷基、C3烷基、C4烷基、C3‑C6烷基。烷基的非限制性实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2‑甲基丁基、1‑甲基丁基、1‑乙基丙基、1,2‑二甲基丙基、新戊基、1,1‑二甲基丙基、4‑甲基戊基、3‑甲基戊基、2‑甲基戊基、1‑甲基戊基、2‑乙基丁基、1‑乙基丁基、3,3‑二甲基丁基、2,2‑二甲基丁基、1,1‑二甲基丁基、2,3‑二甲基丁基、1,3‑二甲基丁基或1,2‑二甲基丁基，或者它们的异构体。“亚基”是指在含有自由价电子的碳原子上再去掉一个氢原子而得到的基团。亚基具有两个与分子其他部分连接的连接位点。例如“亚烷基”或“烷基亚基”指饱和的直链或支链的二价烃基。“亚烷基”的实例包括但不限于如亚甲基(‑CH2‑)、亚乙基(‑C2H4‑)、亚丙基(‑C3H6‑)、亚丁基(‑C4H8‑)、亚戊基(‑C5H10‑)、亚己基(‑C6H12‑)、1‑甲基亚乙基(‑CH(CH3)CH2‑)、 2‑甲基亚乙基(‑CH2CH(CH3)‑)、甲基亚丙基或乙基亚丙基等。 [0064] 如本文所用，当基团与基团进行组合时，基团之间的连接可以是线性或支化的，前提是形成化学上稳定的结构。通过这样的组合形成的结构可以通过该结构中的任意合适的原子与分子的其他部分连接，优选通过指定的化学键连接。例如，当描述C1‑4亚烷基与基团‑CH2‑、‑NH‑、‑(CO)‑、‑NH(CO)‑、‑(CO)NH‑之一的组合时，C1‑4亚烷基与上述基团可以形成线性连接，例如C1‑4亚烷基‑CH2‑、C1‑4亚烷基‑NH‑、C1‑4亚烷基‑(CO)‑、C1‑4亚烷基‑NH(CO)‑、C1‑4亚烷基‑(CO)NH‑、‑CH2‑C1‑4亚烷基、‑NH‑C1‑4亚烷基、‑(CO)‑C1‑4亚烷基、‑NH(CO)‑C1‑4亚烷基、‑(CO)NH‑C1‑4亚烷基。所形成的二价结构可以进一步与分子的其他部分连接。 [0065] 如本文所使用的，表述“缀合物”和“偶联物”的意义相同，并可以互换使用。相似地，表述“抗体偶联药物”与“抗体‑药物缀合物”的意义相同。 [0066] 式(I)的化合物 [0067] 在一方面，本发明提供式(I)的化合物： [0068] A1p―D1q―Y―Lk―W―A2q―D2p (I) [0069] 其中， [0070] D1和D2独立地为包含连接酶受体或供体底物识别序列的部分； [0071] A1和A2独立地为包含能够与负载物连接的活性基团的部分； [0072] Lk为L1‑L2‑L3； [0073] L1和L3各自独立地选自： [0074] ‑CH2‑、‑NH‑、‑(CO)‑、‑NH(CO)‑和‑(CO)NH‑；以及C1‑4亚烷基与以下基团之一组合：‑CH2‑、‑NH‑、‑(CO)‑、‑NH(CO)‑、‑(CO)NH‑； [0075] L2不存在，或为C7‑34亚烷基，并且任选地，所述亚烷基中的一个或多个(‑CH2‑)结构被‑O‑代替； [0076] L1、L2和L3各自独立且任选地被1、2或3个选自‑OR1和‑NR1R2的取代基取代； [0077] R1和R2各自独立地选自：氢、‑C1‑6烷基、‑(CO)‑C1‑6烷基和‑S(＝O)2‑C1‑6烷基； [0078] Y和W各自独立地不存在或选自：可裂解序列、间隔子Sp1及其组合； [0079] 所述可裂解序列包含能够在酶的作用下被裂解的氨基酸序列，并且所述可裂解序列包含1‑10个氨基酸； [0080] Sp1选自：包含1‑20个氨基酸的间隔序列、PAB及其组合； [0081] p为0或1，q为0或1，条件是p和q不同。 [0082] 在一实施方案中，L1、L2和L3独立地被1、2或3个选自‑OR1和‑NR1R2的取代基取代。取2 2 代例如发生在(‑CH3)、(‑CH‑)或 结构上，特别是(‑CH‑)上。 [0083] 在一实施方案中，L1为‑NH‑，或为C1‑4亚烷基与‑NH‑的组合。在一实施方案中，L1为‑(CO)‑，或为C1‑4亚烷基与‑(CO)‑的组合。 [0084] 在一实施方案中，L3为‑NH‑，或为C1‑4亚烷基与‑NH‑的组合。在一实施方案中，L3为‑(CO)‑，或为C1‑4亚烷基与‑(CO)‑的组合。 [0085] 在一实施方案中，L2为C7‑34亚烷基，其中亚烷基为直链亚烷基或支链亚烷基，并且任选地，亚烷基中的一个或多个(‑CH2‑)结构被‑O‑代替，并且亚烷基任选地被1、2或3个选自‑OR1和‑NR1R2的取代基取代。在又一实施方案中，L2选自任选地被1、2或3个选自‑OR1和‑NR1R2的取代基取代的以下基团：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、1‑甲基亚乙基、2‑甲基亚乙基、2‑甲基亚丙基和2‑乙基亚丙基。 [0086] 在另一实施方案中，L2为‑(C2H4‑O)i‑C1‑4亚烷基；i为2‑10的整数。其中‑(C2H4‑O)i‑表示i个PEG单元聚合而成的结构，其中i表示PEG单元的数目。在另一实施方案中，L2为‑(C2H4‑O)i‑C1‑2亚烷基。在一特定的实施方案中，L2为‑(C2H4‑O)i‑C2H4‑。在另一实施方案中，L2为C1‑4亚烷基‑(O‑C2H4)i。在另一实施方案中，L2为C1‑2亚烷基‑(O‑C2H4)i。在一特定的实施方案中，L2为‑C2H4‑(O‑C2H4)i‑。在一实施方案中，i选自以下的值：2‑10、2‑8、2‑6、2‑4或4‑6。 在一特定的实施方案中，i为4。 [0087] 在一实施方案中，Y和W各自独立地不存在或选自可裂解序列、间隔子Sp1及其组合。在一特定的实施方案中，Y不存在。在又一特定的实施方案中，W不存在。在另一特定的实施方案中，Y和W都不存在。在一实施方案中，可裂解序列包含能够被识别为酶的底物，并且能够在酶的作用下被裂解的氨基酸序列。在一特定的实施方案中，可裂解序列能够在细胞 的溶酶体中被酶促裂解。在另一特定的实施方案中，可裂解序列能够在蛋白酶的作用下，尤其是组织蛋白酶的作用下被裂解。在又一特别实施方案中，可裂解序列能够在谷氨酰胺酶 的作用下被裂解。在一实施方案中，可裂解序列选自组织蛋白酶酶切位点、谷氨酰胺酶酶切位点及其组合。在一实施方案中，可裂解序列选自Phe‑Lys、Val‑Cit、Val‑Lys、GLy‑Phe‑Leu‑Gly、Ala‑Leu‑Ala‑Leu及其组合。在一实施方案中，Y和W各自独立地不存在或选自间隔子Sp1。在另一实施方案中，Sp1为包含1‑10个，优选1‑6个，更优选1‑4个氨基酸的间隔序列。 在一特定的实施方案中，Sp1为Leu。在另一特定的实施方案中，Sp1为Gln。在一实施方案中，Sp1为PAB。在又一实施方案中，Y和W各自独立地选自Phe‑Lys‑PAB、Val‑Cit‑PAB和Val‑Lys‑PAB。在一实施方案中，Y和/或W包含的氨基酸可以是天然或非天然的。在一特定的实施方案中，Y不存在，或为氨基酸片段1，氨基酸片段1包含1‑30个各自独立地相同或不同的天然或非天然氨基酸，并且氨基酸片段1选自包含1‑10个氨基酸的可裂解序列、包含1‑20个氨基酸的间隔序列及其组合。在另一特定的实施方案中，W不存在，或为氨基酸片段2，氨基酸片段2包含1‑30个各自独立地相同或不同的天然或非天然氨基酸，并且氨基酸片段2选自包含1‑ 10个氨基酸的可裂解序列、包含1‑20个氨基酸的间隔序列及其组合。 [0088] 在一实施方案中，p＝0，q＝1，式(I)的化合物的结构如下式(I‑1)所示： [0089] D1―Y―Lk―W―A2 (I‑1)； [0090] 其中，A2、D1、Y、Lk和W分别如式(I)中所定义。 [0091] 在另一实施方案中，p＝1，q＝0，式(I)的化合物的结构如下式(I‑2)所示： [0092] A1―Y―Lk―W―D2 (I‑2)； [0093] 其中，A1、D2、Y、Lk和W分别如式(I)中所定义。 [0094] 包含连接酶受体或供体底物识别序列的部分 [0095] 在一实施方案中，连接酶为转肽酶。在一实施方案中，连接酶选自天然转肽酶、非天然转肽酶、其变体及其组合。非天然转肽酶可以但不限于是由天然转肽酶经过改造得到的。在一优选的实施方案中，连接酶选自天然Sortase酶、非天然Sortase及其组合。其中天然Sortase酶的种类包括Sortase A、Sortase B、Sortase C、Sortase D、Sortase L.plantarum等(可以参见US20110321183A1)。连接酶的种类与连接酶识别序列对应，用于 实现不同分子或结构片段之间的特异性偶联。在一实施方案中，连接酶受体底物识别序列 选自寡聚甘氨酸、寡聚丙氨酸和寡聚甘氨酸/丙氨酸混合物，聚合度为3‑10。在一特定的实施方案中，连接酶受体底物识别序列为Gn，其中G为甘氨酸(Gly)，n为3‑10的整数。在另一特定的实施方案中，连接酶为来源于金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Sortase A 酶。相应地，连接酶识别序列可以是该酶的典型识别序列LPXTG。在又一特定的实施方案中，连接酶供体底物识别序列为LPXTGJ，连接酶受体底物识别序列为Gn，其中，X可以是任何天然的或非天然的单个氨基酸；J不存在，或为包含1‑10个氨基酸的氨基酸片段，任选地带有标签。在一实施方案中，J不存在。在又一实施方案中，J为包含1‑10个氨基酸的氨基酸片段，其中每个氨基酸各自独立地为任何天然的或非天然的氨基酸。在另一实施方案中，J为Gm，其中m为1‑10的整数。在又一特定的实施方案中，连接酶供体底物识别序列为LPETG。在另一特定的实施方案中，连接酶供体底物识别序列为LPETGG。在一实施方案中，连接酶为来自 Staphylococcus aureus的Sortase B，对应的供体底物识别序列可以是NPQTN。在另一实施方案中，连接酶为来自Bacillus anthracis的Sortase B，对应的供体底物识别序列可以是NPKTG。在又一实施方案中，连接酶为Streptococcus pyogenes的Sortase A，对应的供体底物识别序列可以是LPXTGJ，其中J如上文所定义。在另一实施方案中，连接酶为来自 Streptomyces coelicolor的Sortase subfamily 5，对应的供体底物识别序列可以是 LAXTG。在又一实施方案中，连接酶为来自Lactobacillus plantarum的Sortase A，对应的供体底物识别序列可以是LPQTSEQ。连接酶识别序列也可以是其他经人工筛选后的优选转 肽酶中的新设计的识别序列。 [0096] 包含活性基团的部分 [0097] 在一实施方案中，式(I)中的A1和A2各自独立地选自氨基化合物、马来酰亚胺及其衍生物、巯基化合物、吡啶巯基化合物(pyridyldithio compound)、卤代乙酸 (haloacetylic acid)、异氰酸酯(isocyanate)。在另一实施方案中，A1和A2中的活性基团各自独立地选自：氨基、马来酰亚胺基、巯基、吡啶巯基(pyridyldithio)、卤代乙酰基 (haloacetyl)和异氰酸酯基(isocyanate)。在又一实施方案中，根据其中的活性基团的结 构，A1和A2能够各自独立地通过二硫键、硫醚键、硫酯键、或氨基甲酸酯键与迈克尔受体(迈克尔加成反应中的受体分子)共价偶联。在一特定的实施方案中，A1和A2各自独立地选自任选地衍生化的赖氨酸。 [0098] 在另一特定的实施方案中，A1和A2各自独立地选自任选地衍生化的半胱氨酸。在一优选的实施方案中，半胱氨酸的衍生化选自：1)羧基酰胺化，形成的酰胺NH2任选地被C1‑6烷基取代；2)氨基酰基化；和3)羧基和/或氨基与包含1‑10个氨基酸的氨基酸片段或包含1‑ 10个核苷酸的核苷酸片段连接，其中氨基酸片段优选为Gly。在一特定的实施方案中，半胱氨酸的衍生化是指半胱氨酸羧基酰胺化或与甘氨酸连接。在一实施方案中，A2为 其中x选自氢、OH、NH2、包含1‑10个氨基酸的氨基酸片段和包含1‑10个核 苷酸的核苷酸片段。在一实施方案中，A1为 其中x选自氢、包含1‑10个氨基 酸的氨基酸片段和包含1‑10个核苷酸的核苷酸片段。在一实施方案中，氨基酰基化是指半胱氨酸的氨基被C1‑6烷基羰基取代。 [0099] 如式(I‑1)所示的连接单元， 当其中D1为Gn，G为甘氨酸，A2为时，式(I‑1)化合物的结构如下式(I‑1‑1)所示： [0100] [0101] 其中，n为3‑10的整数； [0102] x选自氢、OH、NH2、包含1‑10个氨基酸的氨基酸片段、包含1‑10个核苷酸的核苷酸片段； [0103] Y、Lk和W分别如式(I)中所定义。 [0104] 在一优选的实施方案中，在式(I‑1‑1)中，x选自OH、NH2和Gly。 [0105] 在一特定的实施方案中，式(I‑1‑1)中的Y和W都不存在，n＝3，Lk为L1‑L2‑L3，L1为‑NH‑，L3为‑(CO)‑，L2为‑(C2H4‑O)i‑C2H4‑，i＝4，并且x为NH2，连接单元结构如下(连接单元LU102)： [0106] [0107] 在一特定的实施方案中，式(I‑1‑1)中的Y和W都不存在，n＝3，Lk为L1‑L2‑L3，L1为‑NH‑，L3为‑(CO)‑，L2为‑(C2H4‑O)i‑C2H4‑，i＝4，并且x为OH，连接单元结构如下(连接单元LU106)： [0108] [0109] 在一特定的实施方案中，式(I‑1‑1)中的W不存在，Y为L，L为亮氨酸(Leu)，n＝3，Lk为L1‑L2‑L3，L1为‑NH‑，L3为‑(CO)‑，L2为‑(C2H4‑O)i‑C2H4‑，i＝4，并且x为NH2，连接单元结构如下(连接单元LU107)： [0110] [0111] 在又一特定的实施方案中，式(I‑1‑1)中的W不存在，Y为Q，Q为谷氨酰胺(Gln)，n＝3，Lk为L1‑L2‑L3，L1为‑NH‑，L3为‑(CO)‑，L2为‑(C2H4‑O)i‑C2H4‑，i＝4，并且x为NH2，连接单元结构如下(连接单元LU108)： [0112] [0113] 在一特定的实施方案中，式(I‑1‑1)中的Y和W都不存在，n＝3，Lk为L1‑L2‑L3，L1为‑NH‑，L3为‑(CO)‑，L2为‑C5H10‑，连接单元结构如下(连接单元LU109)： [0114] [0115] 在又一特定的实施方案中，式(I‑1‑1)中的Y和W都不存在，n＝3，Lk为L1‑L2‑L3，L1为‑NH‑，L3为‑(CO)‑，L2为被一个‑NR1R2取代的‑C5H10‑，R1为氢，R2为‑(CO)CH3，并且x为NH2，连接单元结构如下(连接单元LU110)： [0116] [0117] 如式(I‑2)所示的连接单元，当其中D2为LPXTG，A1为 时，式(I‑2)化合物的结构如下式(I‑2‑1)所示： [0118] [0119] 其中，x选自氢、包含1‑10个氨基酸的氨基酸片段、包含1‑10个核苷酸的核苷酸片段； [0120] Y、Lk和W分别如式(I)中所定义。 [0121] 在一实施方案中，x为氢。 [0122] 作为连接单元的式(I)化合物 [0123] 在一实施方案中，A1或A2包含的活性基团可以用于与含有另一活性基团的负载物共价连接，从而使式(I)化合物带有负载物(payload)。 [0124] 在另一实施方案中，D1或D2包含的连接酶识别序列可以用于与对应的连接酶识别序列在连接酶的作用下进行偶联。因此式(I)化合物可以与包含连接酶识别序列的分子连 接，其中所述分子包含的连接酶识别序列与D1或D2中的连接酶识别序列为相互对应的供 体/受体底物识别序列。 [0125] 在一实施方案中，所述分子包含连接酶供体底物识别序列，相应地，D1或D2独立地为连接酶受体底物识别序列。在另一实施方案中，所述分子包含连接酶受体底物识别序列，相应地，D1或D2独立地为连接酶供体底物识别序列。 [0126] 因此，式(I)的化合物可以充当连接单元以连接靶向分子(如抗体或其抗原结合片段)和/或负载物。连接单元可以含有连接酶识别序列，从而用于实现连接单元与靶向分子 的偶联。连接单元还可以含有活性基团，从而与负载物共价偶联。 [0127] 根据待偶联的靶向分子的末端修饰类型，连接单元中包含的连接酶识别序列相应地为连接酶受体底物识别序列或连接酶供体底物识别序列。该识别序列与所采用的连接酶 对应。 [0128] 根据待偶联的负载物的活性基团类型，连接单元中包含的活性基团相应地为能够与其发生缩合反应的基团类型。 [0129] 连接单元可能影响形成的药物缀合物的性能。例如，连接单元可以任选地用于提供适当的亲水性，并可以任选地含有裂解位点以获取负载物的适当的释放特性。 [0130] 在一备选的实施方案中，连接单元还包含一个或多个非酶促的裂解位点，其各自独立地位于任意合适的位置。在一实施方案中，非酶促的裂解位点可以是pH敏感的腙。在另一实施方案中，非酶促的裂解位点为对还原剂敏感的二硫键。在另一备选的实施方案中，连接单元还包含一个或多个酶促的裂解位点，其各自独立地位于除Y和W之外的任意合适的位 置。在一实施方案中，酶促的裂解位点选自对蛋白酶敏感的寡肽、组织蛋白酶酶切位点、谷氨酰胺酶酶切位点及其组合。 [0131] 在又一备选的实施方案中，为提高靶向分子‑药物缀合物的负载量，连接单元还可以进一步包含一段分支结构。此分支结构的骨架由多官能团分子通过特定的连接方式形成，可以依据预期负载物的数目，确定支化的数目与结构。所述分支结构中的每一条分支都可以包含上述线性的连接单元结构。 [0132] 本领域技术人员可以通过常规的固相或液相多肽合成方法合成连接单元。 [0133] 带有负载物的式(I)化合物 [0134] A1或A2包含的活性基团与含有另一活性基团的负载物共价连接，可以得到带有负载物的式(I)化合物。 [0135] 因此在又一方面，本发明提供一种化合物，其具有式(II)的结构 [0136] (式(I)的化合物)―PLt (II) [0137] 其中 [0138] PL为负载物，其与式(I)的化合物中的A1或A2部分相连； [0139] t为1‑20的整数。 [0140] t表示连接至式(I)的化合物的PL的数量。 [0141] 在一实施方案中，t为1‑10的整数；例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。 [0142] 在一实施方案中，t为1，式(II)的化合物具有下式(II‑1)或式(II‑2)的结构： [0143] D1―Y―Lk―W―A2―PL (II‑1) [0144] PL―A1―Y―Lk―W―D2 (II‑2) [0145] 其中，A1、A2、D1、D2、Y、Lk和W分别如上文所定义。 [0146] 在另一实施方案中，t为2‑20，式(II)的化合物具有下式(II‑3)至式(II‑6)中任一项的结构： [0147] D1―Y―Lk―W―(A2―PL)t (II‑3) [0148] D1―(Y―Lk―W―A2―PL)t (II‑4) [0149] (PL―A1)t―Y―Lk―W―D2 (II‑5) [0150] (PL―A1―Y―Lk―W)t―D2 (II‑6) [0151] 其中，A1、A2、D1、D2、Y、Lk和W分别如式(II‑1)或式(II‑2)所定义。 [0152] 负载物 [0153] 在本发明中，负载物可以选自小分子化合物、核酸及核酸类似物、示踪分子(包括荧光分子等)、短肽、多肽、拟肽和蛋白质。在一实施方案中，负载物选自小分子化合物、核酸分子、示踪分子。在一优选的实施方案中，负载物选自小分子化合物。在一更优选的实施方案中，负载物选自细胞毒素及其片段。 [0154] 在一实施方案中，细胞毒素选自靶向微管细胞骨架的药物。 [0155] 在一优选的实施方案中，细胞毒素选自紫杉烷类、美登木素类、奥利斯他汀类、埃博霉素类(epothilones)、combretastatin A‑4phosphate、Combretastatin A‑4及其衍生物、吲哚‑磺胺类、长春碱类如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)、长春甘酯(vinglycinate)、脱水长春碱(anhy‑drovinblastine)、Dolastatin 10及其类似物、软海绵素B与艾瑞布林(eribulin)、吲哚‑3‑草酰胺类、鬼臼毒素类、7‑二乙氨基‑3‑(2'‑苯并噁唑基)‑香豆素(DBC)、discodermolide、laulimalide。 [0156] 在另一实施方案中，细胞毒素选自DNA拓扑异构酶抑制剂如喜树碱类及其衍生物、米托蒽醌、米托胍腙。 [0158] 在又一优选的实施方案中，细胞毒素选自亚硝基脲类如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀。 [0159] 在一实施方案中，细胞毒素选自氮杂环丙烷类。 [0160] 在一优选的实施方案中，细胞毒素选自苯并多巴、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌。 [0161] 在一实施方案中，细胞毒素选自抗肿瘤抗生素。 [0162] 在一优选的实施方案中，细胞毒素选自烯二炔抗生素。 [0163] 在一更优选的实施方案中，细胞毒素选自达内霉素、埃斯培拉霉素、新制癌菌素和阿克拉霉素。 [0164] 在另一优选的实施方案中，细胞毒素选自放线菌素、安曲霉素、博来霉素类、放线菌素C、卡拉比星、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、洋红霉素、防线菌素D、柔红霉素、地托比星、阿霉素、表柔比星、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、净司他丁、佐柔比星。 [0165] 在又一优选的实施方案中，细胞毒素选自单端孢霉烯类。 [0166] 在一更优选的实施方案中，细胞毒素选自T‑2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和安归啶(anguidine)。 [0167] 在一实施方案中，细胞毒素选自抗肿瘤的氨基酸衍生物。 [0168] 在一优选的实施方案中，细胞毒素选自乌苯美司、偶氮丝氨酸、6‑重氮基‑5‑氧代‑L‑正亮氨酸。 [0169] 在另一实施方案中，细胞毒素选自叶酸类似物。 [0170] 在一优选的实施方案中，细胞毒素选自二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙和依达曲沙。 [0171] 在一实施方案中，细胞毒素选自嘌呤类似物。 [0173] 在又一实施方案中，细胞毒素选自嘧啶类似物。 [0174] 在一优选的实施方案中，细胞毒素选自安西他滨、吉西他滨、依诺他滨、阿扎胞苷、6‑氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、氟尿苷。 [0175] 在一实施方案中，细胞毒素选自雄激素类。 [0176] 在一优选的实施方案中，细胞毒素选自卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯。 [0177] 在另一实施方案中，细胞毒素选自抗肾上腺类。 [0178] 在一优选的实施方案中，细胞毒素选自氨鲁米特、米托坦和曲洛司坦。 [0179] 在一实施方案中，细胞毒素选自抗雄激素类。 [0180] 在一优选的实施方案中，细胞毒素选自氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林。 [0181] 在又一实施方案中，细胞毒素选自蛋白激酶抑制剂及蛋白酶体抑制剂。 [0182] 在另一实施方案中，细胞毒素选自长春碱类、秋水仙碱类、紫杉烷类、奥利斯他汀类、美登木素类、calicheamicin、doxonubicin、duocarmucin、SN‑38、cryptophycin analog、deruxtecan、duocarmazine、calicheamicin、centanamycin、dolastansine和 pyrrolobenzodiazepine(PBD)。在一特定的实施方案中，细胞毒素选自长春碱类、秋水仙碱类、紫杉烷类、奥利斯他汀类和美登木素类。 [0183] 在一特定的实施方案中，细胞毒素为美登木素，例如DM1等。应当留意，在使用包含巯基部分的细胞毒素的情况下，巯基部分能够与马来酰亚胺部分反应形成硫代琥珀酰亚胺，例如美登木素，例如DM1，可以通过硫代琥珀酰亚胺直接连接细胞毒素。 [0184] 可以理解，在这种情况下，在一些实施例中，负载物和硫醇部分一起构成细胞毒素，因此在这种情况下，负载物表示除硫醇部分外的细胞毒素分子的其余部分。 [0185] 在一特定的实施方案中，细胞毒素是奥利斯他汀类，例如MMAE(monomethyl auristatin E，单甲基奥利斯他汀E)、MMAF(monomethyl auristatin F，单甲基奥利斯他汀F)、MMAD(monomethyl auristatin D，单甲基奥利斯他汀D)等。 [0186] 奥利斯他汀类化合物的合成和结构参见US20060229253，通过引用将其全文纳入本文。 [0187] 负载物含有活性基团，其能够与式(I)化合物中的活性基团反应，使负载物与式(I)化合物共价连接。不含有活性基团的化合物需要经过适当的衍生化得到负载物。在一实施方案中，负载物中的活性基团为马来酰亚胺(maleimide)，不含有马来酰亚胺的化合物可以通过适当的反应生成马来酰亚胺衍生物，例如MMAF经过衍生化得到mc‑MMAF(mc表示马来酰亚胺基己酰)，MMAE经过衍生化得到mc‑Val‑Cit‑PAB‑MMAE，上述结构中的mc可以被mcc(4‑(马来酰亚胺基甲基)环己基‑1‑羰基)或者马来酰亚胺‑R结构代替，其中R为C1‑20亚烷基，并且任选地，亚烷基中的一个或多个(‑CH2‑)结构可以被‑O‑代替。 [0188] 在一实施方案中，式(I)化合物中的A1或A2各自独立地为任选地衍生化的半胱氨酸，其中半胱氨酸结构中的氨基与式(I)化合物的其他部分相连，其巯基与含马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物结构的负载物中的马来酰亚胺基团反应，生成包含硫代琥珀酰亚胺结构 的带有负载物的式(I)化合物。 [0189] 在一特定的实施方案中，式(I)化合物中的半胱氨酸结构中的巯基与来自负载物的马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物通过迈克尔加成反应进行连接。 [0190] 硫代琥珀酰亚胺在生理条件下不稳定，易发生逆迈克尔加成反应而导致偶联位点处断裂。当体系中存在其他巯基化合物时，硫代琥珀酰亚胺还会与之发生巯基交换反应。这两种反应都会导致负载物脱落，产生毒副作用。本发明在迈克尔加成反应步骤之后采用开 环反应实现琥珀酰亚胺开环。开环后的琥珀酰亚胺不再发生逆迈克尔加成或巯基交换，产 物更加稳定。开环反应的方法可以参见WO2015165413A1。 [0191] 无论琥珀酰亚胺开环反应产率高低，开环后的带有负载物的式(I)化合物可通过半制备/制备型HPLC(高效液相色谱)或其他适宜的分离手段来纯化，得到结构、组分确定的高纯度的带有负载物的式(I)化合物。 [0192] 带有负载物的式(I)化合物的具体方案 [0193] 在又一方面，本发明还提供如下式(i)、(ii)、(iii)、(iii’)、(iv)、(v)、(v’)、(vi)、(vii)和(vii’)化合物。 [0194] 在本发明的一些具体的实施方式中，当其中D1为Gn，G为甘氨酸，并且A2为时，式(II‑1)化合物的结构如式(i)所示： [0195] [0196] 其中，n为3‑10的整数； [0197] x选自氢、OH、NH2、包含1‑10个氨基酸的氨基酸片段、包含1‑10个核苷酸的核苷酸片段； [0198] 负载物、Y、W和Lk分别如式(II)所定义。 [0199] 在一优选的实施方案中，x为OH，NH2或Gly。 [0200] 在另一实施方案中，式(i)中的Y和W都不存在，负载物为细胞毒素经衍生化形成的mc‑toxin，其中toxin表示细胞毒素，式(i)化合物的结构如式(ii)所示： [0201] [0202] 其中，n、Lk和x分别如式(i)中所定义。mc结构可以进一步按照已知的方法反应开环，得到式(iii)和式(iii’)化合物。 [0203] [0204] 式(iii)和式(iii’)为异构体。其中，n、Lk和x分别如式(i)中所定义。 [0205] 在一优选的实施方案中，式(ii)中的细胞毒素为MMAF，即，负载物为mc‑MMAF，式(ii)化合物的结构如式(iv)所示： [0206] [0207] 其中，n、Lk和x分别如式(i)中所定义。其中，mc结构可以进一步按照已知的方法反应开环，得到式(v)和式(v’)化合物。 [0208] [0209] [0210] 式(v)和式(v’)为异构体。其中，n、Lk和x分别如式(i)中所定义。 [0211] 在一更优选的实施方案中，式(iv)中的n＝3，Lk为L1‑L2‑L3，L1为‑NH‑，L3为‑(CO)‑，L2为‑(C2H4‑O)i‑C2H4‑，i＝4，x为NH2，式(iv)化合物的结构如式(vi)所示(IM102(闭环))： [0212] [0213] 其中，mc结构可以进一步按照已知的方法反应开环，得到式(vii)和式(vii’)化合物(IM102(开环))。 [0214] [0215] 式(vii)和式(vii’)为异构体。 [0216] 缀合物及其制备 [0217] 带有负载物的式(I)化合物包含连接酶识别序列的部分，能够与其他包含连接酶识别序列的分子连接，并且由此能够例如用于制备靶向分子‑药物缀合物，例如抗体‑药物缀合物。因此，在又一方面，本发明提供一种缀合物，其包含式(I)化合物、靶向分子和负载物。 [0218] 缀合物的具体构成 [0219] 在又一方面，本发明提供一种缀合物，其具有式(III)的结构 [0220] A―((式(I)的化合物)―PLt)z (III) [0221] 其中 [0222] PL为负载物，其与式(I)的化合物中的A1或A2部分相连； [0223] A为靶向分子，其与式(I)的化合物中的D1或D2部分相连； [0224] z为1‑20整数； [0225] t为1‑20的整数。 [0226] t表示连接至式(I)的化合物的PL的数量。 [0227] 在一实施方案中，式(I)的化合物中的D1或D2表示的连接酶识别序列与待偶联的靶向分子中存在的连接酶识别序列对应，以实现式(I)化合物与靶向分子的位点特异性偶 联。当待偶联的靶向分子的末端修饰为基于连接酶供体底物识别序列的末端修饰时，D1或 D2独立地为连接酶受体底物识别序列。或者，当待偶联的靶向分子的末端修饰为基于连接 酶受体底物识别序列的末端修饰时，D1或D2独立地为连接酶供体底物识别序列。 [0228] 在一实施方案中，z为1‑10的整数；例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。 [0229] 在一实施方案中，t为1‑10的整数；例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。 [0230] 在一实施方案中，t为1，式(III)的缀合物具有下式(III‑1)或式(III‑2)的结构： [0231] A―(D1―Y―Lk―W―A2―PL)z (III‑1) [0232] (PL―A1―Y―Lk―W―D2)z―A (III‑2) [0233] 其中，PL、A1、A2、D1、D2、Y、W、Lk和z分别如上文所定义。 [0234] 在另一实施方案中，t为2‑20，式(III)的缀合物的结构如下式(III‑3)至式(III‑6)中任一项所示： [0235] A―(D1―Y―Lk―W―(A2―PL)t)z (III‑3) [0236] A―(D1―(Y―Lk―W―A2―PL)t)z (III‑4) [0237] ((PL―A1)t―Y―Lk―W―D2)z―A (III‑5) [0238] ((PL―A1―Y―Lk―W)t―D2)z―A (III‑6) [0239] 其中，PL、A1、A2、D1、D2、Y、W、Lk和z分别如式(III‑1)或式(III‑2)所定义。 [0240] 靶向分子 [0241] 在一实施方案中，靶向分子为抗体或其抗原结合片段。 [0242] 在本发明一些实施方案中，靶向分子(例如抗体或其抗原结合片段)识别的靶点包括但不限于CD19、CD22、CD25、CD30/TNFRSF8、CD33、CD37、CD44v6、CD56、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD117/KIT、CD123、CD138、CD142、CD174、CD227/MUC1、CD352、CLDN18.2、DLL3、ErbB2/HER2、CN33、GPNMB、ENPP3、Nectin‑4、EGFRvIII、SLC44A4/AGS‑5、mesothelin、CEACAM5、PSMA、TIM1、LY6E、LIV1、Nectin4、SLITRK6、HGFR/cMet、SLAMF7/CS1、EGFR、BCMA、AXL、NaPi2B、GCC、STEAP1、MUC16、Mesothelin、ETBR、EphA2、5T4、FOLR1、LAMP1、Cadherin 6、FGFR2、FGFR3、CA6、CanAg、IntegrinαV、TDGF1、Ephrin A4、Trop2、PTK7、NOTCH3、C4.4A、FLT3。 [0243] 在一实施方案中，靶向分子为抗人HER2抗体或其抗原结合片段。抗人HER2抗体的实例包括但不限于Pertuzumab和Trastuzumab。Pertuzumab与HER2的第二个细胞外结构域 (ECD2)结合，被批准用于治疗HER2阳性乳腺癌。Trastuzumab与HER2的第四胞外结构域 (ECD4)结合，被批准用于治疗Her2阳性乳腺癌和胃癌。 [0244] 在一优选的实施方案中，抗人HER2抗体为选自基于Pertuzumab(Genentech)改造的抗HER2抗体的一种或多种。 [0245] 在一实施方案中，靶向分子为选自抗人TROP2抗体或其抗原结合片段的一种或多种。在一特定的实施方案中，抗人TROP2抗体为选自基于hRS7(参见US20140120035)改造的 抗TROP2抗体的一种或多种。在另一特定的实施方案中，抗人TROP2抗体为选自基于 MAAA1181a(参见US20160297890)改造的抗TROP2抗体的一种或多种。在又一特定的实施方 案中，抗人TROP2抗体为选自以下的一种或多种：基于Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063或Ab0064的任选地经过改造的抗TROP2抗体及其组合。 [0246] 在一优选的实施方案中，抗人HER2或TROP2抗体为重组抗体，其选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段和类抗体。在一实施方案中，类抗体选自scFv，微抗体 (minibody)，双抗体(diabody)，纳米抗体(nanobody)。为了与式(I)的化合物连接，本发明的靶向分子可以包含修饰部分以与式(I)化合物中的D1或D2连接。这样的修饰部分不限制 其引入位置，例如当靶向分子为抗体时，其引入位置可以但不限于位于抗体重链或轻链的C末端或N末端。 [0247] 在一备选的实施方案中，可以采用例如化学修饰方法，在抗体重链或轻链的非末端的位置引入用于与式(I)化合物中的D1或D2连接的修饰部分。 [0248] 在一实施方案中，本发明的靶向分子为抗体或其抗原结合片段，其可以包含末端修饰。末端修饰是指位于抗体重链或轻链的C末端或N末端的修饰，其例如包含连接酶识别 序列。在另一实施方案中，末端修饰还可以包含间隔子Sp2，间隔子Sp2包含2‑100个氨基酸，其中抗体、Sp2与连接酶识别序列顺序连接。在一优选的实施方案中，Sp2为含有2‑20个氨基酸的间隔序列。在一特定的实施方案中，Sp2为选自GA、GGGS和GGGGSGGGGS的间隔序列，尤其是GA。 [0249] 在一优选的实施方案中，抗体或其抗原结合片段所包含的轻链有野生型(LC)、C末端直接引入连接酶供体底物识别序列LPXTG的修饰轻链(LCCT)和C末端引入短肽间隔子和 连接酶供体底物识别序列LPXTG的修饰轻链(LCCTL)3种类型；抗体或其抗原结合片段所包 含的重链有野生型(HC)、C末端直接引入连接酶供体底物识别序列LPXTG的修饰重链(HCCT) 和C末端引入短肽间隔子和连接酶供体底物识别序列LPXTG的修饰重链(HCCTL)3种类型，其 中X可以是任何天然的或非天然的单个氨基酸。当式(III)化合物中的z为1或2时，以上重链与轻链的组合可形成8种优选的抗体分子，参见氨基酸序列表。 [0250] 在一优选的实施方案中，抗体或其抗原结合片段所包含的轻链有野生型(LC)、N末端直接引入连接酶受体底物识别序列GGG的修饰轻链(LCNT)和N末端引入短肽间隔子再加 上连接酶受体底物识别序列GGG的修饰轻链(LCNTL)3种类型；抗体所包含的重链或其抗原 结合片段有野生型(HC)、N末端直接引入连接酶受体底物识别序列GGG的修饰重链(HCNT)和 N末端引入短肽间隔子再加上连接酶受体底物识别序列GGG的修饰重链(HCNTL)3种类型。 [0251] 在一特定实施例中，靶向分子为抗体，其包含分别具有以下氨基酸序列的轻链和重链：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2(P‑LCCTL‑HC)；SEQ ID No.3和SEQ ID No.4(P‑LC‑ HCCT)；SEQ ID No.5和SEQ ID No.6(P‑LC‑HCCTL)；SEQ ID No.7和SEQ ID No.8(P‑LCCT‑HC)；SEQ ID No.9和SEQ ID No.10(P‑LCCT‑HCCT)；SEQ ID No.11和SEQ ID No.12(P‑LCCT‑HCCTL)；SEQ ID No.13和SEQ ID No.14(P‑LCCTL‑HCCT)；SEQ ID No.15和SEQ ID No.16(P‑LCCTL‑HCCTL)；SEQ ID No.17和SEQ ID No.18(修饰的hRS7)；SEQ ID No.19和SEQ ID No.20(修饰的MAAA1181a)；SEQ ID No.21和SEQ ID No.22(Ab0052)；SEQ ID No.23和SEQ ID No.24(Ab0053)；SEQ ID No.25和SEQ ID No.26(Ab0054)；SEQ ID No.27和SEQ ID No.28 (Ab0061)；SEQ ID No.29和SEQ ID No.30(Ab0062)；SEQ ID No.31和SEQ ID No.32 (Ab0063)；或SEQ ID No.33和SEQ ID No.34(Ab0064)。 [0252] 本发明的缀合物还可以包含负载物。该负载物如上文所述。 [0253] 缀合物的具体方案 [0254] 在另一方面，本发明提供如下式(1)、(2)、(2’)、(3)、(3’)、(4)、(4’)的缀合物。 [0255] 如式(III‑1)所示的缀合物，当其中D1为Gn，G为甘氨酸，并且A2为通过巯基与负载物反应后的残基 时，缀合物的结构如 下式(1)所示： [0256] [0257] 其中，A为靶向分子； [0258] n为3‑10的整数； [0259] x为OH，NH2或Gly； [0260] 负载物、Y、Lk、W和z分别如式(III‑1)所定义。 [0261] 在一优选的实施方案中，Y和W都不存在，式(1)中的负载物为mc(开环)‑toxin，toxin表示细胞毒素，缀合物的结构如下式(2)或式(2’)所示： [0262] [0263] 其中，A、toxin、n、Lk、x和z分别如式(1)中所定义。 [0264] 在一更优选的实施方案中，式(2)和式(2’)中的细胞毒素为MMAF，即，负载物为mc(开环)‑MMAF，缀合物的结构如下式(3)或式(3’)所示： [0265] [0266] 式(3)和式(3’)为异构体。 [0267] 其中，A、n、Lk和x分别如式(1)中所定义； [0268] z为1到20之间的任一整数，例如z可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一实施方案中，z选自以下的值：1‑10、1‑8、1‑6或1‑4的整数。在另一实施方案中，z为1或2。在一非常具体的实施方案中，z为2。 [0269] 在一特定的实施方案中，靶向分子为抗体Pertuzumab、hRS7、MAAA1181a、Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063或Ab0064。 [0270] 在另一特定的实施方案中，n＝3，Lk为L1‑L2‑L3，L1为‑NH‑，L3为‑(CO)‑，L2为‑(C2H4‑O)i‑C2H4‑，i＝4，x为NH2，z＝2，缀合物的结构如下式(4)和式(4’)： [0271] [0272] 式(4)和式(4’)为异构体。其中A为修饰的Pertuzumab、修饰的hRS7或修饰的MAAA1181a，或为Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063或Ab0064。 [0273] 缀合物的制备 [0274] 本发明的缀合物可以用本领域任何已知的方法制备。在一些实施方案中，缀合物的制备方法为在连接酶催化下位点特异性地偶联连接酶识别序列修饰的靶向分子与带有 负载物的式(I)化合物，该方法包括步骤A和步骤B。 [0275] 步骤A.连接单元‑负载物中间体的制备 [0276] 在一优选的实施方案中，式(I)化合物中的A1或A2各自独立地通过活性基团与含有另一活性基团的负载物共价连接。在一优选的实施方案中，式(I)化合物中的A1或A2各自独立地通过二硫键、硫醚键、硫酯键、或氨基甲酸酯键与含马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物结构的负载物中的马来酰亚胺基团共价连接，得到连接单元‑负载物中间体，即，带有负载物的式(I)化合物。 [0277] 本发明的式(I)化合物制备得到的连接单元‑负载物中间体的结构、组分确定，纯度高，使得其与抗体进行偶联反应时，引入的杂质少，或不含其他杂质，该中间体在当其用于连接酶催化下的与含有连接酶识别序列的修饰的抗体位点特异性偶联时，可制备得到结 构均一、质量高度可控的ADC。 [0278] 步骤B.靶向分子与带有负载物的式(I)化合物连接 [0279] 本发明的靶向分子与带有负载物的式(I)化合物(即式(II)化合物)可以用本领域任何已知的方法连接。例如采用连接酶催化的定位偶联技术，通过连接酶特异性底物识别 序列将靶向分子与带有负载物的式(I)化合物相互连接。底物识别序列由所使用的特定连 接酶决定。在一实施方案中，靶向分子为轻链和/或重链C末端引入了基于识别序列的末端 修饰的抗体，其与式(II)化合物在适宜的催化反应条件下，由野生型或经过改造优化的连 接酶或其任意组合催化偶联。 [0280] 在一特定的实施方案中，使用的连接酶为Sortase A，偶联反应可用下面的示意图表示： [0281] [0282] 三角形和五角形分别代表以下中的任一：抗体或式(II)化合物的一部分，位置可以互换，其中n、X和J分别如上文所定义。当与对应的受体底物识别序列Gn进行连接时， LPXTGJ序列中甘氨酸上游的肽键被Sortase A裂解，所得的中间体与Gn的游离N端连接，生 成新的肽键，得到的氨基酸序列为LPXTGn。序列Gn和LPXTGJ如上文所定义。 [0283] 药物组合物和药物制剂 [0285] 本发明的药物组合物可以以任意方式施用，只要其实现预防、减轻、防止或者治愈人类或动物患者症状的效果。例如，可根据给药途径制成各种适宜的剂型，尤其是注射剂，例如冻干粉针剂、注射液或注射用无菌粉末。 [0286] 术语“药学上可接受的”是指在正常的医学判断范围内与患者的组织接触而不会有不适当毒性、刺激性、过敏反应等，具有合理的利弊比且能有效用于目的用途。 [0287] 术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的，不会影响缀合物的生物活性及性能的那些载体物质。例如水性载体的实例包括但不限于缓冲盐水等。药学上可接受的载体还包括使组合物接近生理条件的载体物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。 [0288] 在一实施方案中，本发明的药物组合物的药物/抗体比(DAR)为1‑20的整数或非整数，例如1‑10、1‑8、1‑6、1‑4、1‑3、1‑2.5、1‑2、1‑1.5、1.5‑2或1.5‑2.5。在一特定的实施方案中，本发明的缀合物的DAR为1.6‑2.1。在另一特定的实施方案中，本发明的缀合物的DAR为 1.8‑1.9。 [0289] 治疗方法和用途 [0290] 本发明的缀合物可用于治疗肿瘤和/或自身免疫疾病。对缀合物治疗敏感的肿瘤包括以特定肿瘤相关抗原或细胞表面受体为特征的肿瘤，这些肿瘤细胞能被缀合物中的靶 向分子特异识别，进而可以被缀合物中的负载物/细胞毒素杀伤。 [0291] 因此，在又一方面，本发明还提供本发明的缀合物或本发明的药物组合物在制备治疗疾病、病症或病况的药物中的用途，所述疾病、病症或病况选自肿瘤或自身免疫疾病。 [0292] 在另一方面，本发明提供本发明的缀合物或本发明的药物组合物，用于治疗肿瘤或自身免疫疾病。 [0293] 在进一步的方面，本发明提供一种治疗肿瘤或自身免疫疾病的方法，所述方法包括向有此需要的个体给药有效量的本发明的缀合物或本发明的药物组合物。 [0294] 在一优选的实施方案中，本发明提供的抗人HER2抗体与小分子细胞毒素连接形成的缀合物可与肿瘤细胞表面的HER2特异结合，选择性杀伤表达HER2的肿瘤细胞。在另一优 选的实施方案中，本发明提供本发明的缀合物或本发明的药物组合物在制备治疗疾病、病 症或病况的药物中的用途，所述疾病、病症或病况选自HER2阳性的肿瘤。在一更优选的实施方案中，所述疾病、病症或病况选自乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌和尿路上皮癌等。 [0295] 在一优选的实施方案中，本发明提供的抗人TROP2抗体与小分子细胞毒素连接形成的缀合物可与肿瘤细胞表面的TROP2特异结合，选择性杀伤表达TROP2的肿瘤细胞。在另 一优选的实施方案中，本发明提供本发明的缀合物或本发明的药物组合物在制备治疗疾 病、病症或病况的药物中的用途，所述疾病、病症或病况选自TROP2阳性的肿瘤。在一更优选的实施方案中，所述疾病、病症或病况选自乳腺癌、尿路上皮癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、头颈癌和卵巢癌等。 [0296] 给予受试者的所述缀合物的剂量在相当程度上是可以调整的，可以根据所选的特定给药模式和对象的需要变化，并且可以服从卫生护理专业人员的判断。 [0297] 有益效果 [0298] 本发明利用独特的连接结构以及连接酶催化来偶联靶向分子与负载物。本发明提供的缀合物均质性好，活性高，选择性高，特别是胞内代谢产物对靶点抗原低表达及不表达的细胞的细胞增殖毒性显著降低，而且连接单元‑负载物中间体(linking unit‑payload intermediate)的毒性远低于游离态的负载物，药物制备过程中产生较小危害，有利于工业化生产。 [0299] 本发明的缀合物还能够实现下述至少一种技术效果： [0300] (1)对标靶细胞的高抑制活性或对标靶细胞的强杀伤作用。 [0303] (4)优异的安全性(对非靶标的正常细胞或组织较低的毒性和/或较少的副作用，较宽的治疗窗)等。 [0304] 实施例 [0305] 制备实施例 [0306] 为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，以下结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。并且，下列实施例中未提及的具体实验方法，均按照常规实验方法进行。 [0307] 仪器、材料与试剂 [0308] 除非特别说明，实施例中所使用的仪器和试剂均为可商购的。试剂可以不经进一步纯化，直接使用。 [0309] MS型号：Thermo Fisher Q Exactive Plus，Water2795‑Quattro micro三重四级杆质谱仪 [0310] HPLC型号：Waters 2695，Agilent 1100，Agilent 1200 [0311] 半制备HPLC型号：利穗HP plus 50D [0312] 流式细胞仪型号：CytoFLEX S [0313] HIC‑HPLC：色谱柱：Butyl‑HIC；流动相A液：25mM PB、2M(NH4)2SO4，pH 7.0；流动相B液：25mM PB，pH 7.0；流速：0.8ml/min；采集时间：25min；进样量：20μg；柱温：25℃；检测波长：280nm；样品箱温度：8℃。 [0314] SEC‑HPLC：色谱柱：TSK‑gel G3000 SWXL，TOSOH 7.8mm I.D.×300mm,5μm；流动相：0.2M KH2PO4，0.25M KCl，pH 6.2；流速：0.5ml/min；采集时间：30min；进样体积：50μl；柱温：25℃；检测波长；280nm；样品盘温度：8℃。 [0315] CHO细胞获得自Thermo Fisher Scientific；pcDNA3.3获得自Life Technology；HEK293F细胞获得自普瑞金生物；PEIMAX转染试剂获得自Polyscience；MabSelect Sure ProA填料获得自GE；Capto S ImpAct填料获得自GE；Rink‑amide‑MBHA‑树脂及二氯树脂获得自南开合成；HCC1954细胞获得自ATCC CAT#CRL‑2338；SK‑BR‑3细胞获得自ATCC CAT#HTB‑30；BT‑474细胞获得自ATCC CAT#HTB‑20；NCI‑N87细胞(ATCC Cat#CRL‑5822)；MCF7细胞获得自ATCC CAT#HTB‑22；MDA‑MB‑231细胞获得自ATCC CAT#HTB‑26；MDA‑MB‑468细胞获得自ATCC CAT#HTB‑132；抗体 为根据公开序列自行制备；抗体hRS7为根据专利 US20140120035的序列自行制备(所述抗体hRS7的重链和轻链序列来自WHO药物信息，INN列 表113，第29卷，第2期，2015年)；抗体MAAA1181a为根据专利US 20160297890的序列自行制备；优化改造的重组Sortase A酶为在E.coli中自行制备，来源于金黄葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)。 [0316] 实施例1抗体表达载体的构建、抗体表达、纯化及鉴定 [0317] 1.1修饰的抗人HER2抗体表达载体的构建 [0318] 按照以下步骤构建抗体P‑LCCTL‑HC(轻链SEQ ID NO:1，重链：SEQ ID NO:2)的表达质粒。其中抗体P‑LCCTL‑HC的序列为：在Pertuzumab抗体的轻链C端引入了氨基酸序列GALPETGG。 [0319] 1)根据Pertuzumab抗体已公开的氨基酸序列，在轻链N端加上轻链信号肽氨基酸序列，在轻链C端加上氨基酸序列GALPETGG，其中，LPETGG为连接酶供体底物识别序列，GA为间隔序列；在重链N端加上重链信号肽氨基酸序列。然后对轻链氨基酸序列和重链氨基酸序列分别进行密码子优化，优化宿主为CHO，得到轻链及重链核苷酸序列。 [0320] 2)向1)中得到的轻链核苷酸序列的5’端加上抗体表达载体pcDNA3.3的重组臂序列和Kozak序列(GCCGCCACC)，得到轻链表达载体。向1)中得到的重链核苷酸序列的5’端加上抗体表达载体pcDNA3.3的重组臂序列和Kozak序列，得到重链表达载体。分别对轻链及重链表达载体进行PCR扩增后，与pcDNA3.3载体进行重组构建并转化、培养及鉴定，得到编码抗体P‑LCCTL‑HC氨基酸序列的质粒。 [0321] 1.2修饰的抗人HER2抗体P‑LCCTL‑HC的表达 [0322] 使用HEK293F种子细胞进行转染。将Pertuzumab抗体轻链和重链质粒按照质量比2:1进行配比混合。将质粒和PEIMAX转染试剂分别用HEK293F基础培养基稀释，并将两者混 合均匀。混合物室温静置后加入至种子细胞液中转染。取样分析细胞密度和活力并补加 10％体积的HEK293F feed培养基，并降温至32℃继续培养。培养至72h左右、144h左右时，再次取样分析细胞密度和活力。 [0323] 1.3修饰的抗人HER2抗体P‑LCCTL‑HC的纯化 [0324] 选用MabSelect Sure ProA填料装柱，用缓冲液洗去杂质，再用洗脱液洗脱抗体，将洗脱的抗体调至pH5.0。再用Capto S ImpAct填料装柱，用缓冲液洗脱P‑LCCTL‑HC抗体。 通过高分辨质谱(HR‑ESI‑MS)检测抗体P‑LCCTL‑HC轻链，理论分子量：24208.96，实测： 24204.46。 [0325] 1.4其他修饰的抗人HER2抗体的制备 [0326] 按照相似的方法，分别在Pertuzumab抗体的轻链和/或重链C末端引入基于连接酶识别序列的末端修饰，得到修饰的抗体。 [0327] 下表1中列出上文所述的修饰的抗人HER2抗体(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16)。其中，末端修饰序列中的LPETGG为连接酶供体底物识别序列，GA为间隔序列。 [0328] 表1修饰的抗人HER2抗体 [0329]修饰的抗体 序列 末端引入序列 P‑LCCTL‑HC轻链 SEQ ID NO:1 GALPETGG P‑LCCTL‑HC重链 SEQ ID NO:2 ‑* P‑LC‑HCCT轻链 SEQ ID NO:3 ‑ P‑LC‑HCCT重链 SEQ ID NO:4 LPETGG P‑LC‑HCCTL轻链 SEQ ID NO:5 ‑ P‑LC‑HCCTL重链 SEQ ID NO:6 GALPETGG P‑LCCT‑HC轻链 SEQ ID NO:7 LPETGG P‑LCCT‑HC重链 SEQ ID NO:8 ‑ P‑LCCT‑HCCT轻链 SEQ ID NO:9 LPETGG P‑LCCT‑HCCT重链 SEQ ID NO:10 LPETGG P‑LCCT‑HCCTL轻链 SEQ ID NO:11 LPETGG P‑LCCT‑HCCTL重链 SEQ ID NO:12 GALPETGG P‑LCCTL‑HCCT轻链 SEQ ID NO:13 GALPETGG P‑LCCTL‑HCCT重链 SEQ ID NO:14 LPETGG P‑LCCTL‑HCCTL轻链 SEQ ID NO:15 GALPETGG P‑LCCTL‑HCCTL重链 SEQ ID NO:16 GALPETGG [0330] *：“‑”表示未进行末端修饰 [0331] 1.5带有连接酶识别序列的TROP2抗体的制备 [0332] 按照与1.4相似的方法，在下表2‑1中所述的抗体的轻链C端引入氨基酸序列GALPETGG，制备修饰的抗人TROP2抗体。 [0333] 表2‑1修饰的抗人TROP2抗体 [0334] [0335] 设计并制备得到抗人TROP2抗体Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063和Ab0064(表2‑2)，其轻链C端具有氨基酸序列GALPETGG。 [0336] 表2‑2带有连接酶识别序列的抗人TROP2抗体 [0337] 抗体 抗体轻链序列 抗体重链序列 抗体 抗体轻链序列 抗体重链序列Ab0052 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22 Ab0053 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24 Ab0054 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:26 ‑ ‑ ‑ Ab0061 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 Ab0062 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 Ab0063 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 Ab0064 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 [0338] 实施例2中间体的制备 [0339] 2.1连接单元的制备 [0340] 连接单元LU102采用常规固相多肽合成方法合成，采用Rink‑amide‑MBHA‑树脂或二氯树脂，氨基酸及连接单元中的Lk结构的氨基均用Fmoc保护。偶联试剂选用HOBT、HOAt/DIC或HATU，合成结束后树脂采用三氟乙酸裂解。产物经HPLC纯化，冻干备用。理论分子量：+ 538.24，实测：539.2[M+H]。 [0341] 参照上述方法制备连接单元LU104，其结构如下式所示： [0342] [0343] 参照上述方法制备下表中的连接单元，其结构如上文所示。 [0344] 连接单元 序列 质谱+ LU106 GGG‑NH‑(C2H4‑O)4‑C2H4‑CO‑Cys‑OH 540.1[M+H](理论分子量：539.23) + LU107 GGG‑Leu‑NH‑(C2H4‑O)4‑C2H4‑CO‑Cys‑NH2) 652.2[M+H](理论分子量：651.33)LU108 GGG‑Gln‑NH‑(C2H4‑O)4‑C2H4‑CO‑Cys‑NH2) 667.3[M+H]+(理论分子量：666.30)+ LU109 GGG‑NH‑(CH2)5‑CO‑Cys‑NH2) 405.2[M+H](理论分子量：404.18) + LU110 GGG‑(Ac)Lys‑Cys‑NH2) 462.3[M+H](理论分子量：461.21) [0345] 2.2中间体的制备 [0346] 称取连接单元LU102和mc‑MMAF(摩尔比1.2:1)，分别溶解于水和DMF后充分混合，0‑40℃下反应0.5‑20h，得到中间体IM102(闭环)，其结构参见上文式(vi)。经HPLC纯化后，+ + 质谱检测该中间体分子量。理论分子量：1462.80，实测：732.41[M/2+1]，1463.81[M+H]。 [0347] 例如，连接单元LU104可通过以下来转化为C‑末端酰胺化连接单元LU104’：(1)用Boc2O保护甘氨酸的末端NH2，(2)将在(1)中获得的产物与NH3在选自HOBT、HOAt/DIC和HATU的偶联剂存在下反应，以及(3)使甘氨酸的末端NH2脱保护。 [0348] C端酰胺化连接单元LU104’具有以下结构： [0349] [0350] 连接单元LU104和连接单元LU104’可各自独立用于与负载物反应以形成连接单元‑负载物中间体。 [0351] 然后参照上述方法将连接单元LU104’和DM1共价连接，得到中间体IM104(闭环)，其结构式如下： [0352] [0353] 2.3中间体的开环 [0354] IM102(闭环)与适量Tris Base溶液或其他促进开环反应的溶液混合，0‑40℃下反应0.2‑20h。反应完成后，通过半制备/制备型HPLC对反应产物进行纯化，得到IM102(开环)，+ 结构参见上文式(vii)和式(vii’)。理论分子量：1480.81，实测：741.41[M/2+1] ，1481.81+ [M+H]。 [0355] 参照上述方法进行中间体IM104(闭环)的开环及纯化，得到中间体IM104(开环)，其结构式如下(示出异构体)： [0356] [0357] 实施例3靶向分子‑药物缀合物的制备 [0358] 3.1靶向HER2的缀合物DG102和参照药物DG103、参照药物DG104的制备 [0359] 通过连接酶将IM102(开环)与抗体P‑LCCTL‑HC以位点特异的方式偶联，形成候选药物DG102，其结构如上文式(4)和式(4’)所示，其中式(4)和式(4’)为异构体。具体步骤如下： [0360] 1)抗体P‑LCCTL‑HC的处理 [0362] 2)DG102的酶催化偶联 [0363] 使用Sortase A野生型或基于其改造优化的突变型连接酶催化抗体P‑LCCTL‑HC与IM102(开环)的偶联反应，制备候选药物DG102。 [0364] 在连接酶缓冲液中，将抗体P‑LCCTL‑HC与IM102(开环)按1:1‑1:100摩尔数比例充分混合，加入到固相偶联体系。固相偶联体系包含固定化的连接酶，其固定在固相偶联体系的基质上，用于催化抗体P‑LCCTL‑HC与IM102(开环)的偶联反应。偶联反应在4‑40℃进行0.5‑20h。反应结束后，对反应混合物进行超滤或透析以除去未反应的中间体，得到DG102。 将DG102储存于含20mM柠檬酸，200mM NaCl，pH5.0的缓冲液中，存储于4℃或‑80℃。 [0365] 3)DG102的SDS‑PAGE检测分析 [0366] 通过SDS‑PAGE法检测DG102的纯度和偶联效率，检测结果如图1所示。偶联反应定点发生在修饰的抗体P‑LCCTL‑HC的轻链上，且偶联了IM102(开环)的抗体轻链与未发生偶联反应的P‑LCCTL‑HC轻链相比有明显的分子量跃迁。偶联产物中没有检测到未偶联中间体的轻链，偶联效率高达95％或以上，偶联产物的纯度符合预期。 [0367] 4)DG102的高分辨质谱(HR‑ESI‑MS)分析 [0368] 利用ESI‑MS对DG102的轻链进行检测。结果显示，DG102理论分子量：25557.72，实测：25554.17，确证了每条轻链末端偶联一个细胞毒素分子。 [0369] 5)DG102的HIC‑HPLC检测分析 [0370] 通过HIC‑HPLC检测DG102的DAR分布，未偶联细胞毒素的抗体P‑LCCTL‑HC小于5％；偶联产物以DAR为2的DG102为主，计算得到DG102的DAR为1.84左右。 [0371] 6)DG102的SEC‑HPLC检测分析 [0372] 通过SEC‑HPLC分析候选药物DG102的高分子量聚集程度。结果显示，候选药物DG102中未检测到高分子量聚体，说明偶联反应条件温和，基本不会对抗体结构造成破坏。 [0373] 7)参照药物的制备 [0374] 使用与2)相似的方法，将中间体GGG‑Val‑Cit‑PAB‑MMAE与修饰的抗体P‑LCCTL‑HC以位点特异的方式偶联，形成参照药物DG103，其结构如下(示出异构体)： [0375] [0376] 其中A1为P‑LCCTL‑HC。 [0377] 使用与2)相似的方法，将中间体IM104(开环)与修饰的抗体P‑LCCTL‑HC以位点特异的方式偶联，形成参照药物DG104，其结构如下，(示出异构体)： [0378] [0379] 其中A1为P‑LCCTL‑HC。 [0380] 3.2靶向TROP2的缀合物的制备 [0381] 使用与3.1相似的方法，将上文所述的修饰的抗人TROP2抗体分别与中间体IM102(开环)及IM104(开环)偶联，得到靶向TROP2的缀合物。缀合物中各个片段的结构如下表3所示。 [0382] 表3靶向TROP2的缀合物 [0383] [0384] 效果实施例1 P‑LCCTL‑HC及DG102对细胞表面ErbB2/Her2的亲和力测定 [0385] 1)将HER2高表达人乳腺癌HCC1954、SK‑BR‑3细胞，及HER2低表达MCF7细胞制成单5 细胞悬液，取5×10细胞/次测试，分别加入6.25nM Pertuzumab、P‑LCCTL‑HC、DG102，于4℃孵育60min。洗涤：加入1ml含1％BSA的PBS洗涤液，1000rpm离心5min，去除上清，重复两遍。 [0386] 2)分别取100μl FITC‑羊抗人IgG抗体稀释液加入到Pertuzumab、P‑LCCTL‑HC或DG102孵育的细胞中，4℃避光孵育30min。加入1ml洗涤液，1000rpm离心5min，去除上清，重复两遍。加入500μl PBS重悬细胞，过300目网筛，冰盒避光放置，通过CytoFLEX S进行FACS(荧光激活细胞分选)检测(图2‑图4)。 [0387] 结果显示，对HER2高表达或低表达的细胞，P‑LCCTL‑HC及DG102对细胞表面ErbB2/Her2受体的亲和力与Pertuzumab相比均无明显差异，提示本发明的抗体修饰、中间体制备以及偶联反应对抗体无明显影响。 [0388] 效果实施例2 DG102对细胞增殖的影响 [0389] 使用HER2高表达癌细胞HCC1954、SK‑BR‑3、BT‑474、NCI‑N87进行细胞毒性实验，以测量DG102对肿瘤细胞增殖的影响。 [0390] DG102对HER2高表达肿瘤细胞IC50值见下表4： [0391] 表4 [0392] [0393] 结果显示DG102可选择性抑制多种ErbB2/HER2高表达细胞的增殖。并且，DG102的IC50值显著低于DG103及DG104，提示DG102具有更高的活性。由此可知，与Val‑Cit‑PAB或LU104’相比，本发明的连接单元更有利于细胞毒素在胞内发挥药效。此外，包含MMAF的 DG102显示出高于包含DM1的DG104的活性。与之相比，未缀合为ADC的游离DM1具有比游离 MMAF更高的活性。由此可见，本发明的缀合物能有效地将细胞毒素带入胞内，因此对细胞毒素在胞内的药效具有重要的积极影响。而且，在毒素从MMAF——mc‑MMAF——IM102(闭 环)——IM102(开环)的制造过程中，毒性持续降低，相应地，制造过程的防护要求降低，节约了生产成本，且对人员及环境的不利影响减小。 [0394] 使用HER2低表达或阴性的人乳腺癌细胞MDA‑MB‑231、MDA‑MB‑468进行细胞毒性实验。DG102对HER2低表达肿瘤细胞的细胞毒性实验结果如图5‑图6所示。IM102的IC50值见表5。 [0395] 表5 [0396] [0397] 结果显示，DG102对HER2阴性或低表达的肿瘤细胞增殖无明显影响，具有较低的细胞毒性。说明本发明的缀合物具有较高的选择性，对于HER2低表达的细胞，例如正常细胞来说毒性较低，药物的制造过程对环境及人体的危害更小。进一步地，IM102(开环)的IC50值显著高于IM102(闭环)，提示本发明开环结构的缀合物在体内的代谢产物具有更小的细胞毒 性。 [0398] 效果实施例3 DG102体内药效评价 [0399] 实验动物：BALB/c裸鼠，SPF级，由上海西普尔‑必凯实验动物有限公司提供，雌性，6～8周龄，体重为18～22g，共30只。 [0400] 肿瘤细胞：培养人胃癌NCI‑N87肿瘤细胞，在对数生长期收集细胞，消化之后收集并悬浮于适量PBS，pH 7.4。 [0401] 实验方法：动物右肩胛部位皮下注射NCI‑N87细胞，注射量为0.2ml(含有细胞数量7 为1x 10)。对照组每只动物注射0.2ml PBS，pH 7.4。 [0402] 7天后测量肿瘤的直径。筛选肿瘤体积位于100～200mm3区间的动物，随机分组，每组内包括6只，共2组，分别为PBS对照组、DG102 15mg/kg组。 [0403] 胃癌动物造模14天后，尾静脉注射给药。使用PBS，pH 7.4配制DG102，浓度为3mg/ml，每10g体重注射50μl药物。 [0404] 在每个测量时间点，以每组肿瘤平均体积及平均值标准误差(standard error of the mean,SEM)进行统计，单因素方差分析(one‑way ANOVA)进行组间肿瘤体积比较。肿瘤 2 体积计算公式为V＝0.5a×b ，其中a、b分别为肿瘤长径和短径。所有数据均用SPSS 17软件进行分析。有统计学意义的标准为P<0.05。 [0405] 结果显示，DG102在15mg/kg给药剂量下表现出良好的抑制肿瘤生长效应：给药10天后观察到肿瘤体积减小，部分动物肿瘤消失，至给药开始38天时，肿瘤并未出现生长反 弹，38天后肿瘤稍有反弹性生长，但生长速度缓慢。结果表明，DG102可显著抑制ErbB2/HER2阳性肿瘤的生长(图7)。 [0406] 效果实施例4靶向TROP2的缀合物对肿瘤细胞增殖的影响 [0407] 使用与效果实施例2相似的方法，TROP2高表达的肿瘤细胞NCI‑N87、MDA‑MB‑468、SK‑BR‑3和MCF‑7进行细胞毒性实验，以测量靶向TROP2的缀合物DG202、DG302、DG402、DG502、DG602、DG702、DG802、DG902、DG1002对肿瘤细胞增殖的影响，结果如表6‑1和6‑2。其中，NCI‑N87和SK‑BR‑3为HER2高表达的肿瘤细胞，MDA‑MB‑468和MCF‑7为HER2阴性或低表达的肿瘤细胞。 [0408] 表6‑1 [0409] [0410] 表6‑2 [0411] [0412] 结果显示，相对于参照药物DG204、DG304，本发明的缀合物DG202、DG302在TROP2高表达细胞中具有更高的活性。相对于参照药物DG504和DG604，本发明的缀合物DG202、DG302、DG402、DG502、DG602、DG702、DG802、DG902、DG1002在TROP2高表达细胞中具有更高的活性。 [0413] 效果实施例5靶向TROP2的缀合物的体内药效评价 [0414] 参照效果实施例3所述的方法对DG202进行体内药效评价，结果如图8所示。结果显示，本发明的缀合物(例如DG202，Group3)在3mg/kg剂量下可以显著抑制小鼠体内肿瘤的生长，并且比参照药物(例如DG204，Group2)具有更高的药效。 [0415] 参照效果实施例3所述的方法对DG1002进行体内药效评价。其中分组方法为：筛选3 肿瘤体积位于100～200mm 区间的实验动物，分为给药生理盐水的对照组、给药参照药物 DG1004的DG1004 2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg组、给药本发明缀合物DG1002的DG1002 1mg/kg、2mg/kg和4mg/kg组、给药抗体Ab0064的Ab0064 10mg/kg组，每组6只。给药开始后，每周两次使用卡尺测量肿瘤大小，结果如图9所示。 [0416] 结果显示，本发明的缀合物在较低剂量下能够显著抑制肿瘤的生长，与参照药物在较高剂量的效果相近。例如DG1002在4mg/kg剂量下与DG1004在10mg/kg剂量下的效果相 近，DG1002在2mg/kg剂量下与DG1004在5mg/kg剂量下的效果相近，DG1002在1mg/kg剂量下 与DG1004在2.5mg/kg剂量下的效果相近。本发明的缀合物比参照药物具有更高的药效。 [0417] 序列表 [0418] SEQ ID No.1:P‑LCCTL‑HC轻链： [0419] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGALPETGG [0420] SEQ ID No.2:P‑LCCTL‑HC重链： [0421] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG [0422] SEQ ID No.3:P‑LC‑HCCT轻链： [0423] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [0424] SEQ ID No.4:P‑LC‑HCCT重链： [0425] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGLPETGG [0426] SEQ ID No.5:P‑LC‑HCCTL轻链： [0427] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [0428] SEQ ID No.6:P‑LC‑HCCTL重链： [0429] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD 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