[0001] 本发明涉及腺相关病毒(AAV)，其包括在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物。还预期本发明的AAV用作包含本发明的AAV的药物和药物组合物。此外，本发明涉及本发明的AAV用于视网膜细胞核转导的体外用途。还涉及用于筛选插入序列的方法以及通过所述筛选方法获得的肽。还考虑了包含本发明AAV的试剂盒。

[0002] 重组腺相关病毒(AAV)载体已被证明是一种非常适合将基因高效且长期转移到视网膜细胞中的递送系统(Boye et al.(2013)“A comprehensive review of retinal gene therapy”Molecular therapy,21(2013)509-519and Trapani et al.(2014)“Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies”Prog Retin Eye Res)。AAV是属于细小病毒科和依赖病毒属的非致病性病毒，仅在存在腺病毒、乳头状瘤病毒或疱疹病毒的情况下才能复制(Nathwani et al.(2014)“Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B”N Engl J Med,371(2014)1994-2004)，并具有大约5kb单链DNA基因组(Trapani et al.(2014)“Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies”Prog Retin Eye Res.)。

[0003] AAV的安全性和转基因的长期表达已在大型动物模型、非人灵长类动物和多项人类试验中被广泛测试(MacLaren et al.(2014)“Retinal gene therapy in patients with choroideremia:initial findings from a phase 1/2clinical trial”Lancet383,1129-1137,Maguire et al.(2008)“Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis”N Engl J Med,358 2240-2248,Simonelliet al.
(2010)”Gene therapy for Leber's congenital amaurosis is safe and effective through1.5years after vector administration”Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 18,643-650,Nathwani et al.(2014)“Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B”N Engl J Med 371,1994-2004)。

[0004] AAV是用于基因补充疗法(也称为基因增强疗法)的优选基因转移载体。基因补充疗法是用于治疗遗传疾病的有吸引力的方法，其目的在于恢复由致病突变引起的基因功能不足或缺乏。目标是恢复受影响的细胞类型的正常生理功能和/或通过补充基因功能来抑制或延迟变性过程。

[0005] 基因疗法的目的是恢复由致病突变引起的基因功能不足或缺乏。这种方法对于隐性遗传疾病的治疗特别有吸引力，在隐性遗传疾病中，异常转录物或蛋白质预计不会干扰治疗。目标是通过在适当的位置补充足量的正常基因功能来阻止或防止变性过程，并恢复受影响细胞类型或组织的正常生理功能。

[0006] 虽然，AAV在组织和生物体中表现出一定程度的扩散(Le Guiner et al.(2011)“Biodistribution and shedding of AAV vectors”Methods in molecular biology 807,339-359)，但它们在大多数治疗方法中通常需要局部施用，特别是用于眼部基因治疗。
对于光感受器或视网膜色素上皮(RPE)细胞的转导，将AAV颗粒施用于视网膜下腔(即，在RPE和光感受器之间注射液体后形成的空腔)(Mühlfriedel et al.(2013)“Optimized technique for subretinal injections in mice”Methods in molecular biology 935,
343-349,Ochakovski et al.(2017)“Retinal Gene Therapy:Surgical Vector Delivery in the Translation to Clinical Trials.”Front Neurosci 11:174)。

[0007] 结构上，AAV是小的(25nm)、无包膜病毒，有二十面体衣壳。在其衣壳(cap)蛋白的组成和结构上不同的天然存在的或工程化的AAV变体(也是AAV血清型)具有不同的嗜性，即转导不同(视网膜的)细胞类型的能力(Boye et al.(2013)“A comprehensive review of retinal gene therapy”Molecular therapy 21 509-519and Trapani et al.(2014)“Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies”Prog Retin Eye Res)。当与泛活性启动子结合时，这种嗜性决定了基因表达的位点。然而与细胞类型特异性启动子结合时，位点特异性的程度(即转基因仅在视杆或视锥光感受器中表达)由AAV血清型的嗜性和启动子的特异性二者共同来决定( et al.(2015)“Retinal gene delivery by adeno-associated virus(AAV)vectors:Strategies and applications”European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics)。向眼睛的玻璃体中施用AAV导致内视网膜内细胞(主要是神经节细胞和Müller胶质细胞)的转导(Trapani et al.(2014)“Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies”Prog Retin Eye Res)。

[0008] 由于在内界膜(ILM)的物理屏障或在ILM缺乏合适的受体，当玻璃体内施用时，没有一种天然存在的AAV血清型能够转导光感受器。

[0009] 成功的基因治疗方法的先决条件是在靶细胞中高效且持久的转基因表达，仅具有最小的脱靶表达和最低可能的不良作用。尽管可用的AAV载体构成了有价值的基因递送工具，但是仍然存在对改进的AAV的开发的强烈需求。

[0010] 为了靶向光感受器，需要将AAV施用于视网膜下腔。这种侵入性很强的外科手术会导致视网膜从RPE脱离。视网膜脱离通常是暂时性的，视网膜复位后对视网膜功能和形态没有任何严重或长期的有害影响。然而，在变性的视网膜和/或如果脱离涉及黄斑中心凹区域，由于视网膜下注射引起的附带损害的风险可能会增加。因此，需要改进的AAV载体，特别是关于生物利用度、递送途径和靶细胞特异性。

[0011] 因此，仍然需要开发进一步改进的AAV载体。在此，我们描述了从体内选择进化的新型AAV，其具有将基因转移到视网膜细胞(尤其是光感受器)中的改进的特性。

[0012] 本发明符合此需要，如本文中所描述的且如在实施例、附图和权利要求书中所描述的。

[0013] 本发明涉及一种腺相关病毒(AAV)，所述AAV包含在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物；其中插入序列从N-末端到C-末端具有式I:

[0014] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0015] 其中X5选自P(Pro)、L(Leu)和V(Val)；

[0016] 其中X7为R(Arg)；

[0017] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0018] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，

[0019] 或者

[0020] 其中X5选自S(Ser)和T(Thr)；

[0021] 其中X7为S(Ser)；

[0022] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0023] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，

[0024] 或者

[0025] 其中X5选自A(Ala)和Q(Gln)；

[0026] 其中X7为A(Ala)；

[0027] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0028] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，

[0029] 其中当将AAV静脉内施用于C57-Bl6J小鼠的尾静脉中时，在24小时后，病毒AAV DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中，并且

[0030] 其中当将AAV静脉内施用于C57-Bl6J小鼠的尾静脉中以进行视杆细胞分选，以及施用于RG-eGFP小鼠品系R685933的尾静脉中以进行视锥细胞分选时，施用后24小时，病毒AAV DNA存在于使用抗CD73包被的磁珠进行的MAC分选的视杆细胞和/或经FACS分选的视锥细胞中，其中所述视锥细胞表达eGFP，并基于其eGFP表达被进行FACS分选。

[0031] 此外，本发明涉及用作药物的本发明的AAV。

[0032] 此外，本发明涉及用于治疗光感受器疾病的本发明的AAV。

[0033] 本发明还涉及包含本发明AAV的药物组合物。

[0034] 此外，本发明涉及本发明的AAV用于视网膜细胞核转导的体外用途。

[0035] 此外，本发明涉及一种用于筛选插入序列的方法，所述方法包括

[0036] i)将AAV文库静脉内施用于受试者中，其中每个AAV包含一种插入序列；

[0037] ii)从视网膜细胞核提取物中分离病毒AAV DNA；

[0038] iii)将分离的病毒AAV DNA亚克隆到第二AAV文库中；

[0039] iv)将如步骤iii)中获得的第二AAV文库静脉内施用于受试者中；

[0040] v)从视杆或视锥光感受器中分离病毒AAV DNA；

[0041] vi)确定插入序列的序列，

[0042] 从而获得插入序列。

[0043] 本发明还涉及可通过本发明的筛选方法获得的肽(插入序列)。

[0044] 本发明还涉及包含本发明的AAV的试剂盒。

[0045] 附图显示：

[0046] 图1：来自整个视网膜的肽插入物

[0047] 可以鉴定出在AAV2 VP1的第587位具有列出的肽插入物的、被赋予了在静脉内递送后24小时内靶向视网膜细胞并将它们的基因组转移到视网膜细胞核中的能力的下列新型AAV(仅列出具有2个或更多个NGS读段数的变体，具有20个以上NGS读段数的变体用粗体字母标记)。

[0048] 图2：来自视杆细胞光感受器的肽插入物

[0049] 此外，可以鉴定出在AAV2 VP1的第587位具有列出的肽插入物的、被赋予了在静脉内递送后24小时内靶向视杆细胞光感受器的能力的下列新型AAV(仅列出具有2个或更多个NGS读段数的肽，具有20个以上NGS读段数的变体用粗体字母标记)。

[0050] 图3：来自视锥细胞光感受器的肽插入物

[0051] 最后，可以鉴定出在AAV2 VP1的第587位具有列出的肽插入物的、被赋予了在静脉内递送后24小时内靶向视锥细胞光感受器的能力的下列新型AAV(仅列出具有2个或更多个NGS读段数的肽，具有20个以上NGS读段数的变体用粗体字母标记)。

[0052] 图4：具有RGD、RGS或NGR基序的鉴定的肽插入物。

[0053] 一些鉴定的AAV在它们的插入序列中包含推定的整合素结合基序，如RGD、RGS或NGR。这些插入序列总结于图4中。

[0054] 图5：在一个以上的组织/细胞群体中鉴定的肽插入物。显示了每个实验中NGS读段的数量。在一个以上的实验中检测到几个AAV。在图5中总结了这些重叠的AAV，所述AAV包括具有各自NGS读段数的所示插入序列。

[0055] 图6：代表性的体内共聚焦扫描激光检眼镜检查(cSLO)图像，其显示在单次玻璃体内注射1μl(含约2×10E9载体基因组)包装有新型AAV2变体(肽插入序列在每个图像顶部给出)之一的AAV-sc-CMV-eGFP病毒悬液后2周，10周龄C57-BL6J小鼠的眼底中的eGFP自发荧光。在多种视网膜细胞类型和大面积视网膜中观察到强烈的eGFP自发荧光(灰色)。

[0056] 图7：代表性的共聚焦扫描显微镜图像，其显示在单次玻璃体内注射1μl(含约2×10E9载体基因组)包装有新型AAV2(肽插入序列在每个图像栏的顶部给出)之一的AAV-sc-CMV-eGFP病毒悬液后3周，11周龄C57-BL6J小鼠视网膜横截面中的eGFP荧光。对于变体“NNPTPSR”(参见上图中的概览图像和左下图中的特写图)和“GLSPPTR”(仅在右下图中显示特写图)，在多种视网膜细胞类型和层中以及在视网膜横截面的整个区域中观察到强烈的eGFP荧光(灰色)。特别地，许多光感受器内节(is)和外核层(onl)内的细胞体是eGFP阳性，inl,内核层；gel,神经节细胞层。比例尺在上图中标记100μm，在下图中标记25μm。

[0057] 图8：代表性的共聚焦扫描显微镜图像，其显示在单次视网膜下(上图)或玻璃体内(下图)注射1μl(含约2×10E9载体基因组)包装有新型AAV2(肽插入序列在每个图像栏的顶部给出)之一的AAV-sc-CMV-eGFP病毒悬液后3周，11周龄C57-BL6J小鼠的视网膜横截面中的eGFP荧光。在多种视网膜细胞类型和层中观察到强烈的eGFP荧光(灰色)。特别地，许多光感受器内节(is)和外核层(onl)内的细胞体是eGFP阳性的。视网膜下注射后，在视网膜色素上皮细胞(rpe)中也观察到强烈的eGFP荧光。inl，内核层；gel,神经节细胞层。比例尺标记25pm。

[0058] 图9：(A)代表性的体内共聚焦扫描激光检眼镜检查(cSLO)图像，其显示在单次玻璃体内注射(WPI)1μl(含约2×10E9载体基因组)包装有新型AAV变体(GLSPPTR或NNPTPSR；肽插入序列在每个图像顶部给出)之一的AAV-sc-CMV-eGFP病毒悬液后1、2和3周，2月龄C57-BL6J小鼠的眼底中的eGFP自发荧光。在多种视网膜细胞类型和大面积视网膜中观察到强烈的eGFP自发荧光(灰色)。所有图像都是用相同的激光和探测器设置采集的。(B)代表性的共聚焦扫描显微镜图像，其显示在单次玻璃体内注射(WPI)1μl(含约2×10E9载体基因组)包装有AAV2或新型AAV变体(GLSPPTR或NNPTPSR；肽插入序列在每个图像栏的顶部给出)之一的AAV-sc-CMV-eGFP病毒悬液后3周，在2月龄C57-BL6J小鼠的视网膜横截面中用抗eGFP抗体获得的免疫信号(灰色)。对于新型变体GLSPPTR和NNPTPSR，分别在多种视网膜细胞类型和层中观察到强烈的eGFP免疫信号(灰色)。相反，AAV2导致稀疏细胞的较弱的标记。
所有图像都是用相同的激光和探测器设置采集的。特别地，外核层(onl)内的许多光感受器细胞体是eGFP阳性的。inl，内核层；gcl，神经节细胞层。

[0059] 图10：代表性的共聚焦扫描显微镜概览图像，其显示在单次玻璃体内注射(WPI)1μl(含约2×10E9载体基因组)包装有AAV2或新型AAV变体(GLSPPTR或NNPTPSR；肽插入序列在每个图像栏的顶部给出)之一的AAV-sc-CMV-eGFP病毒悬液后3周，在2月龄C57-BL6J小鼠的视网膜横截面中用抗eGFP抗体获得的免疫信号(上图，灰色)。对于新型变体GLSPPTR和NNPTPSR，分别在多种视网膜细胞类型和层中，以及在整个视网膜横截面中观察到强烈的eGFP免疫信号(灰色)。相反，AAV2导致在视网膜的较小区域中的较弱标记。所有图像都是用相同的激光和探测器设置采集的。相应的Hoechst 33342核细胞染色(灰色)图像显示在每张eGFP图像下方。

[0060] 图11：AAV载体在661w细胞中的转导效率。(A)在用包装有AAV2、7m8或新型AAV变体(GLSPPTR或NNPTPSR；肽插入序列在每个图像栏的顶部给出)之一的MOI 100,000的AAV-sc-CMV-eGFP转导后48小时，来自661w细胞培养物的代表性落射荧光图像。(B)显示用FACS测量的、在未转导的661w细胞培养物和用包装有AAV2、7m8或新型AAV变体(GLSPPTR或NNPTPSR；肽插入序列在每个图像栏的顶部给出)之一的MOI 100,000的AAV-sc-CMV-eGFP转导后48小时的661w细胞培养物中的相对eGFP强度％的图。

[0061] 图12：代表性的共聚焦扫描显微镜图像，其显示在单次玻璃体内注射1μl(含约2×10E9载体基因组)包装有新型AAV 2“GLSPPTR”衣壳的ss-mSWS-eGFP病毒悬液后6周，10周龄C57-BL6J小鼠视网膜横截面上的eGFP的视锥细胞光感受器表达。AAV-ss-mSWS-eGFP在小鼠S视蛋白启动子的控制下驱动eGFP的表达。在视锥细胞光感受器中观察到强烈的抗eGFP免疫信号(灰色)。用视锥细胞标记视锥抑制素(cone arrestin)双重标记的定量显示，78.7±
3.1％(n＝4)的视锥抑制素阳性的视锥细胞为eGFP阳性。OS/IS，外节和内节。ONL，外核层。
INL，内核层。OPL，外丛状层。

[0062] 图13：代表性的共聚焦扫描显微镜图像，其显示在用包装有新型AAV2(肽插入序列在每个图像栏的顶部给出)之一的sc-CMV-eGFP的1×10E11的总vg(病毒基因组)转导后9天，在体外(DIV)在人视网膜外植体中AAV介导的eGFP表达。在多种视网膜细胞类型和层中观察到强烈的天然eGFP荧光(灰色)。特别地，许多光感受器内节(is)和外核层(onl)内的细胞体是eGFP阳性的。IS，内节。ONL，外核层。INL，内核层。ONL，内核层。GCL，神经节细胞层。

[0063] 图14：在单次玻璃体内注射1μl(含约1×10E10总vg)包装有新型AAV2“GLSPPTR”衣壳的ss-mSWS-mCnga3-WPRE(Michalakis et al.(2010)Restoration of Cone Vision in -/-the CNGA3 Mouse Model of Congenital Complete Lack of Cone Photoreceptor 
Function Mol Ther.:2057–2063)后2个月，来自3月龄Cnga3缺陷小鼠的代表性的明视闪烁ERG测量。显示了在3.1log cd sec/m2和指示频率下处理的眼(黑色)和未处理的对照眼(虚线灰色)的迹线。

[0064] 图15：代表性的共聚焦扫描显微镜图像，其显示在单次玻璃体内注射1μl(含约1×10E10总vg)包装有新型AAV2“GLSPPTR”衣壳的ss-mSWS-mCnga3-WPRE(Michalakis et al.(2010)Restoration of Cone Vision in the CNGA3-/-Mouse Model of Congenital Complete Lack of Cone Photoreceptor Function Mol Ther.:2057–2063)后2个月，来自
3月龄Cnga3缺陷小鼠的视网膜横截面上的视锥细胞光感受器表达CNGA3蛋白。在花生凝集素(PNA)阳性视锥细胞光感受器中发现强烈的抗CNGA3免疫信号。os，外节。onl，外核层。
inl，内核层。gcl，神经节细胞层。

[0065] 图16：在单次玻璃体内注射1μl(含约1×10E10总vg)的包装有新型AAV2“NNPTPSR”衣壳的ss-mRho-mCngb1-sv40，(Koch et al.2012)Gene therapy restores vision and delays degeneration in the CNGB1-/-mouse model of retinitis pigmentosa.Hum Mol Genet.:4486–4496)后2个月，来自3月龄Cnga3缺陷小鼠的代表性暗视单闪烁ERG测量。示出了在指示的光刺激亮度下来自处理的眼(黑色)和未处理的对照眼(虚线灰色)的迹线。

[0066] 本发明人已经发现具有新型肽插入物的新型AAV衣壳，其对于所有旨在有效转导视网膜细胞类型(特别是光感受器)的研究非常有价值。此外，这些新型AAV衣壳变体允许从玻璃体内或从系统隔室中跨越天然屏障以转导视网膜细胞类型(尤其是光感受器)。

[0067] 本发明的AAV特别有益，也是特殊选择过程的结果。选择过程包括两轮甚至三轮选择，本发明的AAV必须通过。首先，提供类似于Perabo et al.(2003)“In vitro selection of viral vectors with modified tropism:the adeno-associated virus display.”Molecular Therapy,Vol.8,No.1所述的AAV肽展示文库。特别地，对于质粒pWt.oen的构建，质粒pGFPC-1(Clontech,Palo Alto,CA)中的HCMV启动子/增强子盒和GFP开放阅读框被质粒pUC-AV2的野生型AAV-2基因组编码片段所取代(Girod et al.(1999)“Genetic capsid modifications allow efficient re-targeting of adeno-associated virus type 2.Nat.Med.5:1052–1056)。通过PCR诱变，在氨基酸第587和588位的位置之间插入编码氨基酸AAAstopA和限制性酶切位点NotI和AscI的DNA片段。为了产生AAV质粒文库(文库#1)，单链DNA分子池被合成为5′-TTGGCGCGCCGCVNNVNNVNNVNNVNNVNNVNNGGCGGCCGCTTTTTT 
CCTTGA-3′(底部链；SEQ ID NO.2)，并用HPLC纯化(Metabion GmbH,Martinsried，德国)。为了合成双链分子，使用引物5′-CTCAAGGAAAAAAGC-3′(SEQ ID NO.3)。dsDNA分子被克隆到质粒pWt.oen的NotI–AscI大片段中。

[0068] 使用基因脉冲发生器(Bio-Rad，Hercules，CA)将文库#1电转化到大肠杆菌菌株DH5α中，并纯化扩增的DNA。转化效率由电镀样品等分试样控制。超过20个克隆的DNA通过用引物5′-ATGTCCGTCCGTGTGTGG-3′(SEQ ID No.4)测序来控制。筛选的序列没有显示同源性，表明插入序列完全随机化。

[0069] 为了生产病毒，用37.5μg的DNA共转染15个150mm培养皿的处于80％融合的HEK293细胞。为了生产AAV文库，文库#1和质粒pXX6(从J.Samulski,Chapel Hill,NC；Xiao,Li and Samulski(1998)“Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.”J.Virol.72:2224–2232获得)在HEK293细胞中以1∶1的摩尔比共转染。48小时后，收集细胞并通过离心沉淀。将细胞重悬于150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH8.5)中，冷冻-解冻数次，并在37℃下用Benzonase(50U/ml)处理30min。通过离心去除细胞碎片，将上清液加载到碘克沙醇梯度上，并在18℃下69,
000rpm处理1h，如(Zolotukhin et al.(1999)“Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.Gene Ther.6:973–985)所述。然后从40％碘克沙醇相中收获病毒粒子(virion)，并用rep探针通过DNA点杂交滴定(Girod et al.(1999)“Genetic capsid modifications allow 
efficient re-targeting of adeno-associated virus type 2.Nat.Med.5:1052–1056)。
这个过程产生了文库#1。

[0070] 如上所述，将AAV肽展示文库包装在HEK293细胞中，随后偶联基因型和表型(如PCT/EP2008/004366中所述)。后者是确保基因组编码展示在衣壳上的肽所必需的。此外，AAV文库中，通过插入的肽序列，与HSPG结合的突变体已被耗尽，以最大限度地减少携带HSPG二级高亲和力结合位点的AAV的存在(Sallach et al.(2014)“Tropism-modified AAV vectors overcome barriers to successful cutaneous therapy.Mol.Ther.22:929-39)。

[0071] 在第一轮选择中，活的成年C57BL/6J小鼠接受了100μl的单次尾静脉注射，其中包含AAV肽展示文库#1的大约8x10^10总载体基因组(vg)。24小时后，通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并通过将Dumont#7弯头镊子(Fine Science Tools,Heidelberg)放置在靠近视神经的后部周围并施加温和的压力使眼睛脱垂。用锋利的刀片沿眼球赤道切开角膜。随后，通过轻轻向上拉动镊子，将视网膜从视网膜色素上皮(RPE)分离，并与晶状体和玻璃体一起从剩余的眼组织移除。在冰冷的0.1M磷酸盐缓冲液(PB)中冲洗组织并用镊子去除晶状体和任何剩余的视网膜色素上皮细胞后，将每只小鼠的两个视网膜汇集并转移到Eppendorf管中，在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃以供进一步使用。使用Subcellular Protein Fractionation Kit for Tissues(Thermo Fischer Scientific,#87790)从整个视网膜中分离细胞核(以确保仅分析细胞核DNA)。使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen,#69504)分离核DNA，并使用针对AAV文库DNA的特异性分析，通过使用Roche454测序系统进行测序来进一步分析AAV基因组的出现。随后，通过使用引物5'-GTATCTACCAACCTCCAGAGAG-3'(SEQ ID NO.5)和5'-GTGTTGACATCTGCGGTAGC-3'(SEQ ID NO.6)进行PCR，扩增插入位点周围的病毒DNA，并通过NotI–AscI位点克隆到质粒pWt.oen中，从而产生质粒池。

[0072] 为了生产AAV文库#2，用37.5μg的、从第一轮选择中获得的质粒DNA池和质粒pXX6，以1∶1的摩尔比共转染15个150mm培养皿的处于80％融合的293细胞。48小时后，收集细胞并通过离心沉淀。将细胞重悬于150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH8.5)中，冷冻-解冻数次，并在37℃下用Benzonase(50U/ml)处理30分钟。通过离心去除细胞碎片，将上清液加载到碘克沙醇梯度上，并在18℃下以69,000rpm处理1小时，如(Zolotukhin  et  al.(1999)
“Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.Gene Ther.6:973–985)所述。然后从40％碘克沙醇相中收获病毒粒子，并用rep或gfp探针通过DNA点杂交滴定(Girod et al.(1999)“Genetic capsid modifications allow efficient re-targeting of adeno-associated virus type 2.Nat.Med.5:1052–1056)。这个过程产生了文库#2。

[0073] 文库#2被表型-基因型偶联(如PCT/EP2008/004366中所述)、滴定并用于新一轮体内选择。特别地，成年的活的C57BL/6J小鼠接受了50μl的单次尾静脉注射，其中包含大约5x 10^11总vg。第2轮选择的后续步骤如第1轮选择所述进行，从而产生用于产生文库#3的新质粒池。

[0074] 为了生产AAV文库#3，用37.5μg的、从第一轮选择中获得的质粒DNA池和质粒pXX6，以1∶1的摩尔比共转染15个150mm培养皿的处于80％融合的293细胞。48小时后，收集细胞并通过离心沉淀。将细胞重悬于150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH8.5)中，冷冻-解冻数次，并在37℃下用Benzonase(50U/ml)处理30分钟。通过离心去除细胞碎片，将上清液加载到碘克沙醇梯度上，并在18℃下以69,000rpm处理1小时，如(Zolotukhin  et  al.(1999)
“Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.Gene Ther.6:973–985)所述。然后从40％碘克沙醇相中收获病毒粒子，并用rep或gfp探针通过DNA点杂交滴定(Girod et al.(1999)“Genetic capsid modifications allow efficient re-targeting of adeno-associated virus type 2.Nat.Med.5:1052–1056)。这个过程产生了文库#3。

[0075] 在第3a轮选择中，活的成年C57BL/6J小鼠接受了100μl的单次尾静脉注射，其中含有AAV肽展示文库#3的大约5×10^11的总vg。24小时后，按照第1轮和第2轮选择中描述的程序分离视网膜，除了合并的视网膜没有冷冻，而是立即进行处理以分离视杆细胞光感受器。特别地，按照(Feodorova et al.(2015)“Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.”MethodsX  2:39-46)中所述进行木瓜蛋白酶解离，并根据(Eberle  et al.(2014)
“Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.”J Vis Exp 84:e50932)通过基于抗CD73的MACS分选来分离视杆细胞。使用Subcellular Protein Fractionation Kit for Tissues(Thermo Fischer Scientific,#87790)，从经MACS分选的视杆细胞中分离视杆细胞核(以确保仅分析核DNA)。使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen,#69504)分离细胞核DNA。使用Roche 
454测序系统进行测序，以确定插入的肽序列最主要出现在视杆细胞中。

[0076] 在第3b轮选择中，在视锥细胞光感受器中表达增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的活的成年RG-eGFP小鼠(Fei et al.(2003)“Development of the cone photoreceptor mosaic in the mouse retina revealed by fluorescent cones in transgenic mice.”Mol Vision 9:31-42)接受了100μl的单次尾静脉注射，其中含有AAV肽展示文库#3的大约5×10^11的总vg。24小时后，按照第1轮和第2轮选择中描述的程序分离视网膜，除了合并的视网膜没有冷冻，而是立即进行处理以分离视锥细胞光感受器。特别地，按照(Feodorova et al.(2015)“Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.”MethodsX 2:39-46)中所述进行木瓜蛋白酶解离，并根据(Becirovic et al.(2016)In  Vivo Analysis of Disease-Associated Point Mutations Unveils Profound Differences in mRNA Splicing of Peripherin-2in Rod and Cone Photoreceptors.”PLOS Genetics 12(1):e1005811)对视锥细胞进行FACS分选(eGFP标记)。使用Subcellular Protein Fractionation Kit for Tissues(Thermo Fischer Scientific,#87790)从FACS分选的视锥细胞中分离视锥细胞核(以确保只分析细胞核DNA)。使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen,#69504)分离细胞核DNA。使用Roche 454测序系统进行测序，以确定插入的肽序列最主要出现在视锥细胞中。

[0077] 为了产生用于生产具有新衣壳变体的AAV载体的新辅助质粒，合成了编码顶部(5'-CGCGGCCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCCG-3')(SEQ ID NO.7)链和底部(5'-CGCGCGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGCGGC-3')(SEQ ID NO.8)链的合成单链DNA寡核苷酸，所述链编码在前面的选择轮中获得的选择的插入序列，所述链两侧各有2-3个丙氨酸(Eurofins Genomics GmbH,Ebersberg,德国)，所述链杂交形成双链DNA寡核苷酸，其侧翼具有悬垂物(overhang)，Mlul–Ascl限制性酶切位点，退火并连接到AAV反式质粒pRC99的Mlul–Ascl限制性酶切位点(Nickiin et al.(2001)“Efficient and selective AAV2-mediated gene transfer directed to human vascular endothelial cells”Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 4,174-181and Girod et al.(1999)“Genetic capsid modifications allow efficient re-targeting of adeno-associated virus type 2”Nature medicine 5,1052-1056)，所述质粒表达AAV2 Rep和Cap基因，导致产生AAV2 VP1-3开放阅读框，在对应于VP1的第587位氨基酸的位置处具有预期的肽插入物。所述序列的插入物破坏了Mlul/Ascl位点，并产生了一个新的EagI位点，这可用于筛选正确的克隆。所得质粒的正确序列通过使用引物5′-CTTTGGGAAGCAAGGCTCAG-3′(SEQ ID NO.9)的标准测序得到验证。

[0078] 这些修饰的pRC99质粒被用于生产AAV颗粒，所述AAV颗粒具有用于生物测试所需的新AAV衣壳修饰。AAV的生产是通过描述于以下的标准技术进行的：(Michalakis et al.(2010)“Restoration of cone vision in the CNGA3-/-mouse model of congenital complete lack of cone photoreceptor function,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 18,2057-2063and Becirovic et al.(2016)“AAV Vectors for FRET-Based Analysis of Protein-Protein Interactions in Photoreceptor Outer Segments.”Front Neurosci 10:356)。一种含有CMV-eGFP表达盒(AAV-sc-CMV-eGFP)的自互补(sc)AAV顺式质粒(Hacker et al.(2005)“Adeno-associated virus serotypes 1to 5mediated tumor cell directed gene transfer and improvement of transduction efficiency.”J Gene Med 7(11):1429-38)被用作顺式质粒。

[0079] 为了生产衣壳修饰的AAV变体，用37.5μg的每种修饰的pRC99质粒、质粒pXX6和质粒AAV-sc-CMV-eGFP，以1∶1的摩尔比共转染15个150mm的培养皿的处于80％融合的293细胞。48小时后，收集细胞并通过离心沉淀。将细胞重悬于150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH8.5)中，冷冻-解冻数次，并在37℃下用Benzonase(50U/ml)处理30分钟。通过离心去除细胞碎片，将上清液加载到碘克沙醇梯度上，并在18℃下以69，000rpm处理1小时，如(Zolotukhin et al.(1999)“Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.Gene Ther.6:973–985)所述。然后从40％碘克沙醇相中收获病毒粒子，使用Amicon Ultra-4离心过滤器单元(100kDa(Millipore))将病毒粒子重新缓冲到磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并使用ITR特异性引物通过qPCR(LightCycler System，Roche Diagnostics，Mannheim，德国)测定基因组颗粒滴度(D’Costa et al.(2016)“Practical utilization of recombinant AAV vector reference standards:focus on vector genomes titration by free ITR qPCR.”Mol Ther Methods Clin Dev.5:16019)。

[0080] 以这种方式，获得了用于产生具有高视网膜光感受器转导效率的AAV衣壳变体载体的AAV辅助质粒。静脉注射后24小时，靶细胞(如视锥细胞光感受器)中存在编码修饰的AAV衣壳的特定基因组表明，这些特定衣壳修饰能够克服以下生物学障碍：

[0081] 1.逃避宿主免疫系统

[0082] 2.逃避系统清除

[0083] 3.血管内皮细胞屏障和视网膜-血屏障(RBB)

[0084] 4.在视网膜内：从视网膜血管逃逸并扩散到视网膜组织中

[0085] 5.如果假设从脉络膜血管进入：通过Bruch’s膜、视网膜色素上皮细胞屏障和光感受器细胞外基质以及可能的外界膜转移，最终进入光感受器细胞。

[0086] 如果进入路径是光感受器外节，则连接纤毛也必须被克服

[0087] 6.如果假设从玻璃体血管进入：通过内界膜、神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层转移，最终进入光感受器的突触末梢

[0088] 7.在进入细胞后，AAV颗粒必须穿过内溶酶体囊泡系统进行运输并逃逸，脱衣壳并穿过核膜使其基因组穿梭到细胞核中

[0089] 8.因此，在靶细胞的细胞核筛选中对特定AAV基因组的检测表明，必须成功克服所有这些障碍。

[0090] 此外，肝素结合的文库已经耗尽。这是特别重要的，因为已经假定视网膜细胞和光感受器的转导通常特别需要肝素结合。与标准AAV和先前生成的AAV相比，新型AAV通过使用专门为其选择的肝素结合耗竭文库，最有可能使用不同的细胞进入和运输机制。

[0091] 如上所述，新型衣壳对于所有旨在有效转导视网膜细胞的应用都具有很大价值。这可以是在活的动物中或在外植体组织培养中或细胞培养中。此外，这可以用于基础研究或临床应用(如眼部基因治疗)。此外，所述应用不限于基因表达，还可以包括使用siRNA(shRNA)技术的基因敲除或使用例如核酸酶(如锌指、TALEN或CAS9/CRISPR系统)的基因编辑。最后，新型AAV也可用作其它分子(包括但不限于DNA、RNA、肽、蛋白质、化学化合物)的货运系统(cargo system)。

[0092] 本发明涉及一种腺相关病毒(AAV)，所述AAV包含在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物；其中插入序列从N-末端到C-末端具有式I:

[0093] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0094] 其中X5选自P(Pro)、L(Leu)和V(Val)；

[0095] 其中X7为R(Arg)；

[0096] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0097] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，

[0098] 或

[0099] 其中X5选自S(Ser)和T(Thr)；

[0100] 其中X7为S(Ser)；

[0101] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0102] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，

[0103] 或

[0104] 其中X5选自A(Ala)和Q(Gln)；

[0105] 其中X7为A(Ala)；

[0106] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0107] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，

[0108] 其中当将AAV静脉内施用于C57-Bl6J小鼠的尾静脉中时，在24小时后，病毒AAV DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中，并且

[0109] 其中当将AAV静脉内施用于C57-Bl6J小鼠的尾静脉中以进行视杆细胞分选，以及施用于RG-eGFP小鼠品系R685933的尾静脉中以进行视锥细胞分选时，施用后24小时，病毒AAV DNA存在于使用抗CD73包被的磁珠进行的MAC分选的视杆细胞和/或经FACS分选的视锥细胞中，其中所述视锥细胞表达eGFP，并基于其eGFP表达而被进行FACS分选。

[0110] 如本文所使用的腺相关病毒(AAV)可用于指任何AAV病毒本身或其部分，例如病毒衣壳、病毒基因组等。术语“AAV”还包括所有亚型，包括天然存在的和重组的形式，及其变体。

[0111] AAV的非限制性实例包括AAV1型(AAV-1)、AAV2型(AAV-2)、AAV3型(AAV-3)、AAV3B型(AAV-3B)、AAV4型(AAV-4)、AAV5型(AAV-5)、AAV6型(AAV-6)、AAV7型(AAV-7)、AAV8型(AAV-8)、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、rh10、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和绵羊AAV。“灵长类AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类AAV”是指感染非灵长类动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV等。

[0112] 特别地，本文所述的实验是用修饰的AAV2衣壳进行的。然而，其他AAV衣壳(来自本文所述的其他AAV)也耐受在相应衣壳位置的肽插入物(Michelfelder et al.(2011)“Peptide ligands incorporated into the threefold spike capsid domain to re-direct gene transduction of AAV8 and AAV9 in vivo”PloS one 6,e23101)。

[0113] 因此，肽插入物(如本文所述的插入序列)可以转移到其它已知的AAV衣壳，例如转移到本文所述的任何AAV的任何衣壳，或者例如转移到AAV8、AAV9、AAV7或AAV5。与AAV2相比，这些AAV在视网膜中可以具有更高的效率和更宽的转导谱。

[0114] 此外，AAV衣壳肽插入物可以与衣壳酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸突变结合(Petrs-Silva et al.(2009)“High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors”Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 17,463-471and Zhong et al.(2008)“Next 
generation of adeno-associated virus 2vectors:point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses”Proceedings of the 
National Academy of Sciences of the United States of America,105,7827-7832)以减少蛋白酶体介导的降解并提高转导效率。

[0115] 所述AAV可以是AAV2。

[0116] 此外，所述AAV可以是天然存在的(野生型AAV)、变体或重组AAV。“天然存在的”或“野生型”AAV是指包含病毒蛋白的任何腺相关病毒或其衍生物，例如由天然存在的病毒(衣壳)蛋白组成的病毒衣壳。因此，本发明的AAV可以是天然存在的AAV，其仅包含如本文所述的存在于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的插入序列。

[0117] “AAV变体”或“变体AAV”是指包括AAV病毒颗粒，所述AAV病毒颗粒包含AAV蛋白的变体或突变体(例如突变的AAV蛋白)。变体AAV蛋白的实例包括相对于相应的亲本AAV蛋白(即衍生其的AAV蛋白)、野生型AAV蛋白等包含至少一个氨基酸差异(例如，氨基酸置换、氨基酸插入、氨基酸缺失)的AAV蛋白，其中变体AAV蛋白不由天然存在的AAV蛋白中存在的氨基酸序列组成。例如，除了本发明的插入序列之外，这种变体AAV可以包括衣壳蛋白VP3中的突变。

[0118] 除了在结构上(即在序列水平上)与相应的亲本AAV不同外，AAV变体可能在功能上也与相应的亲本AAV不同。换句话说，包含相对于相应亲本AAV衣壳蛋白的至少一个氨基酸差异的变体衣壳蛋白可以赋予相应亲本AAV不具有的AAV变体功能特征。例如，AAV变体可以具有不同的细胞嗜性，即不同的对特定类型细胞的亲和力和/或感染特定类型细胞的能力，例如，AAV变体可以以比亲本AAV增高(或降低)的亲和力结合到细胞(例如视网膜细胞)，和/或以比亲本AAV增高(或降低)的效率感染/转导细胞(例如视网膜细胞)，使得用相同滴度的病毒颗粒，细胞群中更多(或更少)的细胞被转导/感染。作为第二个例子，AAV变体可以对宿主动物产生的抗体具有更强(或更弱)的亲和力，例如，AAV变体可以以更强(或更弱)的亲和力结合中和抗体，并在更大(或更小)的程度上从宿主组织中被清除。因此，本发明的AAV可以是突变(变体)AAV，其包含如本文所述的在对应于SEQ ID NO:1第587和588位的位置之间的插入序列。

[0119] “重组AAV”或“rAAV”是指包括在其病毒基因组中包含异源多核苷酸序列的任何AAV。通常，异源多核苷酸侧翼至少有一个，通常有两个天然存在的或变体AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体包括rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒。本文所述的病毒载体也是rAAV。因此，例如，包含异源多核苷酸序列的rAAV将是包含通常不包含在天然存在的野生型AAV中的核酸序列例如转基因(例如，非AAV RNA编码多核苷酸序列、非AAV蛋白编码多核苷酸序列)、非AAV启动子序列、非AAV多腺苷酸化序列等的rAAV。

[0120] 这种重组AAV载体是本领域的公知常识，因此技术人员也知道如何构建这种重组AAV。

[0121] “rAAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含一个或多个异源核酸序列的AAV基因组(即vDNA)。rAAV载体可以通常只需要末端重复(TR)存在就能产生病毒。所有其他的病毒序列都被认为是可有可无的，并且可以以反式提供(Muzyczka,(1992)Curr  Topics Microbiol.Immunol.158:97)。通常，rAAV载体基因组仅保留一个或多个TR序列，以便最大化可被载体/衣壳有效包装的转基因的大小。结构性和非结构性蛋白质编码序列可以以反式提供(例如，来自载体，例如质粒，或者通过将序列稳定整合到包装细胞中)。在本发明的实施方案中，rAAV载体基因组包括至少一个TR序列(例如，AAV TR序列)，任选地两个TR(例如，两个AAV TR)，所述两个TR通常位于载体基因组的5’和3’末端，并位于异源核酸的侧翼，但不需要与其相邻。所述TR彼此间可以相同也可以不同。

[0122] 术语“末端重复”或“TR”包括形成发夹结构并起到反向末端重复的作用(即介导所需的功能，如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等)的任何病毒末端重复或合成序列。所述TR可以是AAV TR或非AAV TR。例如，非AAV TR序列如其它细小病毒(如犬细小病毒(CPV)、小鼠细小病毒(MVM)、人细小病毒B-19)的那些或任何其它合适的病毒序列(如作为SV40复制起点的SV40发夹)可用作TR，其可通过截短、取代、缺失、插入和/或添加而被进一步修饰。此外，TR可以是部分或完全合成的，例如在Samulski等人的美国专利No.5,478,745中描述的“双D序列”。

[0123] “AAV末端重复”或“AAV TR”可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13或任何其它现在已知或以后发现的AAV。只要末端重复介导所需的功能(例如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等)，AAV末端重复不需要具有天然末端重复序列(例如，天然AAV TR序列可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变而被改变)。本发明的病毒载体还可以是“靶向”病毒载体(例如，具有定向嗜性)和/或如国际专利公开WO 
00/28004和Chao et al.,(2000)Molecular Therapy 2:619中所描述的“杂合”细小病毒(即，其中病毒TR和病毒衣壳来自不同的细小病毒)。

[0124] 术语“重组AAV”还包括例如仅包含AAV衣壳、并且在衣壳内携带非核酸货物(例如蛋白质、多肽或作为其基因组的补充或替代的另一种分子)的AAV。例如，衣壳可包含与AAV相关基因组异源的核酸。还预期，衣壳携带异源核酸(不是AAV核酸)。如何产生这种重组AAV被描述于例如US9610354B2或WO1996000587A1中。

[0125] 本文所用的衣壳蛋白是指AAV衣壳蛋白。代表性地，AAV衣壳由60个衣壳蛋白亚单位VP1、VP2和VP3组成，它们通常以1∶1∶10或1∶1∶20的比例按二十面体对称性排列。据报道，VP2和VP3对于正确的病毒颗粒组装是至关重要的。然而，最近的研究表明，VP2对于完整的病毒颗粒形成和有效的感染不是必要的，并且还表明VP2可以耐受在其N末端的大插入物，而VP1不能(可能是因为PLA2结构域的存在)。值得注意的是，VP1的N末端被隔离在成熟衣壳内。它可以包含磷脂酶A2样区域和推定的核定位信号。因此，所述衣壳蛋白可包含本发明的VP1衣壳蛋白以及AAV VP2和/或VP3衣壳蛋白中的一种或两种。

[0126] VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的序列是本领域技术人员已知的。还预期了VP1、VP2和VP3中任一种的变体，只要它们仍然能够组装衣壳(也参见本文所示的总结了一些序列的表1)。分析是否组装了衣壳的方法也是本领域技术人员已知的，例如在Sonntag et al.(2011)“The Assembly-Activating Protein Promotes Capsid Assembly of Different Adeno-Associated Virus Serotypes”J Virol.85(23):12686–12697中所描述的。

[0127] 本发明衣壳蛋白的“变体”包括含有突变的衣壳蛋白。所述突变可以存在于任何衣壳序列中。例如，所述突变可以存在于表1所示的任何一个序列中，只要它产生突变的衣壳蛋白。这种突变可以包括一个或多个点突变，例如1、2、5、10、15、20、50或更多个点突变。变体也可以包括插入(在DNA/RNA中添加一个或多个核苷酸，或在特定衣壳蛋白如VP1、VP2和/或VP3中添加一个或多个氨基酸)，如1、2、3、5、6或更多个插入。点突变和插入都可以根据本领域已知的一般规则来选择，这与例如SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比，对氨基酸序列的活性没有影响。

[0128] 变体还可以包括核酸碱基或氨基酸的缺失，从而导致衣壳蛋白的氨基酸数量减少。因此，与其野生型序列(例如表1所示的任何序列的)相比，多肽可包含1、2、3、4、5、10、20、30或更多个氨基酸残基的缺失。与表1所示的核酸分子相比，还包括超过1、2、3、4、10、
20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300或更多个核酸碱基的缺失。然而，变体仍然可以具有与表1中所示的任何多肽或核酸分子相同的功能性质。

[0129] 鉴于本发明涵盖本文所述衣壳蛋白(多肽、核酸分子)的变体，本发明还包括与表1中所示的任何多肽/核酸分子具有80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的衣壳核酸序列或多肽序列。

[0130] 因此，携带多肽、蛋白质或分子的重组AAV可以包含VP1、VP3和/或VP2衣壳蛋白作为所述载体中存在的唯一AAV蛋白。

[0131] 因此，本发明的AAV可以是包含如本文所述的插入序列的重组AAV，所述插入序列在对应于SEQ ID NO：1的第587位和588位位置之间。

[0132] 还预期，所述AAV包含或具有与天然存在的AAV1型(AAV-1)、AAV2型(AAV-2)、AAV3型(AAV-3)、AAV3B、AAV4型(AAV-4)、AAV5型(AAV-5)、AAV6型(AAV-6)、AAV7型(AAV-7)、AAV8型(AAV-8)、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和绵羊AAV具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的序列。还预期，所述AAV与表1中引用的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。

[0133] 术语“多肽”当在本文中使用时，意指肽、蛋白质或多肽，它们可以互换使用，并且包含给定长度的氨基酸链，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。所述多肽可包含20种基因编码氨基酸中的氨基酸。这些是本领域技术人员已知的。还包括20种基因编码氨基酸以外的氨基酸，即非天然氨基酸。这种非天然氨基酸的例子包括D-氨基酸、同型氨基酸、N-甲基氨基酸、α-甲基氨基酸、β(同型)氨基酸、γ-氨基酸、螺旋/转角稳定基序、骨架修饰(例如类肽)。还预期了在自然界中发现的不寻常的氨基酸，它们是技术人员已知的。例子包括硒代半胱氨酸、羟脯氨酸(Hyp)、β-丙氨酸、瓜氨酸(Cit)、鸟氨酸(Orn)、正亮氨酸(Nle)、3-硝基酪氨酸、硝基精氨酸、焦谷氨酸(Pyr)。因此，术语多肽也可以包括这样的氨基酸序列，其包含除了20种基因编码氨基酸中所示的氨基酸之外的氨基酸。它可以例如包含一种或多种在自然界中发现的不寻常氨基酸和/或一种或多种非天然氨基酸。

[0134] 术语多肽还指但不排除多肽的修饰。这种修饰是本领域技术人员已知的，并且例如在WO 2010/093784中列出。

[0135] 关于术语“核酸分子”，当在本文中使用时，其涵盖具有碱基的核苷酸序列的任何核酸分子，所述碱基包括所述核酸分子所包含的嘌呤和嘧啶碱基，其中所述碱基代表核酸分子的初级结构。核酸序列可包括DNA、cDNA、基因组DNA、RNA，既包括正义链也包括反义链。本发明的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA，或经修饰的RNA或DNA。

[0136] 可以对DNA和RNA进行各种各样的修饰；因此，术语“核酸分子”可以包括化学、酶学或代谢修饰的形式。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和不寻常碱基(如肌苷)。

[0137] 根据本发明，在两个或更多个核酸分子或氨基酸序列的上下文中，术语“相同”或“百分比同一性”是指当在比较窗口或指定区域进行比较和比对以获得最大一致性时(如使用本领域已知的序列比较算法，或者通过手动比对和视觉检查所测量的)，两个或更多个序列或亚序列是相同的，或者具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，至少95％、96％、97％、98％或99％同一性)。具有例如80％至95％或更高序列同一性的序列被认为是基本上相同的。这样的定义也适用于测试序列的互补序列。本领域技术人员将知道如何使用本领域已知的算法例如基于CLUSTALW计算机程序(Thompson Nucl.Acids Res.2(1994),
4673-4680)或FASTDB(Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990),237-245)，来确定序列之间的百分比同一性。

[0138] 本领域技术人员还可以使用BLAST和BLAST 2.0算法(Altschul Nucl.Acids Res.25(1977),3389-3402)。用于核酸序列的BLASTN程序默认使用的字长(W)为28，预期阈值(E)为10，匹配/错配分数1、-2，线性空位罚分和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用的字长(W)为6，预期阈值(E)为10，空位罚分为存在:11，延展:1。此外，可以使用BLOSUM62评分矩阵(Henikoff Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89,(1989),10915)。

[0139] 例如，BLAST2.0，其代表Basic Local Alignment Search Tool(Altschul,Nucl.Acids Res.25(1997),3389-3402；Altschul,J.Mol.Evol.36(1993),290-300；
Altschul,J.Mol.Biol.215(1990),403-410)，可用于搜索局部序列比对。

[0140] 如本文所述的AAV在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间具有至少6-8个氨基酸的插入物。插入序列可以具有6个氨基酸。插入序列也可以具有7个氨基酸。插入序列可以具有8个氨基酸。因此，还预期了包含本文所述的插入序列的AAV，其中X1A不存在且X1B存在，或其中X1B不存在且X1A存在。

[0141] 插入序列从N-末端到C-末端具有式I:X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7(式I)。在该式中，X5可以选自P(Pro)、L(Leu)和V(Val)；其中X7可以是R(Arg)；X1A、X1B、X2、X3、X4、X6可以独立地是任何氨基酸；并且X1A和/或X1B可以独立地任选地不存在或存在，其中当将AAV静脉内施用于C57-Bl6J小鼠的尾静脉中时，24小时后，任选地，病毒AAV DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中。

[0142] 因此，本发明还涉及腺相关病毒(AAV)，所述AAV包含在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物(插入序列)；其中所述插入序列从N-末端到C-末端具有式I：

[0143] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0144] 其中X5选自P(Pro)、L(Leu)和V(Val)；

[0145] 其中X7为R(Arg)；

[0146] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0147] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，其中当将AAV静脉内施用于C57-BL6J小鼠的尾静脉中时，在24小时后，任选地，病毒AAV DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中。

[0148] 类似地，本发明涉及腺相关病毒(AAV)VP1衣壳蛋白，所述AAV VP1衣壳蛋白包括在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物(插入序列)，其中所述插入序列从N-末端到C-末端具有式I：

[0149] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0150] 其中X5选自P(Pro)、L(Leu)和V(Val)；

[0151] 其中X7为R(Arg)；

[0152] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0153] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，

[0154] 特别地，在AAV或AAV VP1衣壳蛋白中，X5可以是P(Pro)。可选地，X5可以是L(Leu)。可选地，X5可以是V(val)。另外地或可选地，X1A和/或X1B可以选自G、S、N、V和P，优选地，X1A和/或X1B是N。另外地或可选地，X2可以选自L、S和N，优选地，X2可以是S。另外地或可选地，X3可以选自S、P、T、Q。X3也可以选自S和P。另外地或可选地，X4可以选自P、G、S、A和T，优选地，X4可以是S。另外地或可选地，X6可以选自T、P、N、Q和S，优选地，X6可以是P。因此，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白可以包含如本文所述的插入序列GLSPPTR(SEQ ID NO.10)、SSPGLPR(SEQ ID NO.11)、NSTSVNR(SEQ ID NO.12)、VSSSLQR(SEQ ID NO.13)、PNQAPPR(SEQ ID NO.14)或NNPTPSR(SEQ ID NO:15)。

[0155] 可选地，在式I中，X5可以选自S(Ser)和T(Thr)；X7可以是S(Ser)；X1A、X1B、X2、X3、X4、X6可以独立地是任何氨基酸；X1A和/或X1B可以独立地任选地不存在或存在。

[0156] 因此，本发明还涉及腺相关病毒(AAV)，所述AAV包含在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物；其中插入序列从N-末端到C-末端具有式I:

[0157] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0158] 其中X5选自S(Ser)和T(Thr)；

[0159] 其中X7为S(Ser)；

[0160] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0161] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，其中当将AAV静脉内施用于C57-BL6J小鼠的尾静脉中时，在24小时后，任选地，病毒AAV DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中。

[0162] 类似地，本发明还涉及腺相关病毒(AAV)VP1衣壳蛋白，所述AAV VP1衣壳蛋白包含[0163] 在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物；其中插入序列从N-末端到C-末端具有式I:

[0164] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0165] 其中X5选自S(Ser)和T(Thr)；

[0166] 其中X7为S(Ser)；

[0167] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0168] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在。

[0169] 特别地，在AAV或AAV VP1衣壳蛋白中，X5可以是S(Ser)。可选地，X5可以是T(Thr)。另外地或可选地，X1A和/或X1B可以选自G、R、H和S。另外地或可选地，X2可以选自A、S和Q，优选地，X2可以是A。另外地或可选地，X3可以选自H、N和A，优选地，X3可以是N。另外地或可选地，X4可以选自R、Q和D，优选地，X4可以是R。另外地或可选地，X6可以选自R、S和D，优选地，X6可以是D。

[0170] 因此，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白也可以包含插入序列GAHRSDS(SEQ ID NO.16)、RANQTSS(SEQ ID NO.17)、HSARTDS(SEQ ID NO.18)或SQNDSRS(SEQ ID NO.19)。

[0171] 可选地，在式I中，X5可以选自A(Ala)和Q(Gln)；X7可以是A(Ala)；X1A、X1B、X2、X3、X4、X6可以独立地是任何氨基酸；以及X1A和/或X1B可以独立地任选地不存在或存在。

[0172] 因此，本发明还涉及腺相关病毒(AAV)，所述AAV包含

[0173] 在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物；其中插入序列从N-末端到C-末端具有式I:

[0174] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0175] 其中X5选自A(Ala)和Q(Gln)；

[0176] 其中X7为A(Ala)；

[0177] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0178] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，其中当将AAV静脉内施用于C57-BL6J小鼠的尾静脉中时，在24小时后，任选地，病毒AAV DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中。

[0179] 类似地，本发明还涉及腺相关病毒(AAV)VP1衣壳蛋白，所述AAV VP1衣壳蛋白包含[0180] 在对应于SEQ ID NO：1的第587和第588位之间的至少6-8个氨基酸的插

[0181] 入物；其中插入序列从N-末端到C-末端具有式I:

[0182] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0183] 其中X5选自A(Ala)和Q(Gln)；

[0184] 其中X7为A(Ala)；

[0185] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0186] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在。

[0187] 特别地，在AAV或AAV VP1衣壳蛋白中，X5可以是A(Ala)。可选地，X5可以是Q(Gln)。另外地或可选地，X1A和/或X1B可以选自N和R。另外或可选地，X2可以选自S和G。另外地或可选地，X3可以选自R和S。另外地或可选地，X4可以选自P和L。另外地或可选地，X6可以选自A和N。

[0188] 因此，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白还可包含插入序列NSRPAAA(SEQ ID NO.20)或RGSLQNA(SEQ ID NO.21)。

[0189] 至少6-8个氨基酸的插入物在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间。当根据本发明使用时，术语“位置”是指SEQ ID NO.1的氨基酸序列中任一氨基酸的位置。值得注意的是，SEQ ID NO.1对应于AAV2衣壳的VP1蛋白。

[0190] 本文使用的术语“对应”还包括位置不仅由在前核苷酸/氨基酸的数目确定。根据本发明，可以被取代的给定核苷酸的位置可以由于(突变型、重组型或野生型)AAV衣壳蛋白VP1中其它地方缺失或添加核苷酸而变化，包括启动子和/或任何其它调节序列或基因(包括外显子和内含子)。类似地，根据本发明，可以被取代的给定氨基酸的位置可以由于在(突变型或野生型)AAV衣壳蛋白VP1的其它地方缺失或添加氨基酸而变化。

[0191] 因此，在根据本发明的“对应位置”下，优选理解的是，氨基酸可以在指示的数字位置上不同，但是仍然可以具有相似的相邻核苷酸/氨基酸。所述可以被替换、缺失或添加的氨基酸也包含在术语“对应位置”中。具体地，当将参考序列(主题序列)SEQ ID NO:1与目的氨基酸序列(查询序列)进行比对时，技术人员可以例如在寻找本文规定的氨基酸位置(即，对应于SEQ ID No:1中所示氨基酸序列的第587和588位)时检查目的序列的基序GNRQ(SEQ ID NO:1的第586-589位；SEQ ID NO:22)。

[0192] 为了确定给定(突变型或野生型)氨基酸序列中的氨基酸残基是否对应于SEQ ID NO:1氨基酸序列中的某个位置，本领域技术人员可以使用本领域公知的手段和方法，例如，手动地或通过使用如BLAST2.0(其代表Basic Local Alignment Search Tool)或ClustalW的计算机程序或任何其他适合于产生序列比对的程序，进行比对。

[0193] 还预期，插入序列的侧翼是在插入序列的一端或两端的一个或多个柔性氨基酸。柔性氨基酸允许相邻的蛋白结构域相对于彼此自由移动。任何柔性氨基酸都包含在表述柔性氨基酸中。本领域技术人员知道哪些氨基酸是柔性的，哪些是不太柔性的。

[0194] 如本文所用的“柔性氨基酸”可以选自A(Ala)、L(Leu)、G(Gly)、S(Ser)和T(Thr)。所述柔性氨基酸还可以选自G(Gly)、S(Ser)和A(Ala)。柔性氨基酸也可以是Ala。

[0195] 插入序列可以在一端或两端侧接任意数量的柔性氨基酸。例如，插入序列可以在一端或两端侧接1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个柔性氨基酸。

[0196] 还包括本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白，其中插入序列从N-末端至C-末端具有式II：

[0197] L3-L2-L1-X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7-L4-L5-L6  (式II)

[0198] 其中L1、L2、L3、L4、L5和L6独立地是柔性氨基酸；并且

[0199] 其中L1、L2、L3、L4、L5和L6独立地任选地不存在或存在。

[0200] 还预期，此外，L1、L2、L3、L4、L5和L6独立地选自A(Ala)、L(Leu)、G(Gly)、S(Ser)和T(Thr)。还预期，在如本文所述的插入序列中，X1A或X1B中的一个存在，X1A或X1B中的另一个不存在，并且在式(II)中，L1、L2、L3、L4和L5全部都存在，并且其中L6不存在。

[0201] 因此，包括柔性氨基酸的插入序列可以具有7至14个氨基酸的长度。因此，包括柔性氨基酸的插入序列可以具有7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸的长度。然而，当存在更多的柔性氨基酸时，则包括柔性氨基酸的插入序列也可以具有15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸的长度。

[0202] 还预期，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白包含如本文所述的插入序列，其中X1A和/或X1B和/或X2和/或X3不是酸性氨基酸。另外地或可选地，本文所述的插入序列不包含氨基酸E(谷氨酸)。

[0203] 本文所用术语“酸性氨基酸”是指氨基酸D(Asp)和E(谷氨酸)。

[0204] 另外地或可选地，本文所用的插入序列可以包含1、2、3或4个酸性氨基酸。例如，插入序列可包含一个酸性氨基酸。所述氨基酸可以是D(Asp)。

[0205] 进一步预期，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白包含如本文所述的插入序列，其中X1A或X1B中的一个存在，并且X1A或X1B中的另一个不存在，并且其中X2不是碱性或酸性氨基酸。

[0206] 如本文所用，“碱性氨基酸”是K(Lys)、R(Arg)和H(His)中的任一种。

[0207] 进一步预期，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白包含如本文所述的插入序列，所述插入序列在任何位置都不包含K(Lys)或H(His)。还预期，所述插入序列包括R(Arg)，作为唯一的碱性氨基酸。此外，插入序列可以包括D(Asp)，作为唯一的酸性氨基酸。

[0208] 进一步预期，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白包含如本文所述的插入序列，其中X1A和/或X1B和/或X2和/或X3和/或X4和/或X6不是疏水性芳族氨基酸。

[0209] 如本文所述的“疏水性氨基酸”是选自F(Phe)、W(Trp)或Y(Tyr)的氨基酸。

[0210] 还预期，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白包含如本文所述的插入序列，所述插入序列不包含任何疏水性氨基酸。

[0211] 进一步预期，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白包含如本文所述的插入序列，所述插入序列不包含氨基酸F(Phe)、W(Trp)、Y(Tyr)、K(Lys)、E(Glu)、C(Cys)、M(Met)、I(Ile)和H(His)中的任何一种。

[0212] 此外，预期本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白包含如本文所述的插入序列，其中X1A或X1B是特殊氨基酸、疏水性脂肪族氨基酸或具有不带电荷的侧基的极性氨基酸。

[0213] 如本文所用，“特殊氨基酸”包括C(Cys)、G(Gly)和P(Pro)。

[0214] 如本文所用，“疏水性脂肪族氨基酸”包括(Ala)、L(Leu)、V(Val)和I(Ile)。

[0215] 如本文所用的“具有不带电荷的侧基的极性氨基酸”包括S(Ser)、T(Thr)、N(Asn)和Q(Gln)。

[0216] 因此，在如本文所述的插入序列中，X1A和/或X1B可以选自A、L、V、I、S、T、N、Q、C、P和G。在如本文所述的插入序列中，X1A和/或X1B也可以选自G、P和N。在如本文所述的插入序列中，X1A和/或X1B也可以选自G、N、S和A。

[0217] 在如本文所述的插入序列中，X1A和/或X1B也可以是L、K、D、E、I、C、M、F、W、Y以外的任何氨基酸。在如本文所述的插入序列中，X1A和/或X1B也可以是任何氨基酸。

[0218] 另外地或可选地，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白包含如本文所述的插入序列，其中X2可以是疏水性脂肪族氨基酸或具有不带电荷的侧基的极性氨基酸。因此，在如本文所述的插入序列中，X2可以选自S、T、N、Q、A、L、V和I。X2也可以选自N和L。在如本文所述的插入序列中，X2也可以选自L、N、S和A。X2也可以是任何氨基酸。在如本文所述的插入序列中，X2也可以是D、E、I、C、M、F、W和Y以外的任何氨基酸。

[0219] 另外地或可选地，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白包含如本文所述的插入序列，其中X3可选自疏水性脂肪族氨基酸或特殊氨基酸或具有不带电荷的侧基的极性氨基酸。因此，在如本文所述的插入序列中，X3可以选自A、L、V、I、S、T、N、Q、C、G和P。在如本文所述的插入序列中，X3也可以选自S、Q和P。在如本文所述的插入序列中，X3也可以选自P、S、G和A。X3也可以是P。在如本文所述的插入序列中，X3也可以是任何氨基酸。在如本文所述的插入序列中，X3也可以是L、E、I、C、M、F、W和Y以外的任何氨基酸。

[0220] 另外地或可选地，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白包含如本文所述的插入序列，其中X4可以是疏水性脂肪族或碱性或酸性氨基酸或特殊氨基酸或具有不带电荷的侧基的极性氨基酸。因此，在如本文所述的插入序列中，X4可以选自K、R、H、D、E、S、T、N、Q、A、V、I、L、C、G和P。如本文所述的插入序列中，X4也可以选自P、A和T。在如本文所述的插入序列中，X4也可以选自P、T、S和G。在如本文所述的插入序列中，X4可以选自P或T。在如本文所述的插入序列中，X4可以是P。X4可以是T。在如本文所述的插入序列中，X4也可以是L、E、I、C、M、F、W和Y以外的任何氨基酸。

[0221] 另外地或可选地，本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白包含如本文所述的插入序列，其中X6可以是酸性氨基酸、碱性氨基酸、具有不带电荷的侧基的极性氨基酸或特殊氨基酸。因此，在如本文所述的插入序列中，X6可以选自K、R、H、D、E、S、T、N、Q、A、C、G和P。在如本文所述的插入序列中，X6也可以选自T、P和S。X6也可以选自S、T、P和A。在如本文所述的插入序列中，X6也可以选自S、T、P和A。X6也可以选自S或T。在如本文所述的插入序列中，X6可以是S。在如本文所述的插入序列中，X6可以是T。

[0222] 本发明的AAV或AAV VP1衣壳蛋白还可包含如本文所述的插入序列，其中X1A或X1B中的一个存在，且X1A或X1B中的一个不存在；和

[0223] 其中X1A或X1B选自A、L、V、I、S、T、N、Q、C、P和G，优选地X1A或X1B选自G、P和N；和/或[0224] 其中X2选自S、T、N、Q、A、L、V和I，优选地X2选自N和L；和/或

[0225] 其中X3选自A、L、V、I、S、T、N、Q、C、G和P，优选地X3选自S、Q和P；和/或[0226] 其中X4选自K、R、H、D、E、S、T、N、Q、A、V、I、L、C、G和P，优选地X4选自P、A和T；和/或[0227] 其中X6选自K、R、H、D、E、S、T、N、Q、A、C、G和P，优选地X6选自T、P和S。

[0228] 本发明的AAV能够转导视网膜细胞。因此，使用本发明的AAV可以导致，当将AAV静脉内施用于C57-Bl6J(本文也称为C57BL/6J)小鼠的尾静脉中时，24小时后，小鼠视网膜细胞核提取物中存在病毒AAV DNA。小鼠可以从Charles River

[0229] (http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/jax-mice-strai n-c57bl-6j？loc＝DE)购买。

[0230] C57BL/6J近交系是由Dr.CC Little通过来自Miss Abbie Lathrop保存的雌性57和雄性52的交配而产生的。同一杂交产生了C57L和C57BR品系。

[0231] 本领域技术人员知道该小鼠品系的基因型，并且也知道在哪里可以获得这种小鼠品系。本领域技术人员也知道亚系之间的差异，例如在Mekasa et al.(2009)“Genetic differences among C57BL/6Substrains”Exp.Anim.58(2),141-149中所述的。

[0232] 这种小鼠品系是市场上可买到的，并且可以例如从Charles River Laboratories或Janvier labs获得。

[0233] 特别地，将本文别处所述的AAV文库#1的最多8x10E10基因组颗粒注射到4周龄C57-BL6J小鼠的尾静脉中。静脉注射入尾静脉后24小时，收获视网膜组织，如本文别处详细描述的。然后，在静脉内施用后24小时内具有进入视网膜细胞核的能力的AAV的基因组用PCR进行扩增，如本文别处详细描述的。

[0234] 还预期这样的本发明AAV，当将AAV静脉内施用到C57-BL6J(C57/BL6J)小鼠的尾静脉中时，24小时后，病毒AAV DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中，并且在确定插入序列(第1轮选择)并将检测的插入序列亚克隆到另一AAV中之后，当将AAV静脉内施用到C57-BL6J(C57BL/6J)小鼠的尾静脉中(第2轮选择)时，24小时后，另一AAV的病毒DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中。在第二轮选择中，遵循与本文中针对第一轮选择以及实施例中所描述的相同的程序。

[0235] 为了检测视锥细胞中的病毒DNA，首先将如本文所述的第1轮和第2轮选择中获得的病毒注射到如本文所述的4周龄C57BL6J小鼠或RG-eGFP小鼠品系R685933的尾静脉中。

[0236] 将从如本文所述的第二轮选择中获得的至多5x 10^11个基因组颗粒注射到如本文所述的4周龄C57BL6J或RG-eGFP小鼠品系R685933的尾静脉中。

[0237] RG-eGFP小鼠(品系R685933)由Fei和Hughes(2001)“Transgenic expression of the jellyfish green fluorescent protein in the cone photoreceptors of the mouse.”Vis Neurosci.18(4):615-23描述。RG-eGFP小鼠(品系R685933)可以购自MMRRC(https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php？mmrrc_id＝43)。

[0238] 为了在注射后24小时检测视杆细胞中的病毒DNA，通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并且通过将Dumont#7弯头镊子(Fine Science Tools,Heidelberg)放置在靠近视神经的后部周围并施加温和的压力使眼睛脱垂。用锋利的刀片沿眼球赤道切开角膜。随后，通过轻轻向上拉动镊子，将视网膜从视网膜色素上皮(RPE)分离，并与晶状体和玻璃体一起从剩余的眼组织移除。在冰冷的0.1M磷酸盐缓冲液(PB)中冲洗组织并用镊子去除晶状体和任何剩余的RPE细胞后，将每只小鼠的两个视网膜汇集并转移到Eppendorf管中，并立即处理以用于视杆细胞光感受器的分离。特别地，按照(Feodorova et al.(2015)“Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.”MethodsX 2:39-46)中所述进行木瓜蛋白酶解离，并根据(Eberle et al.(2014)“Subretinal transplantation of MACS  purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.”J Vis Exp 84:
e50932)通过基于抗CD73的MACS分选来分离视杆细胞。使用Subcellular Protein 
Fractionation Kit for Tissues(Thermo Fischer Scientific,#87790)从经MACS分选的视杆细胞中分离视杆细胞核(以确保仅分析细胞核DNA)。使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen,#69504)分离细胞核DNA。使用Roche 454测序系统进行测序，以确定插入的肽序列最主要出现在视杆细胞中。另外地或可选地，本发明的AAV是这样的，当将AAV静脉内施用到C57BL/6J小鼠的尾静脉中时，在施用后24小时，病毒AAV DNA存在于使用抗CD73包被的磁珠进行的MAC分选的视杆细胞和/或经FACS分选的视锥细胞中，其中所述视锥细胞表达eGFP并且基于它们的eGFP表达而被FACS分选。

[0239] 为了在注射后24小时检测视锥细胞中的病毒AAV DNA，通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并且通过将Dumont#7弯头镊子(Fine Science Tools,Heidelberg)放置在靠近视神经的后部周围并施加温和的压力使眼睛脱垂。用锋利的刀片沿眼球赤道切开角膜。随后，通过轻轻向上拉动镊子，将视网膜从视网膜色素上皮(RPE)分离，并与晶状体和玻璃体一起从剩余的眼组织移除。在冰冷的0.1M磷酸盐缓冲液(PB)中漂洗组织并且用镊子移除晶状体和任何剩余的RPE细胞后，将每个小鼠的两个视网膜合并并转移到Eppendorf管中，并立即处理以分离视锥细胞光感受器。特别地，按照(Feodorova et al.(2015)“Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.”MethodsX 2:39-46)中所述进行木瓜蛋白酶解离，并根据(Becirovic et al.(2016)In Vivo Analysis of Disease-Associated Point Mutations Unveils Profound Differences in mRNA Splicing of Peripherin-2in Rod and Cone Photoreceptors.”PLOS Genetics 12(1):e1005811)通过FACS分选(eGFP标记)视锥细胞。使用Subcellular Protein Fractionation Kit for Tissues(Thermo Fischer 
Scientific,#87790)从FACS分选的视锥细胞中分离视锥细胞核(以确保仅分析细胞核DNA)。使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen,#69504)分离细胞核DNA。使用Roche 454测序系统进行测序，以确定插入的肽序列最主要出现在视锥细胞中。

[0240] 视锥细胞光感受器基于来自如本文所述的RG-eGFP小鼠品系R685933的eGFP荧光而被FACS分选。随后，从分选的视杆细胞光感受器和视锥细胞光感受器中分离病毒DNA，并使用下一代测序(NGS)进行测序。

[0241] 本发明还涉及包含本发明AAV VP1衣壳蛋白的AAV衣壳。

[0242] 本发明还涉及包含本发明的AAV衣壳和转基因、分子或多肽的病毒载体，其中所述核酸、分子或多肽被AAV衣壳包裹。核酸、分子或多肽任选地提供医学效果。

[0243] 本发明还涉及用作药物的本发明的AAV或病毒载体。本发明还涉及用于疗法的本发明的AAV或病毒载体。

[0244] 出于这些目的，本发明的AAV可用作其它分子的货运系统。此类分子的非限制性实例是DNA、RNA、肽、蛋白质或化学化合物。因此，如本文所述的用于疗法或用于药物组合物中的AAV可以是如本文所述的重组AAV。此类AAV可包含转基因。

[0245] 转基因可以编码在生物学和医学中有用的产物，例如蛋白质、肽、RNA、酶或催化性RNA。理想的RNA分子包括shRNA、tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化性RNA和反义RNA。有用的RNA序列的一个实例是在经处理的受试者中抑制靶核酸序列表达的序列。

[0246] 本文所述的rAAV或病毒载体可包含转基因，例如微型基因(minigene)。所述微型基因至少可以由本文所述的异源核酸序列(所述转基因)及其调控序列，以及5’和3’AAV反向末端重复(ITR)组成。正是这种微型基因可以被包装到衣壳蛋白中，并被递送至选定的靶细胞。

[0247] 所述转基因可以是例如核酸序列，其与转基因侧翼的载体序列异源，其编码目的多肽、蛋白质或其他产物。核酸编码序列可以以允许转基因在靶细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接至调节组分。异源核酸序列(转基因)可以来自任何生物体。AAV或病毒载体可包含一种或多种转基因。

[0248] 转基因序列的组成将取决于所得载体的用途。例如，选择转基因以提供光基因疗法(optogenetic therapy)。在光基因疗法中，人工光感受器是通过光激活通道或泵的基因递送到剩余的视网膜回路中存活的细胞类型来构建的。这对于失去大量光感受器功能，但至神经节细胞和视神经的双极细胞回路保持完整的患者特别有用。在一个实施方案中，异源核酸序列(转基因)可以是视蛋白。视蛋白序列可以来自任何合适的单细胞或多细胞生物，包括人、藻类和细菌。视蛋白可以是例如视紫红质、光视蛋白、L/M波长(红色/绿色)-视蛋白或短波长(S)视蛋白(蓝色)。在另一个实施方案中，视蛋白是通道视紫红质或氯视紫红质。

[0249] 还可以选择转基因用于基因增补(gene augmentation)疗法，即提供缺失或缺陷基因的替换拷贝。本领域技术人员可以容易地选择转基因以提供必要的替换基因。在一个实施方案中，缺失/缺陷基因与眼部病症相关。转基因也可以是YX、GRM6、TRPM1L或GPR179，并且眼部病症是先天性静止性夜盲症。参见，例如，Zeitz et al,Am J Hum Genet.2013Jan 10；92(l):67-75。

[0250] 还可以选择转基因用于基因抑制疗法，即，一个或多个天然基因的表达在转录或翻译水平上被中断或抑制。这可以例如使用短发夹RNA(shRNA)或本领域熟知的其它技术来实现。参见，例如Sun et al,Int J Cancer.2010Feb l；126(3):764-74and O'Reilly M,et al.Am J Hum Genet.2007Jul；81(l):127-35。本领域技术人员可以根据需要沉默的基因容易地选择转基因。

[0251] 转基因可包含一个以上的转基因。这可以使用携带两个或更多个异源序列的单个载体，或使用各自携带一个或多个异源序列的两个或更多个AAV或病毒载体来实现。

[0252] AAV或病毒载体也可用于基因抑制(或敲除)和基因增补联合疗法。在敲除/增补联合疗法中，目的基因的缺陷拷贝被沉默，并提供非突变拷贝。这可以通过使用两个或更多个共同施用的载体来实现。参见，Millington-Ward et al,Molecular Therapy,April 2011,19(4):642-649。本领域技术人员可以基于期望的结果容易地选择转基因。

[0253] 可以选择转基因用于基因校正疗法。这可以使用例如锌指核酸酶(ZFN)诱导的DNA双链断裂结合外源DNA供体底物以及TALEN或CAS9/CRISPR系统结合外源RNA供体底物来实现。参见，例如Ellis et al.(2013)“Zinc-finger nuclease-mediated gene correction using single AAV vector transduction and enhancement by Food and Drug Administration-approved drugs”Gene Ther.20(1):35-42和Singh,Braddick,Dhar(2017)‘Exploring the potential of genome editing CRISPR-Cas9 technology.’Gene；599,pp.1-18。本领域技术人员可以基于期望的结果容易地选择转基因。例如，Cas9和多种gRNA可以被包装进单独的AAV载体，增加总体包装能力，但必须纯化和共感染两种AAV。

[0254] 转基因可以包含报告序列或由其组成，所述报告序列在表达时产生可检测的信号。此类报告序列包括但不限于编码以下的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、膜结合蛋白(包括例如CD2、CD4、CD8、流感血凝素蛋白)，以及本领域熟知的其它蛋白，针对它们的高亲和力抗体存在或可通过常规手段产生，和融合蛋白，所述融合蛋白包含适当地融合至抗原标签结构域的膜结合蛋白，尤其是血凝素或Myc。

[0255] 本文所述的这些编码序列，当与驱动其表达的调节元件结合时，可提供可通过常规手段检测的信号，所述常规手段包括酶促、放射成像、比色、荧光或其它光谱测定、荧光激活细胞分选测定和免疫测定(包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学)。例如，在标记序列是lacZ基因的情况下，通过测定β-半乳糖苷酶的活性来检测携带信号的载体的存在。在转基因是绿色荧光蛋白或荧光素酶的情况下，携带信号的载体可以通过光度计中的颜色或光产生进行视觉测量。

[0256] 转基因可用于校正或改善基因缺陷(如在上述应用中)，所述缺陷可包括其中正常基因以低于正常水平表达的缺陷或功能基因产物不表达的缺陷。优选类型的转基因序列编码在靶细胞中表达的治疗性蛋白质或多肽。

[0257] 本发明进一步包括使用多种转基因，例如，以校正或改善由多亚基蛋白引起的基因缺陷。某些情况下，可以使用不同的转基因来编码蛋白质的每个亚基，或者编码不同的肽或蛋白质。当编码蛋白质亚基的DNA的大小很大时，这是合乎需要的。为了使细胞产生多亚基蛋白质，细胞被含有每一种不同亚基的重组病毒感染。或者，蛋白质的不同亚基可以由同一转基因编码。在这种情况下，单个转基因将包含编码每个亚基的DNA，并且每个亚基的DNA由内部核糖体进入位点(IRES)隔开。当编码每个亚基的DNA的大小较小时，例如编码亚基和IRES的DNA的总大小小于5千碱基时，这是合乎需要的。

[0258] 调节序列包括常规控制元件，其可以以允许转基因在用载体转染的细胞或感染了如本文所述产生的病毒的细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接到转基因上。如本文所用，“可操作地连接”的序列包括与目的基因相邻的表达控制序列和以反式或远距离作用以控制目的基因的表达控制序列。

[0259] 本文所用的表达控制序列可包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号(例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号)；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强所编码的产物分泌的序列。包括启动子在内的大量表达控制序列在本领域中是已知的，并且可以被利用。

[0260] 在本文提供的AAV中有用的调节序列还可以包含内含子，其理想地位于启动子/增强子序列与基因之间。一种理想的内含子序列来自SV-40，是一种被称为SD-SA的100bp的微型内含子剪接供体/剪接受体。另一种合适的序列包括土拨鼠肝炎病毒转录后元件(参见，例如，L.Wang and I.Verma,1999Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,96:3906-3910)。PolyA信号可以来自许多合适的物种，包括但不限于SV-40、人和牛。

[0261] 本文所述的AAV的另一调节组分是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列或其它合适的系统可用于从单个基因转录物产生一种以上的多肽。IRES(或其它合适的序列)用于产生包含一条以上多肽链的蛋白质，或用于表达来自同一细胞或在同一细胞内的两种不同蛋白质。示例性IRES是脊髓灰质炎病毒内部核糖体进入序列，其支持光感受器、RPE和神经节细胞中的转基因表达。优选地，IRES在rAAV载体中位于转基因的3’端。

[0262] 本发明的AAV可包含启动子(或启动子的功能片段)。在AAV中使用的启动子可以从大量组成型或诱导型启动子中进行选择，这些启动子可以在期望的靶细胞中表达所选择的转基因。靶细胞可以是光感受器细胞。启动子可以来自任何物种，包括人。理想地，启动子可以是“细胞特异性的”。术语“细胞特异性的”是指针对重组载体选择的特定启动子可以在特定细胞或眼部细胞类型中指导所选择的转基因的表达。有用的启动子包括但不限于视杆细胞视蛋白启动子(RHO)、红-绿视蛋白启动子、蓝色视蛋白启动子、cGMP-磷酸二酯酶启动子、SWS启动子(蓝色短波长敏感(SWS)视蛋白启动子)、小鼠视蛋白启动子(Beltran et al 2010，如上文引用的)、视紫红质启动子(Mussolino et al,Gene Ther,July 2011,18(7):
637-45)；视锥细胞转导素的α亚基(Morrissey et al,BMC Dev,Biol,Jan 2011,11:3)；视锥细胞抑制素(ARR3)启动子(Kahle NA et al.,Hum Gene Ther Clin Dev,September 
2018,29(3):121-131)，β磷酸二酯酶(PDE)启动子；视网膜色素变性(RP1)启动子(Nicord et al,J.Gene Med,Dec 2007,9(12):1015-23)；NXNL2/NXNL 1启动子(Lambard et al,PLoS One,Oct.2010,5(10):el3025)，RPE65启动子；视网膜变性缓慢/外周蛋白2(Rds/perph2)启动子(Cai et al,Exp Eye Res.2010Aug；91(2):186-94)；VMD2启动子(Achi et al,Human Gene Therapy,2009(20:31-9))，和ABCA4启动子。

[0263] 对这些和其它常见载体和调控元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可获得的。参见，例如，Sambrook等人，以及其中引用的参考文献，例如，第3.18-3.26页和第16.17-16.27页，以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1989。当然，并不是所有的载体和表达控制序列都可以同样好地表达本文所述的所有转基因。然而，本领域技术人员在不脱离本发明的范围的情况下可以在这些以及其它表达控制序列中进行选择。

[0264] 通常，疾病的治疗或处理或预防包括对有需要的哺乳动物受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含本文所述的rAAV或病毒载体(例如携带编码转基因的核酸序列或其片段，在于受试者眼部细胞中表达基因产物的调节序列的控制下)，以及任选的另外的药学上可接受的载体。

[0265] 本发明还涉及包含本文所述的AAV或病毒载体的药物组合物。这样的药物组合物可以进一步包含载体，优选药学上可接受的载体。药物组合物可以是可注射溶液的形式。可根据已知技术，使用合适的无毒、药学上可接受的稀释剂或溶剂(例如甘露醇、1，3-丁二醇、水、林格氏(Ringer's)溶液或等渗氯化钠溶液)，或合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂(例如无菌的、无刺激性、不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯；以及脂肪酸，包括油酸)，来配制可注射溶液或混悬液。

[0266] 对于可注射制剂，药物组合物可以是在合适的小瓶或管中与合适的赋形剂混合的冻干粉。在临床使用之前，可通过将冻干粉溶解在合适的溶剂体系中以形成适于静脉内或肌内注射或用于视网膜下、玻璃体内或结膜下注射的组合物来重构药物。

[0267] 还预期，本发明的药物组合物被配制为滴眼剂/作为滴眼剂施用。

[0268] 本发明的AAV或本发明的药物组合物可以以治疗有效量施用。AAV的“治疗有效量”可以随各种因素而变化，所述因素包括但不限于活性化合物在患者体内的稳定性、要缓解的病况的严重性、要治疗的患者的总体重、施用途径、活性化合物在体内的吸收、分布和排泄的难易程度、要治疗的患者的年龄和敏感性、不良事件等，这对于技术人员来说是显而易见的。所述施用量可以随着各种因素随时间的变化而进行调整。

[0269] 原则上，本发明的AAV/药物组合物可以以任何合适的方式施用。本发明的AAV，例如包含用于靶标光感受器细胞的所需转基因，可以配制成用于视网膜下或玻璃体内注射的药物组合物。可用于本文所述方法的其它施用形式包括但不限于直接递送至所需器官(例如，眼睛，例如滴眼剂)、口服、吸入、鼻内、气管内、静脉内、肌内、皮下、皮内和其它肠胃外施用途径。如果需要，可以采取组合施用途径。

[0270] 此外，可能需要进行非侵入性视网膜成像和功能研究，以确定特定眼细胞区域作为治疗靶标。

[0271] AAV可在生理上可接受的载体中被施用于受试者，如本文所述。药物组合物中或施用时AAV的浓度可以在10E8和10E12总载体基因组/μl之间，优选在6x10E8和6x10E9/μl之间。AAV也可以以约10E9载体基因组/μl的浓度施用。

[0272] 本发明的AAV可单独施用或与其它治疗组合施用。因此，药物组合物还可另外或可选地包含一种或多种其它活性成分。

[0273] 用于本发明的药物组合物/AAV可以施用于受试者。本文所述的AAV和药物组合物适用于人类治疗和兽医应用。受试者可以是哺乳动物或鸟类。合适的哺乳动物的实例包括但不限于小鼠、大鼠、牛、山羊、绵羊、猪、狗、猫、马、豚鼠、犬、仓鼠、水貂、海豹、鲸鱼、骆驼、黑猩猩、恒河猴和人类，优选人类。合适的鸟类的实例包括但不限于火鸡、小鸡、鹅、鸭、短颈野鸭(teal)、野鸭(mallard)、八哥、北方平尾鸟(Northern pintail)、海鸥、天鹅、珍珠鸡或水禽等。药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体。

[0274] 本发明还涉及用于治疗光感受器细胞疾病的本发明的AAV。在这些实施方案中，AAV(例如rAAV)或病毒载体可以包含编码治疗性多肽、治疗性核酸、治疗性蛋白质/多肽或治疗性分子的异源核酸。

[0275] 本发明进一步涉及治疗受试者(例如，优选地，需要治疗的受试者)的方法，所述方法包括施用本发明的AAV。优选地，AAV以治疗有效量施用。

[0276] 本发明的AAV也可用于体外诊断方法。因此，本发明还涉及诊断方法，所述方法包括使本发明的AAV与从受试者获得的样品接触。

[0277] 本发明还涉及药物的制造，所述药物包含本发明的AAV。

[0278] 本发明还涉及包含本发明AAV的制剂。

[0279] 异源核酸可以在于视网膜中表达的启动子序列的控制下。异源核酸可以可操作地连接至启动子，所述启动子适于在一种或多种视网膜细胞类型(例如视杆细胞和视锥细胞)中表达治疗性多肽或治疗性核酸。例如，启动子可以是视紫红质激酶(RK)启动子、视蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。

[0280] 本发明的AAV可包含异源核酸，用于将异源核酸递送至受试者的光感受器细胞。

[0281] 异源核酸治疗性核酸、治疗性蛋白质/多肽或治疗性分子可用于治疗眼部病症，所述眼部病症选自：常染色体隐性遗传严重早发性视网膜变性(Leber氏先天性黑蒙)、先天性色盲(congenital achromatopsia)、Stargardt氏病、Best氏病、Doyne氏病、视锥细胞营养不良、视网膜色素变性、X-连锁视网膜裂、Usher氏综合征、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性AMD、糖尿病性黄斑病变、增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)、囊样黄斑水肿、中心性浆液性视网膜病、视网膜脱离、眼内炎症、青光眼和后葡萄膜炎。

[0282] 本文所述的光感受器细胞疾病可以是影响光感受器细胞(例如视杆细胞和/或视锥细胞)的任何疾病。光感受器细胞疾病的非限制性实例包括失明、色盲(achromatopsia)、年龄相关性黄斑变性、视网膜变性、视网膜营养不良、视网膜色素变性、视锥细胞营养不良、视杆细胞-视锥细胞营养不良、色盲(color blindness)、黄斑变性、夜盲症、视网膜裂、无脉络膜症(choroideremia)、糖尿病性视网膜病变、遗传性视神经病变、Oguchi疾病I型、白点状视网膜炎(retinitis punctata albescens，RPA)、进行性视网膜萎缩(PRA)、白点状眼底(FA)或先天性静止性夜盲症(CSNB)。

[0283] 本发明还涉及本发明的AAV或病毒载体用于转导视网膜细胞核的体外用途。

[0284] 本发明还涉及用于筛选插入序列的方法，所述方法包括

[0285] i)向受试者静脉内施用AAV文库，其中每个AAV包含一个插入序列；

[0286] ii)从视网膜细胞核提取物中分离病毒AAV DNA；

[0287] iii)确定插入序列的序列，

[0288] 从而获得插入序列。

[0289] 本发明还涉及用于筛选插入序列的方法，所述方法包括

[0290] i)向受试者静脉内施用AAV文库，其中每个AAV包含一个插入序列；

[0291] ii)从视网膜细胞核提取物中分离病毒AAV DNA；

[0292] iii)将分离的病毒AAV DNA亚克隆到第二AAV文库中；

[0293] iv)将如步骤iii)中获得的第二AAV文库静脉内施用于受试者中；

[0294] v)从视杆细胞或视锥细胞光感受器中分离病毒AAV DNA；

[0295] vi)确定插入序列的序列，

[0296] 从而获得插入序列。

[0297] 在如本文所述的用于筛选插入序列的方法中，步骤i)、ii)和iii)可重复。

[0298] AAV文库是如本文别处所述的病毒文库。亚克隆如本文别处所述进行。

[0299] 本发明还涉及可通过本文所述的筛选方法获得的肽(插入序列)。

[0300] 本发明还涉及包含本发明的AAV或本发明的药物组合物的试剂盒。所述试剂盒可以进一步包含以下中的一种或多种

[0301] (i)缓冲剂；

[0302] (ii)寡核苷酸；

[0303] (iii)活性成分；

[0304] (iv)适于玻璃体内注射的注射器。

[0305] 本发明还涉及包含本发明的AAV或本发明的药物组合物的试剂盒。所述试剂盒可以进一步包含以下中的一种或多种

[0306] (i)缓冲剂；

[0307] (ii)寡核苷酸；

[0308] (iii)活性成分；

[0309] (iv)适于提供滴眼剂的容器。

[0310] 本发明还涉及适于玻璃体内注射的注射器，其包含含有本发明的AAV或病毒载体或包含本发明的药物组合物的溶液。

[0311] 本发明还提供了一种用于生产本发明的AAV的方法。例如，可以通过培养宿主细胞来产生AAV，所述宿主细胞包含编码本文所述AAV衣壳蛋白的核酸序列或其片段；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重复(ITR)和任选地编码所需转基因的异源核酸序列组成；和足够的辅助功能以允许包装到AAV衣壳蛋白中。可将需要在宿主细胞中培养以将AAV包装在AAV衣壳中的组分以反式形式提供给宿主细胞。或者，任何一种或多种所需组分(例如，rep序列、cap序列和/或辅助功能)可由稳定的宿主细胞提供，所述宿主细胞已使用本领域技术人员已知的方法被工程化以包含一种或多种所需组分。

[0312] 最适宜地，这种稳定的宿主细胞将在诱导型启动子的控制下包含所需的组分。然而，所需组分可以在组成型启动子的控制下。本文提供了合适的诱导型启动子和组成型启动子的实例。在另一个替代方案中，所选择的稳定的宿主细胞可以包含在组成型启动子控制下的选择的组分和在一个或多个诱导型启动子控制下的其它选择的组分。例如，可以产生稳定的宿主细胞，其来源于HEK293细胞(其包含在组成型启动子的控制下的E1辅助功能)，但其包含在诱导型启动子的控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可以产生其它稳定的宿主细胞。

[0313] 生产本文所述rAAV所需的rep序列、cap序列和辅助功能可以以任何遗传元件的形式递送到包装宿主细胞，所述遗传元件转移携带在其上的序列。所选择的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文所述的那些。用于构建本发明任何实施方案的方法是具有核酸操作技能(包括基因工程技术、重组工程技术和合成技术)的技术人员已知的。参见例如Sambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY。类似地，生成rAAV病毒粒子的方法是众所周知的，并且合适方法的选择不是对本发明的限制。参见，例如K.Fisher et al,1993J.Virol,70:520-532和US专利5,478,745等。

[0314] 本发明的特征还在于以下项：

[0315] 1.腺相关病毒(AAV)，所述AAV包括

[0316] 在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物；其中插入序列从N-末端到C-末端具有式I:

[0317] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0318] 其中X5选自P(Pro)、L(Leu)和V(Val)；

[0319] 其中X7为R(Arg)；

[0320] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0321] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，

[0322] 或

[0323] 其中X5选自S(Ser)和T(Thr)；

[0324] 其中X7为S(Ser)；

[0325] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0326] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，

[0327] 或

[0328] 其中X5选自A(Ala)和Q(Gln)；

[0329] 其中X7为A(Ala)；

[0330] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0331] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，

[0332] 其中当将AAV静脉内施用于C57-Bl6J小鼠的尾静脉中时，在24小时后，病毒AAV DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中，和

[0333] 其中当将AAV静脉内施用于C57-Bl6J小鼠的尾静脉中以进行视杆细胞分选，以及施用于RG-eGFP小鼠品系R685933的尾静脉中以进行视锥细胞分选时，施用后24小时，病毒AAV DNA存在于使用抗CD73包被的磁珠进行的MAC分选的视杆细胞和/或FACS分选的视锥细胞中，其中所述视锥细胞表达eGFP，并基于其eGFP表达而被进行FACS分选。

[0334] 2.腺相关病毒(AAV)，所述AAV包括

[0335] 在对应于SEQ ID NO：1的第587位和588位之间的至少6-8个氨基酸的插入物(插入序列)；其中所述插入序列从N-末端到C-末端具有式I：

[0336] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0337] 其中X5选自P(Pro)、L(Leu)和V(Val)；

[0338] 其中X7为R(Arg)；

[0339] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0340] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，其中，任选地，当将AAV静脉内施用于C57-BL6J小鼠的尾静脉中时，在24小时后，病毒AAV DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中。

[0341] 3.腺相关病毒(AAV)，所述AAV包括

[0342] 在对应于SEQ ID NO：1的第587位和588位之间的至少6-8个氨基酸的插入物；其中插入序列从N-末端到C-末端具有式I:

[0343] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0344] 其中X5选自S(Ser)和T(Thr)；

[0345] 其中X7为S(Ser)；

[0346] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0347] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，其中，任选地，当将AAV静脉内施用于C57-BL6J小鼠的尾静脉中时，在24小时后，病毒AAV DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中。

[0348] 4.腺相关病毒(AAV)，所述AAV包括

[0349] 在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物；其中插入序列从N-末端到C-末端具有式I:

[0350] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0351] 其中X5选自A(Ala)和Q(Gln)；

[0352] 其中X7为A(Ala)；

[0353] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0354] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在，其中，任选地，当将AAV静脉内施用于C57-BL6J小鼠的尾静脉中时，在24小时后，病毒AAV DNA存在于小鼠视网膜细胞核提取物中。

[0355] 5.腺相关病毒(AAV)VP1衣壳蛋白，所述AAV VP1衣壳蛋白包含

[0356] 在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物(插入序列)；其中所述插入序列从N-末端到C-末端具有式I：

[0357] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0358] 其中X5选自P(Pro)、L(Leu)和V(Val)；

[0359] 其中X7为R(Arg)；

[0360] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0361] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在。

[0362] 6.腺相关病毒(AAV)VP1衣壳蛋白，所述AAV VP1衣壳蛋白包含在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物；其中插入序列从N-末端到C-末端具有式I:

[0363] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0364] 其中X5选自S(Ser)和T(Thr)；

[0365] 其中X7为S(Ser)；

[0366] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0367] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在。

[0368] 7.腺相关病毒(AAV)VP1衣壳蛋白，所述AAV VP1衣壳蛋白包含

[0369] 在对应于SEQ ID NO：1的第587和588位的位置之间的至少6-8个氨基酸的插入物；其中插入序列从N-末端到C-末端具有式I:

[0370] X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7  (式I)

[0371] 其中X5选自A(Ala)和Q(Gln)；

[0372] 其中X7为A(Ala)；

[0373] 其中X1A、X1B、X2、X3、X4、X6独立地是任何氨基酸；

[0374] 其中X1A和/或X1B独立地任选地不存在或存在。

[0375] 8.第1-7项中任一项的AAV或AAV2衣壳蛋白，其中X1A不存在且X1B存在，或其中X1B不存在且X1A存在。

[0376] 9.第1-8项中任一项的AAV或AAV VP1衣壳蛋白，其中所述插入序列从N-末端到C-末端具有式II:

[0377] L3-L2-L1-X1A-X1B-X2-X3-X4-X5-X6-X7-L4-L5-L6  (式II)

[0378] 其中L是柔性氨基酸；和

[0379] 其中L1、L2、L3、L4、L5和L6独立地选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr；和

[0380] 其中L1、L2、L3、L4、L5和L6独立地任选地不存在或存在。

[0381] 10.前述任一项的AAV或AAV VP1衣壳蛋白，其中X1A或X1B中的一个存在，且X1A或X1B中的另一个不存在，和

[0382] 其中L1、L2、L3、L4和L5全部存在，并且其中L6不存在。

[0383] 11.前述任一项的AAV或AAV2衣壳蛋白，其中X1A和/或X1B和/或X2和/或X3不是酸性氨基酸。

[0384] 12.前述任一项的AAV或AAV VP1衣壳蛋白，其中X1A或X1B中的一个存在，且X1A或X1B中的另一个不存在，并且其中X2不是碱性或酸性氨基酸。

[0385] 13.前述任一项的AAV或AAV VP1衣壳蛋白，其中X1A和/或X1B和/或X2和/或X3和/或X4和/或X6不是疏水性芳族氨基酸。

[0386] 14.前述任一项的AAV或AAV VP1衣壳蛋白，其中X1A或X1B中的一个存在，且X1A或X1B中的另一个不存在，和

[0387] 其中X1A或X1B选自A、L、V、I、S、T、N、Q、C、P和G，优选地X1A或X1B选自G、P和N；和/或[0388] 其中X2选自S、T、N、Q、A、L、V和I，优选地X2选自N和L；和/或

[0389] 其中X3选自A、L、V、I、S、T、N、Q、C、G和P，优选地X3选自S、Q和P；和/或[0390] 其中X4选自K、R、H、D、E、S、T、N、Q、A、V、I、L、C、G和P，优选地X4选自P、A和T；和/或[0391] 其中X6选自K、R、H、D、E、S、T、N、Q、A、C、G和P，优选地X6选自T、P和S。

[0392] 15.前述任一项的AAV或AAV VP1衣壳蛋白，其用作药物/治疗疾病。

[0393] 16.前述任一项的AAV，其用于治疗光感受器细胞疾病。

[0394] 17.一种AAV衣壳，其包含前述任一项的AAV VP1衣壳蛋白，并且任选地进一步包含AAV衣壳蛋白VP2和/或VP3中的一种或多种。

[0395] 18.一种病毒载体，其包含第17项的AAV衣壳和转基因、分子或多肽，其中所述转基因、分子或多肽被AAV衣壳包裹。

[0396] 19.包含前述任一项的AAV或病毒载体的药物组合物。

[0397] 20.第1-18项中任一项的AAV或病毒载体用于转导视网膜细胞核的体外用途。

[0398] 21.一种用于筛选插入序列的方法，所述方法包括

[0399] i)向受试者静脉内施用AAV文库，其中每个AAV包含一个插入序列；

[0400] ii)从视网膜细胞核提取物中分离病毒AAV DNA；

[0401] iii)将分离的病毒AAV DNA亚克隆到第二AAV文库中；

[0402] iv)将如步骤iii)中获得的第二AAV文库静脉内施用于受试者；v)从视杆细胞光感受器或视锥细胞光感受器中分离病毒DNA；vi)确定插入序列的序列，

[0403] 从而获得插入序列。

[0404] 22.通过第21项的方法获得的肽(插入序列)。

[0405] 23.试剂盒，其包含第1-18项中任一项的AAV或病毒载体。

[0406] 24.前述任一项的病毒载体，其用作药物/治疗疾病。

[0407] 25.前述任一项的病毒载体，其用于治疗光感受器细胞疾病。本文所述的不同AAV的基因组序列和VP1蛋白序列。

[0408]

[0409]

[0410] 表1.不同AAV的基因组序列和VP1蛋白序列。

[0411] 本发明中所使用的序列。

[0412]

[0413]

[0414]

[0415] 表2.本文描述的序列。

[0416] 实施例

[0417] 以下实施例举例说明本发明。这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。实施例被包括以用于说明的目的，并且本发明仅由权利要求书所限制。

[0418] 实施例1：新型AAV衣壳

[0419] 我们进行了AAV肽展示选择，以鉴定对视网膜细胞具有改善的靶向性的AAV。我们使用了AAV突变体文库，其在AAV2衣壳蛋白VP1的第587位氨基酸处显示7聚体随机肽(有时也是6聚体和8聚体)(Perabo et al.(2003)”In vitro selection of viral vectors with modified tropism:the adeno-associated virus display,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 8,151-157)。在两端(N末端和C末端)的任一端，插入的肽两侧各有2-3个额外的“柔性”氨基酸(如丙氨酸)。第587位氨基酸位于衣壳的三重对称轴上的峰的尖端(Xie et al.(2002)“The atomic structure of adeno-associated virus(AAV-2),a vector for human gene therapy”Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99,10405-
10410)，并且在硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)结合位点内(Opie  et al.(2003)
“Identification of amino acid residues in the capsid proteins of adeno-
associated virus type 2that contribute to heparin sulfate proteoglycan 
binding,Journal of virology 77,6995-7006和Kern et al.(2003)“Identification of a heparin-binding motif on adeno-associated virus type 2capsids”Journal of virology 77,11072-11081)。

[0420] 7-聚体在此暴露位置的插入促进了插入肽的受体结合并破坏了HSPG的主要受体结合基序(Perabo et al.(2006)“Heparan sulfate proteoglycan binding properties of adeno-associated virus retargeting mutants and consequences for their in vivo tropism”Journal of virology,80,7265-7269)，这在旨在改变病毒嗜性的方法中至关重要。此外，通过插入的肽序列，AAV文库中与HSPG结合的突变体已被耗尽(Perabo et al.(2006)“Heparan sulfate proteoglycan binding properties of adeno-associated virus retargeting mutants and consequences for their in vivo tropism”Journal of virology,80,7265-7269)，以最大限度地减少携带HSPG二级高亲和力结合位点的AAV的存在(Sallach et al.(2014)“Tropism-modified AAV vectors overcome barriers to successful cutaneous therapy”Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 22,929-939)。将该AAV文库(文库#1)的8x10E10基因组颗粒注射到4周龄C57-BL6J小鼠的尾静脉中。24小时后，收获视网膜组织，并从视网膜细胞核提取物中分离病毒DNA。静脉内施用后24小时内能够进入视网膜细胞核的AAV的基因组用PCR进行扩增，并用于产生第二AAV文库，所述第二AAV文库含有选自第一轮的7聚体插入物。然后将第二AAV文库(文库#2)的8x10E10基因组颗粒注射到4周龄C57-BL6J小鼠的尾静脉中。24小时后，收获视网膜组织(没有RPE或视网膜外组织)，并从视网膜细胞核提取物中分离病毒DNA。在基于PCR的扩增之后，确定编码7聚体AAV的DNA序列，并产生具有这些7聚体插入物的第三AAV文库。接下来，将第三AAV文库(文库#3)的8x10E10基因组颗粒注射到4周龄C57-BL6J小鼠的尾静脉中或在视锥细胞光感受器中表达eGFP的RG-eGFP系R685933的尾静脉中(Fei和Hughes(2001)“Transgenic expression of the jellyfish green fluorescent protein in the cone photoreceptors of the mouse”Visual neuroscience 18,615-623)。24小时后，使用抗CD73包被的磁珠对视杆细胞光感受器进行MAC分选(Eberle et al.(2011)“integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina”Investigative ophthalmology&visual science 52,6462-
6471)，并基于eGFP荧光对视锥细胞光感受器进行FAC分选(Fei and Hughes(2001)
“Transgenic expression of the jellyfish green fluorescent protein in the cone photoreceptors of the mouse”Visual neuroscience 18,615-623)。随后，从分选的视杆细胞和视锥细胞光感受器中分离出病毒DNA，并使用下一代测序(NGS)进行测序。在AAV2 VP1的第587位具有列出的肽插入物的下列新型AAV被赋予了在静脉内递送后24小时内靶向视网膜细胞并将它们的基因组转移到视网膜细胞核中的能力(仅列出具有2个或更多个NGS读段数的变体，具有20个以上NGS读段数的变体用粗体字母标记)见图1。

[0421] 此外，在AAV2 VP1的第587位具有列出的肽插入物的下列新型AAV被赋予了在静脉内递送后24小时内靶向视杆细胞光感受器的能力(仅列出具有2个或更多个NGS读段数的肽，具有20个以上NGS读段数的变体用粗体字母标记)(见图2)。

[0422] 最后，在AAV2 VP1的第587位具有列出的肽插入物的下列新型AAV被赋予了在静脉内递送后24小时内靶向视锥细胞光感受器的能力(仅列出具有2个或更多个NGS读段数的肽，具有20个以上NGS读段数的AAV用粗体字母标记)(见图3)。

[0423] 一些鉴定的变体含有推定的整合素结合基序，如RGD、RGS或NGR。这些携带所指示的插入序列的AAV总结在图4中。

[0424] 一些AAV在一个以上的实验中被检测到。具有相应数量NGS读段数的这些重叠AAV总结于图5中。值得注意的是，对于序列“RGSLQNA”，显示来自整个视网膜的NGS读段数是0。然而，这是一个错误。这是因为NGS读段数是针对视杆细胞和视锥细胞检测的。只有在先前的第一轮和第二轮选择中选择了插入序列时，才能获得这些数据，这两轮选择的特点是在视网膜中检测到了DNA。因此，这种插入序列以前一定也在视网膜中被检测到过。

[0425] 实施例2：新型AAV衣壳的生物学测试

[0426] 在AAV反式质粒pRC99(表达AAV2 Rep和Cap基因)的Asel/Mlul限制性位点中插入编码所选肽变体的合成DNA寡核苷酸，所述肽变体在其任一端的两侧各有2-3个丙氨酸(Nickiin et al.(2001)“Efficient and selective AAV2-mediated gene transfer directed to human vascular endothelial cells,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 4,174-181，和Girod et al.(1999)“Genetic capsid modifications allow efficient re-targeting of adeno-associated virus type 2”,Nature medicine 5,1052-1056)，导致产生AAV2 VP1-3开放阅读框，同时预期的肽插入位于对应于VP1的第587位氨基酸的位置。这些修饰的pRC99质粒用于生产AAV颗粒，所述AAV颗粒含有新型AAV衣壳变体，用于生物学测试。AAV的生产是通过(Michalakis et al.(2010)“Restoration of cone vision in the CNGA3-/-mouse model of congenital complete lack of cone photoreceptor function,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy,18,2057-2063)中所述的标准技术进行的。将含有CMV-eGFP表达盒(AAV-sc-CMV-eGFP)的自互补(sc)AAV eis质粒用于包装。然后将这种AAV颗粒(6x10E8-6x10E9总载体基因组)递送到成年野生型C56-BL6/J小鼠的玻璃体中(玻璃体内注射1pi AAV混悬液)，随后使用体内荧光眼底显微镜(共焦扫描激光检眼镜)检查小鼠。随后，取出眼睛，并处理眼杯以进行组织学分析，eGFP荧光成像和免疫组织化学。图6-9示出了结果。

[0427] 野生型AAV2血清型载体在视网膜下或玻璃体内递送时仅显示有限的转导效率(Lebherz et al.(2008)“Novel AAV serotypes for improved ocular gene transfer”The journal of gene medicine 10,375-382,Auricchio et al.(2001)“Exchange of surface proteins  impacts on  viral  vector cellular specificity and transduction characteristics:the retina as a model”Hum Mol Genet,10,3075-
3081,Hellstrom et al.(2009)“Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after 
intravitreal injection,Gene therapy 16,521-532)。特别地，从视网膜下腔，AAV2主要转导视网膜色素上皮(rpe)细胞(Auricchio et al.(2001)“Exchange of surface 
proteins impacts on viral vector cellular specificity and transduction 
characteristics:the retina as a model”Hum Mol Genet 10,3075-3081和Trapani et al.(2014)“Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies”Prog Retin Eye Res.)。从玻璃体内腔，AAV2主要转导Müller胶质细胞和视网膜神经节细胞(Auricchio et al.(2001)“Exchange of surface proteins impacts on viral vector cellular specificity and transduction characteristics:the retina as a model”Hum Mol Genet 10,3075-3081和Trapani et al.(2014)“Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies”Prog Retin Eye Res.)。

[0428] 对于玻璃体内转导的实施例，参见Hellstrom et al.(2009)“Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection,Gene therapy 16,521-532中的图2a，或者Auricchio et al.(2001)“Exchange of surface proteins impacts on viral vector cellular specificity and transduction characteristics:the retina as a model”Hum Mol Genet 10,3075-3081中的图4a。例如，关于视网膜下转导模式，参见(Lebherz et al.(2008)“Novel AAV serotypes for improved ocular gene transfer”The journal of gene medicine 10,375-382)中的图4。

[0429] 本文所述的特定修饰显著改变了我们的新型AAV衣壳变体的嗜性和转导行为，所述新型AAV衣壳变体现在能够非常有效地从视网膜下腔和玻璃体内腔转导多种视网膜细胞类型(见图6-10)。更重要的是，新型AAV从视网膜下腔和/或玻璃体内腔非常有效地转导视杆细胞和视锥细胞光感受器。总之，所选择的新型AAV衣壳变体的生物学测试显示了由我们的新型肽插入物所诱导的转导行为发生了显著改变，这对于旨在在基础研究中高效和高水平转导特定视网膜细胞类型的任何种类的实验或对于开发基于基因转移的眼部疾病治疗(例如眼部基因疗法)都非常有用。与细胞类型特异性启动子(例如视锥细胞或视杆细胞特异性启动子)结合，所述新型AAV衣壳变体将允许克服转导的天然障碍，并在全身应用后或在玻璃体内或结膜下递送后靶向特定细胞类型。

[0430] 我们的新型AAV衣壳变体的转导效率在永生化视锥光感受器细胞系661w中被进一步表征(Tan et al.(2004)“Expression of cone-photoreceptor-specific antigens in a cell line derived from retinal tumors in transgenic mice.”Investigative Ophthalmology&Visual Science 45 764–768)。为此，处于约60％融合率生长的661w以每细胞100，000个病毒基因组的感染复数(MOI)被新型AAV衣壳、野生型AAV2或工程化的AAV2变体7m8(即在CMV启动子控制下表达eGFP的LALGETTRP(SEQ ID NO.23))(Dalkara et al.(2013)“In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.”Science 
Translational Medicine,5(189)189ra76)感染。48小时后，使用落射荧光显微镜(EVOS FL细胞成像系统，Thermo Fisher Scientific)测定eGFP荧光。随后，将细胞用4％多聚甲醛在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中固定15分钟，用PBS洗涤并重悬以用于基于流式细胞术的eGFP信号测定(FACSCantoII系统，BD Bioscience)。与AAV2或7m8相比，新型AAV衣壳变体“NNPTPSR”和“GLSPPTR”显示出661w孔的优越转导效率。图11示出了结果。

[0431] 迄今为止的所有实验都是用修饰的AAV2衣壳进行的。然而，其它AAV衣壳也耐受相应衣壳位置的肽插入(Michelfelder et al.(2011)“Peptide ligands incorporated into the threefold spike capsid domain to re-direct gene transduction of AAV8 and AAV9 in vivo”PloS one,6,e23101)，因此我们的新型肽插入物可以转移到其他已知的AAV衣壳，例如AAV8、AAV9、AAV7或AAV5，已知它们与AAV2相比在视网膜中具有更高的效率和更宽的转导谱。此外，我们的新型AAV衣壳肽插入物可以与衣壳酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸突变结合(Petrs-Silva et al.(2009)“High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors”Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 17 463-471和Zhong et al.(2008)“Next generation of adeno-associated virus 2vectors:point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses”Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105,7827-7832)，以减少蛋白酶体介导的降解并提高转导效率。

[0432] 实施例3：视网膜横截面

[0433] 为了显示本文所述的AAV载体确实转导光感受器，AAV2“GLSPPTR”衣壳已被玻璃体内应用于活的小鼠。特别地，单次玻璃体内注射1μl(含有约2×10E9载体基因组)的包装有AAV2“GLSPPTR”衣壳的ss-mSWS-eGFP病毒悬液(也参见实施例2)玻璃体内应用于10周龄C57-BL6J小鼠。在小鼠SWS启动子的控制下，AAV-ss-mSWS-eGFP驱动eGFP的表达。6周后测定GFP的表达。为此，从眼睛的光感受器区域获取共焦扫描显微镜图像。如图12所示，在视锥细胞光感受器的视网膜横截面中可以检测到eGFP。在此，观察到视锥细胞光感受器中的强的抗eGFP免疫信号(灰色)。视锥细胞标记视锥抑制素的双重标记定量显示，78.7±3.1％(n＝4)的视锥抑制素阳性视锥细胞为eGFP阳性。因此，该实验表明所述AAV特异性靶向光感受器。

[0434] 实施例4：人外植体

[0435] 为了分析实施例1和2中描述的AAV载体是否也能转导人光感受器细胞，分析了人外植体。根据先前公布的方法，光感受器侧朝下培养验尸后的人视网膜组织(Fradot M et al.May 2011Gene therapy in ophthalmology:validation on cultured retinal cells and explants from postmortem human eyes.Human gene therapy.22(5):587-93)。在第0天，通过将1×10E11总vg的、包装有新型AAV2“GLSPPTR”或“NNPTPSR”衣壳之一的sc-CMV-eGFP施用于视网膜的玻璃体侧，来转导人视网膜组织外植体，并将其在体外培养9天(DIV)。
在DIV9，除去培养基，用4％多聚甲醛在磷酸盐缓冲盐水中固定组织，随后使用共聚焦显微镜进行冷冻切片和天然eGFP荧光成像。

[0436] 在图13中，代表性的共聚焦扫描显微镜图像显示，在人视网膜外植体中发现AAV介导的eGFP表达(衣壳肽插入序列在每个图像栏的顶部给出)。值得注意的是，在多种视网膜细胞类型和层中观察到强烈的天然eGFP荧光(灰色)。特别地，许多光感受器内节(is)和外核层(onl)内的细胞体是eGFP阳性的。IS，内节。ONL，外核层。INL，内核层。ONL，内核层。GCL，神经节细胞层。

[0437] 实施例5：ERG测量(视锥细胞中的转基因表达)

[0438] 为了分析如实施例1和2中获得的AAV载体是否也能有效地向光感受器细胞提供转基因，进行了ERG测量。视网膜电图(ERG)是技术人员已知的诊断测试，其测量视网膜中的神经细胞和非神经细胞响应光刺激而产生的电活动。所述电响应是由光诱导的跨视网膜离子(主要是钠离子和钾离子)流量变化产生的视网膜电位的结果。

[0439] 在本实验中，使用了Cnga3缺陷(CNGA3-/-)小鼠，这些小鼠由于视锥细胞光感受器环核苷酸门控(CNG)通道亚基CNGA3的基因缺失而具有先天性无功能的视锥细胞光感受器。实施例2的AAV载体适于在靶向视锥细胞的蓝色(短波长敏感，SWS)视蛋白启动子(ss-mSWS-mCnga3-WPRE)控制下驱动小鼠CNGA3互补DNA的表达。该技术也在(Michalakis et al.(2010)Restoration of Cone Vision in the CNGA3-/-Mouse Model of Congenital Complete Lack of Cone Photoreceptor Function Mol Ther.:2057–2063)中被描述。用如实施例2中公开的“GLSPPTR”衣壳包装AAV2。约1x10E10总vg的AAV颗粒在4周龄Cnga3缺陷小鼠中被玻璃体内递送。

[0440] 具体地，ERG测量是在单次玻璃体内注射1μl(含ss-mSWS-mCnga3-WPRE的约1×10E10总vg)后2个月进行的。代表性的明视闪烁ERG测量值如图14所示。图中显示了在
3.1log cd sec/m2和指示频率的刺激下处理的眼(黑色)和未处理的对照眼(虚线灰色)的迹线。

[0441] 接受包含转基因的AAV载体的Cnga3缺陷小鼠表现出振幅的增加。振幅的增加指示在明视条件下视锥细胞系统功能的改善，而未处理的Cnga3缺陷型小鼠不响应于光刺激(Michalakis et al.(2010)Restoration of Cone Vision in the CNGA3-/-Mouse Model of Congenital Complete Lack of Cone Photoreceptor Function Mol Ther.:2057–2063)。

[0442] 在ERG测量之后，收集处理的眼和未处理的对照眼，并如(Michalakis et al.(2010)Restoration of Cone Vision in the CNGA3-/-Mouse Model of Congenital Complete Lack of Cone Photoreceptor Function Mol Ther.:2057–2063)中所述将其处理以用于抗CNGA3免疫组织化学分析CNGA3蛋白表达。

[0443] 代表性的数据在图15中示出。特别地，共聚焦扫描显微镜图像显示，在单次玻璃体内注射1μl(含约1×10E10总vg)的包装有新型AAV2“GLSPPTR”衣壳的ss-mSWS-mCnga3-WPRE(Michalakis et al.2010，本文别处已引用)2个月后，来自3月龄Cnga3缺陷小鼠的视网膜横截面上的视锥细胞光感受器表达CNGA3蛋白。在花生凝集素(PNA)阳性视锥细胞光感受器中发现强烈的抗CNGA3免疫信号。os，外节。onl，外核层。inl，内核层。gcl，神经节细胞层。

[0444] 实施例6：ERG测量(视杆细胞中的转基因表达)

[0445] 类似于实施例5，图16显示了3月龄Cnga3缺陷小鼠在单次玻璃体内注射1μl(含约1×10E10总vg)的包装有新型AAV2“NNPTPSR”衣壳的ss-mRho-mCngb1-sv40((Koch et al.(2012)Gene therapy restores vision and delays degeneration in the CNGB1-/-mouse model of retinitis pigmentosa.Hum Mol Genet.:4486–4496)2个月后的代表性的暗视单闪烁ERG测量结果。示出了在指示的光刺激亮度下来自处理的眼(黑色)和未处理的对照眼(虚线灰色)的迹线。

[0446] 必须指出，本文所使用的单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对于“一种试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，以及对于“所述方法”包括本领域普通技术人员已知的等效步骤和方法，这些步骤和方法可以被修改或替代本文所述的方法。

[0447] 此外，本文所用术语“约”指的是可测量的值，例如多核苷酸或多肽序列的长度、剂量、时间、温度等的量，意在包括特定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。本文所用术语“和/或”指的是并包括相关列出项的一个或多个的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)解释时组合的缺乏。

[0448] 除非上下文另有说明，否则明确的意图是可以以任何组合使用本文所述的本发明的各种特征。

[0449] 此外，本发明还预期在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文所阐述的任何特征或特征的组合。

[0450] 本公开中引用的所有出版物和专利通过引用整体并入。被引入以供参考之数据范围与本说明书抵触或不符时本说明书将取代任何此类资料。

[0451] 除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为意指该系列中的每个元素。本领域技术人员将认识到，或者仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在被本发明所包含。

[0452] 在整个说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变体将被理解为意指包括所陈述的整体(integer)、或整体(integers)或步骤(steps)的步骤(step)或分组(group)，但不排除任何其他整体(integer)、或整体(integer)或步骤(step)的步骤(step)或分组(group)。当在本文使用时，术语“包含”可以用术语“包括”代替，或者当在本文使用时，有时用术语“具有”代替。

[0453] 当在本文中使用时，“由......组成”排除了权利要求元素中未具体指明的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“主要由……组成”不排除实质上不影响权利要求的基础和新颖特征的材料或步骤。

[0454] 在本文中的各种情况下，术语“包括”、“主要由……组成”和“由......组成”中的任何一个都可以用另外两个术语中的任何一个来代替。

[0455] 在本说明书的整个文本中引用了若干文献。本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、规范等)，无论是上文还是下文，通过引用将其全部内容并入本文中。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这种公开。

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