五环三萜衍生物的医药用途、五环三萜衍生物、包含其的药物组合物 |
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| 申请号 | CN202311207625.0 | 申请日 | 2023-09-19 | 公开(公告)号 | CN117731675A | 公开(公告)日 | 2024-03-22 |
| 申请人 | 上海科技大学; 临港国家实验室; 中科苏州药物研究院; | 发明人 | 梅良和; 谢成英; 白芳; 王亚芳; 徐岚松; 张向磊; 徐超; 张星宇; 王林; 曾洁; 吴洒男; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了以下化合物(I)或者其药学上可接受的盐、酯、光学异构体、互变异构体、立体异构体、多晶型物、 溶剂 合物、N‑ 氧 化物、同位素标记的化合物、 代谢物 、 螯合物 、络合物、包合物或前药，以及含有本发明的化合物的药物组合物，还提供本发明化合物作为维A酸相关孤儿受体γt(RORγt)拮抗剂或反向激动剂或者NF1 抑制剂 的用途，以及在与维A酸相关孤儿受体γt或者NF1异常激动相关 疾病 药物制备中的应用，及相应的药物组合物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.式(1)所示的五环三萜化合物或者其药学上可接受的盐、酯、光学异构体、互变异构 |
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| 说明书全文 | 五环三萜衍生物的医药用途、五环三萜衍生物、包含其的药物组合物 技术领域[0001] 本发明属于五环三萜衍生物技术领域，具体涉及一种作为RORγt拮抗剂和反向激动剂剂的五环三萜衍生物、其制备方法及用途。 背景技术[0002] 维A酸相关孤儿受体家族(RORs)属于核受体超家族，包含RORα，RORβ，RORγ三个亚家族，于组织中广泛分布。RORs可进入细胞核参与调控相关基因的转录，继而调控不同的生理和病理过程。RORγ由rorc基因表达并产生两种不同的亚型，分别为RORγ1和RORγ2，也 称为RORγt。RORγt的mRNA序列相对RORγ减少100个碱基，蛋白序列相差21个氨基酸，两种 亚型表现出明显的组织分布和基因调控差异性，RORγ在人体中广泛表达，而RORγt主要表 达于胸腺和Th17细胞中。在小鼠中，若RORγ和RORγt的表达同时缺失，则会加剧胸腺细胞 坏死。此外，小鼠多数会表现出淋巴结和派尔集合淋巴结(Peyer’s patches)缺失。在基因 嵌入小鼠模型中，使用绿色荧光蛋白(GFP)替代RORγt，但不影响RORγ的表达，结果表明 RORγt对于淋巴组织诱导细胞的形成和淋巴组织的正常发育至关重要(非专利文献1)。从 结构组成来看，两者均含有相同地N端激活结构域(AF1，A/B)，DNA结合结构域(DBD)，中间的铰链区(Hinge)，C端的受体结合结构域(LBD)以及AF‑2区域。RORγt的LBD区域高度保守，相对其他亚家族，其序列相似性约为50％。转录阶段，LBD通过结合小分子激动剂或拮抗剂招 募共激活因子或共抑制因子调控RORγt的转录活性。根据小分子配体对RORγt的调控作 用，可分为激动剂，拮抗剂和反向激动剂三类。所谓激动剂会促进效应蛋白与RORγt结合， 而拮抗剂则会破坏效应蛋白与RORγt形成功能复合体。反向激动剂则会促进抑制因子与 RORγt的结合，继而降低转录效率。RORγt是促进和调控辅助性T细胞，γδT细胞，先天性淋巴细胞(ILCs)，淋巴组织诱导细胞(LTi)中促炎因子IL‑17表达的关键蛋白。一系列研究发 现，多种针对RORγt上下游蛋白如IL‑12p40，IL‑17A的单克隆抗体在治疗银屑病方面具有 良好的效果。除此之外，研究表明特异性阻断IL‑17A，IL‑23p19对多样性硬化(MS)，银屑病(psoriasis)，银屑病性关节炎(psoriatic arthritis)，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，炎症性肠病(inflammatory bowel disease)等免疫性疾病具有较好的治疗前 景。 [0003] 因此，RORγt渐已成为治疗炎症性疾病的重要靶点，并且在肥胖和肿瘤免疫治疗方面也具有良好的效果。GSK2981278是一种RORγt的反向激动剂，用于治疗斑块型银屑病 (非专利文献2)。临床前的体外研究结果表明，Jurkat细胞中，GSK2981278可以剂量依赖地 阻断RORγt的活化，抑制细胞中内源性的IL‑17a的表达。在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小 鼠模型中，外用含有GSK2981278的乳膏可以有效降低小鼠皮肤表面红肿，结痂和增生等银 屑病性症状。LYC‑55716是Lycera公司研发的一种口服RORγ激动剂，在调控基因表达，增强免疫细胞功能的同时能降低免疫抑制机制，继而进一步扩大T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤 作用(非专利文献11)。相对于传统的免疫治疗药物，LYC‑55716能促进淋巴细胞分泌IL‑17 和其他细胞因子的分泌，激活免疫系统，提高淋巴细胞的细胞毒性；与此同时化合物能抑制 调节性T细胞的产生，阻断该类细胞对免疫反应的抑制作用，削弱免疫抑制通路。 [0004] 特异性设计RORγt的拮抗剂和反向激动剂对于免疫性炎症性疾病和肿瘤的治疗具有重要意义和良好的应用前景，寻找特异性设计RORγt的拮抗剂和反向激动剂一直是免 疫性炎症性疾病和肿瘤的治疗药物开发的重要方向。 [0005] 非专利文献 [0006] 1.Eberl，G.ROR γ t，a multitask nuclear receptor at mucosal surfaces.Mucosal Immunology 2017，10，27‑34. [0007] 2.Smith，S.H.；Peredo，C.E.；Takeda，Y.；Bui，T.；Neil，J.；Rickard，D.；Millerman，E.；Therrien，J.‑P.；Nicodeme，E.；Brusq，J.‑M.；Birault，V.；Viviani，F.； Hofland，H.；Jetten，A.M.；Cote‑Sierra，J.Development of a Topical Treatment for Psoriasis Targeting RORγ:From Bench to Skin.In PLoS One，2016；Vol.11，p e0147979. [0008] 3.Aicher TD，Van Huis CA，Hurd AR，Skalitzky DJ，Taylor CB，Beleh OM，Glick G，Toogood PL，Yang B，Zheng T，Huo C，Gao J，Qiao C，Tian X，Zhang J，Demock K，Hao LY，Lesch CA，Morgan RW，Moisan J，Wang Y，Scatina J，Paulos CM，Zou W，Carter LL，Hu X.Discovery of LYC‑55716:A Potent，Selective，and Orally Bioavailable Retinoic Acid Receptor‑Related Orphan Receptor‑γ(RORγ)Agonist for Use in Treating Cancer.J Med Chem.2021Sep 23；64(18):13410‑13428 发明内容[0010] 具体而言，本发明提供式(1)所示的五环三萜化合物或者其药学上可接受的盐、酯、光学异构体、互变异构体、立体异构体、多晶型物、溶剂合物、N‑氧化物、同位素标记的化合物、代谢物、螯合物、络合物、包合物或前药，作为维A酸相关孤儿受体γt拮抗剂或反向激动剂的用途， [0011] [0012] 式(1)中，X1选自单键、‑C(CH2)‑、CH2或者C＝O，当X1为单键时，其所在环为五元环，[0013] 表示单键或者双键， [0014] X2选自‑C(CR1R2)‑、‑CR1＝、CH2或者C＝O，R1和R2各自独立地为H、卤素、NH2、OH、SH、氰基、硝基、羟甲基、羟基、酰胺基、C1～C6烷基、C1～C6卤代烷基、C1～C6烷氧基、C1～C6烷氧基‑C1～C6亚烷基、C1‑6烷基取代氨基、取代或未取代的C2‑10的脂肪族烃基、取代或未取代的饱和或部分不饱和的3‑10元杂环基、取代或未取代的C6‑10芳基、或者取代或未取代的5‑14元杂芳基； [0015] X3选自‑CHR3‑、或者C＝O，R3选自H、胍基、NH2、NHR4、OH、C1‑6烷基取代氨基、‑Si4 (R)3、C1‑6烷基、C1‑6烷氧基、饱和或部分不饱和的C3‑6环烃基、饱和或部分不饱和的3‑10 4 4 4 元杂环基、C6‑10芳基、5‑14元杂芳基、C6‑12芳烷基、NH(C＝O)R 、‑C(＝O)R、‑OC(＝O)R 、‑C 4 4 (＝O)OR；其中，R为H、叔丁氧羰基、C1～C6烷基、饱和或部分不饱和的C 3‑6环烃基、饱和或部分不饱和的3‑10元杂环基或者C6‑10芳基； [0016] F选自H、卤素、NH2、OH、SH、C1‑6烷基取代氨基、取代或未取代的C2‑10的脂肪族烃基、取代或未取代的饱和或部分不饱和的3‑10元杂环基、取代或未取代的饱和或部分不饱和的3‑10元桥杂环基、取代或未取代的C6‑10芳基、或者取代或未取代的5‑14元杂芳基； [0017] E选自H、卤素、NH2、OH、SH、CN、胍基、C1‑6烷基取代氨基、取代或未取代的C1‑10的脂肪族烃基、取代或未取代的饱和或部分不饱和的3‑10元桥环烷基、取代或未取代的饱和或部分不饱和的3‑10元的杂环基、取代或未取代的饱和或部分不饱和的3‑10元桥杂环基、 取代或未取代的饱和或部分不饱和的3‑10元稠杂环基、取代或未取代的C6‑10芳基、或者取 5 5 5 5 5 代或未取代的5‑14元的杂芳基、‑C(＝O)R、‑OC(＝O)R 、‑C(＝O)OR 、‑OR 、‑SR 、‑S(＝O) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 R、‑S(＝O)2R、‑S(＝O)2N(R)2、‑N(R)2、‑C(＝O)N(R)2、‑NR‑C(＝O)R、‑NR ‑C(＝O)OR 、‑ 5 5 5 5 5 5 NR‑S(＝O)2‑R 、C(＝O)‑N(R)2、‑C1‑6亚烷基‑N(R)2、‑C1‑6亚烷基‑OR、‑C1‑6亚烯基‑OR 5 5 和‑O‑C1‑6亚烷基‑N(R)2、 其中，R为H、NH2、胍基、C1～C6烷基、饱和或部分不饱和 的C 3‑6环烃基、饱和或部分不饱和的3‑10元杂环基或者C6‑10芳基； [0018] Y为化学键、O、S、NH、‑C(CH2)‑、 或者C＝O； [0019] Z选自化学键、C1‑6亚烷基、C2‑6亚烯基、C2‑6亚炔基、饱和或部分不饱和的C3‑107 亚环烃基、‑O‑、‑CO‑、‑C(＝O)O‑、‑O C(＝O)‑、‑CONR‑、‑NHCO‑、‑NHCONH‑、‑NH‑、‑S‑、亚磺 7 酰基、磺酰基中的一种，R表示H、C1‑6烷基取代氨基、取代或未取代的C1‑10的脂肪族烃基； [0020] L1和L2各自独立地为连接基团，其表示化学键、或直链或支链的C1～C6的亚烷基链，其中所述直链或支链的C1～C6的亚烷基链可选地被一或多个选自‑O‑、‑CO‑、‑C(＝O) 4 4 O‑、‑CONH‑、‑NHCO‑、‑NHCONH‑、‑NH‑、‑NR ‑、‑C(R)2‑、‑S‑、亚磺酰基、磺酰基、亚磺酰氧基、磺酰氧基、‑氨基磺酰基氨基‑、亚炔基、亚烯基、亚环烷基、 或它们的任意组合 中的二价基团中断一或多次；或者所述直链或支链的C1～C6的亚烷基链可以被选自‑C(＝ [0021] O)R5、‑OC(＝O)R5、‑C(＝O)OR5、‑OR5、‑SR5、‑S(＝O)R5、‑S(＝O)2R5、‑S(＝O)2N5 5 5 5 5 5 5 5 5 (R)2、‑N(R)2、‑C(＝O)N(R)2、‑NR‑C(＝O)R、‑NR ‑C(＝O)OR、‑NR‑S(＝O)2‑R、‑C(＝O)‑ 5 5 5 5 5 5 N(R)2、‑C(＝O)‑N(OR)R、‑C1‑6亚烷基‑N(R)2、‑C1‑6亚烷基‑OR、‑C1‑6亚烯基‑OR和‑O‑ 5 C1‑6亚烷基‑N(R)2中的一种或多种取代， [0022] 上述的取代或未取代是指基团中的H被选自卤素、氰基、硝基、羟基、氨基、醛基、酯基、C1～C30烷基、C1‑6烷基取代氨基、C1～C30烷氧基、C2～C20杂环烷基、C1～C30烷基硅基、C6～C30芳基、C6～C30芳氧基、C3～C30杂芳基、C6～C30芳基氨基或C3～C30杂芳基氨基中的一种或者至少两种的组合以上的基团所取代，或者指基团中的‑CH2‑中的两个H被替换成氧代＝O。 [0023] 本发明化合物能特异性结合于RORγt的配体结合结构域，抑制促炎因子IL‑17表达。因此，本发明的化合物能作为维A酸相关孤儿受体γt RORγt拮抗剂或反向激动剂使 用，基于该用途，这些化合物可以在制备用于治疗以及缓解与ASK1异常激活或表达相关的 疾病的药物中的应用，所述疾病包括且不限于非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、肾细胞癌、黑色素瘤、神经纤维瘤、淋巴瘤、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、白血病、银屑病、银屑病性关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、动脉粥样硬化、肥胖、糖尿病、糖尿病性肾病、冠心病、风湿性心脏病、心肌梗塞、心肌肥大、哮喘、肺动脉高压、阿尔兹海默症、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化等疾病，尤其是适合用于非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌的治疗和缓解 药物。 [0024] 另外，本发明中的化合物能与I型神经纤维瘤蛋白(NF1)结合。为了进一步深入探索本发明化合物抗肿瘤的内在作用机制，后述实施例中展示了本发明化合物与KRAS以及不 同突变体的亲和力评价数据。KRAS为Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，与I型神经纤维 瘤蛋白(NF1)有直接的相互作用，具体为NF1作为KRAS的GTP酶激活蛋白，调控GTP与KRAS的 结合，与肿瘤的发生和发展密切相关。也就是说，本发明的化合物同样作为KRAS及不同突变 G12C G12D G12V G13D 体，包括KRAS 、KRAS 、KRAS 、KRAS ，和KRAS同源的Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同 源物HRAS、神经纤维瘤大鼠肉瘤病毒癌基因同源物NRAS的抑制剂的用途。 [0025] 由此可知，上述式(I)所示的化合物，都可以在制备用于治疗以及缓解与选自I型神经纤维瘤蛋白NF1、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物KRAS、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基 G12C G12D 因同源物变体KRAS 、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物变体KRAS 、Kirsten大鼠肉瘤 G12V G13D 病毒癌基因同源物变体KRAS 、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物变体KRAS 、Harvey 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物HRAS、和神经纤维瘤大鼠肉瘤病毒癌基因同源物NRAS中的一种 以上的异常激活或表达相关的疾病的药物中的应用。这些疾病，包括但是不限于非小细胞 肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、肾细胞癌、黑色素瘤、神经纤维瘤、淋巴瘤、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、白血病、银屑病、银屑病性关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、动脉粥样硬化、肥胖、糖尿病、糖尿病性肾病、冠心病、风湿性心脏病、心肌梗塞、心肌肥大、哮喘、肺动脉高压、阿尔兹海默症、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化等疾病，尤其是适合用于非小细胞肺 癌、结直肠癌、胰腺癌的治疗和缓解药物。 [0026] 综上本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于制备缓解和治疗与ROR γt或NF1异常活化相关的疾病的药物中的应用。 [0027] 在本发明优选的实施方式中，式(1)表示的化合物具有下述式(2)或者式(3)的结构， [0028] [0029] 在式(2)中，X2、X3、Y、Z、E、F、L1、L2表达的意思与式(1)中相同。 [0030] 在本发明优选的实施方式中，Y为‑C(CH2)‑、 或者C＝O； [0031] Z为‑C(＝O)O‑、‑O C(＝O)‑、‑CONH‑、‑NHCO‑、或者‑CONMe‑。 [0032] 在本发明优选的实施方式中，L1和F的组合，或者，L2和E的组合，各自独立地为H、Me、或以下基团中的一种或这些基团的组合： [0033] [0034] 其中Hal代表F、Cl、Br、I， 表示连接的位置，“—”划过的环结构的表达方式，表示连接位点于该环结构上任意能够成键的位置。 [0035] 在本发明优选的实施方式中，L1和L2各自独立的表示单键或者式(4)所示的二价基团， [0036] [0037] n0为0或1；m为1‑5的整数、优选为2或3；n1为0‑3的整数，优选为1；n2为0‑3的整数，优选为1；n3为0‑3的整数，优选为1；n4为0‑3的整数，优选为1；n5为0‑3的整数，优选为1； [0038] Z0为单键、‑CH2‑、‑CHR9‑、‑NH‑、‑O‑、‑S‑、 [0039] [0040] ‑CO‑、或‑C(＝O)O‑； [0041] Z1为单键、‑CH2‑、‑CHR9‑、‑NH‑、‑O‑、‑S‑、 [0042] [0043] ‑CO‑、或‑C(＝O)O‑； [0044] Z2为单键、‑CH2‑、‑CHR9‑、‑NH‑、‑O‑、‑S‑、 [0045] [0046] ‑CO‑、或‑C(＝O)O‑； [0047] 其中R9为C1‑6烷基取代氨基、取代或未取代的C1‑10的脂肪族烃基、‑C(＝O)R10、‑10 10 10 10 10 10 10 10 OC(＝O)R 、‑C(＝O)OR 、‑OR 、‑SR 、‑S(＝O)R 、‑S(＝O)2R 、‑S(＝O)2N(R )2、‑N(R )2、‑ 10 10 10 10 10 10 10 10 C(＝O)N(R )2、‑NR ‑C(＝O)R 、‑NR ‑C(＝O)OR 、‑NR ‑S(＝O)2‑R 、C(＝O)‑N(R )2、‑ 10 10 10 10 C1‑6亚烷基‑N(R )2、‑C1‑6亚烷基‑OR 、‑C1‑6亚烯基‑OR 和‑O‑C1‑6亚烷基‑N(R )2；其 10 中，R 为H、胍基、C1～C6烷基、饱和或部分不饱和的C 3‑6环烃基、饱和或部分不饱和的3‑10元杂环基或者C6‑10芳基； 表示连接的位置，两端连接方向任意调换， [0048] 上述的取代或未取代是指基团中的H被选自卤素、氰基、硝基、羟基、氨基、醛基、酯基、C1～C30烷基、C1‑6烷基取代氨基、C1～C30烷氧基、C2～C20杂环烷基、C1～C30烷基硅基、C6～C30芳基、C6～C30芳氧基、C3～C30杂芳基、C6～C30芳基氨基或C3～C30杂芳基氨基中的一种或者至少两种的组合以上的基团所取代，或者指基团中的‑CH2‑中的两个H被替换成氧代＝O。 [0049] 上述医药用途中，所述式(I)化合物的施用剂量为0.1‑200mg/kg。 [0050] 本发明同样提供具有通式(I)结构的化合物或者其药学上可接受的盐、酯、光学异构体、互变异构体、立体异构体、多晶型物、溶剂合物、N‑氧化物、同位素标记的化合物、代谢物、螯合物、络合物、包合物或前药，具体结构式与优选实施方式与上述相同不赘述，但是条件是：式(1)所示的化合物不为以下具体化合物 [0051] [0052] 本发明的化合物中各基团的具体例和优选例，以及本发明化合物的具体例子，与上述医药用途中化合物中各基团的具体例和优选例、化合物的优选例相同，在此不赘述。 [0053] 本发明还提供一种药物组合物，其包含预防或治疗有效量的式(I)所示的化合物或者其药学上可接受的盐、酯、光学异构体、互变异构体、立体异构体、多晶型物、溶剂合物、N‑氧化物、同位素标记的化合物、代谢物、螯合物、络合物、包合物或前药，以及药学上可接受的载体，所述药物组合物优选为固体制剂、半固体制剂、液体制剂或气态制剂。 [0054] 本发明的一个实施方式中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型或注射剂，所述口服剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。用于口服给药的液体剂型包括药学上可 接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂；所述注射剂包含生理上可接受的无菌含水或无水 溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的本发明的化 合物或者其药学上可接受的盐、酯、光学异构体、互变异构体、立体异构体、多晶型物、溶剂合物、N‑氧化物、同位素标记的化合物、代谢物、螯合物、络合物、包合物或前药的无菌粉末。 [0055] 本发明中，维A酸相关孤儿受体γt有时简称为RORγt。有时，I型神经纤维瘤蛋白NF1、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物KRAS、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物变体 G12C G12D KRAS 、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物变体KRAS 、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同 G12V G13D 源物变体KRAS 、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物变体KRAS 、Harvey大鼠肉瘤病毒 癌基因同源物HRAS、和神经纤维瘤大鼠肉瘤病毒癌基因同源物NRAS分别简称为：NF1、KRAS、G12C G12D G12V G13D KRAS 、KRAS 、KRAS 、KRAS 、HRAS、和NRAS。 [0056] 术语“约”是指在所述数值的±10％范围内，优选±5％范围内，更优选±2％范围内。 [0057] 本发明的优选化合物 [0058] 已经记载本发明化合物的通式和优选范围。进一步优选地，本发明化合物的具体例子可以选自如下结构的任意一种，但是并不限于以下化合物： [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0074] 本发明化合物获得的一般方法 [0075] 通式合成方法 [0076] 本发明通式(I)所示的五环三萜衍生物化合物可以通过公知方法获得，例如通过公知的有机合成方法进行合成。以下给出了实例性的合成路线，但是本领域人员也可以通 过公知的其他方法获得。 [0077] 在本发明中，对所述化合物的合成方法进行简要说明，通式(I)化合物的代表性合成路径按照以下的分类进行说明。 [0078] 1.C‑28羧酸部位的改造修饰 [0079] 白桦脂酸/醇的C‑28是最常见的一个修饰位点也是最容易改造的一个反应位点，常见的修饰方式有(1)可以生成酸与醇缩合或卤代烃反应合成白桦脂酸的酯；(2)酸与胺缩 合合成C‑28的白桦脂酰胺；(3)醇氧化为白桦脂醛与胺还原胺化合成白桦脂酸酰胺的衍生 物；(4)白桦脂酸Claisen重排合成白桦脂C‑17‑胺。 [0080] 1.1白桦脂酸酰胺衍生物的合成 [0081] 常见的酰胺合成方法主要包括：(1)羧酸与胺的缩合酰化反应；(2)胺与酰卤的酰化反应；(3)胺与酸酐(或混合酸酐)的酰化反应；(4)酯交换为酰胺。 [0082] 羧酸与胺的缩合酰化反应包括(1)混合酸酐法：酸与氯甲酸甲酯或异丁酯、羰基二咪唑、磺酰氯，Boc酸酐等方法。(2)缩合剂法：碳二亚胺类缩合剂(包括DCC，DIC，EDCI)，使用该缩合剂一般会添加DMAP，HOBt等酰化的催化剂或活化剂；DCC和DIC的价格比较便宜，DCC 有一个最大的缺点就是反应的另外一个产物二环己基脲在一般的有机溶剂中溶解度很小 但又有一些微溶。EDCI主要的特点是反应生产的尿是水溶性的，容易洗涤。一般是EDCI和 HOBt合用。碳鎓盐类缩合剂包括：HATU，TBTU等，HATU是活性最高的碳鎓盐类缩合剂，由于价格比较贵，经常在其它缩合剂效果不好时才用到它。使用碳鎓盐缩合剂进行酰胺缩合主要 是通过分子内的转移，一步得到相应的活性酯。鏻鎓盐类的缩合剂包括BOP和PyBOP，这两个 均为较强的缩合剂。 [0083] 酰卤(酰氯、酰溴、酰氟)与胺作用是合成酰胺的最简便的方法；通过酰氯、酰溴与脂肪族、芳香族胺均可以迅速酰化，以较高的产率生成酰胺。酰卤最常用的是酰氯一般由酸 与二氯亚砜或草酰氯反应生产酰氯。 [0084] 文献报道的白桦脂酸的C‑28酰胺衍生物的合成方法主要包括：(1)白桦脂酸与胺[1，2] [3] 直接缩合酰化，缩合剂大部分DMAP/EDCI，DCM. ；或HOBt，TBTU，THF ，都是在白桦脂酸3‑β‑OH不保护的条件与活性较高的脂肪胺直接缩合，直接缩合的方法不太适合和芳香胺或者 位阻较大的脂肪胺；(2)白桦脂酸3‑β‑OH用Ac‑保护后生产的3‑β‑于先阳基白桦脂酸，在二氯亚砜或草酰氯，以DMF为催化剂合成3‑AcO‑白桦脂酸酰氯，与胺反应，生产的3‑乙酰氧白桦脂酸酰胺随后碱催化的条件下在甲醇溶剂中，酯交换脱保护中生成相应的白桦脂酰 [4] 胺 。 [0085] 参考文献合成方法，和脂肪胺等高活性的胺的缩合我们也采用直接缩合的方法，我们用活性较好的HATU和BOP，如Scheme 1，和位置比较大胺或芳胺采用酰氯的方法进行缩 合。 [0086] Scheme 1:合成化合物 [0087] [0089] 适用化合物1‑18。 [0090] Scheme 2:白桦脂酸‑C‑28酰胺衍生物的合成 [0091] [0092] 以商业化的BA和3‑5个碳二胺或4‑7元环二胺或对应的单N‑Boc保护二胺，以经典的肽偶联反应，HATU或BOP作为缩合剂，DIPEA为碱，DMF作为溶剂，合成白桦脂酸二胺的酰胺衍生物。N‑Boc保护的白桦脂酸二胺衍生物，在酸性条件下脱保护得到游离胺，然后还原胺 化条件进行烷基化(DCM做溶剂，醛/HOAc/NaBH3CN)得到所需的目标产物。 [0093] 适用化合物19‑33。 [0094] Scheme 3:白桦脂酸的酰胺衍生物合成方法2 [0095] [0096] 芳香胺类活性较弱的胺用经典的肽偶联试剂如HATU，BOP均无反应。在DMAP存在下，白桦脂酸与乙酸酐在DCM中反应得到3‑乙酰化白桦脂酸，3‑乙酰化白桦脂酸在DCM中加 入草酰氯得到3‑乙酰化白桦脂酰氯，3‑乙酰化白桦脂酰氯与胺反应得到3‑乙酰化白桦酯酸酰胺衍生物，然后用K2CO3/MeOH脱乙酰基，得到目标化合物[5‑6]。 [0097] 适用化合物34‑49。 [0098] Scheme 4： [0099] [0100] 适用化合物50。 [0101] Scheme 5： [0102] [0103] 适用化合物51。 [0104] Scheme 6 [0105] [0106] 适用化合物52‑54。 [0107] Scheme 7:白桦脂酸酯的合成 [0108] [0110] Scheme 8:合成化合物204，205，207and 208 [0111] [0112] 化合物204，025，207和208按照Scheme 8路线合成。白桦脂酸和2，2‑二乙氧基乙烷‑1‑胺以干燥DMF为溶剂、BOP为偶联试剂、DIPEA为碱偶联得到白桦脂酸2，2‑二乙氧基乙烷‑1‑胺酰胺207‑1，然后在酸性条件下脱保护得到相应的醛，醛与吡咯烷或3‑羟基吡咯烷在DCM溶液中，以NaBH(OAc)3为还原剂和HOAc为催化剂，与相对于的胺还原胺化得到目标化 合物204，205，207和208。 [0113] 适用化合物56‑59。 [0114] Scheme 9 [0115] [0116] (a)Ac2O，TEA，DMAP，DCM，reflux；(b)Al(OiPr)3，i‑PrOH；(c)PCC/DCM；(d)K2CO3，DCM/MeOH；(e)N1，N1‑dimethylpropane‑1，3‑diamine，HOAc，NaBH(OAc)3，DCE； [0117] 白桦酯醇在Ac2O/Py体系中生产C‑3，C‑28的白桦脂醇的乙酰衍生物。随后在Al[9] (OiPr)3，i‑PrOH体系中选择性去除C‑28乙酰基得到C‑3‑乙酰基‑白桦脂醇 。 [0118] 适用化合物60。 [0119] Scheme 10 [0120] [0121] 适用化合物61。 [0122] 2.白桦脂酸E环C‑29，C‑30的改造修饰 [0123] 白桦脂酸的E环C‑29，C‑30的甲基乙烯是白桦脂酸的一个常见的修饰位点。烯烃可以形成环丙烷，氧化得到酮，甲基可以氧化为醛或发生溴代反应，进一步合成C‑30胺取代衍生物。C‑20烯烃是白桦脂酸的另外已修饰位点：烯烃可以与卡宾试剂反应生产环丙烷系列，与间氯过氧苯甲酸形成环丙烷，与OsO4氧化合成酮。 [0124] Scheme 11： [0125] [0126] 化合物153根据Scheme 11合成。将白桦脂酸在K2CO3存在下在丙酮溶液中与苄溴反[10] 应得到白桦脂酸苄酯 。然后在DCM溶液中，在二乙基锌存在下用二碘甲烷将C‑28酯153‑1 [11] 转化为153‑2的C‑20环丙基化合物 。C‑28酯153‑2在EtOAc和MeOH的混合溶液中，以以Pd/C为催化剂加氢脱保护成C‑28酸，C‑20环丙基白桦脂酸与用N1，N1二乙基乙烷‑1，2‑二胺在DMF溶液中，以HATU为缩合剂、以DIPEA为碱缩合得到化合物153。 [0127] 适用化合物62。 [0128] Scheme 12： [0129] [0130] 白桦脂酸的烯烃在可以再OsO4为催化剂，NaIO4为氧化剂，MeCN/H2O为溶剂的氧化为酮[12]。 [0131] 适用化合物63。 [0132] Scheme 13： [0133] [0134] 白桦脂酸的C‑30的烯丙甲基可以用NBS处理合成C‑30的溴甲基衍生物，随后后与胺反应生产C‑30胺基取代的白桦脂酸衍生物[13‑15]。C‑30的溴代物与8‑BOC‑3，8‑二氮杂双环[3.2.1]辛烷反应合成了白桦脂酸的C‑30胺基衍生物，随后C‑28的羧酸与胺反应生产 白桦脂酸的C‑30胺基取代C‑28的酰胺衍生物384(Scheme 13). [0135] 适用化合物64。 [0136] 3.白桦脂酸C‑17‑氨基衍生物的合成 [0137] Scheme 14： [0138] [0139] Curtius重排反应是一类亲核重排反应。反应中，羧酸与叠氮化物作用生成酰基叠氮化物再重排为异氰酸酯。反应中原位生成的异氰酸酯和各种亲核试剂反应，可以得到氨 基甲酸酯，脲等各种N‑酰基衍生物，也可以直接水解得到伯胺。白桦脂酸的羧基可以与DPPA反应生产白桦脂酸C‑17的异氰酸酯，酸性条件下水解合成C‑17胺基的衍生物。 [0140] 适用化合物65。 [0141] 4.白桦脂酸C‑2，C‑3和C‑28衍生物的合成 [0142] Scheme 15 [0143] [0144] 白桦脂酸与2‑碘氧基苯甲酸(IBX)氧化得到关键中间体白桦酮脂酸，白桦酮脂酸的C‑28羧酸与胺缩合合成白桦酮脂酸的C‑28酰胺衍生物；白桦酮酯酸衍生物的C‑3的酮可 [17] 以与羟胺反应合成C‑3的羟胺进一步还原生产C‑NH2的衍生物 ，或直接与AcONH4/ [18] NaBH3CN/MeOH反应胺化合成C‑3的NH2衍生物 。同时白桦酮脂酸衍生物的C‑2可以与多聚 [19] 甲醛/K2CO3/DMF反应合成丙烯酮衍生物 。 [0145] 适用化合物66‑67。 [0146] Scheme 16 [0147] [0148] 白桦脂酸‑4‑胺基吡啶酰胺的3‑β‑羟基用经典的Dess‑Martin氧化为酮，3位酮可以进一步还原胺化合成3‑NH2‑衍生物。羰基邻位可以与甲醛生成并烯烃酮，与DMFDMA生产N，N‑二甲基烯酮。分别合成化合物079，092，114。 [0149] 适用化合物68‑70。 [0150] 5.白桦脂酸五元A环酰胺衍生物的合成 [0151] 白桦酮脂酸的A环的C‑2位置可以引入甲酰基，甲酰基可以在氧化条件下发生开环反应生产开环的二酸，二酸生产二羧酸酯后进一步关环脱羧形成五元A环的白桦脂酸衍生 物[20]。 [0152] Scheme 17: [0153] [0154] 白桦脂酸与苄溴反应生产白桦脂酸苄酯，进一步发生氧化反应生产白桦酮脂酸苄[21‑22] 酯 。白桦酮脂酸苄酯进一步在C‑2引入甲酰基，氧化开环为二酸，二酸生成二酯，二酯 缩合关环脱酸生产5元A环白桦酮脂酸苄酯，随后还原，脱苄，进一步羧酸缩合合成相对于的 五元A环白桦脂酸酰胺衍生物264和268。 [0155] 适用化合物71‑72。 [0156] 6.2‑氰基‑白桦烯酮脂酸酰胺衍生物的合成 [0157] Scheme 18: [0158] [0159] 白桦酮脂酸与甲酸乙酯在甲醇钠存在下在无水四氢呋喃下进行克莱森缩合后，然后用1N稀盐酸将反应混合物的pH调至2‑4，生产C‑2甲酰基‑白桦酮脂酸与盐酸羟胺形成异 恶唑环，异恶唑环在甲醇钠条件下开环为C‑2氰基白桦酮脂酸，C‑2氰基白桦酮脂酸在DDQ条件下脱氢生成2‑氰基‑白桦烯酮脂酸[23]. [0160] 适用化合物73。 [0161] Scheme 19：氰基烯酮的化合物090的合成 [0162] [0163] 适用化合物74。 [0164] 对于上述制备方法中，提供碱性条件的试剂选自有机碱或无机碱类，所述的有机碱类包括但不限于三乙胺、N，N‑二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钾中的一种或多种，所述的无机碱类为氢化钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸胺、碳酸铯、氢氧化钠和碳酸氢钠中的一种或多种； [0165] 提供酸性条件的试剂包括但不限于氯化氢、氯化氢的1，4‑二氧六环溶液、三氟乙酸、盐酸和硫酸中的一种或多种； [0166] 催化剂包括但不限于钯/碳、四‑三苯基膦钯、[1，1'‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(Pd(dppf)Cl2)、[1，1'‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、4‑二甲氨基吡啶(DMAP)、四氯化锡中的一种或多种； [0167] 配体包括但不限于三苯基膦，甲基三苯基溴化膦中的一种或多种； [0168] 缩合剂：2‑(7‑氧化苯并三氮唑)‑N，N，N'，N'‑四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)； [0169] 引发剂：过氧苯甲酰(BPO)； [0170] 还原剂：三乙基硅烷； [0172] 上述反应优选在溶剂中进行，所用溶剂包括但不限于：N，N‑二甲基甲酰胺、1，4‑二氧六环、水、四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇、乙醇、甲苯、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇、乙二醇二乙醚、四氯化碳及其混合物。 [0173] 药物组合物和治疗方法 [0174] 本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐、酯、光学异构体、立体异构体、多晶型物、溶剂合物、N‑氧化物、同位素标记的化合物、代谢物、螯合物、络合物、包合物或前药，以及药学上可接受的载体，所述药物组合物优选为固体制剂、半固体制剂、液体制剂或气态制剂。 [0175] 本发明中“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有 过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。 [0176] 在本发明的药物组合物中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物通过静脉内给药时，水是示例性载体。还可以使用生理盐水和葡萄 糖及甘油水溶液作为液体载体，特别是用于注射液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、 乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述组合物还可以视需要包含少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲 剂。口服制剂可以包含标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药学上可接受的载体的实例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)中所述。 [0177] 本发明的药物组合物可以系统地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以适合的途径给药，例如通过注射(如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射，包括滴注)或经皮给药；或通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。 [0178] 对于这些给药途径，可以适合的剂型给药本发明的药物组合物。 [0179] 所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂。 [0180] 本发明所述药物组合物，含有安全有效量的本发明化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂等中的一种或几种。药物制剂应与给药方式相匹配。 [0181] 本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方 法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组 合物也可以被制成粉剂用于雾化吸入。 [0182] 活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重‑约50毫克/千克体重；优选地，为约5微克/千克体重‑约10毫克/千克体重；进一步优选地，为约10微克/千克体重‑约5毫克/千克体重。此外，本发明化合物还可与其他治疗剂一起使用。 [0183] 对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、雾化吸入等。 [0184] 使用药物组合物时，是将安全有效量的药物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地，该 剂量是约10微克/千克体重‑约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人 健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。 [0185] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中 未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外 说明，否则百分比和份数按重量计算。 [0186] 如本文中所使用的术语“有效量”指被给药后会在一定程度上缓解所治疗病症的一或多种症状的化合物的量。具体而言，如本文所用，化合物的“有效量”是指足以抑制维A酸相关孤儿受体γt RORγt的量。如本文所用，化合物的“治疗有效剂量”是指足以改善或 以某种方式减少症状、停止或逆转病情进展、或抑制维A酸相关孤儿受体γt RORγt的量。 这种剂量可以作为单一剂量使用，也可以按照一种方案服用，从而有效。 [0187] 可调整给药方案以提供最佳所需响应。例如，可给药单次推注，可随时间给药数个分剂量，或可如治疗情况的急需所表明而按比例减少或增加剂量。要注意，剂量值可随要减 轻的病况的类型及严重性而变化，且可包括单次或多次剂量。要进一步理解，对于任何特定 个体，具体的给药方案应根据个体需要及给药组合物或监督组合物的给药的人员的专业判 断来随时间调整。 [0188] 如此处所用，“治疗”是指以任何方式改善或以其他方式改变患者的病情、紊乱或疾病的症状或病理。如本文所述，“通过使用某一特定化合物或药物组合物来改善某一特定 疾病的症状”是指可归因于或与该组合物的使用有关的任何减少，不论是永久性的还是暂 时性的、持久的或暂时性的。 [0189] 如本文所使用的“个体”包括人或非人动物。示例性人个体包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人个体(称为患者)或正常个体。本发明中“非人动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。 [0191] 图1是HTRF实验中白桦酯酸的剂量‑效应曲线示意图； [0192] 图2是生物膜干涉实验中KRASG12C与本发明化合物的结合曲线示意图。 具体实施方式[0193] 下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。 [0194] 下述实施例中分析测试仪器及测试条件： [0195] 1、1H(400MHz)和13C(100MHz)NMR用Bruker‑JEOL‑400型核磁共振仪测定，使用氘代溶剂的化学位移的内标如下： [0196] [0197] 1H NMR的表示方法：s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，br＝宽峰，dd＝双重峰的双重峰，dt＝三重峰的双重峰。若提供偶合常数时，其单位为Hz。 [0198] 2、高效液相色谱‑质谱联用仪(LC/MS) [0199] 型号：Agilent 6120B型，ESI电离法。 [0200] 色谱柱：Infinitylab Poroshell 120EC‑C18 4.6*50mm 2.7um [0201] 流动相：0.1％甲酸 [0202] 3、高效液相色谱：安捷伦1260， [0203] 色谱柱子型号：Xbridge C18 3.5um 4.6*150mm [0204] 4、常用显色剂的配制方法 [0205] 磷钼酸显色剂：浓硫酸10mL，加乙醇至100mL。显色剂具有广泛适用性。 [0206] 碘蒸气：少许碘置于的密闭广口瓶中。显色剂适用于不饱和烯烃、炔烃等。 [0207] 合成及纯化及设备： [0208] 旋转蒸发器：RE‑2000B(郑州科泰实验设备有限公司)；循环水真空泵：SHK‑IIIS(郑州科泰实验设备有限公司)；低温冷却液循环泵:DLSK‑10/20(郑州科泰实验设备有限公 司)；集热式磁力搅拌器:DF‑101S(郑州科泰实验设备有限公司)；真空油泵：普兰德MZ2CNT (郑州科泰实验设备有限公司)；冷冻干燥仪：Free Zone Plus 2.5L(美国LABCONCO)；手提 式紫外分析仪：ZF‑1(郑州科泰实验设备有限公司)；千分之一电子天平：JA4103(上海舜宇 恒平科学仪器有限公司)；薄层硅胶板：GF254(青岛海洋化学制品有限公司)；中压制备机： Biotage selekt SEL‑2SV(Biotage)；微量制备机：汉邦制备色谱仪NP7000(江苏汉邦科技 股份有限公司)。 [0209] 实验试剂： [0210] 本研究中化合物合成、纯化及分析检测用到的主要试剂如下： [0211] 白桦脂酸：>98％，上海毕得医药科技有限公司。；白桦酯醇：>98％，上海毕得医药科技有限公司。；HATU：>98％，北京迈瑞达科技有限公司；BOP:>98％，上海毕得医药科技有限公司；甲醇：分析纯(上海泰坦科技股份有限公司)；异丙醇：分析纯(上海泰坦科技股份有限公司)；丙酮：分析纯(上海泰坦科技股份有限公司)；乙酸乙酯：分析纯(上海泰坦科技股份有限公司)；乙醇：分析纯(上海泰坦科技股份有限公司)；四氢呋喃：分析纯(上海泰坦科 技股份有限公司)；石油醚：分析纯(上海泰坦科技股份有限公司)；二氯甲烷：分析纯(上海 泰坦科技股份有限公司)；乙腈：分析纯(上海泰坦科技股份有限公司)；吡啶：分析纯(上海 泰坦科技股份有限公司)；氘代氯仿：分析纯(上海泰坦科技股份有限公司)；氘代DMSO:分析 纯(上海泰坦科技股份有限公司)；氘代甲醇:分析纯(上海泰坦科技股份有限公司)；盐酸： 分析纯(国药集团化学试刻有限公司)；氢氧化钠：分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；无 水硫酸钠：分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；层析用硅胶(200‑300目)：(青岛海洋化学制品有限公司)；其它胺类及试剂均采购北京百灵威科技有限公司、上海毕得医药、上海泰 坦科技、北京迈瑞达、国药集团等试剂公司，未经处理直接使用。干燥DMF用4A分子筛干燥； 无水THF采用商业化含水量小于100ppm。 [0212] 薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.2mm‑0.3mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm‑ 0.5mm。 [0213] 柱层析一般使用烟台黄海硅胶200‑300目硅胶为载体。 [0214] 在下列实例中，除非另有指明，所有温度为摄氏温度，除非另有指明，各种起始原料和试剂来自市售或者是根据已知的方法合成，市售原料和试剂均不经进一步纯化直接使 用，除非另有指明，市售厂家包括但不限于国药集团，百灵威科技有限公司，梯希爱(上海) 化成工业发展有限公司，上海毕得医药科技有限公司和上海迈瑞尔化学科技有限公司等。 [0215] CD3OD：氘代甲醇 [0216] CDCl3：氘代氯仿 [0217] DMSO‑d6：氘代二甲基亚砜 [0218] HATU：2‑(7‑氧化苯并三氮唑)‑N，N，N'，N'‑四甲基脲六氟磷酸酯 [0219] BOP：1H‑苯并三唑‑1‑基氧代三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸盐 [0220] Boc：叔丁氧羰基 [0221] Cbz：苄氧羰基 [0222] TLC：薄层色谱法 [0223] HPLC：高效液相色谱法 [0224] purity：纯度 [0225] &：和 [0226] 氢气氛围是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。 [0227] 实施例中无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。 [0228] 实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃‑30℃。 [0229] 实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系或薄层色谱法的展开剂体系包括：A：石油醚和乙酸乙酯 体系；B：二氯甲烷和甲醇体系；C：正己烷：乙酸乙酯；其中溶剂的体积比根据化合物的极性不同而不同，也可以加入少量的酸性或碱性试剂进行调节，如醋酸或三乙胺等。 [0230] 药物化学实验部分 [0231] 中间体1 [0232] 3‑(2‑氨基乙基)‑5，5‑二甲基咪唑烷‑2，4‑二酮IN‑1 [0233] [0234] 5，5‑二甲基海因IN‑1a(500mg，3.9mmol)，N‑Boc‑溴乙胺IN‑1b(1.40g，6.0mmol)和碳酸钾(1.6g，11.7mmol)溶于N，N‑二甲基甲酰胺(15mL)中室温搅拌过夜，TLC显示反应完3 全。反应液倒入冰水中(60mL)，乙酸乙酯(50mLX)萃取，合并有机相，有机相水洗(30mL x 2)，饱和盐水洗(30mL)，无水硫酸钠干燥，浓缩得到白色固体标题化合物中间体IN‑1 (500mg，粗品)。粗品溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(3mL)，体系室温反应1小时。TLC显示反应完成。反应液直接旋干得白色固体标题化合物中间体IN‑1的三氟乙酸盐(400mg， 粗品)。 [0235] 中间体2 [0236] N1‑(吡啶‑4‑基)乙烷‑1，2‑二胺IN‑2 [0237] [0238] 将4‑氟吡啶盐酸盐IN‑2a(200mg，1.5mmol)分散于乙二胺(3mL)中，封管中110℃下搅拌0.5小时。TLC显示反应完全，反应液直接旋干得到标题化合物中间体IN‑2(220mg，粗 品)。 [0239] LC‑MS(ESI):138.2[M+1]+ [0240] 中间体3 [0241] N‑(2‑氨基乙基)‑N‑乙基乙酰胺IN‑3 [0242] [0243] 将N‑Boc‑N'‑乙基乙二胺IN‑3a(92mg，0.49mmol)和三乙胺(91mg，0.9mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，冰水浴条件下，慢慢加入乙酰氯(0.47mg，0.6mmol)后室温搅拌10分钟，TLC监测反应完全；反应液倒入水中，二氯甲烷萃取(30mL x 2)有机相合并，水洗(20mL x 2)，饱和食盐水洗(20mL)，硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗品。粗品溶于三氟乙酸中(15mL)中，室 温搅拌3小时，反应液直接浓缩，得黄色油状物标题化合物中间体IN‑3(70mg，粗品)。 [0244] LC‑MS(ESI):131.2[M+1]+ [0245] 中间体4 [0246] N3，N3‑二乙基吡啶‑3，4‑二胺IN‑4 [0247] [0248] 第一步 合成化合物IN‑4b [0249] 3‑溴‑4‑硝基吡啶‑N‑氧化物IN‑4a(1.00g，4.566mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，加入二乙胺(334mg，45.66mmol)，升温至60℃搅拌24小时，TLC显示反应完，将反应液倒入冰水(80mL)中，乙酸乙酯(50mL x 3)萃取三次，有机相合并，水洗(30mL x 2)，饱和食盐水洗(35mL)，硫酸钠干燥，减压浓缩，粗品经硅胶柱层析(乙酸乙酯/正己烷＝10‑30％)分离纯 化，得到白色固体标题化合物IN‑4b(910mg，收率94％)。 [0250] 第二步 合成化合物IN‑4 [0251] 化合物IN‑4b(800mg，3.79mmol)溶于甲醇(100mL)中，加入10％钯/碳(500mg)，氢气置换两次，在氢气球条件下室温搅拌过夜，TLC显示原料反应完，LC‑MS显示有一半中间 体，补加10％的钯/碳(500mg)，在氢气球条件下室温搅拌8小时，TLC显示中间体反应完全， 反应液垫硅藻土抽滤掉钯/碳，有机相浓缩干得黄色液体标题化合物中间体IN‑4(610mg，收 率97％)。 [0252] LC‑MS(ESI):166.2[M+H]+. [0253] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.93(s，1H)，7.79(d，J＝5.6Hz，1H)，6.54(d，J＝5.6Hz，1H)，5.61(br，2H)，2.92(q，J＝7.2Hz，4H)，0.92(t，J＝7.2Hz，6H). [0254] 中间体5 [0255] L‑色氨酸甲酰胺IN‑5 [0256] [0257] 第一步 合成化合物IN‑5b [0258] 将N‑苄氧羰基‑L‑色氨酸IN‑5a(150mg，0.44mmol)，HATU(251mg，0.66mmol)，N，N‑二异丙基乙胺(284mg，2.2mmol)和甲胺盐酸盐(89mg，1.32mmol)，室温下加入到N，N‑二甲基甲酰胺(1.5mL)中，室温下反应1小时，TLC检测反应完全。加入到水(10mL)中，有大量固体析出，过滤，滤饼干燥得到白色固体标题化合物IN‑5b(150mg，粗品)。 [0259] 第二步 合成化合物IN‑5 [0260] 将化合物IN‑5b(150mg，0.43mmol)和钯/碳(10％，20mg)加入到甲醇(2mL)中，室温下反应16小时，TLC检测反应完全。反应液垫硅藻土过滤，母液浓缩，干燥得到标题化合物中间体IN‑5(90mg，粗品)。 [0261] LC‑MS(ESI):218.2[M+H]+. [0262] 实施例1 [0263] [0264] 白桦脂酸1a(200mg，0.44mmol)溶于干燥N，N‑二甲基甲酰胺(6mL)中，室温下加入BOP(290mg，0.65mmol)，N，N‑二异丙基乙胺(0.2mL，1.14mmol)，搅拌10分钟后加入(3R)‑1‑甲基‑3‑吡咯烷胺1b(CAS#457097‑75‑5，77mg，0.77mmol)，室温下搅拌12小时。TLC检测原料消失。将反应液倒入水中，析出的固体过滤，水洗，干燥。粗品硅胶色谱柱层析纯化，甲醇/二氯甲烷(1‑2％)洗涤，得到白色固体标题化合物1(90mg，收率38％)。 [0265] LC‑MS(ESI):539.5[M+H]+. [0266] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.90(d，J＝6.8Hz，1H)，4.65(d，J＝2.8Hz，1H)，4.53(d，J＝2.8Hz，1H)，4.35‑4.22(m，2H)，3.10‑2.93(m，4H)，2.72(s，3H)，2.28‑2.14(m，2H)，1.95‑1.64(m，4H)，1.62(s，3H)，1.60‑1.52(m，2H)，1.48‑0.59(m，20H)，0.91(s，3H)，0.87(s，3H)， 0.85(s，3H)，0.76(s，3H)，0.65(s，3H). [0267] 实施例2‑18 [0268] 参照实施例1的合成方法合成实施例2‑18的化合物： [0269] [0270] [0271] [0272] [0273] [0274] 实施例19 [0275] [0276] 第一步 合成化合物19b [0277] 将白桦脂酸1a(500mg，1.09mmol)和HATU(623.5mg，1.64mmol)，N，N‑二异丙基乙胺(283.8mg，2.2mmol)溶于无水N，N‑二甲基甲酰胺(10mL)中，在室温条件下搅拌10min后加入(R)‑1‑Boc‑3‑氨基哌啶19a(CAS#188111‑79‑7，440mg，2.2mmol)，升温至70℃反应16小时，3 TLC监测原料反应完全，加水稀释(30mL)，乙酸乙酯萃取(30mL X)，合并有机相，水洗(20mL 2 X)，饱和食盐水洗(20mL)，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化(甲醇/二氯甲烷 ＝1‑3％)得白色固体标题化合物19b(620mg，收率89％)。 [0278] 1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.73(s，1H)，4.59(s，1H)，3.95(s，1H)，3.39(s，3H)，3.21‑3.15(m，1H)，3.13‑3.07(m，1H)，2.52‑2.46(m，1H)，1.98‑1.88(m，2H)，1.74‑1.69(m，3H)， 1.68(s，4H)，1.65‑1.64(m，1H)，1.62‑1.57(m，3H)，1.56‑1.50(m，4H)，1.47(s，9H)，1.43‑ 1.32(m，7H)，1.31‑1.27(m，1H)，1.25‑1.21(m，1H)，1.17‑1.12(m，1H)，1.03‑0.99(m，1H)， 0.96‑0.95(m，9H)，0.90‑0.85(m，2H)，0.81(s，3H)，0.76(s，3H)，0.69‑0.66(m，1H).[0279] 第二步 合成化合物19c [0280] 化合物19b(620mg，0.97mmol)溶于盐酸1，4‑二氧六环溶液(20mL，4M)中，室温搅拌1小时，有白色固体析出，TLC监测原料反应完全，浓缩，加入10％的甲醇和二氯甲烷混合溶 剂(80mL)稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液洗涤(10mL)，水洗(10mL)，饱和食盐水洗(10mL)， 无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体标题化合物19c(420mg，收率80％)，粗品直接用于下一 步。 [0281] 第三步 合成化合物19 [0282] 化合物19c(100mg，0.186mmol)溶于甲醇(8mL)中，然后依次加入乙酸(22.2mg，0.37mmol)，甲醛水溶液(37％，120mg，1.48mmol)，反应在室温条件下搅拌0.5小时后加入氰基硼氢化钠(93mg，1.48mmol)，继续搅拌2小时，TLC监测反应完全，反应液用二氯甲烷混合 溶剂(60mL)，有机相用水洗(15mL)，饱和食盐水洗涤(15mL)，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化(甲醇/二氯甲烷＝1‑3％)得到白色固体标题化合物19(62mg，收率 60.3％)。 [0283] LC‑MS(ESI):553.5[M+H]+. [0284] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.18(d，J＝8.0Hz，1H)，4.64(s，1H)，4.53(s，1H)，4.26(s，1H)，3.76‑3.63(m，1H)，3.04‑2.93(m，2H)，2.68‑2.53(m，3H)，2.20‑2.13(m，1H)，2.12(s，3H)，1.82‑1.65(m，4H)，1.62(s，3H)，1.60‑1.52(m，4H)，1.48‑1.09(m，18H)，1.05‑0.99(m，1H)，0.91(s，3H)，0.86(s，3H)，0.85(s，3H)，0.76(s，3H)，0.65(s，3H)，0.64‑0.89(m，1H). [0285] 实施例2‑18 [0286] 参照实施例19的合成方法合成实施例20‑30的化合物： [0287] [0288] [0289] [0290] 实施例31 [0291] [0292] 第一步 合成化合物31b [0293] 将白桦脂酸1a(200mg，0.44mmol)溶于无水N，N‑二甲基甲酰胺(4mL)中，再依次加入N，N‑二异丙基乙胺(113mg，0.88mmol)和BOP(290mg，0.66mmol)，室温搅拌10分钟后加入羟乙基乙二胺31a(68mg，0.66mmol)，升温至70℃搅拌过夜，TLC显示原料反应完全。反应液 冷却至室温，加水(15mL)稀释，乙酸乙酯(25mL×3)萃取，合并有机相，水(20mL×3)洗，饱和 食盐水(30mL)洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体标题化合物31b(300mg，粗品)，直接用 于下一步。 [0294] LC‑MS(ESI)：543.5[M+H]+. [0295] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.52(t，J＝5.6，1H)，4.65(s，1H)，4.53(s，1H)，4.45(s，1H)，4.26(d，J＝4.8Hz，1H)，3.42(t，J＝5.2Hz，2H)，3.21‑3.13(m，1H)，3.07‑2.96(m，3H)， 2.58‑2.54(m，4H)，2.15‑2.06(m，1H)，1.78‑1.66(m，2H)，1.62(s，3H)，1.57‑1.54(m，2H)， 1.48‑1.36(m，5H)，1.35‑1.30(m，5H)，1.24‑1.22(m，4H)，1.15‑1.09(m，1H)，1.04‑1.01(m， 1H)，0.96‑0.95(m，1H)，0.91(s，3H)，0.87(s，3H)，0.84(s，4H)，0.76(s，3H)，0.65(s，3H)， 0.61(s，1H). [0296] 第二步 合成化合物31 [0297] 将化合物31b(300mg，crude)溶解在二氯甲烷(8mL)中，加入乙醛水溶液(40％，608mg，5.5mmol)，室温搅拌30分钟，加入三乙酰氧基硼氢化钠(351mg，1.7mmol)，室温搅拌过夜，LC‑MS显示原料反应完全。反应液加水(15mL)稀释，10％的甲醇/二氯甲烷混合溶剂 3 (30mLX)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化(甲醇/二氯甲 烷＝1‑1.5％)得到白色固体标题化合物31(50mg，两步收率19.7％)。 [0298] LC‑MS(ESI)：571.5[M+1]+. [0299] 1H NMR(DMSO‑d6，400Hz)δ7.45(t，J＝5.2Hz，1H)，4.65(d，J＝1.2Hz，1H)，4.53(s，1H)，4.35(t，J＝5.2Hz，1H)，4.28(d，J＝5.2Hz，1H)，3.44‑3.39(m，2H)，3.19‑3.10(m，1H)， 3.04‑2.94(m，3H)，2.56‑2.54(m，2H)，2.50‑2.39(m，6H)，2.11‑2.08(m，1H)，1.77‑1.70(m， 2H)，1.62‑1.52(m，5H)，1.47‑1.19(m，14H)，1.15‑0.80(m，14H)，0.76(s，3H)，0.64(s，4H).[0300] 实施例32‑33 [0301] 参照实施例31的合成方法合成实施例32‑33的化合物： [0302] [0303] [0304] 实施例34 [0305] [0306] 第一步 合成化合物34a [0307] 白桦脂酸1a(4.00g，8.76mmol)溶于四氢呋喃(40mL)中，加入4‑二甲氨基吡啶(0.21g，1.75mmol)和乙酸酐(1.07g，10.51mmol)，室温搅拌2小时后，TLC监测显示原料反应 3 完全，反应液倒入冰水中(80mL)淬灭，乙酸乙酯萃取(50mL X)，合并有机相，饱和食盐水洗 (50mL)，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝20‑30％)纯化得白色固体标题化合物34a(3.40g，收率78％)。 [0308] 1HNMR(400MHz，DMSO‑d6):δ11.28(br，1H)，4.74(br，1H)，4.61(br，1H)，4.49‑4.45(m，1H)，3.04‑2.98(m，1H)，2.29‑2.26(m，1H)，2.21‑2.14(m，1H)，2.05(s，3H)，2.01‑1.94(m，2H)，1.70‑1.17(m，21H)，1.10‑0.93(m，8H)，0.85(s，3H)，0.84(s，3H)，0.83(s，3H).[0309] 第二步 合成化合物34b [0310] 将化合物34a(200mg，0.40mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中，0℃下加入草酰氯(0.38g，3.00mmol)，和一滴N，N‑二甲基甲酰胺，反应液缓慢升至室温，氮气保护下室温搅拌 2小时，TLC检测发现反应已完成。反应液浓缩，得到黄色油状液体标题化合物34b(粗品)，直接进行下一步反应。 [0311] 第三步 合成化合物34d [0312] 将化合物34b(粗品)溶解于二氯甲烷(8mL)中，0℃下加入三乙胺(0.08g，0.78mmol)与5‑氨基噻唑34c(50mg，0.47mmol)。加毕，缓慢升至室温搅拌4小时，TLC显示反 2 应已完成。反应液倒入水中(25mL)，二氯甲烷(30mLX)萃取，合并有机相，水洗(30mL)，饱和盐水(30mL)洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，粗品经硅胶柱层析(甲醇/二氯甲烷＝2％)纯化 得到白色固体标题化合物34d(110mg，收率49％)。 [0313] 第四步 合成化合物34 [0314] 将化合物34d(110mg，0.18mmol)溶剂在甲醇(4mL)中，加入无水碳酸钾(28mg，0.2mmol)，反应液加热至60℃搅拌16小时，TLC检测发现反应已完成。反应液冷却至室温，反应液直接浓缩，粗品经硅胶柱层析(甲醇/二氯甲烷＝2％)纯化二次得到白色固体标题化合 物34(15mg，收率15％)。 [0315] LC‑MS(ESI):537.3[M‑H]‑. [0316] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ10.99(s，1H)，8.52(s，1H)，7.63(s，1H)，4.71(s，1H)，4.57(s，1H)，4.27(d，J＝5.2Hz，1H)，3.05‑2.92(m，2H)，2.64‑2.54(m，1H)，2.30(d，J＝ 13.8Hz，1H)，1.98‑1.88(m，1H)，1.65(s，3H)，1.58‑1.53(m，4H)，1.48‑1.39(m，4H)，1.32‑ 1.06(m，13H)，0.94(s，3H)，0.86(s，3H)，0.80(s，3H)，0.76(s，3H)，0.64(s，3H)。 [0317] 实施例35‑49 [0318] 参照实施例34的合成方法合成实施例35‑49的化合物： [0319] [0320] [0321] [0322] [0323] 实施例50 [0324] [0325] 第一步 合成化合物50a [0326] 参考实施例34第二步的合成方法，以氨水为为原料，合成白色固体标题化合物50a。 [0327] 第二步 合成化合物50b [0328] 将化合物50a(400mg，0.803mmol)溶解在无水乙醇(10mL)中，加入38％的甲醛水溶液(4mL)，加入二乙胺(2mL)，反应液50℃搅拌48小时，TLC显示剩余少量原料，加入乙酸乙酯稀释(200mL)，水洗(200mL)，饱和食盐水洗(200mL)，无水硫酸钠干燥，有机相浓缩干硅胶柱层析纯化得白色固体标题化合物50b(350mg，收率75％)。 [0329] LC‑MS(ESI):583.5[M+H]+. [0330] 第三步 合成化合物50 [0331] 化合物50b(350mg，0.600mmol)溶于甲醇(8mL)中，加入15％氢氧化钠水溶液(10mL)，原料析出，再加入四氢呋喃(8mL)溶解，升温至40℃搅拌2小时，TLC显示原料反应 完，加入乙酸乙酯稀释(100mL)，水洗(100mL)，饱和食盐水洗(100mL)，无水硫酸钠干燥，有机相浓缩干硅胶柱层析纯化得白色固体标题化合物50(80mg，产率25％)。 [0332] LC‑MS(ESI):541.5[M+H]+. [0333] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.76(s，1H)，4.65(d，J＝2.8Hz，1H)，4.53(s，1H)，4.27(d，J＝5.2Hz，1H)，4.25‑4.18(m，1H)，3.89(s，1H)，3.05‑2.92(m，2H)，2.65‑2.55(m，1H)，2.48‑2.40(m，4H)，2.24‑2.14(m，1H)，1.90‑1.79(m，1H)，1.78‑1.65(m，1H)，1.62(s，3H)， 1.60‑0.97(m，24H)，0.91(s，3H)，0.89‑0.81(m，7H)，0.76(s，3H)，0.64(s，3H)，0.63‑0.59(m，1H). [0334] 实施例51 [0335] [0336] 第一步合成化合物51a [0337] 将3‑乙酰氧基白桦脂酸34a(200.0mg，0.40mmol)溶于N，N‑二甲基甲酰胺(5mL)中，室温下加入HATU(266mg，0.60mmol)，N，N‑二异丙基乙胺(155mg，1.20mmol)搅拌10分钟，加入2‑氨基乙酰胺(59mg，0.80mmol)，室温搅拌过夜，TLC显示反应完，加入乙酸乙酯稀释3 (100mL)，水洗三次(100mL X)，饱和食盐水洗(100mL)，无水硫酸钠干燥，有机相浓缩得白 色固体标题化合物51a(240mg，粗品)，直接用于下一步。 [0338] 第二步 合成化合物51b [0339] 将化合物51a(120mg，粗品)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入4‑二甲氨基吡啶(20mg)，氮气保护，降温至0℃，滴加二碳酸二叔丁酯(99mg，0.454mmol)的二氯甲烷溶液，滴完室温 搅拌2小时，TLC显示原料剩余少量，加入二乙胺(0.5mL)，室温搅拌2小时，TLC显示反应完，反应液加入二氯甲烷稀释(100mL)，水洗(100mL)，1M稀盐酸洗(100mL)，饱和碳酸氢钠洗 (100mL)，饱和食盐水洗(100mL)，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体标题化合物51b(120mg，粗品)，直接用于下一步。 [0340] 第三步 合成化合物51 [0341] 化合物51b(120mg，粗品)溶于甲醇(5mL)中，加入15％氢氧化钠水溶液(5mL)，原料析出，再加入四氢呋喃(5mL)溶解，升温至40℃搅拌2小时，TLC显示原料反应完，加入乙酸乙酯稀释(100mL)，水洗(100mL)，饱和食盐水洗(100mL)，无水硫酸钠干燥，有机相浓缩干硅胶柱层析纯化得白色固体标题化合物51(70mg，3步产率57％)。 [0342] LC‑MS(ESI):569.5[M+1]+. [0343] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.60(t，J＝5.6Hz，1H)，4.64(d，J＝2.4Hz，1H)，4.53(s，1H)，4.27(d，J＝4.8Hz，1H)，3.83(d，J＝5.6Hz，2H)，3.32‑3.11(m，4H)，3.03‑2.92(m，2H)， 2.49‑2.42(m，1H)，2.22‑2.12(m，1H)，1.94‑1.86(m，1H)，1.83‑1.69(m，1H)，1.63(s，3H)， 1.59‑1.17(m，15H)，1.16‑1.08(m，4H)，1.04‑0.97(m，4H)，0.96‑0.78(m，11H)，0.75(s，3H)， 0.64(s，3H)，0.63‑0.58(m，1H). [0344] 实施例52 [0345] [0346] 将化合物48(60mg，0.091mmol)和氢氧化锂水合物(38mg，0.91mmol)加入到甲醇(1mL)和水(0.5mL)的混合液中，室温下搅拌4小时，TLC监测原料反应完全，反应液降温到0 2 ℃，用稀盐酸酸化至pH＝6，乙酸乙酯(5mL X)萃取，合并有机相，饱和食盐水(5mL)洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经pre‑TLC纯化得白色固体标题化合物52(30mg，收率51％)。 [0347] LC‑MS:m/z＝643.5[M+H]+. [0348] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ12.32(s，1H)，10.77(s，1H)，7.56(t，J＝8.0Hz，2H)，7.27(d，J＝8.0Hz，1H)，7.13(d，J＝2.0Hz，1H)，7.03(t，J＝7.2Hz，1H)，6.95(t，J＝7.2Hz， 1H)，4.58(s，1H)，4.48‑4.42(m，2H)，4.25(s，1H)，3.22‑3.18(m，1H)，3.08‑2.84(m，3H)， 2.28‑2.16(m，1H)，2.07‑1.96(m，1H)，1.91‑1.86(m，1H)，1.73‑1.61(m，1H)，1.57(s，3H)， 1.53‑1.36(m，5H)，1.34‑1.15(m，7H)，1.18‑0.97(m，4H)，0.87(s，3H)，0.83‑0.77(m，1H)， 0.76(s，3H)，0.66(s，3H)，0.65(s，3H)，0.56‑0.49(m，3H)，0.22(s，3H). [0349] 实施例53 [0350] [0351] 第一步合成化合物53a [0352] 将化合物IN‑5a(1.00g，2.96mmol)，HATU(1.69g，4.44mmol)，N，N‑二异丙基乙胺(1.15g，8.88mmol)和N，O‑二甲基羟胺盐酸盐(0.35g，3.55mmol)溶解到干燥N，N‑二甲基甲酰胺(10mL)中，室温下反应1小时，TLC检测反应完全。加入到水中，有大量固体析出，固体过滤，水洗，干燥得到标题化合物53a(1.10g，粗品)，直接用于下一步。 [0353] 第二步 合成化合物53b [0354] 将化合物53a(300mg，0.79mmol)和钯/碳(10％，30mg)加入到甲醇(3mL)中，室温下反应16小时，TLC检测反应完全。过滤去除钯/碳，洗涤，滤液浓缩，得到标题化合物53b (195mg，粗品)，直接用于下一步。 [0355] 第三步 合成化合物53 [0356] 将白桦脂酸1a(100mg，0.22mmol)，BOP(195mg，0.44mmol)和N，N‑二异丙基乙胺(85mg，0.66mmol)加入到N，N‑二甲基甲酰胺(1mL)中，室温下搅拌30分钟，加入化合物53b (125mg，0.33mmol)，加热80反应8小时，剩少许活性酯。反应液冷却至室温，加水，合并有机相，水洗，有大量固体析出，过滤得到粗产品pre‑TLC纯化得标题化合物53(70mg，三步收率 19.72％)。 [0357] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ10.76(s，1H)，7.53(d，J＝7.6Hz，2H)，7.27(d，J＝8.0Hz，1H)，7.15(d，J＝2.0Hz，1H)，7.03(t，J＝7.2Hz，1H)，6.96(t，J＝7.2Hz，1H)，5.01‑ 4.89(m，1H)，4.58(d，J＝2.0Hz，1H)，4.47(s，1H)，4.24(d，J＝5.2Hz，1H)，3.85(s，3H)，3.16(s，3H)，3.10‑3.02(m，1H)，3.00‑2.82(m，3H)，2.20‑2.06(m，2H)，1.91‑1.81(m，1H)，1.67‑ 1.58(m，1H)，1.57(s，3H)，1.51‑1.37(m，6H)，1.34‑1.13(m，8H)，1.11‑1.01(m，3H)，0.87(s， 4H)，0.76(s，4H)，0.67‑0.60(m，7H)，0.58‑0.38(m，3H). [0358] 实施例54 [0359] [0360] 将化合物53(40mg，0.058mmol)加入到四氢呋喃(0.5mL)中，反应体系温度降到0℃，滴加入乙烯基溴化镁四氢呋喃溶液(1M，0.29mmol)，在此温度下搅拌反应1小时，TLC检 测有新点产物。反应液加水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩粗品pre‑TLC纯化得标题化合物54(11mg，收率29.05％)。 [0361] LC‑MS(ESI):653.5[M+1]+. [0362] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ10.79(d，J＝2.4Hz，1H)，7.81(d，J＝7.6Hz，1H)，7.56(d，J＝7.6Hz，1H)，7.28(d，J＝8.0Hz，1H)，7.13(d，J＝2.4Hz，1H)，7.08‑7.00(m，1H)，7.00‑6.91(m，1H)，6.71‑6.54(m，1H)，6.34‑6.21(m，1H)，5.92‑5.77(m，1H)，4.81‑4.71(m，1H)， 4.59(d，J＝2.8Hz，1H)，4.49(t，J＝2.0Hz，1H)，4.26(d，J＝4.8Hz，1H)，3.23‑3.10(m，1H)， 3.00‑2.81(m，3H)，2.32‑2.18(m，1H)，1.99(d，J＝13.2Hz，1H)，1.89‑1.77(m，1H)，1.57(s， 3H)，1.53‑0.96(m，18H)，0.87(s，3H)，0.76(s，3H)，0.66(d，J＝8.4Hz，6H)，0.58‑0.40(m， 3H)，0.26(s，3H). [0363] 实施例55 [0364] [0365] 将白桦脂酸1a(100mg，0.22mmol)，无水碳酸钾(76mg，0.55mmol)，碘化钾(91mg，0.55mmol)和2‑二乙氨基氯乙烷盐酸盐55a(114mg，0.66mmol)溶解于干燥N，N‑二甲基甲酰 胺(3mL)中，室温搅拌反应过夜。TLC检测发现有新点生成，反应液倒入冰水(20mL)中，乙酸 乙酯(20mL)萃取三次，有机相合并，水洗(20mL x 2)，饱和食盐水洗(25mL)，硫酸钠干燥，减压浓缩，粗品经硅胶柱层析(乙酸乙酯/正己烷＝10‑30％)分离纯化，得到白色固体标题化 合物55(59mg，收率48％)。 [0366] LC‑MS(ESI):556.5[M+1]+. [0367] 1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.73(d，J＝1.6Hz，1H)，4.60(s，1H)，4.22‑4.10(m，2H)，3.18(dd，J＝11.2，4.8Hz，1H)，3.06‑2.98(m，1H)，2.71(t，J＝6.0Hz，2H)，2.59(q，J＝ 7.2Hz，4H)，2.27‑2.17(m，2H)，1.94‑1.84(m，2H)，1.68(s，3H)，1.66‑1.28(m，16H)，1.24‑ 1.11(m，2H)，1.05(t，J＝7.2Hz，6H)，0.96(s，6H)，0.94‑0.88(m，4H)，0.82(s，3H)，0.75(s， 3H)，0.70‑0.65(m，1H). [0368] 实施例56 [0369] [0370] 第一步合成化合物56a [0371] 白桦脂酸1a(1.0g，2.19mmol)溶于干燥N，N‑二甲基甲酰胺(10mL)中，依次加入N，N‑二异丙基乙胺(565mg，4.38mmol)和BOP(1.45g，3.27mmol)，反应在室温条件下搅拌10分 钟，再加入2，2‑二乙氧基乙烷‑1‑胺(450mg，3.38mmol)，继续搅拌1小时，TLC监测原料反应 2 3 完全，加水稀释(10mL)，乙酸乙酯萃取(20mL X)，合并有机相，水洗(20mL X)，饱和食盐水 洗(20mL)，无水硫酸钠干燥，浓缩，得白色固体标题化合物56a(1.60g，粗品)，直接用于下一步。 [0372] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.64(t，J＝5.9Hz，1H)，4.65(d，J＝2.6Hz，1H)，4.53(t，J＝2.0Hz，1H)，4.35(t，J＝5.5Hz，1H)，4.26(d，J＝5.1Hz，1H)，3.33(s，2H)，3.24(d，J＝1.5Hz，7H)，3.06‑2.91(m，3H)，2.56(dd，J＝12.4，3.2Hz，1H)，2.14(d，J＝11.7Hz，1H)， 1.81‑1.65(m，2H)，1.62(s，3H)，1.61‑1.52(m，2H)，1.47‑1.20(m，14H)，1.20‑1.07(m，2H)， 1.02(d，J＝8.1Hz，1H)，0.97‑0.80(m，12H)，0.76(s，3H)，0.65(s，3H)，0.63‑0.59(d，J＝ 8.7Hz，1H). [0373] 第二步 合成化合物56b [0374] 化合物56a(1.6g，粗品)溶于四氢呋喃(20mL)，加入盐酸(10mL，6N)中，在室温下继续搅拌3小时，TLC监测原料反应完全，加入碳酸氢钠溶液调至体系碱性(pH＝8)，水相用二 3 氯甲烷萃取(30mL X)，合并有机相，水洗(20mL)，饱和食盐水洗(20mL)，无水硫酸钠干燥， 浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚＝10％‑50％)得黄色固体标题化合物56b (900mg，收率85.6％)。 [0375] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ9.38(s，1H)，8.09(t，J＝5.3Hz，1H)，4.65(d，J＝2.7Hz，1H)，4.56‑4.51(m，1H)，4.26(d，J＝5.1Hz，1H)，3.81‑3.67(m，2H)，3.03‑2.91(m，2H)，2.48‑ 2.42(m，1H)，2.22‑2.14(m，1H)，1.89‑1.67(m，2H)，1.63(s，3H)，1.59‑1.20(m，17H)，1.15‑ 1.03(m，2H)，0.92(s，3H)，0.87(s，3H)，0.84(s，3H)，0.76(s，3H)，0.65(s，3H)，0.63‑0.59(m，1H). [0376] 第三步 合成化合物56 [0377] 化合物56b(200mg，0.402mmol)，四氢吡咯(56mg，0.80mmol)和醋酸(48mg，0.8mmol)溶解在甲醇(20mL)中，室温搅拌10分钟后，慢慢加入氰基硼氢化钠(63mg，1mmol)，反应液继续搅拌1小时。TLC监测原料反应完全，加入碳酸氢钠饱和溶液调至体系碱性(pH＝ 3 8)，水相用二氯甲烷萃取(20mL X)，合并有机相，水洗(20mL)，饱和食盐水洗(20mL)，无水 硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化(甲醇/二氯甲烷＝1‑3％)得到白色固体标题化 合物56(61mg，收率27.4％)。 [0378] LC‑MS(ESI):553.5[M+H]+. [0379] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.84(s，1H)，4.64(d，J＝2.8Hz，1H)，4.53(s，1H)，4.28(d，J＝5.2Hz，1H)，3.09‑2.85(m，6H)，2.56‑2.46(m，1H)，2.20‑2.10(m，1H)，1.87‑1.68(m，6H)，1.62(s，3H)，1.60‑0.98(m，23H)，0.91(s，3H)，0.86(s，3H)，0.84(s，3H)，0.76(s，3H)， 0.64(s，3H)，0.62‑0.58(m，1H). [0380] 实施例57‑59 [0381] 参照实施例56第三步的合成方法合成实施例57‑59的化合物： [0382] [0383] 根据通式合成方法合成以下实施例化合物： [0384] 实施例60 [0385] [0386] LC‑MS(ESI):527.5[M+H]+. [0387] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ4.67(s，1H)，4.54(s，1H)，4.30‑4.25(d，J＝4.4Hz，1H)，2.97(s，1H)，2.65‑2.55(m，3H)，2.45‑2.38(m，1H)，2.28‑2.19(m，3H)，2.11(s，6H)， 1.92‑1.73(m，4H)，1.73‑1.53(m，9H)，1.49‑1.40(m，4H)，1.38‑1.24(m，6H)，1.20‑1.03(m， 3H)，0.98(s，4H)，0.90(d，J＝22.4Hz，8H)，0.76(s，3H)，0.64(d，J＝13.2Hz，4H). [0388] 实施例61 [0389] [0390] LC‑MS(ESI):541.5[M+H]+. [0391] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ6.98(s，1H)，6.50‑6.42(m，1H)，6.35(d，J＝15.2Hz，1H)，4.69(s，1H)，4.58(s，1H)，4.26(d，J＝5.2Hz，1H)，3.03‑2.91(m，3H)，2.82‑2.73(m， 1H)，2.65(d，J＝13.2Hz，1H)，2.31(t，J＝8.4Hz，1H)，2.15(s，6H)，2.04‑1.96(t，J＝ 12.0Hz，1H)，1.78‑1.68(m，1H)，1.67‑1.15(m，20H)，0.97‑0.82(m，11H)，0.78(s，3H)，0.65(s，4H). [0392] 实施例62 [0393] [0394] LC‑MS(ESI):555.5[M+H]+. [0395] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.52(t，J＝5.2Hz，1H)，4.27(d，J＝4.8Hz，1H)，3.15‑3.06(m，1H)，3.00‑2.87(m，2H)，2.47‑2.41(m，1H)，2.21‑2.14(m，2H)，2.13‑2.04(m，7H)， 1.88(d，J＝11.2Hz，1H)，1.69(d，J＝7.2Hz，3H)，1.59(d，J＝13.2Hz，1H)，1.53‑1.40(m， 7H)，1.37‑1.20(m，9H)，1.17‑1.09(m，1H)，1.04‑0.98(m，1H)，0.93(s，3H)，0.89‑0.81(m， 10H)，0.78(s，3H)，0.65(s，4H)，0.33‑0.27(m，2H)，0.21‑0.12(m，2H). [0396] 实施例63 [0397] [0398] LC‑MS(ESI):543.5[M+1]+. [0399] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.66(t，J＝5.6Hz，1H)，4.26(d，J＝5.2Hz，1H)，3.53‑3.46(m，1H)，3.44‑3.38(m，1H)，3.24‑3.08(m，2H)，3.02‑2.89(m，2H)，2.41‑2.32(m，1H)， 2.27‑2.21(m，2H)，2.15(s，6H)，2.08(s，3H)，1.88‑1.71(m，3H)，1.58‑1.11(m，17H)，1.07‑ 0.99(m，2H)，0.90(s，3H)，0.87(s，3H)，0.83(s，3H)，0.76(s，3H)，0.68‑0.57(m，4H).[0400] 实施例64 [0401] [0402] LC‑MS(ESI):663.5[M+H]+ [0403] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.66‑7.59(m，1H)，4.82(d，J＝3.4Hz，2H)，4.25(d，J＝5.2Hz，1H)，3.48(s，3H)，3.12‑3.03(m，2H)，2.98‑2.84(m，4H)，2.77(s，2H)，2.68‑2.60(m， 2H)，2.59‑2.53(m，1H)，2.46‑2.37(m，2H)，2.36‑2.25(m，3H)，2.17‑2.05(m，4H)，1.81‑1.69(m，5H)，1.67‑1.61(m，2H)，1.58‑1.50(m，2H)，1.46‑1.26(m，14H)，1.15‑0.96(m，4H)，0.90(s，3H)，0.86(s，3H)，0.84(s，3H)，0.76(s，3H)，0.67‑0.59(m，4H). [0404] 实施例65 [0405] [0406] LC‑MS(ESI):533.5[M+1]+. [0407] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ8.79(d，J＝6.0Hz，2H)，7.76(d，J＝6.0Hz，2H)，7.47(s，1H)，4.71(d，J＝2.0Hz，1H)，4.59(br，1H)，3.00‑2.89(m，2H)，2.72(d，J＝12.8Hz，1H)， 2.45‑2.40(m，1H)，2.15‑2.09(m，1H)，1.86‑1.76(m，1H)，1.71‑1.15(m，20H)，1.02‑0.95(m， 8H)，0.87‑0.79(m，7H)，0.65(s，4H). [0408] 实施例66 [0409] [0410] LC‑MS(ESI):565.5[M+H]+. [0411] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.97(s，1H)，5.82(s，1H)，5.20(s，1H)，4.67(d，J＝2.0Hz，1H)，4.56(s，1H)，3.18‑2.86(m，6H)，2.68(d，J＝15.4Hz，1H)，2.61‑2.53(m，1H)， 2.12(t，J＝11.6Hz，2H)，1.83‑1.66(m，3H)，1.64(s，3H)，1.54‑1.31(m，12H)，1.31‑1.06(m， 11H)，1.03(s，3H)，0.96‑0.93(m，7H)，0.89(s，3H)，0.76(s，3H)； [0412] 实施例67 [0413] [0414] LC‑MS(ESI):540.5[M+H]+. [0415] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.58(t，J＝5.6Hz，1H)，4.65(d，J＝2.8Hz，1H)，4.53(s，1H)，3.17‑3.08(m，1H)，3.05‑2.88(m，2H)，2.62‑2.52(m，1H)，2.21‑2.14(m，3H)，2.09(s， 6H)，1.78‑1.68(m，2H)，1.62(s，3H)，1.60‑0.64(m，23H)，0.91(s，3H)，0.86(s，3H)，0.85(s， 3H)，0.75(s，3H)，0.63(s，3H)； [0416] 实施例68 [0417] [0418] LC‑MS(ESI):533.5[M+1]+. [0419] 1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.36(d，J＝6.4Hz，2H)，6.68(d，J＝6.8Hz，2H)，4.73(br，1H)，4.61(s，1H)，3.10‑3.04(m，1H)，2.89‑2.85(m，1H)，2.78‑2.71(m，1H)，2.34‑2.31(m， 1H)，2.06‑2.01(m，1H)，1.90‑1.39(m，20H)，1.34‑1.30(m，1H)，1.25‑1.21(m，1H)，1.08‑ 1.01(m，8H)，0.97(s，3H)，0.90(s，3H)，0.85(s，3H). [0420] 实施例69 [0421] [0422] LC‑MS:543.5[M+1]+. [0423] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6):δ8.50(d，J＝3.2Hz，2H)，7.47(d，J＝4.2Hz，2H)，7.37(s，3H)，5.97(s，1H)，5.14(s，1H)，4.78(s，1H)，4.64(s，1H)，3.18‑3.11(m，1H)，2.73‑2.63(m，2H)，2.09‑1.77(m，6H)，1.71(s，3H)，1.62‑1.33(m，14H)，1.10(s，3H)，1.03(s，3H)，1.02(s，3H)，0.98(s，3H)，0.84(s，3H). [0424] 实施例70 [0425] [0426] LC‑MS(ESI):586.5[M+1]+. [0427] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6):δ9.90(s，1H)，8.40(d，J＝6.4Hz，2H)，7.67(d，J＝6.4Hz，2H)，7.32(s，1H)，4.72(br，1H)，4.58(br，1H)，3.01(s，6H)，3.01‑2.97(m，1H)，2.80‑ 2.72(m，2H)，2.36(d，J＝14.0Hz，1H)，2.07‑2.02(m，2H)，1.77‑1.49(m，9H)，1.44‑1.16(m， 10H)，0.99(s，3H)，0.91(s，3H)，0.90(s，3H)，0.75(s，3H). [0428] 实施例71 [0429] [0430] LC‑MS(ESI):527.5[M+H]+. [0431] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ7.58(t，J＝5.6Hz，1H)，4.65(s，1H)，4.53(s，1H)，4.44(d，J＝3.6Hz，1H)，3.80‑3.77(m，1H)，3.16‑3.08(m，1H)，3.05‑2.91(m，2H)，2.59‑2.52(m，1H)，2.18(t，J＝6.8Hz，2H)，2.11(s，6H)，1.78‑1.67(m，2H)，1.63(s，3H)，1.59‑1.11(m， 18H)，1.04‑0.85(m，12H)，0.80(d，J＝14.0Hz，6H). [0432] 实施例72 [0433] [0434] LC‑MS(ESI):541.5[M+H]+. [0435] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ10.29(s，1H)，8.00(s，1H)，4.66(s，1H)，4.54(s，1H)，4.47(d，J＝3.6Hz，1H)，3.80‑3.77(m，1H)，3.40‑3.39(m，2H)，3.11(s，3H)，3.06‑2.93(m， 3H)，2.52‑2.42(m，1H)，2.14(d，J＝13.0Hz，1H)，1.81‑1.69(m，2H)，1.63(s，3H)，1.62‑1.53(m，1H)，1.51‑1.12(m，20H)，1.07‑0.96(m，2H)，0.92(s，9H)，0.80(d，J＝13.0Hz，7H).[0436] 实施例73 [0437] [0438] LC‑MS(ESI):576.5[M+H]+. [0439] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ9.34(s，1H)，8.18(s，1H)，7.93(t，J＝5.2Hz，1H)，4.69(s，1H)，4.57(s，1H)，4.40‑4.01(br，2H)，3.43‑3.29(m，2H)，3.22‑3.13(m，4H)，3.09‑2.97(m，3H)，2.59(t，J＝10.8Hz，1H)，2.09(d，J＝13.2Hz，1H)，1.81‑1.60(m，8H)，1.53‑1.15(m，16H)，1.13‑1.09(m，10H)，0.93(s，6H). [0440] 实施例74 [0441] [0442] LC‑MS:554.5[M+1]+(98.15％purity by HPLC，220nm) [0443] 1H NMR(400MHz，DMSO‑d6):δ9.87(s，1H)，8.39(d，J＝6.0Hz，2H)，8.20(s，1H)，7.64(d，J＝6.0Hz，2H)，4.73(s，1H)，4.59(s，1H)，3.04‑2.98(m，1H)，2.79‑2.73(m，1H)，2.36(d，J＝14.0Hz，1H)，2.06‑2.01(m，1H)，1.75‑1.72(m，3H)，1.67(s，3H)，1.63‑1.48(m，7H)，1.35‑1.23(m，6H)，1.15(d，J＝13.2Hz，1H)，1.10(s，3H)，1.05(s，3H)，1.02(s，3H)，0.96(s， 3H)，0.93(s，3H). [0444] 药理实验部分 [0445] 测试例1：化合物在分子层面对RORγt的亲和力测试 [0446] 本发明中的化合物在分子层面对RORγt的亲和力测试通过以下方法进行： [0447] 化合物准备：精确称量化合物，使用DMSO(Sigma，D5879)溶解至10mM母液备用。使用1x HBS‑ET缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3.0mM EDTA，and 0.005％(v/v)TW‑ 20)将母液2倍梯度稀释10个浓度，反应体系中化合物的终浓度为10、5、2.5、1.25、0.63、 0.31、0.16、0.08、0.04、0.02μM，化合物的DMSO终浓度为5％。根据相应的实验程序设计将一定量的化合物样品依次转移至96孔板(Greiner，650101)中。 [0448] 表面等离子共振实验(SPR)：采用氨基偶联法将RORγt配体结合结构域蛋白偶联至CM5芯片(Cytiva，BR100530)，信号值约6000‑8000响应单位(RU)。首先运行三次初始化循环，之后依次注入待测化合物，设置结合时间为120秒，解离时间为100秒，随后使用含有 50％DMSO的溶液将芯片中残余的化合物洗除。使用含有4.5％‑5.8％DMSO的1x HBS‑ET缓冲 液每48个循环进行一次溶剂校正。 [0449] 检测与分析：使用Biacore 8K进行信号检测，数据收集和处理分析。实验生成的原始数据使用Biacore8K数据处理软件通过减除对照组参数和溶剂校正，采用静态亲和力模 型拟合出相应的KD值，详见表1。 [0450] 结论：本发明实施例化合物对RORγt具有较强的亲和力。 [0451] 表1.本发明中部分化合物与RORγt配体结合结构域蛋白的KD值 [0452]化合物编号 KD(μM) 化合物编号 KD(μM) 化合物编号 KD(μM) 1 0.67 18 ND 35 ND 2 1.87 19 0.34 36 15.2 3 0.78 20 0.96 42 NB 4 10.2 21 2.08 48 2.06 5 2.9 22 0.64 49 2.19 6 0.18 23 0.55 54 6.41 7 0.78 24 0.77 56 0.87 8 0.12 25 0.42 57 0.29 a 9 ND 26 0.66 62 0.24 10 0.27 27 0.25 63 6.53 b 11 NB 28 ND 64 0.52 12 NB 29 1.96 93 6.39 13 NB 30 NB 94 8.5 14 ND 31 1.11 98 NB 15 ND 32 1.88 143 NB 16 0.77 33 0.52 150 3.82 17 0.59 34 5.46 [0453] 注：a表示该化合物与RORγt配体结合结构域蛋白的亲和力数据尚未测试。b表示化合物与RORγt配体结合结构域蛋白没有结合。 [0454] 测试例2：基于均相时间分辨荧光(HTRF)的化合物结合测试 [0455] 采用HTRF实验评估本发明中的化合物对RORγt和共激活肽SRC1‑2相互作用的阻断能力，实验方法如下： [0456] 化合物准备：精确称量化合物，使用DMSO(Sigma，D5879)溶解至10mM母液备用。使用缓冲液(20mM HEPES,200mM NaCl,5mM DTT,and 4％(v/v)glycerol,pH 7.0)将母液稀释 至化合物的终浓度为100‑0.2μM，化合物的DMSO终浓度为1％。共激活肽SRC1‑2准备：N端生物素化的SRC1‑2肽(序列：CPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSPS)由上海吉尔生化有限公司合成。精 确称量共激活肽SRC1‑2，使用无菌水溶解至10mM母液备用。使用缓冲液(20mM HEPES,200mM NaCl,5mM DTT,and 4％(v/v)glycerol,pH 7.0)将母液稀释至0.5μM备用。铕元素标记的抗 His抗体和XL665标记的链霉亲和素购自Perkin Elmer，用无菌水溶解为10x母液，使用缓冲 液(20mM HEPES,200mM NaCl,5mM DTT,and 4％(v/v)glycerol,pH7.0)稀释为1x溶液，避光 保存备用。 [0457] 均相时间分辨荧光实验(HTRF)：将RORγt蛋白和稀释的化合物加入到白色384微孔板(384OptiPlate,Perkin Elmer)中混匀，室温孵育60min后加入共激活肽SRC1‑2混匀， 室温孵育30min，最后加入铕元素标记的抗his抗体和XL665标记的链霉亲和素混匀，室温避 光孵育60min。 [0458] 检测和分析：使用微孔板检测仪EnVision(Perkin Elmer)进行信号检测和数据收集。在330nm下激发，在615nm和665nm处测量发射光信号。通过GraphPad Prism 9软件计算 抑制率，拟合出相应化合物IC50值，结果见图1和表2。 [0459] 结论：本发明白桦脂酸及实施例化合物能结合ROR γt，有效阻断其与共激活肽SRC1‑2的相互作用。 [0460] 表2.本发明中部分化合物对RORγt和共激活肽SRC1‑2的抑制率 [0461]化合物编号 10μM抑制率 白桦脂酸 79.24％ 4 63.83％ 6 51.25％(25μM) 7 97.31％ 10 78.27％ 11 55.60％(25μM) 16 46.14％ [0462] 测试例3：化合物在分子层面对NF1的亲和力测试 [0463] 本发明中的化合物在分子层面对NF1的亲和力测试通过以下方法进行： [0464] 化合物准备：精确称量化合物，使用DMSO(Sigma，D5879)溶解至10mM母液备用。使用1x HBS‑ET缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3.0mM EDTA，and 0.005％(v/v)TW‑ 20)将母液2倍梯度稀释10个浓度，反应体系中化合物的终浓度为10、5、2.5、1.25、0.63、 0.31、0.16、0.08、0.04、0.02μM，化合物的DMSO终浓度为5％。根据相应的实验程序设计将一定量的化合物样品依次转移至96孔板(Greiner，650101)中。 [0465] 表面等离子共振实验(SPR)：采用氨基偶联法将NF1配体结合结构域蛋白偶联至CM5芯片(Cytiva，BR100530)，信号值约10000响应单位(RU)。首先运行三次初始化循环，之 后依次注入待测化合物，设置结合时间为120秒，解离时间为100秒，随后使用含有50％DMSO 的溶液将芯片中残余的化合物洗除。使用含有4.5％‑5.8％DMSO的1x HBS‑ET缓冲液每48个 循环进行一次溶剂校正。 [0466] 检测与分析：使用Biacore 8K进行信号检测，数据收集和处理分析。实验生成的原始数据使用Biacore8K数据处理软件通过减除对照组参数和溶剂校正，采用静态亲和力模 型拟合出相应的KD值，详见表3。 [0467] 结论：本发明实施例化合物对NF1具有较强的亲和力。 [0468] 表3.本发明中部分化合物与NF1的KD值 [0469] 化合物编号 KD(μM) 化合物编号 KD(μM) 化合物编号 KD(μM)1 2.29 16 0.64 29 23.4 2 NB 17 73.4 30 NB 3 NB 19 NB 31 2.0 4 NB 20 NB 32 5.47 5 NB 21 NB 33 0.61 6 NB 22 NB 34 NB 7 2.02 23 15.3 42 NB 8 NB 24 NB 54 0.851 10 0.27 25 1.55 56 NB 11 NB 26 1.61 57 2.94 12 NB 27 0.84 62 1.04 13 NB [0470] 测试例4：化合物在分子层面与KRASG12C结合实验 [0471] 实验样品准备：精确称量化合物，使用DMSO(Sigma，D5879)将化合物溶解至100mM备用。配制运行缓冲溶液(20mM HEPES，150mM NaCl，1mM TCEP，0.005％TW‑20，pH 7.4)将纯G12C 化好的HIS‑SUMO‑KRAS 蛋白稀释至20μg/mL，同时配制白桦酯酸至50μM和10μM；配置化合物6至4μM和1μM。化合物中的DMSO浓度为0.1％。根据实验需求将蛋白和化合物加入黑色的 96孔板(Corning，3650)中； [0472] 生物膜干涉实验(BLI)：将HIS1K(forte bio，18‑5120)探针置于运行缓冲溶液中，静置5min；将探针以及待测化合物样品放入Octet RED96中，设置结合时间为180秒，解离时 间为120秒。 [0473] 检测与分析：使用Octet RED96进行信号检测，数据收集和处理分析。实验生成的原始数据使用Octet RED96数据处理软件通过减除对照组的数值，采用全局拟合(Global Fitting)的方法对信号进行拟合获得相应的KD值。 [0474] 结论：本发明实施例化合物对KRASG12C具有一定的结合(图2)。 |
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