脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物 |
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| 申请号 | CN202310815171.9 | 申请日 | 2023-07-04 | 公开(公告)号 | CN117069785A | 公开(公告)日 | 2023-11-17 |
| 申请人 | 中生复诺健生物科技(上海)有限公司; 上海复诺健生物科技有限公司; | 发明人 | 张云涛; 王成龙; 周一鸣; 威廉·贾; 高艳霞; 徐江; 赵寰瑜; | ||||
| 摘要 | 本文提供脂质化合物，其可与其他脂质组分，例如中性脂质、胆固醇和 聚合物 结合的脂质组合使用，以形成脂质纳米颗粒用于递送 治疗 剂(例如核酸分子)以实现治疗或 预防 目的，包括 疫苗 接种。本文还提供包含所述脂质化合物的脂质纳米颗粒组合物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.式(I)的化合物： |
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| 说明书全文 | 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物技术领域[0001] 本公开涉及生物医药领域，特别涉及脂质化合物，其可与其他脂质组分，例如中性脂质、胆固醇和聚合物结合的脂质组合使用，以形成脂质纳米颗粒用于在活体外和活体内 递送治疗剂(例如核酸分子，包括核酸模拟物，例如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉核酸 (morpholino))以实现治疗或预防目的，包括疫苗接种。 背景技术[0002] RNA疗法可以操纵基因表达或产生功能蛋白，使这些药物适用于具有既定遗传靶点的疾病，包括传染病、癌症和免疫疾病等。不管它们的治疗作用机制如何，一些功能性RNA (如mRNA)的大尺寸、它们的阴离子电荷以及它们对血流和组织中存在的RNase的敏感性，都 使得mRNA难以有效地进入细胞并自行发挥作用。 [0003] 脂质纳米颗粒(LNP)是mRNA药物常用的载体。LNP是一种多组分系统，通常由可电离脂质或阳离子类脂质化合物、辅助脂质、胆固醇、保护剂聚乙二醇‑脂质共轭物组成。LNP 可将mRNA包裹在结构内部空腔中，这种结构可以提高mRNA体内稳定性，有利于mRNA发挥作 用。然而，制剂中的LNP载体是药物注射后疼痛与炎症等不良反应的主要诱因。此外，mRNA发 挥作用必须经过其翻译出对应的蛋白质实现，需要mRNA从颗粒中逃逸出来，然而，这对于细 胞内的LNP颗粒非常困难。最后，当温度升高时，mRNA具有从LNP中解离的倾向，因此这种制 剂必须低温保存，这也限制了这种剂型在全球范围内的使用。总结来说，尽管这种递送技术 的作用有目共睹，但还有很大的优化空间。 [0004] 可电离脂质或阳离子类脂质化合物是LNP的核心组分，它是LNP有效性和毒副作用的主要影响因素，也是目前开发LNP的主要专利壁垒所在。解决可电离脂质或阳离子类脂质 化合物的细胞毒性是LNP技术的关键点之一，开发中需要在递送效率和毒副作用之间取得 平衡。对于可电离脂质或阳离子脂质它的细胞毒性取决于其亲水性头基的结构，阳离子脂 质的头基结构是季胺，可电离脂质的头基结构是叔胺，一般来说季铵头基的两亲分子要比 叔胺头基的两亲分子毒性更大。目前国内外在开发的主要集中在可电离脂质，可电离脂质 在低pH下质子化，这使其带正电，但在生理pH下保持中性，于生理低pH值环境下可质子化带 正电，并在mRNA被递送后安全清除。可电离脂质的pH敏感性有利于体内mRNA的传递，因为中 性脂质与血细胞的阴离子膜的相互作用较少，从而提高脂质纳米颗粒的生物相容性。 [0005] 因此，可电离脂质是专利保护的重点。比如在新冠期间大放异彩的mRNA疫苗，其递送系统LNP的主要成分ALC‑0315(Acuitas/辉瑞)和SM‑102(Moderna)就是亲水性头基是叔 胺的可电离脂质。在LNP专利领域，Arbutus公司是LNP领域的龙头公司，它广泛且深入地覆 盖了可电离脂质/阳离子脂质方面的大量专利，涵盖了众多的化合物结构专利、LNP组合物 及其配比专利和应用专利。 [0006] 由于国外可电离脂质布局更早，国内开发可电离脂质收到了国外专利的限制，目前国内公司突破专利的主要方向在改变可电离脂质的头基结构和连接基团，本专利的主要 开发方向是改变可电离脂质的脂质链，用甾族脂质分子替换化合物的脂肪链，通过专利调 研，US 9,365,610B2专利中存在胆固醇替代脂肪链的类似结构，但该专利中的化合物的头 基结构与本专利不相同，本专利使用的头基结构是与ALC‑0315和SM‑102类似的醇胺结构， US 9,365,610 B2专利中是不含羟基含有两个叔胺的头部结构。 [0007] 核酸递送近年有了长足的发展，然而，在治疗过程中基因递送目前面临着诸多挑战：缺少体内高效递送mRNA的化合物；市场上存在的化合物制备的LNP用于mRNA递送有明显 的副作用；可电离脂质合成工艺复杂；可电离脂质专利壁垒严重。 [0009] 本公开提供脂质化合物，包括其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其可单独使用或与其他脂质组分，例如中性脂质、带电脂质、类固醇(包括例如所有固醇)和/或其类 似物和/或聚合物结合的脂质和/或聚合物组合使用，以形成用于递送治疗剂(例如核酸分 子，包括核酸模拟物，例如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉核酸)的脂质纳米颗粒。在一些 情况下，使用所述脂质纳米颗粒递送核酸，例如反义和/或信使RNA。还提供使用此类脂质纳 米颗粒治疗各种疾病或疾患，例如由感染物和/或蛋白质不足引起的疾病或疾患的方法。 [0010] 在第一方面，本公开提供式(I)的化合物： [0011] [0012] 或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中： [0013] L1为‑OC(＝O)R1、‑C(＝O)OR1、‑OC(＝O)OR1、‑C(＝O)R1、‑OR1、‑S(O)xR1、‑S‑SR1、‑C1 1 a 1 b c a b c b c a (＝O)SR、‑SC(＝O)R 、‑NR C(＝O)R、‑C(＝O)NRR 、‑NR C(＝O)NRR、‑OC(＝O)NRR 、‑NR C 1 1 1 1 1 b c (＝O)OR 、‑SC(＝S)R、‑C(＝S)SR 、‑C(＝S)R、‑CH(OH)R 、‑P(＝O)(OR)(OR)、‑(C6‑C10亚 1 1 1 芳基)‑R、‑(6至10元亚杂芳基)‑R或R； [0014] R1为C6‑C24烷基或C6‑C24烯基或C6‑C24炔基； [0015] Ra和Rb各自独立地为H、C1‑C12烷基、C2‑C12烯基或C2‑C12炔基； [0016] Rc为C1‑C12烷基、C2‑C12烯基或C2‑C12炔基； [0017] G1和G2各自独立地为C1‑C12亚烷基、C2‑C12亚烯基或C2‑C12亚炔基； [0018] L2为‑(C＝O)O‑、OC(＝O)O‑或‑O‑； [0019] R2为甾醇基团； [0020] R3为‑Rd‑OH，Rd为C1‑C12亚烷基；并且 [0021] 其中任选地，每个烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基和亚杂芳基独立地被取代。 [0022] 在第二方面，本公开提供组合物，其包含上述第一方面所述的化合物以及治疗剂或预防剂。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种结构脂质。在一个实施方 案中，所述一种或多种结构脂质是DSPC。在一个实施方案中，所述化合物与所述结构脂质的 摩尔比在约2∶1至约8∶1的范围内，优选约49:10。在一个实施方案中，所述组合物进一步包 含类固醇。在一个实施方案中，所述类固醇是胆固醇。在一个实施方案中，所述化合物与所 述类固醇的摩尔比在约5∶1至约1∶1的范围内，优选约49：39.5。在一个实施方案中，所述组 合物进一步包含一种或多种聚合物结合的脂质。在一个实施方案中，所述聚合物结合的脂 质是DMG‑PEG2000或DMPE‑PEG2000。在一个实施方案中，所述化合物与所述聚合物结合的脂 质的摩尔比在约100∶1至约20∶1的范围内，优选约49:1.5。在一个实施方案中，所述治疗剂 或预防剂包含选自以下的一种或多种：小分子药物、核酸分子、蛋白质。在一个实施方案中， 所述核酸分子包含至少一种编码蛋白或其片段或表位的DNA或mRNA或siRNA或nclRNA。在一 个实施方案中，所述mRNA是单顺反子mRNA。在一个实施方案中，所述mRNA是多顺反子mRNA。 在一个实施方案中，所述蛋白是致病性抗原。在一个实施方案中，所述蛋白是肿瘤相关抗 原。在一个实施方案中，所述蛋白是具有治疗或修复功能的蛋白。在一个实施方案中，所述 mRNA包含一种或多种功能性核苷酸类似物。在一个实施方案中，所述功能性核苷酸类似物 是选自以下的一种或多种：假尿苷、1‑甲基‑假尿苷和5‑甲基胞嘧啶。在一个实施方案中，所 述组合物是纳米颗粒。 [0023] 在第三方面，本公开提供脂质纳米颗粒，其包含上述第一方面所述的化合物或上述第二方面所述的的组合物。 [0024] 在第四方面，本公开提供药物组合物，其包含上述第一方面所述的化合物、上述第二方面所述的组合物或上述第三方面所述的脂质纳米颗粒，以及药学上可接受的赋形剂或 稀释剂。 [0025] 在第五方面，本公开提供上述第三方面所述的脂质纳米颗粒或上述第四方面所述的药物组合物在制备药物中的用途。 [0027] 图1是本公开的化合物1的核磁共振氢谱图； [0028] 图2是本公开的化合物2的核磁共振氢谱图； [0029] 图3是本公开的化合物3的核磁共振氢谱图； [0030] 图4是本公开的化合物4的核磁共振氢谱图； [0031] 图5是本公开的化合物5的核磁共振氢谱图； [0032] 图6是本公开的化合物6的核磁共振氢谱图； [0033] 图7是本公开的化合物7的核磁共振氢谱图； [0034] 图8是本公开的化合物8的核磁共振氢谱图； [0035] 图9是本公开的化合物9的核磁共振氢谱图； [0036] 图10是本公开的化合物10的核磁共振氢谱图； [0037] 图11是本公开的化合物11的核磁共振氢谱图； [0038] 图12是本公开的实施例7的体外细胞实验结果图。 具体实施方式[0039] 本文所描述或引用的技术和程序包括所属领域的技术人员使用常规方法一般很好理解和/或通常采用的技术和程序，如例如Sambrook等人，Molecular Cloning： ALaboratory Manual(第3版，2001)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等人编，2003)中所描述的广泛使用的方法。 [0040] 术语 [0041] 除非另有描述，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与所属领域的技术人员通常所理解相同的含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下术语描述，并且在适当 时，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，反之亦然。所有专利、申请、公布的申请和其 他出版物均以全文引用的方式并入。如果所阐述的关于术语的任何描述与以引用的方式并 入本文中的任何文件相冲突，则以下文阐述的术语描述为准。 [0042] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“脂质”是指一组有机化合物，其包括但不限于脂肪酸酯，并且一般以难溶于水但可溶于许多非极性有机溶剂中为特征。尽管脂质 一般具有弱水溶性，但是某些类别的脂质(例如经极性基团改性的脂质，例如DMG‑PEG2000) 具有有限的水溶性且在某些条件下可溶于水。已知的脂质类型包括生物分子，如脂肪酸、 蜡、固醇、脂溶性维生素、甘油单酸酯、甘油二酸酯、甘油三酸酯和磷脂。脂质可分为至少三 类：(1)“简单脂质”，包括脂肪和油，以及蜡；(2)“化合物脂质”，包括磷脂和糖脂(例如DMPE‑PEG2000)；和(3)“衍生脂质”，如类固醇。此外，如本文所使用，脂质还包括类脂质化合物。术语“类脂质化合物”又简称为“类脂质’；是指脂质样化合物(例如具有脂质样物理性质的两 亲性化合物)。 [0043] 术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指具有至少一个纳米(nm)级尺寸(例如1至1,000nm)的颗粒，其含有一种或多种类型的脂质分子。本文所提供的LNP可进一步含有至少一 种非脂质有效负载分子(例如一种或多种核酸分子)。在一些实施方案中，LNP包含部分或完 全包封在脂质壳内的非脂质有效负载分子。具体地说，在一些实施方案中，其中有效负载是 带负电分子(例如编码病毒蛋白的mRNA)，并且LNP的脂质组分包含至少一种阳离子脂质。不 受理论束缚，预期阳离子脂质可与带负电的有效负载分子相互作用，并在LNP形成期间促进 有效负载并入和/或包封至LNP中。可形成如本文所提供的LNP的一部分的其他脂质包括但 不限于中性脂质和带电脂质，如类固醇、聚合物结合的脂质和各种两性离子性脂质。在某些 实施方案中，根据本公开的LNP包含如本文所描述的一种或多种式(I)(和其子式)的脂质。 [0044] 术语“阳离子脂质”是指在其环境的任何pH值或氢离子活性下带正电，或能够响应于其环境(例如其预定用途的环境)的pH值或氢离子活性而带正电的脂质。因此，术语“阳离 子”涵盖“永久性阳离子”和“可阳离子化”。在某些实施方案中，阳离子脂质中的正电荷源自 季氮原子的存在。在某些实施方案中，阳离子脂质包含两性离子性脂质，所述两性离子性脂 质在其预定用途的环境中(例如在生理pH值下)带正电荷。在某些实施方案中，阳离子脂质 是如本文所描述的一种或多种式(I)(和其子式)的脂质。 [0046] 术语“中性脂质”涵盖在所选pH值下或在所选pH值范围内以不带电形式或以中性两性离子形式存在的任何脂质分子。在一些实施方案中，所选的有用pH值或范围对应于预 定脂质用途的环境中的pH条件，如生理pH值。作为非限制性实例，可结合本公开使用的中性 脂质包括但不限于磷脂酰胆碱，如1，2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DSPC)、1，2‑二棕榈酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DPPC)、1，2‑二肉豆蔻酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DMPC)、1‑棕榈酰基‑2‑油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(POPC)、1，2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DOPC)；磷脂酰乙醇胺，如1，2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺(DOPE)、2‑((2，3‑双(油酰氧基)丙基))二甲基铵基)乙基磷酸氢盐(DOCP)；鞘磷脂(SM)；神经酰胺；类固醇，如固醇和 其衍生物。本文所提供的中性脂质可为合成的或者衍生自天然来源或化合物(自其分离或 改性)。 [0047] 术语“带电脂质”涵盖在所选pH值下或在所选pH值范围内以带正电或带负电形式存在的任何脂质分子。在一些实施方案中，所选pH值或范围对应于预定脂质用途的环境中 的pH条件，如生理pH值。作为非限制性实例，可与本公开结合使用的中性脂质包括但不限于 磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、固醇半琥珀酸酯、二烷基三甲基铵‑丙烷 (例如DOTAP、DOTMA)、二烷基二甲基氨基丙烷、乙基磷酸胆碱、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基 固醇(例如DC‑Chol)、1，2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸‑L‑丝氨酸钠盐(DOPS‑Na)、1，2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸‑(1′‑外消旋‑甘油)钠盐(DOPG‑Na)和1，2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸钠盐(DOPA‑Na)。本文所提供的带电脂质可为合成的或者衍生自天然来源或化合物(自其 分离或改性)。 [0048] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的饱和直链或支链烃链基团。在一个实施方案中，烷基具有例如一至二十四个碳原子(C1‑C24烷 基)、四至二十个碳原子(C4‑C20烷基)、六至十六个碳原子(C6‑C16烷基)、六至九个碳原子 (C6‑C9烷基)、一至十五个碳原子(C1‑C15烷基)、一至十二个碳原子(C1‑C12烷基)、一至八个碳原子(C1‑C8烷基)或一至六个碳原子(C1‑C6烷基)且其通过单键连接至分子其余部分。烷基 的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、1‑甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1，1‑二甲基乙基(叔丁基)、3‑甲基己基、2‑甲基己基等。除非另有说明，否则烷基任选地经取代。 [0049] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其含有一个或多个碳‑碳双键。所属领域的技术人员应了解，术语“烯基” 还包含具有“顺式”和“反式”构型，或者具有“E”和“Z”构型的基团。在一个实施方案中，烯基具有例如二至二十四个碳原子(C2‑C24烯基)、四至二十个碳原子(C4‑C20烯基)、六至十六个 碳原子(C6‑C16烯基)、六至九个碳原子(C6‑C9烯基)、二至十五个碳原子(C2‑C15烯基)、二至十二个碳原子(C2‑C12烯基)、二至八个碳原子(C2‑C8烯基)或二至六个碳原子(C2‑C6烯基)且其 通过单键连接至分子其余部分。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙‑1‑烯基、丁‑1‑烯基、 戊‑1‑烯基、戊‑1，4‑二烯基等。除非另有说明，否则烯基任选地经取代。 [0050] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“炔基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其含有一个或多个碳‑碳三键。在一个实施方案中，炔基具有例如二至二 十四个碳原子(C2‑C24炔基)、四至二十个碳原子(C4‑C20炔基)、六至十六个碳原子(C6‑C16炔 基)、六至九个碳原子(C6‑C9炔基)、二至十五个碳原子(C2‑C15炔基)、二至十二个碳原子(C2‑C12炔基)、二至八个碳原子(C2‑C8炔基)或二至六个碳原子(C2‑C6炔基)且其通过单键连接至 分子其余部分。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基等。除非另有说 明，否则炔基任选地经取代。 [0051] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成且为饱和的。在一个实施方案 中，亚烷基具有例如一至二十四个碳原子(C1‑C24亚烷基)、一至十五个碳原子(C1‑C15亚烷 基)、一至十二个碳原子(C1‑C12亚烷基)、一至八个碳原子(C1‑C8亚烷基)、一至六个碳原子 (C1‑C6亚烷基)、二至四个碳原子(C2‑C4亚烷基)、一至二个碳原子(C1‑C2亚烷基)。亚烷基的 实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基等。亚烷基链经由单键连接至分子其 余部分，并且经由单键连接至基团。亚烷基链与分子其余部分和与基团的连接点可经由链 内的一个碳或任何两个碳进行。除非另有说明，否则亚烷基链任选地经取代。 [0052] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚烯基”是指将分子其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成且含有一个或多个碳‑碳双键。在一个实施方 案中，亚烯基具有例如二至二十四个碳原子(C2‑C24亚烯基)、二至十五个碳原子(C2‑C15亚烯 基)、二至十二个碳原子(C2‑C12亚烯基)、二至八个碳原子(C2‑C8亚烯基)、二至六个碳原子 (C2‑C6亚烯基)或二至四个碳原子(C2‑C4亚烯基)。亚烯基的实例包括但不限于亚乙烯基、亚 丙烯基、亚正丁烯基等。亚烯基经由单键或双键连接至分子其余部分，并且经由单键或双键 连接至基团。亚烯基与分子其余部分和与基团的连接点可经由链内的一个碳或任何两个碳 进行。除非另有说明，否则亚烯基任选地经取代。 [0053] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚炔基”是指将分子其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成且含有一个或多个碳‑碳三键。在一个实施方 案中，亚炔基具有例如二至二十四个碳原子(C2‑C24亚炔基)、二至十五个碳原子(C2‑C15亚炔 基)、二至十二个碳原子(C2‑C12亚炔基)、二至八个碳原子(C2‑C8亚炔基)、二至六个碳原子 (C2‑C6亚炔基)或二至四个碳原子(C2‑C4亚炔基)。亚炔基的实例包括但不限于亚乙炔基、亚 丙炔基、亚正丁炔基等。亚炔基经由单键或双键连接至分子其余部分，并且经由单键或双键 连接至基团。亚炔基与分子其余部分和与基团的连接点可经由链内的一个碳或任何两个碳 进行。除非另有说明，否则亚炔基任选地经取代。 [0054] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“芳基”是指含有至少一个芳族烃环的单环芳族基团和/或多环单价芳族基团。在某些实施方案中，芳基具有6至18个环碳原子(C6‑ C18芳基)、6至14个环碳原子(C6‑C14芳基)或6至10个环碳原子(C6‑C10芳基)。芳基的实例包括 但不限于苯基、萘基、芴基、薁基、蒽基、菲基、芘基、联苯基和联三苯基。术语“芳基”还指双环、三环或其他多环烃环，其中至少一个环是芳族环，并且其他环可为饱和、部分不饱和或 芳族环，例如二氢萘基、茚基、二氢茚基或四氢萘基(tetrahydronaphthyl/tetralinyl)。除 非另有说明，否则芳基任选地经取代。 [0055] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚芳基”是二价芳基。除非另有说明，否则亚芳基任选地经取代。 [0056] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“杂芳基”是指含有至少一个芳族环的单环芳族基团和/或多环芳族基团，其中至少一个芳族环含有一个或多个(例如一个、一个或 两个、一个至三个、或一个至四个)独立地选自O、S和N的杂原子。杂芳基可在任何杂原子或 碳原子处连接至主结构。在某些实施方案中，杂芳基具有5至20个、5至15个或5至10个环原 子。术语“杂芳基”还指双环、三环或其他多环，其中至少一个环是芳族环，并且其他环可为 饱和、部分不饱和或芳族环，其中至少一个芳族环含有一个或多个独立地选自O、S和N的杂 原子。单环杂芳基的实例包括但不限于吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、异噁唑 基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基和三嗪基。双环杂芳基的实例包括但不限于吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻吩 基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲哚嗪基、苯并呋喃基、异 苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、噌啉基、喹噁啉基、吲唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并 吡啶基、噻吩并吡啶基、二氢异吲哚基和四氢喹啉基。三环杂芳基的实例包括但不限于咔唑 基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基和呫吨基。除非另有说明，否则杂芳基任选地经 取代。 [0057] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚杂芳基”是二价杂芳基。除非另有说明，否则亚杂芳基任选地经取代。 [0058] 当本文所描述的基团被称为“经取代”时，其可经一个或多个任何适当的取代基取代。取代基的说明性实例包括但不限于在本文所提供的示例性化合物和实施方案中发现的 取代基，以及：卤素原子，如F、Cl、Br或I；氰基；氧代(＝O)；羟基(‑OH)；烷基；烯基；炔基；环烷基；芳基；‑(C＝O)OR’；‑O(C＝O)R’；‑C(＝O)R’；‑OR’；‑S(O)xR’；‑S‑SR’；‑C(＝O)SR’；‑SC(＝O)R’；‑NR’R’；‑NR’C(＝O)R’；‑C(＝O)NR’R’；‑NR’C(＝O)NR’R’；‑OC(＝O)NR’R’；‑NR’C(＝O)OR’；‑NR’S(O)xNR’R’；‑NR’S(O)xR′；和‑S(O)xNR’R’，其中：R’在每次出现时独立地为H、C1‑C15烷基或环烷基，并且x是0、1或2。在一些实施方案中，取代基是C1‑C12烷基。在其他实施方案中，取代基是环烷基。在其他实施方案中，取代基是卤基，如氟基。在其他实施方案 中，取代基是氧代。在其他实施方案中，取代基是羟基。在其他实施方案中，取代基是烷氧基 (‑OR’)。在其他实施方案中，取代基是羧基。在其他实施方案中，取代基是氨基(‑NR’R’)。 [0059] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“任选地选用的”或“任选地”(例如任选地经取代)意指随后描述的事件或情况可能会发生或可能不会发生，并且该描述包括所述 事件或情况发生的情况和其不发生的情况。举例来说，“任选地经取代的烷基”意指烷基可 经取代或可不经取代，并且该描述包括经取代的烷基和不具有取代的烷基两者。 [0060] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语生物活性化合物的“前药”是指可在生理条件下或通过溶剂分解而转化为生物活性化合物的化合物。在一个实施方案中，术语“前 药”是指生物活性化合物的药学上可接受的代谢前体。当将前药施用于有需要的受试者时， 前药可能为无活性的，但在活体内转化为生物活性化合物。前药典型地在活体内迅速转型 以产生母体生物活性化合物，例如通过在血液中水解而转型。前药化合物在哺乳动物生物 体中通常提供溶解性、组织相容性或延迟释放的优点(参见Bundgard，H.，Design ofProdrugs(1985)，第7‑9页，第21‑24页(Elsevier，Amsterdam))。关于前药的论述提供于 Higuchi，T.等人，A.C.S.Symposium Series，第14卷；以及Bioreversible Carriers inDrug Design，Edward B.Roche编辑，American Pharmaceutical Association andPergamon Press，1987中。 [0061] 在一个实施方案中，术语“前药”还意图包括任何共价键合的载体，当将此类前药施用于哺乳动物受试者时，其在活体内释放活性化合物。化合物的前药可通过修饰化合物 中存在的官能基来制备，其方式是使得修饰可在常规操作中或在活体内裂解而得到母体化 合物。前药包括羟基、氨基或巯基键合至任何基团的化合物，当将化合物的前药施用于哺乳 动物受试者时，所述基团裂解而分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。 [0062] 前药的实例包括但不限于本文所提供化合物中的醇官能基的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或胺官能基的酰胺衍生物。 [0063] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。 [0064] 药学上可接受的酸加成盐的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；以及有机酸，例如但不限于乙酸、2，2‑二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4‑乙酰胺基苯甲酸、樟脑酸、樟脑‑10‑磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸(cyclamic acid)、十二烷基硫酸、乙烷‑1，2‑二磺酸、乙烷磺酸、2‑羟基乙烷磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2‑氧代戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、粘液酸、萘‑1，5‑二磺酸、萘‑2‑磺酸、1‑羟基‑2‑萘甲酸、烟碱酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸(pamoic acid)、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4‑氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。 [0065] 药学上可接受的碱加成盐的实例包括但不限于通过将无机碱或有机碱添加至游离酸化合物而制备的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。在一个实施方案中，无机盐是铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐 包括但不限于以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺；经取代胺，包括天然存在的经取代胺；环胺和碱 性离子交换树脂，如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇 (deanol)、2‑二甲基氨基乙醇、2‑二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺(benethamine)、苄 星(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱(theobromine)、三乙醇胺、氨基丁三 醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N‑乙基哌啶、聚胺树脂等。在一个实施方案中，有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。 [0066] 本文所提供的化合物可含有一个或多个不对称中心，且因此可产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构形式，所述形式可根据绝对立体化学定义为(R)‑或(S)‑或对 于氨基酸可定义为(D)‑或(L)‑。除非另有说明，否则本文所提供的化合物意图包括所有此 类可能的异构体，以及其外消旋和光学纯形式。光学活性(+)与(‑)、(R)‑与(S)‑或(D)‑与 (L)‑异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术，例如色谱法和分步结晶 法拆分。用于制备/分离个别对映异构体的常规技术包括自适合的光学纯前体手性合成或 使用例如手性高压液相色谱法(HPLC)拆分外消旋体(或盐或衍生物的外消旋体)。当本文所 述化合物含有烯属双键或其他几何不对称中心时，除非另有说明，否则所述化合物意欲包 括E和Z几何异构体。同样，还意欲包括所有互变异构形式。 [0067] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“异构体”是指具有相同分子式的不同化合物。“立体异构体”是仅原子在空间中的排列方式不同的异构体。“阻转异构体”是由绕单 键的受阻旋转得到的立体异构体。“对映异构体”是一对互为不可重叠的镜像的立体异构 体。一对对映异构体的任何比例的混合物可称为“外消旋”混合物。“非对映异构体”是具有 至少两个不对称原子但不互为镜像的立体异构体。 [0068] “立体异构体”还可包括E和Z异构体或其混合物，以及顺式和反式异构体或其混合物。在某些实施方案中，本文所述的化合物分离为E或Z异构体。在其他实施方案中，本文所 述的化合物是E和Z异构体的混合物。 [0069] “互变异构体”是指化合物的彼此平衡的异构形式。异构形式的浓度将取决于发现化合物的环境，并且可取决于例如化合物是固体还是在有机溶液或水溶液中而有所不同。 [0070] 还应注意，本文所述的化合物可在一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位3 125 素。举例来说，化合物可用放射性同位素进行放射性标记，如氚(H)、碘‑125( I)、硫‑35 35 14 2 13 15 ( S)或碳‑14( C)，或者可为同位素富集的，如氘(H)、碳‑13( C)或氮‑15( N)。如本文所 使用，“同位素体”是同位素富集的化合物。术语“同位素富集”是指原子的同位素组成不同 于该原子的天然同位素组成。“同位素富集”还可指化合物含有的至少一个原子的同位素组 成不同于该原子的天然同位素组成。术语“同位素组成”是指给定原子存在的每种同位素的 量。经放射性标记和同位素富集的化合物可用作治疗剂，例如癌症治疗剂；研究试剂，例如 结合分析试剂；和诊断剂，例如活体内成像剂。本文所述化合物的所有同位素变体，无论是 否具有放射性，皆意欲涵盖在本文所提供的实施方案的范围内。在一些实施方案中，提供本 文所述化合物的同位素体，例如同位素体是氘、碳‑13和/或氮‑15富集的。如本文所使用， 2 “氘代”是指化合物中的至少一个氢(H)已经氘(以D或 H表示)置换，也就是说，化合物在至 少一个位置处富含氘。 [0071] 应注意，如果所描绘的结构与该结构的名称之间存在差异，则应以所描绘的结构为准。 [0072] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于被美国食品与药物管理局批准可接受用于人类或家畜的任何佐剂、载体、 赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。 [0074] 如本文可互换使用，术语“聚核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括例如DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基 和/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应并入聚合物中的任何底物。聚核 苷酸可包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和其类似物。核酸可为单股或双股形式。如本 文所使用且除非另有说明，否则“核酸”还包括核酸模拟物，如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和 吗啉核酸。如本文所使用，“寡核苷酸”是指短的合成聚核苷酸，其长度一般但未必少于约 200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“聚核苷酸”并非互相排斥的。以上关于聚核苷酸的描述同 样且完全适用于寡核苷酸。除非另有说明，否则本文所公开的任何单股聚核苷酸序列的左 手端为5′端；双股聚核苷酸序列的左手方向称为5′方向。新生RNA转录物的5′至3′添加方向 称为转录方向；DNA股上具有与RNA转录物相同的序列且相对于RNA转录物的5′端而位于5′ 端的序列区域称为“上游序列”；DNA股上具有与RNA转录物相同的序列且相对于RNA转录物 的3′端而位于3′端的序列区域称为“下游序列”。 [0075] “分离的核酸”是指与天然地伴随天然序列的其他基因组DNA序列以及蛋白质或复合物(如核糖体和聚合酶)基本上分离的核酸，例如RNA、DNA或混合核酸。“分离”的核酸分子 是与存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。此外，当通过重组技 术制造时，“分离”的核酸分子，如mRNA分子，可基本上不含其他细胞材料或培养基，或者当 化学合成时，其可基本上不含化学前体或其他化学品。在特定实施方案中，本文所述的编码 抗原的一种或多种核酸分子是分离或纯化的。该术语包括已自其天然存在的环境移除的核 酸序列，并且包括重组或克隆的DNA或RNA分离物以及化学合成的类似物或由异源系统生物 合成的类似物。基本上纯的分子可包括分子的分离形式。 [0076] 术语“编码核酸”或其语法等效物当用于指核酸分子时包括(a)处于天然状态或通过所属领域的技术人员熟知的方法操作时可转录产生mRNA且接着转译成肽和/或多肽的核 酸分子；和(b)mRNA分子本身。反义股是此类核酸分子的互补序列，并且可由其推断出编码 序列。术语“编码区”是指编码核酸序列中转译成肽或多肽的部分。术语“非转译区”或“UTR”是指编码核酸中不转译成肽或多肽的部分。取决于UTR相对于核酸分子的编码区的取向， UTR如果位于编码区5′端，则称为5′‑UTR，并且UTR如果位于编码区3′端，则称为3′‑UTR。 [0077] 如本文所使用，术语“mRNA”是指包含一个或多个开放阅读框(ORF)的信使RNA分子，其可经具有所述mRNA的细胞或生物体转译以产生一种或多种肽或蛋白质产物。含有一 个或多个ORF的区域称为mRNA分子的编码区。在某些实施方案中，mRNA分子进一步包含一个 或多个非转译区(UTR)。 [0078] 在某些实施方案中，mRNA是仅包含一个ORF的单顺反子mRNA。在某些实施方案中，单顺反子mRNA编码包含选定抗原(例如致病性抗原或肿瘤相关抗原)的至少一个表位的肽 或蛋白质。在其他实施方案中，mRNA是包含两个或更多个ORF的多顺反子mRNA。在某些实施 方案中，多顺反子mRNA编码可彼此相同或不同的两种或更多种肽或蛋白质。在某些实施方 案中，由多顺反子mRNA编码的每种肽或蛋白质包含选定抗原的至少一个表位。在某些实施 方案中，由多顺反子mRNA编码的不同肽或蛋白质各自包含不同抗原的至少一个表位。在本 文所述实施方案中的任一个中，所述至少一个表位可为抗原的至少2个、至少3个、至少4个、 至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个表位。 [0079] 术语“核碱基”涵盖嘌呤和嘧啶，包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷以及其天然或合成类似物或衍生物。 [0080] 如本文所使用，术语“功能性核苷酸类似物”是指经典核苷酸A、G、C、U或T的经修饰型式，所述型式(a)保留相应经典核苷酸的碱基配对特性，并且(b)含有至少一种对相应天 然核苷酸的(i)核碱基、(ii)糖基、(iii)磷酸酯基或(iv)(i)至(iii)的任何组合的化学修 饰。如本文所使用，碱基配对不仅涵盖经典沃森‑克里克(Watson‑Crick)腺嘌呤‑胸腺嘧啶、 腺嘌呤‑尿嘧啶或鸟嘌呤‑胞嘧啶碱基对，而且还涵盖在经典核苷酸与功能性核苷酸类似物 之间或在一对功能性核苷酸类似物之间形成的碱基对，其中氢键供体与氢键受体的布置允 许在经修饰的核碱基与经典核碱基之间或在两个互补的经修饰核碱基结构之间形成氢键。 举例来说，鸟苷(G)的功能性类似物保留与胞嘧啶(C)或胞嘧啶的功能性类似物碱基配对的 能力。此类非经典碱基配对的一个实例是经修饰核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之 间的碱基配对。如本文所述，功能性核苷酸类似物可为天然存在或非天然存在的。因此，含 有功能性核苷酸类似物的核酸分子可具有至少一个经修饰的核碱基、糖基和/或核苷间键 联。本文提供对核酸分子的核碱基、糖基或核苷间键联的示例性化学修饰。 [0081] 如本文所使用，术语“转译强化子元件”、“TEE”和“转译强化子”是指核酸分子中用于促进核酸的编码序列转译成蛋白质或肽产物，如经由帽依赖性或非帽依赖性转译而转译 成蛋白质或肽产物的区域。TEE典型地位于核酸分子(例如mRNA)的UTR区，并增强位于上游 或下游的编码序列的转译水平。举例来说，核酸分子的5′‑UTR中的TEE可位于核酸分子的启 动子与起始密码子之间。各种TEE序列是此项技术中已知的(Wellensiek等人，Genome‑ wideprofiling of human cap‑independent translation‑enhancing elements， NatureMethods，2013年8月；10(8)：747‑750；Chappell等人，PNAS，2004年6月29日，101(26) 9590‑9594)。已知一些TEE在多个物种中是保守的(Pánek等人，Nucleic Acids Research， 第41卷，第16期，2013年9月1日，第7625‑7634页)。 [0082] 如本文所使用，术语“茎‑环序列”是指具有至少两个区域的单股聚核苷酸序列，当以相反方向阅读时，所述两个区域彼此互补或基本上互补，并且因此能够彼此碱基配对形 成至少一个双螺旋和未配对的环。所得到的结构称为茎‑环结构、发夹或发夹环，它是在许 多RNA分子中发现的二级结构。 [0083] 如本文所使用，术语“肽”是指含有二至五十(2‑50)个经一个或多个共价肽键连接的氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或多个氨基酸 残基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物或非天然氨基酸)的氨基酸聚合物。 [0084] 术语“多肽”与“蛋白质”在本文中可互换使用，指具有超过五十(50)个由共价肽键连接的氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于针对蛋白质的描述，反 之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或多个氨基酸残基是非天然存 在的氨基酸(例如氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。如本文所使用，所述术语涵盖任何长度 的氨基酸链，包括全长蛋白质(例如抗原)。 [0085] 术语“抗原”是指能够被受试者的免疫系统(包括适应性免疫系统)识别的物质，并且在受试者与抗原接触之后能够触发免疫反应(包括抗原特异性免疫反应)。在某些实施方 案中，抗原是与患病细胞，如感染病原体的细胞或赘生性细胞相关的蛋白质(例如肿瘤相关 抗原(TAA))。 [0086] 在肽或多肽的情况下，如本文所使用，术语“片段”是指包含少于全长的氨基酸序列的肽或多肽。此类片段可例如来自于氨基末端的截短、羧基末端的截短和/或氨基酸序列 中残基的内部缺失。片段可例如由选择性RNA剪接或由活体内蛋白酶活性产生。在某些实施 方案中，片段是指包括含多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基 酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、 至少30个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个 连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基 酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残 基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少250个、至少300个、至少 350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个、至少650个、至少700个、 至少750个、至少800个、至少850个、至少900个或至少950个连续氨基酸残基的氨基酸序列 的多肽。在特定实施方案中，多肽的片段保留所述多肽的至少1种、至少2种、至少3种或更多 种功能。 [0087] “表位”是抗原分子表面上与单个抗体分子结合的位点，如抗原表面上能够结合至抗体的一个或多个抗原结合区的局部区域，并且其在动物体内，如在哺乳动物体内(例如人 体内)具有抗原或免疫原性活性，能够引起免疫反应。具有免疫原性活性的表位是多肽的在 动物体内引起抗体反应的部分。具有抗原活性的表位是多肽的通过此项技术中熟知的任何 方法，包括例如通过免疫分析确定的抗体所结合的部分。抗原性表位未必具有免疫原性。表 位通常由分子的化学活性表面基团，如氨基酸或糖侧链组成，并且具有特定的三维结构特 征以及特定的电荷特征。抗体表位可为线性表位或构象表位。线性表位是由蛋白质中的连 续氨基酸序列形成的。构象表位是由在蛋白质序列中不连续但在蛋白质折叠成其三维结构 时结合在一起的氨基酸形成的。当蛋白质的三维结构呈改变的构象时，如在另一种蛋白质 或配体活化或结合之后，形成诱导性表位。在某些实施方案中，表位是多肽的三维表面特 征。在其他实施方案中，表位是多肽的线性特征。一般来说，抗原具有若干或许多不同的表 位，并且可与许多不同的抗体反应。 [0088] 如本文所使用，术语“基因疫苗”是指包含至少一种核酸分子的治疗性或预防性组合物，所述至少一种核酸分子编码与目标疾病(例如感染性疾病或赘生性疾病)相关的抗 原。向受试者施用疫苗(“疫苗接种”)允许产生编码的肽或蛋白质，由此在受试者体内引起 针对目标疾病的免疫反应。在某些实施方案中，免疫反应包括适应性免疫反应，如产生针对 编码的抗原的抗体，和/或能够特异性消除表达所述抗原的患病细胞的免疫细胞的活化和 增殖。在某些实施方案中，免疫反应进一步包括先天免疫反应。根据本公开，疫苗可在目标 疾病的临床症状发作之前或之后施用于受试者。在一些实施方案中，对健康或无症状受试 者进行疫苗接种使经疫苗接种的受试者对目标疾病的发展具有免疫性或不太敏感。在一些 实施方案中，对显示疾病症状的受试者进行疫苗接种改善经疫苗接种的受试者的疾病状况 或治疗所述疾病。 [0089] 术语“先天免疫反应”和“先天免疫”是此项技术中公认的，并且是指身体的免疫系统在识别出病原体相关分子模式时启动的非特异性防御机制，其涉及不同形式的细胞活 动，包括经由各种路径的细胞因子产生和细胞死亡。如本文所使用，先天免疫反应包括但不 限于炎症细胞因子的产生(例如I型干扰素或IL‑10产生)增加；NFκB路径的活化；免疫细胞 的增殖、成熟、分化和/或存活增加，以及在一些情况下细胞凋亡的诱导。先天免疫的活化可 使用此项技术中已知的方法检测，如测量(NF)‑κB活化情况。 [0090] 术语“适应性免疫反应”和“适应性免疫”是此项技术中公认的，并且是指身体的免疫系统在识别出特定抗原时启动的抗原特异性防御机制，包括体液反应和细胞介导的反 应。如本文所使用，适应性免疫反应包括由疫苗组合物，如本文所述的遗传组合物触发和/ 或增强的细胞反应。在一些实施方案中，疫苗组合物包含作为抗原特异性适应性免疫反应 的靶标的抗原。在其他实施方案中，疫苗组合物在施用后允许在经免疫的受试者中产生抗 原，所述抗原是抗原特异性适应性免疫反应的靶标。适应性免疫反应的活化可使用此项技 术中已知的方法检测，如测量抗原特异性抗体的产生或抗原特异性细胞介导的细胞毒性水 平。 [0091] 术语“抗体”意欲包括在免疫球蛋白类多肽范围内的B细胞的多肽产物，其能够与特定分子抗原结合并由两对相同的多肽链构成，其中每一对具有一条重链(约50‑70kDa)和 一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括含约100至约130个或更多个氨基酸 的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如Antibody Engineering (Borrebaeck编，第2版，1995)；和Kuby，Immunology(第3版，1997)。在特定实施方案中，特定 分子抗原可由本文所提供的抗体结合，包括多肽、其片段或表位。抗体还包括但不限于合成 抗体、重组产生的抗体、骆驼化抗体、内抗体、抗独特型(抗Id)抗体和以上任一种的功能片 段，功能片段是指抗体重链或轻链多肽的保留作为所述片段来源的抗体的部分或全部结合 活性的一部分。功能片段的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如包括单特异性、双特异性 等)、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab)2片段、F(ab′)2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体和微型抗体。具体地说，本文所提供的抗体包括免 疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如抗原结合结构域或含有抗原结合位 点的分子(例如抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可见于例如Harlow和Lane， Antibodies：A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology： AComprehensive Desk Reference(Myers编，1995)；Huston等人，1993，Cell Biophysics22：189‑224；Plüickthun和Skerra，1989，Meth.Enzymol.178：497‑515；和Day，AdvancedImmunochemistry(第2版，1990)。本文所提供的抗体可为免疫球蛋白分子的任何 类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。 [0092] 术语“施用”是指将存在于体外的物质(例如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)注射或以其他方式物理递送至患者体肉的操作，如经粘膜、皮内、静脉内、肌肉内、皮下递送 和/或本文所描述或此项技术中已知的任何其他物理递送方法递送。当治疗疾病、病症、疾 患或其症状时，典型地在所述疾病、病症、疾患或其症状发作之后进行物质的施用。当预防 疾病、病症、疾患或其症状时，典型地在所述疾病、病症、疾患或其症状发作之前进行物质的 施用。 [0093] “长期”施用与急性模式相对，是指以连续模式施用一或多种剂(例如持续一段时间，如数天、数周、数月或数年)，由此在较长一段时间内维持初始治疗效果(活性)。“间歇 性”施用是指治疗不是不间断地连续进行，而是本质上周期性的。 [0094] 如本文所使用，术语“靶向递送”或动词形式“靶向”是指相较于递送至任何其他器官、组织、细胞或细胞内隔室(称为非目标位置)，促进所递送的剂(如本文所述的脂质纳米 颗粒组合物中的治疗有效负载分子)到达特定器官、组织、细胞和/或细胞内隔室(称为目标 位置)的过程。靶向递送可使用此项技术中已知的方法检测，例如通过在全身施用后将所递 送的剂在目标细胞群体中的浓度与所递送的剂在非目标细胞群体处的浓度相比较来检测。 在某些实施方案中，靶向递送使得目标位置处的浓度为非目标位置处的浓度的至少2倍高。 [0095] “有效量”一般是足以降低症状的严重程度和/或频率；消除症状和/或潜在原因；防止症状和/或其潜在原因的发生；和/或改善或补救由疾病、病症或疾患，包括例如由感染 和赘瘤形成引起或与之相关的损害的量。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量或预防 有效量。 [0096] 如本文所使用，术语“治疗有效量”是指足以减少和/或改善给定疾病、病症或疾患，和/或其相关症状(例如感染性疾病，如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病， 如癌症)的严重程度和/或持续时间的剂(例如疫苗组合物)的量。本公开的物质/分子/剂 (例如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)的“治疗有效量”可根据诸多因素而变化，如个体的 疾病状态、年龄、性别和体重，以及物质/分子/剂在个体体内引起所希望反应的能力。治疗 有效量包含物质/分子/剂的治疗有益作用胜过其任何有毒或有害作用的量。在某些实施方 案中，术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病、病症或疾患的如本文 所述的脂质纳米颗粒组合物或其中所含治疗剂或预防剂(例如治疗性mRNA)的量。 [0097] “预防有效量”是当施用于受试者时将具有预期预防作用，例如预防疾病、病症、疾患或相关症状(例如感染性疾病，如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病，如癌 症)、延迟其发作(或复发)或降低其发作(或复发)可能性的药物组合物的量。典型地但非必 须地，由于预防剂量是在疾病、病症或疾患之前或其早期阶段用于受试者，因此预防有效量 可能小于治疗有效量。完全的治疗或预防作用未必通过施用一次剂量而发生，而可能仅在 施用一系列剂量后才发生。因此，治疗或预防有效量可分一或多次施用来施用。 [0098] 术语“预防”是指降低疾病、病症、疾患或相关症状(例如感染性疾病，如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病，如癌症)发作(或复发)的可能性。 [0099] 术语“管理”是指受试者自疗法(例如预防剂或治疗剂)获得的有益作用，其不会引起疾病的治愈。在某些实施方案中，向受试者施用一种或多种疗法(例如预防剂或治疗剂， 如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)以“管理”感染性或赘生性疾病、其一种或多种症状，由 此预防疾病的进展或恶化。 [0100] 术语“预防剂”是指可以完全或部分地抑制受试者的疾病和/或其相关症状的发展、复发、发作或扩散的任何剂。 [0101] 术语“治疗剂”是指可用于治疗、预防或减轻疾病、病症或疾患，包括用于治疗、预防或减轻疾病、病症或疾患和/或其相关症状的一种或多种症状的任何剂。 [0102] 术语“疗法”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病、病症或疾患的任何方案、方法和/或剂。在某些实施方案中，术语“疗法(therapies/therapy)”是指所属领域的技术 人员，如医务人员已知可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病、病症或疾患的生物疗法、支 持疗法和/或其他疗法。 [0103] 如本文所使用，“预防有效血清效价”是受试者(例如人类)体内完全或部分地抑制受试者的疾病、病症或疾患，和/或其相关症状的发展、复发、发作或扩散的抗体的血清效 价。 [0104] 在某些实施方案中，“治疗有效血清效价”是受试者(例如人类)体内降低受试者的与疾病、病症或疾患相关的严重程度、持续时间和/或症状的抗体的血清效价。 [0105] 术语“血清效价”是指一名受试者中来自多个样品(例如在多个时间点)或在至少10名、至少20名、至少40名至多达约100名、1000名或更多受试者的群体中的平均血清效价。 [0106] 术语“副作用”涵盖疗法(例如预防剂或治疗剂)的不想要和/或不良作用。不想要的作用未必为不良的。疗法(例如预防剂或治疗剂)的不良作用可能为有害的、令人不适的 或有风险的。副作用的实例包括腹泻、咳嗽、肠胃炎、喘鸣、恶心、呕吐、厌食、腹部绞痛、发 烧、疼痛、体重减轻、脱水、脱发、呼吸困难、失眠、头晕、粘膜炎、神经和肌肉影响、疲劳、口干、食欲不振、施用部位出现皮疹或肿胀、如发烧、发冷和疲劳之类的类似流感的症状、消化 道问题和过敏反应。患者经历的其他不期望的作用众多且为此项技术中所知的。有许多作 用描述于Physician’s Desk Reference(第68版，2014)中。 [0107] 术语“受试者”与“患者”可互换使用。如本文所使用，在某些实施方案中，受试者是鸟，优选鸡，或哺乳动物，该哺乳动物优选地选自包括山羊、牛、猪、狗、猫、驴、猴、猿，诸如小鼠、仓鼠、兔子的啮齿类动物，特别是人的组。在特定实施方案中，受试者是人类。在一个实 施方案中，受试者是患有感染性疾病或赘生性疾病的哺乳动物(例如人类)。在另一个实施 方案中，受试者是有发展感染性疾病或赘生性疾病的风险的哺乳动物(例如人类)。 [0109] 术语“可检测剂”是指可用于确定样品或受试者中所希望分子，如由本文所述的mRNA分子编码的抗原的存在(existence/presence)的物质。可检测剂可为能够被目测的物 质或者能够以其他方式测定和/或测量(例如通过定量)的物质。 [0110] “基本上全部”是指至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％。 [0111] 如本文所使用且除非另有说明，否则术语“约”或“大约”意指所属领域的普通技术人员所测定的特定值的可接受的误差，其部分取决于测量或测定所述值的方式。在某些实 施方案中，术语“约”或“大约”意指在1、2、3或4个标准偏差以内。在某些实施方案中，术语 “约”和“大约”意指在给定值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、 7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内、0.05％以内 或更低。 [0112] 除非上下文另外明确指出，否则本文所使用的单数形式术语“一个(种)”和“所述”包括复数个(种)参考物。 [0113] 本说明书中引用的所有出版物、专利申请、寄存编号和其他参考文献皆以全文引用的方式并入本文中，其引用程度就如同特定且单独地指示每一个别出版物或专利申请以 引用的方式并入一般。本文所论述的出版物仅仅提供在本申请的申请日之前的公开内容。 本文中任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。此外，提 供的公布日期可能与实际公布日期有所不同，实际公布日期可能需要独立确认。 [0115] 脂质化合物 [0116] 在第一方面，本公开提供式(I)的化合物： [0117] [0118] 或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中： [0119] L1为‑OC(＝O)R1、‑C(＝O)OR1、‑OC(＝O)OR1、‑C(＝O)R1、‑OR1、‑S(O)xR1、‑S‑SR1、‑C1 1 a 1 b c a b c b c a (＝O)SR、‑SC(＝O)R 、‑NR C(＝O)R、‑C(＝O)NRR 、‑NR C(＝O)NRR、‑OC(＝O)NRR 、‑NR C 1 1 1 1 1 b c (＝O)OR 、‑SC(＝S)R、‑C(＝S)SR 、‑C(＝S)R、‑CH(OH)R 、‑P(＝O)(OR)(OR)、‑(C6‑C10亚 1 1 1 芳基)‑R、‑(6至10元亚杂芳基)‑R或R； [0120] R1为C6‑C24烷基或C6‑C24烯基或C6‑C24炔基； [0121] Ra和Rb各自独立地为H、C1‑C12烷基、C2‑C12烯基或C2‑C12炔基； [0122] Rc为C1‑C12烷基、C2‑C12烯基或C2‑C12炔基； [0123] G1和G2各自独立地为C1‑C12亚烷基、C2‑C12亚烯基或C2‑C12亚炔基； [0124] L2为‑(C＝O)O‑、OC(＝O)O‑或‑O‑； [0125] R2为甾醇基团； [0126] R3为‑Rd‑OH，Rd为C1‑C12亚烷基；并且 [0127] 其中任选地，每个烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基和亚杂芳基独立地被取代。 [0128] 在一种实施方案中，L1为‑OC(＝O)R1、‑C(＝O)OR1、‑C(＝O)NRbRc或‑OC(＝O)OR1。 [0129] 在一种实施方案中，R1为直链C6‑C24烷基或支链C6‑C24烷基。 [0130] 在一种实施方案中，L1为： [0131] [0132] [0133] 在一种实施方案中，G1为C2‑C10亚烷基。在一种实施方案中，G1为C5‑C7亚烷基。在一1 种实施方案中，G为： [0134] [0135] 在一种实施方案中，G2为C2‑C11亚烷基。在一种实施方案中，G2为C4‑C10亚烷基。在一2 种实施方案中，G为： [0136] [0137] [0138] 在一种实施方案中，R2为： [0139] [0140] 在一种实施方案中，Rd为C2‑C4亚烷基。 [0141] 在一种实施方案中，R3为： [0142] [0143] 在一种实施方案中，所述化合物是下表中的化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体。 [0144] [0145] [0146] [0147] 应理解，如上所示的本文所提供的化合物的任何实施方案，以及如上所示的本文所提供的化合物的任何特定取代基和/或变量可独立地与化合物的其他实施方案和/或取 代基和/或变量组合以形成以上未具体阐述的实施方案。另外，在列出任何特定基团或变量 的取代基和/或变量的清单的情况下，应理解，可自特定实施方案和/或权利要求中删除每 一个别取代基和/或变量，并且其余的取代基和/或变量清单将被认为在本文所提供的实施 方案的范围内。 [0148] 应理解，在本说明书中，所描绘各式的取代基和/或变量的组合只有在此类贡献产生稳定化合物时才为容许的。 [0149] 纳米颗粒组合物 [0150] 在一个方面中，本文描述包含本文所述的脂质化合物的纳米颗粒组合物。在特定实施方案中，所述纳米颗粒组合物包含如本文所描述的根据式(I)(和其子式)的化合物。 [0151] 在一些实施方案中，当例如通过动态光散射(DLS)、透射电子显微镜检查、扫描电子显微镜检查或另一种方法测量时，本文提供的纳米颗粒组合物的最大尺寸是1μm或更短 (例如≤1μm、＜900nm、≤800nm、＜700nm、≤600nm、＜500nm、＜400nm、≤300nm、≤200nm、≤ 175nm、≤150nm、≤125nm、≤100nm、≤75nm、≤50nm或更短)。在一个实施方案中，本文提供 的脂质纳米颗粒具有在约40nm至约200nm范围内的至少一个尺寸。在一个实施方案中，所述 至少一个尺寸在约40nm至约100nm范围内。 [0152] 可结合本公开使用的纳米颗粒组合物包括例如脂质纳米颗粒(LNP)、纳米脂蛋白颗粒、脂质体、脂质囊泡和脂质复合物(lipoplex)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是 包括一个或多个脂质双层的囊泡。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包括经水性隔室隔 开的两个或更多个同心双层。脂质双层可经官能化和/或彼此交联。脂质双层可包括一种或 多种配体、蛋白质或通道。 [0153] 纳米颗粒组合物的特征可取决于其组分。举例来说，包含胆固醇作为结构脂质的纳米颗粒组合物可具有与包含不同结构脂质的纳米颗粒组合物不同的特征。类似地纳米颗 粒组合物的特征可取决于其组分的绝对或相对量。举例来说，包含较高摩尔分率的磷脂的 纳米颗粒组合物可具有与包含较低摩尔分率的磷脂的纳米颗粒组合物不同的特征。特征还 可取决于纳米颗粒组合物的制备方法和条件而变化。 [0154] 纳米颗粒组合物可通过多种方法表征。举例来说，可使用显微镜检查(例如透射电子显微镜检查或扫描电子显微镜检查)来检查纳米颗粒组合物的形态和大小分布。可使用 动态光散射或电位测定法(例如电位滴定法)来测量ζ电位。动态光散射还可用于确定粒度。 还可使用仪器，例如Zetasizer Nano ZS(Malvem Instruments Ltd，Malvem， Worcestershire，UK)来测量纳米颗粒组合物的多个特征，例如粒度、多分散指数和ζ电位。 [0155] Dh(大小)：纳米颗粒组合物的平均大小可在数十纳米至数百纳米之间。举例来说，平均大小可为约40nm至约150nm，例如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、 80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、 145nm或150nm。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约50nm至约100nm、约 50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约 60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约 70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm或约90nm至约100nm。在某些实施方案 中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约70nm至约100nm。在一些实施方案中，平均大小可为 约80nm。在其他实施方案中，平均大小可为约100nm。 [0156] PDI：纳米颗粒组合物可为相对均质的。可使用多分散指数来指示纳米颗粒组合物的均质性，例如纳米颗粒组合物的粒度分布。较小(例如小于0.3)的多分散指数一般指示较 窄的粒度分布。纳米颗粒组合物的多分散指数可为约0至约0.25，例如0.01、0.02、0.03、 0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、 0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的多分散指 数可为约0.10至约0.20。 [0157] 包封效率：治疗剂和/或预防剂的包封效率描述相对于所提供的初始量，在制备后经纳米颗粒组合物包封或以其他方式与纳米颗粒组合物缔合的治疗剂和/或预防剂的量。 包封效率合意地较高(例如接近100％)。包封效率可例如通过比较在用一种或多种有机溶 剂或清洁剂破坏纳米颗粒组合物之前与之后含有纳米颗粒组合物的溶液中治疗剂和/或预 防剂的量来测量。荧光可用于测量溶液中游离治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的量。对于本 文所述的纳米颗粒组合物，治疗剂和/或预防剂的包封效率可为至少50％，例如50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％。在一些实施方案中，包封效率可为至少80％。在某些实施方案中，包封效率可 为至少90％。 [0158] zeta电位：纳米颗粒组合物的ζ电位可用于指示组合物的动电位。举例来说，ζ电位可描述纳米颗粒组合物的表面电荷。具有相对较低正电荷或负电荷的纳米颗粒组合物一般 是合意的，因为带较高电荷的物质可与体内的细胞、组织和其他成分发生不合意的相互作 用。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的ζ电位可为约‑10mV至约+20mV、约‑10mV至约+ 15mV、约‑10mV至约+10mV、约‑10mV至约+5mV、约‑10mV至约0mV、约‑10mV至约‑5mV、约‑5mV至约+20mV、约‑5mV至约+15mV、约‑5mV至约+10mV、约‑5mV至约+5mV、约‑5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至 约+15mV或约+5mV至约+10mV。 [0159] 在另一个实施方案中，自复制型RNA可配制于脂质体中。作为非限制性实例，自复制型RNA可如以全文引用的方式并入本文中的国际公布第WO20120067378号中所述而配制 于脂质体中。在一个方面中，脂质体可包含pKa值有利于递送mRNA的脂质。在另一个方面中， 脂质体可在生理pH值下具有基本上呈中性的表面电荷且因此可有效用于免疫(参见例如以 全文引用的方式并入本文中的国际公布第WO20120067378号中所述的脂质体)。 [0160] 在一些实施方案中，所述纳米颗粒组合物包含脂质组分，所述脂质组分包括至少一种脂质，例如本文所述的根据式(I)(和其子式)之一的化合物。举例来说，在一些实施方 案中，纳米颗粒组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包括一种本文所提供的化合物。纳米 颗粒组合物还可包含一种或多种如下所述的其他脂质或非脂质组分。 [0161] 阳离子/可电离脂质 [0162] 如本文所述，在一些实施方案中，本文所提供的纳米颗粒组合物除包含根据式(I)(和其子式)的脂质以外，还包含一种或多种带电或可电离的脂质。不受理论束缚，预期纳米 颗粒组合物的某些带电或两性离子脂质组分类似于细胞膜中的脂质组分，由此可改善纳米 颗粒的细胞摄取。可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的示例性带电或可电离的脂质包 括但不限于3‑(双十二烷基氨基)‑N1，N1，4‑三(十二烷基)‑1‑哌嗪乙胺(KL10)、N1‑[2‑(双十二烷基氨基)乙基]‑N1，N4，N4‑三(十二烷基)‑1，4‑哌嗪二乙胺(KL22)、14,25‑双十三烷基‑15，18,21,24‑四氮杂‑三十八烷(KL25)、1，2‑二亚油基氧基‑N，N‑二甲基氨基丙烷 (DLinDMA)、2，2‑二亚油基‑4‑二甲基氨基甲基‑[1，3]‑二氧杂环戊烷(DLin‑K‑DMA)、4‑(二甲基氨基)丁酸三十七碳‑6，9，28，31‑四烯‑19‑基酯(DLin‑MC3‑DMA)、2，2‑二亚油基‑4‑(2‑二甲基氨基乙基)‑[1，3]‑二氧杂环戊烷(DLin‑KC2‑DMA)、1，2‑二油基氧基‑N，N‑二甲基氨基丙烷(DODMA)、2‑({8‑[(3β)‑胆固‑5‑烯‑3‑基氧基]辛基}氧基)‑N，N‑二甲基‑3‑[(9Z， 12Z)‑十八碳‑9，12‑二烯‑1‑基氧基]丙‑1‑胺(辛基‑CLinDMA)、(2R)‑2‑({8‑[(3β)‑胆固‑5‑烯‑3‑基氧基]辛基}氧基)‑N，N‑二甲基‑3‑[(9Z，12Z)‑十八碳‑9，12‑二烯‑1‑基氧基]丙‑1‑胺(辛基‑CLinDMA(2R))、(2S)‑2‑({8‑[(3β)‑胆固‑5‑烯‑3‑基氧基]辛基}氧基)‑N，N‑二甲基‑3‑[(9Z‑，12Z)‑十八碳‑9，12‑二烯‑1‑基氧基]丙‑1‑胺(辛基‑CLinDMA(2S))、(12Z， 15Z)‑N，N‑二甲基‑2‑壬基二十一碳‑12，15‑二烯‑1‑胺、N，N‑二甲基‑1‑{(1S，2R)‑2‑辛基环丙基}十七烷‑8‑胺。可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的额外示例性带电或可电离的 脂 质 包括在 Sabnis 等人 ，“A Novel Amino Lipid Series for mRNA Delivery ： Improved Endosomal Escape and Sustained Pharmacology and Safety in Non‑human Primates”，Molecular Therapy，第26卷，第6期，2018年中所述的脂质(例如脂质5)，所述文 献全部以引用的方式并入本文中。 [0163] 在一些实施方案中，适合阳离子脂质包括氯化N‑[1‑(2，3‑二油基氧基)丙基]‑N，N，N‑三甲基铵(DOTMA)；氯化N‑[1‑(2，3‑二油酰基氧基)丙基]‑N，N，N‑三甲基铵(DOTAP)；1， 2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑乙基磷酸胆碱(DOEPC)；1，2‑二月桂酰基‑sn‑甘油‑3‑乙基磷酸胆碱(DLEPC)；1，2‑二肉豆蔻酰基‑sn‑甘油‑3‑乙基磷酸胆碱(DMEPC)；1，2‑二肉豆蔻油酰基‑sn‑甘油‑3‑乙基磷酸胆碱(14:1)；N1‑[2‑((1S)‑1‑[(3‑氨基丙基)氨基]‑4‑[二(3‑氨基‑丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]‑3，4‑二[油基氧基]‑苯甲酰胺(MVL5)；双十八烷基酰胺基‑ 甘氨酰基精四胺(DOGS)；3b‑[N‑(N′，N′‑二甲基氨基乙基)氨甲酰基]胆固醇(DC‑Chol)；溴化双十八烷基二甲基铵(DDAB)；SAINT‑2，N‑甲基‑4‑(二油基)甲基吡啶鎓；溴化1，2‑二肉豆蔻基氧基丙基‑3‑二甲基羟乙基铵(DMRIE)；溴化1，2‑二油酰基‑3‑二甲基‑羟乙基铵 (DORIE)；氯化1，2‑二油酰基氧基丙基‑3‑二甲基羟乙基铵(DORI)；二烷基化氨基酸(DILA2) (例如C18：1‑norArg‑C16)；氯化二油基二甲基铵(DODAC)；1‑棕榈酰基‑2‑油酰基‑sn‑甘油‑ 3‑乙基磷酸胆碱(POEPC)；1，2‑二肉豆蔻油酰基‑sn‑甘油‑3‑乙基磷酸胆碱(MOEPC)；二油酸(R)‑5‑(二甲基氨基)戊烷‑1，2‑二基酯盐酸盐(DODAPen‑Cl)；二油酸(R)‑5‑胍基戊烷‑1，2‑二基酯盐酸盐(DOPen‑G)；和氯化(R)‑N，N，N‑三甲基‑4，5‑双(油酰基氧基)戊‑1‑胺鎓盐(DOTAPen)。具有在生理pH值下带电荷的头基的阳离子脂质也是适合的，如伯胺(例如DODAG N′，N′‑双十八烷基‑N‑4，8‑二氮杂‑10‑氨基癸酰基甘氨酸酰胺)和胍鎓头基(例如双‑胍鎓‑精三胺‑胆固醇(BGSC)、双‑胍鎓‑tren‑胆固醇(BGTC)、PONA和二油酸(R)‑5‑胍基戊烷‑1，2‑二基酯盐酸盐(DOPen‑G))。另一适合的阳离子脂质是二油酸(R)‑5‑(二甲基氨基)戊烷‑1， 2‑二基酯盐酸盐(DODAPen‑Cl)。在某些实施方案中，阳离子脂质是特定对映异构体或外消 旋形式，并且包括上述阳离子脂质的各种盐形式(例如氯化物或硫酸盐)。举例来说，在一些 实施方案中，阳离子脂质是氯化N‑[1‑(2，3‑二油酰基氧基)丙基]‑N，N，N‑三甲基铵(DOTAP‑Cl)或硫酸N‑[1‑(2，3‑二油酰基氧基)丙基]‑N，N，N‑三甲基铵(DOTAP‑硫酸盐)。在一些实施方案中，阳离子脂质是可电离阳离子脂质，例如溴化双十八烷基二甲基铵(DDAB)；1，2‑二亚 油基氧基‑3‑二甲基氨基丙烷(DLinDMA)；2，2‑二亚油基‑4‑(2‑二甲基氨基乙基)‑[1，3]‑二氧杂环戊烷(DLin‑KC2‑DMA)；4‑(二甲基氨基)丁酸三十七碳‑6，9，28，31‑四烯‑19‑基酯(DLin‑MC3‑DMA)；1，2‑二油酰基氧基‑3‑二甲基氨基丙烷(DODAP)；1，2‑二油基氧基‑3‑二甲基氨基丙烷(DODMA)；和N‑吗啉基胆固醇(Mo‑CHOL)。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包括 两种或更多种阳离子脂质(例如两种或更多种上述阳离子脂质)的组合。 [0164] 另外，在一些实施方案中，可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的带电或可电离的脂质是包括环状胺基的脂质。适用于本文所公开的制剂和方法的额外阳离子脂质包括 WO2015199952、WO2016176330和WO2015011633中所述的那些阳离子脂质，各案的全部内容 以全文引用的方式并入本文中。 [0165] 聚合物结合的脂质 [0166] 在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种聚合物结合的脂质，例如聚乙二醇化脂质(PEG脂质)。不受理论束缚，预期纳米颗粒组合物中的聚合物结 合的脂质组分可改善胶体稳定性和/或减少纳米颗粒的蛋白质吸收。可结合本公开使用的 示例性阳离子脂质包括但不限于PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神 经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油和其混合物。举 例来说，PEG脂质可为PEG‑c‑DOMG、PEG‑DMG、PEG‑DLPE、PEG‑DMPE、PEG‑DPPC、PEG‑DSPE、神经酰胺‑PEG2000或Chol‑PEG2000。 [0167] 在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质。举例来说，一些实施方案包括聚乙二醇化二酰基甘油(PEG‑DAG)，例如1‑(单甲氧基‑聚乙二醇)‑2，3‑二肉豆蔻酰 基甘油(PEG‑DMG)；聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG‑PE)；PEG琥珀酸酯二酰基甘油(PEG‑S‑ DAG)，例如4‑O‑(2’，3’‑二(十四烷酰氧基)丙基‑1‑O‑(ω‑甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG‑S‑DMG)；聚乙二醇化神经酰胺(PEG‑cer)；或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，例如ω‑ 甲氧基(聚乙氧基)乙基‑N‑(2，3‑二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2，3‑二(十四烷氧基) 丙基‑N‑(ω‑甲氧基)(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。 [0168] 在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是以在1.0摩尔％至2.5摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是以约1.7摩尔％的浓度存在。在一个实施 方案中，聚合物结合的脂质是以约1.5摩尔％的浓度存在。 [0169] 在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约35∶1至约25∶1范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约100∶1至约20∶1 范围内，优选约49:1.5。 [0170] 在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有下式： [0171] [0172] 或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中： [0173] R12和R13各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链饱和或不饱和烷基链，其中所述烷基链任选地间杂有一个或多个酯键；并且 [0174] w具有在30至60范围内的平均值。 [0175] 在一个实施方案中，R12和R13各自独立地为含有12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在其他实施方案中，平均w在42至55范围内，例如平均w是42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54或55。在一些特定实施方案中，平均w是约49。 [0176] 在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有下式： [0177] [0178] 其中平均w是约49。 [0179] 在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质是DMG‑PEG2000，其具有下式： [0180] [0181] 结构脂质 [0182] 在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种结构脂质。不受理论束缚，预期结构脂质可使纳米颗粒的两亲结构，例如但不限于纳米颗粒的脂质双层 结构稳定。可结合本公开使用的示例性结构脂质包括但不限于胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦 角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、西红柿碱、西红柿苷、熊果酸、α‑生育酚和其混合物。 在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在一些实施方案中，结构脂质包括胆固醇和皮质类 固醇(例如泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、泼尼松(prednisone)和 氢化可的松(hydrocortisone))或其组合。 [0183] 在一个实施方案中，本文所提供的脂质纳米颗粒包含类固醇或类固醇类似物。在一个实施方案中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在一个实施方案中，类固醇是以在39摩 尔％至49摩尔％、40摩尔％至46摩尔％、40摩尔％至44摩尔％、40摩尔％至42摩尔％、42摩 尔％至44摩尔％或44摩尔％至46摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇是 以40摩尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44摩尔％、45摩尔％或46摩尔％的浓度存在。 [0184] 在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0∶0.9至1.0∶1.2、或1.0∶1.0至1.0∶1.2范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约5∶1至约1∶1 范围内，优选约49：39.5。在一个实施方案中，类固醇以在32摩尔％至40摩尔％类固醇范围 内的浓度存在。 [0185] 磷脂 [0186] 在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种磷脂，例如一种或多种(多)不饱和脂质。不受理论束缚，预期磷脂可组装成一个或多个脂质双层结构。可 形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的示例性磷脂包括但不限于1，2‑二硬脂酰基‑sn‑甘 油‑3‑磷酸胆碱(DSPC)、1，2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2‑二亚油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DLPC)、1，2‑二肉豆蔻酰基‑sn‑甘油磷酸胆碱(DMPC)、1，2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DOPC)、1，2‑二棕榈酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DPPC)、1，2‑二(十一烷酰基)‑sn‑甘油‑磷酸胆碱(DUPC)、1‑棕榈酰基‑2‑油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(POPC)、 1，2‑二‑O‑十八碳烯基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1‑油酰基‑2‑胆固醇基半琥珀酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(OChemsPC)、1‑十六烷基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1，2‑二亚油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱、1，2‑二花生四烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱、 1，2‑二十二碳六烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱、1，2‑二植烷酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1，2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1，2‑二亚油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1，2‑二亚油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1，2‑二花生四烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1，2‑二十二碳六烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1，2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸‑外消旋‑(1‑甘油)钠盐(DOPG)和鞘磷脂。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物包含DSPC。在 某些实施方案中，纳米颗粒组合物包含DOPE。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含DSPC 和DOPE两者。 [0187] 另外的示例性中性脂质包括例如二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基磷脂酰乙醇胺4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)‑环己烷‑1‑甲酸 酯(DOPE‑mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂 酰基‑磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16‑O‑单甲基PE、16‑O‑二甲基PE、18‑1‑反式PE、1‑硬脂酰基‑2‑油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1，2‑二反油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一 个实施方案中，中性脂质是1，2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油‑3磷酸胆碱(DSPC)。在一个实施方案 中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。 [0188] 在一个实施方案中，中性脂质是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)或磷脂酰甘油(PG)。 [0189] 可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的额外磷脂还包括WO2017/112865中所描述的那些磷脂，其全部内容以全文引用的方式并入本文中。 [0190] 治疗性有效负载 [0191] 根据本公开，本文所述的纳米颗粒组合物可进一步包含一种或多种治疗剂和/或预防剂。这些治疗剂和/或预防剂在本公开中有时称为“治疗性有效负载”或“有效负载”。在 一些实施方案中，治疗性有效负载可在活体内或活体外，使用纳米颗粒作为递送媒介物施 用。 [0192] 在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含以下作为治疗性有效负载：小分子化合物(例如小分子药物)，例如抗癌剂(例如长春新碱(vincristine)、多柔比星 (doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喜树碱(camptothecin)、顺铂(cisplatin)、博 来霉素(bleomycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨喋呤(methotrexate)和链脲佐菌 素(streptozotocin))、抗肿瘤剂(例如放线菌素D(actinomycin D)、长春新碱、长春花碱 (vinblastine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、蒽环霉素 (anthracyclines)、烷基化剂、铂类化合物、抗代谢物和核苷类似物，例如甲氨喋呤以及嘌 呤和嘧啶类似物)、抗感染剂、局麻药(例如地布卡因(dibucaine)和氯丙嗪 (chlorpromazine))、β‑肾上腺素性阻断剂(例如普萘洛尔(propranolol)、噻吗洛尔 (timolol)和拉贝洛尔(labetalol))、抗高血压剂(例如可乐定(clonidine)和肼屈嗪 (hydralazine))、抗抑郁剂(例如丙咪嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和多塞 平(doxepin))、抗痉挛剂(例如苯妥英(phenytoin))、抗组胺剂(例如苯海拉明 (diphenhydramine)、氯非安明(chlorpheniramine)和异丙嗪(promethazine))、抗生素/抗 细菌剂(例如庆大霉素(gentamycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)和头孢西丁 (cefoxitin))、抗真菌剂(例如咪康唑(miconazole)、特康唑(terconazole)、益康唑 (econazole)、异康唑(isoconazole)、布康唑(butaconazole)、克霉唑(clotrimazole)、伊 曲康唑(itraconazole)、制霉菌素(nystatin)、萘替芬(naftifine)和两性霉素B (amphotericin B))、抗寄生虫剂、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经传递质拮抗剂、抗青 光眼剂、维生素、麻醉剂和成像剂。 [0193] 在一些实施方案中，治疗性有效负载包含细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、疫苗、引起免疫反应的化合物和/或另一治疗剂和/或预防剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括可 能对细胞有害的任何剂。实例包括但不限于紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉 素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、长春新碱、长春花碱、秋水 仙碱(colchicine)、多柔比星、道诺霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮 (dihydroxyanthracinedione)、米托蒽醌、米拉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1‑脱氢睾 酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘 洛尔、嘌呤霉素(puromycin)、美登素类化合物(maytansinoids)，例如美登醇 (maytansinol)、拉奇霉素(rachelmycin)(CC‑1065)以及其类似物或同系物。放射性离子包 括但不限于碘(例如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。 [0194] 在其他实施方案中，本发明纳米颗粒组合物的治疗性有效负载可包括但不限于治疗剂和/或预防剂，例如抗代谢物(例如甲氨喋呤、6‑巯基嘌呤、6‑硫鸟嘌呤、阿糖胞苷 (cytarabine)、5‑氟尿嘧啶、达卡巴嗪(dacarbazine))、烷基化剂(例如氮芥 (mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、拉奇霉素(CC‑ 1065)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、 环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲佐菌素、丝裂霉素C和 顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(例如道诺霉素(先前称为柔红霉素 (daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素D(dactinomycin)(先前称为放线菌 素))、博来霉素、米拉霉素和安曲霉素(anthramycin)(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新 碱、长春花碱、紫杉醇和美登素类化合物)。 [0195] 在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含诸如肽和多肽之类生物分子作为治疗性有效负载。形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的生物分子可为天然来源或合成的。举例 来说，在一些实施方案中，本发明纳米颗粒组合物的治疗性有效负载可包括但不限于庆大 霉素、阿米卡星(amikacin)、胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)、 粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、因子VIR、促黄体激素释放激素(LHRH)类似物、干 扰素、肝素、B型肝炎表面抗原、伤寒疫苗、霍乱疫苗以及肽和多肽。 [0196] 核酸 [0197] 在一些实施方案中，本发明纳米颗粒组合物包含一种或多种核酸分子(例如DNA或RNA分子)作为治疗性有效负载。可包括在本发明纳米颗粒组合物中作为治疗性有效负载的 核酸分子的例示性形式包括但不限于以下一种或多种：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸 (RNA)，包括信使mRNA(mRNA)、其杂交体、RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义 RNA、核糖酶、催化性DNA、诱导形成三螺旋的RNA、适体、载体等。在某些实施方案中，治疗性 有效负载包含RNA。可包括在本发明纳米颗粒组合物中作为治疗性有效负载的RNA分子包括 但不限于短聚体(shortmer)、agomir、antagomir、反义体(antisense)、核糖酶、小干扰RNA (siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、Dicer‑底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA (shRNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)和此项技术中已知的RNA分子的其他形式。在特定 实施方案中，RNA是mRNA。 [0198] 在其他实施方案中，纳米颗粒组合物包含siRNA分子作为治疗性有效负载。具体地说，在一些实施方案中，siRNA分子能够选择性干扰并下调感兴趣基因的表达。举例来说，在 一些实施方案中，在向有需要的受试者施用包含siRNA的纳米颗粒组合物后，siRNA有效负 载使与特定疾病、病症或疾患相关的基因选择性沉默。在一些实施方案中，siRNA分子包含 与编码感兴趣蛋白质产物的mRNA序列互补的序列。在一些实施方案中，siRNA分子是免疫调 节性siRNA。 [0199] 在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含shRNA分子或编码shRNA分子的载体作为治疗性有效负载。具体地说，在一些实施方案中，治疗性有效负载在施用于目标细胞后，在 目标细胞内产生shRNA。与shRNA相关的构建体和机制是相关技术中熟知的。 [0200] 在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含mRNA分子作为治疗性有效负载。具体地说，在一些实施方案中，所述mRNA分子编码感兴趣多肽，包括任何天然或非天然存在或以其 他方式修饰的多肽。由mRNA编码的多肽可具有任何大小且可具有任何二级结构或活性。在 一些实施方案中，由mRNA有效负载编码的多肽当在细胞中表达时可具有治疗作用。 [0201] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含mRNA分子。在特定实施方案中，所述核酸分子包含至少一个编码感兴趣肽或多肽的编码区(例如开放阅读框(ORF))。在一些实施 方案中，核酸分子还包含至少一个非转译区(UTR)。在特定实施方案中，非转译区(UTR)位于 编码区的上游(5′端)，并且在本文中称为5′‑UTR。在特定实施方案中，非转译区(UTR)位于 编码区的下游(3′端)，并且在本文中称为3′‑UTR。在特定实施方案中，核酸分子同时包含 5′‑UTR和3′‑UTR。在一些实施方案中，5′‑UTR包含5′‑帽结构。在一些实施方案中，核酸分子包含Kozak序列(例如在5′‑UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含poly‑A区(例如在3′‑ UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含聚腺苷酸化信号(例如在3′‑UTR中)。在一些实施 方案中，核酸分子包含稳定区(例如在3′‑UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含二级结 构。在一些实施方案中，二级结构是茎‑环。在一些实施方案中，核酸分子包含茎‑环序列(例 如在5′‑UTR和/或3′‑UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含一个或多个能够在剪接过 程中切除的内含子区。在特定实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自5′‑UTR和编码区 的区域。在特定实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自编码区和3′‑UTR的区域。在特定 实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自5′‑UTR、编码区和3’‑UTR的区域。 [0202] 编码区 [0203] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含至少一个编码区。在一些实施方案中，编码区是编码单一肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，编码区包含至少两 个ORF，每个ORF编码一种肽或蛋白质。在编码区包含多于一个ORF的实施方案中，编码的肽 和/或蛋白质可彼此相同或不同。在一些实施方案中，编码区中的多个ORF经非编码序列隔 开。在特定实施方案中，隔开两个ORF的非编码序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。 [0204] 不受理论束缚，预期内部核糖体进入位点(IRES)可用作唯一的核糖体结合位点，或充当mRNA的多个核糖体结合位点之一。包含多于一个功能性核糖体结合位点的mRNA分子 可编码若干肽或多肽，所述肽或多肽独立地由核糖体转译(例如多顺反子mRNA)。因此，在一 些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含一个或多个内部核糖体进入位点 (IRES)。可以与本公开结合使用的IRES序列的实例包括但不限于来自小RNA病毒(例如 FMDV)、害虫病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、C 型肝炎病毒(HCV)、猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猴免疫缺陷病毒(sIV)或蟋蟀麻 痹病毒(CrPV)的那些IRES序列。 [0205] 在各个实施方案中，本公开的核酸分子编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种肽或蛋白质。核酸分子编码的肽和蛋白质可相同或不同。在一些实施方案中，本公开的核酸分子编码二肽(例如肌肽和鹅肌肽)。在一些实施方案中，核酸分子编码三肽。在一些实施 方案中，核酸分子编码四肽。在一些实施方案中，核酸分子编码五肽。在一些实施方案中，核 酸分子编码六肽。在一些实施方案中，核酸分子编码七肽。在一些实施方案中，核酸分子编 码八肽。在一些实施方案中，核酸分子编码九肽。在一些实施方案中，核酸分子编码十肽。在 一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约15个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核 酸分子编码具有至少约50个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至 少约100个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约150个氨基酸 的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约300个氨基酸的肽或多肽。在一 些实施方案中，核酸分子编码具有至少约500个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核 酸分子编码具有至少约1000个氨基酸的肽或多肽。 [0206] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子的长度为至少约30个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约35nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约 40nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约45nt。在一些实施方案中，核酸分子的 长度为至少约50nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约55nt。在一些实施方案 中，核酸分子的长度为至少约60nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约65nt。在 一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约70nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至 少约75nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约80nt。在一些实施方案中，核酸分 子的长度为至少约85nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约90nt。在一些实施方 案中，核酸分子的长度为至少约95nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约100nt。 在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约120nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度 为至少约140nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约160nt。在一些实施方案中， 核酸分子的长度为至少约180nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约200nt。在一 些实施方案中，核酸分子的长度为至少约250nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至 少约300nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约400nt。在一些实施方案中，核酸 分子的长度为至少约500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约600nt。在一些实 施方案中，核酸分子的长度为至少约700nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约 800nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约900nt。在一些实施方案中，核酸分子 的长度为至少约1000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1100nt。在一些实施 方案中，核酸分子的长度为至少约1200nt在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约 1300nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1400nt。在一些实施方案中，核酸分 子的长度为至少约1500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1600nt。在一些实 施方案中，核酸分子的长度为至少约1700nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约 1800nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1900nt。在一些实施方案中，核酸分 子的长度为至少约2000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约2500nt。在一些实 施方案中，核酸分子的长度为至少约3000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约 3500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约4000nt。在一些实施方案中，核酸分 子的长度为至少约4500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约5000nt。 [0207] 在特定实施方案中，治疗性有效负载包含如本文所述的疫苗组合物(例如基因疫苗)。在一些实施方案中，治疗性有效负载包含能够引发针对一种或多种目标疾患或疾病的 免疫的化合物。在一些实施方案中，目标疾患与病原体感染相关或由病原体感染引起，所述 病原体例如为冠状病毒(例如2019‑nCoV)、流感病毒、麻疹病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、狂犬 病病毒、脑膜炎病毒、百日咳病毒、破伤风病毒、鼠疫病毒、肝炎病毒和结核病病毒。在一些 实施方案中，治疗性有效负载包含编码病原体特有的致病性蛋白质或其抗原片段或表位的 核酸序列(例如mRNA)。疫苗在施用于经疫苗接种的受试者后，允许表达编码的致病性蛋白 质(或其抗原片段或表位)，由此在受试者体内引发针对病原体的免疫。 [0208] 在一些实施方案中，目标疾患与细胞的赘生性生长相关或由细胞的赘生性生长引起(例如癌症)。在一些实施方案中，治疗性有效负载包含编码癌症特有的肿瘤相关抗原 (TAA)或其抗原片段或表位的核酸序列(例如mRNA)。疫苗在施用于经疫苗接种的受试者后， 允许表达所编码的TAA(或其抗原片段或表位)，由此在受试者体内引发针对表达TAA的赘生 性细胞的免疫。 [0209] 5’‑帽结构 [0210] 不受理论束缚，预期聚核苷酸的5′‑帽结构参与核输出并增加聚核苷酸稳定性，并且结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，CBP负责细胞中的聚核苷酸稳定性，并且经由CBP与poly‑A结 合蛋白缔合形成成熟环状mRNA物质来引起转译能力。5′‑帽结构进一步有助于mRNA剪接期 间5′‑近端内含子的移除。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含5′‑帽结构。 [0211] 核酸分子可在5′端经细胞内源性转录机构戴帽，由此在聚核苷酸的末端鸟苷帽残基与5′末端转录的有义核苷酸之间产生5′‑ppp‑5′‑三磷酸键联。接着，此5′‑鸟苷酸帽可经甲基化以产生N7‑甲基‑鸟苷酸残基。聚核苷酸5′端的末端和/或末端前(anteterminal)转 录的核苷酸的核糖也可任选地经2′‑O‑甲基化。经由鸟苷酸帽结构水解和裂解进行的5′‑脱 帽可靶向核酸分子，例如mRNA分子以进行降解。 [0212] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含对由内源过程产生的天然5′‑帽结构的一个或多个改变。不受理论束缚，对5′‑帽的修饰可增加聚核苷酸的稳定性，增加聚核苷 酸的半衰期，并且可增加聚核苷酸的转译效率。 [0213] 对天然5′‑帽结构的示例性改变包括产生不可水解的帽结构，以防止脱帽，并由此增加聚核苷酸的半衰期。在一些实施方案中，因为帽结构水解需要裂解5′‑ppp‑5′磷酸二酯 键联，所以在一些实施方案中，可在戴帽反应期间使用经修饰的核苷酸。举例来说，在一些 实施方案中，可根据制造商的说明书，将来自New England Biolabs(Ipswich，Mass.)的牛 痘病毒戴帽酶(Vaccinia Capping Enzyme)用于α‑硫代鸟苷核苷酸以在5′‑ppp‑5′帽中产 生硫代磷酸酯键联。可使用额外经修饰的鸟苷核苷酸，例如α‑甲基膦酸和硒代磷酸核苷酸。 [0214] 对于天然5′‑帽结构的额外示例性改变还包括在戴帽的鸟苷三磷酸(GTP)的2′位和/或3′位的修饰、糖环氧(产生碳环的氧)替代为亚甲基部分(CH2)、在帽结构的三磷酸桥 部分处的修饰或在核碱基(G)部分处的修饰。 [0215] 对于天然5′‑帽结构的额外示例性改变包括但不限于聚核苷酸5′‑末端和/或5′‑末端前核苷酸的核糖在糖2′‑羟基上的2′‑O‑甲基化(如上所述)。可使用多个不同的5′‑帽 结构产生聚核苷酸(例如mRNA分子)的5′‑帽。可与本公开结合使用的额外示例性5′‑帽结构 进一步包括国际专利公布第WO2008127688号、第WO 2008016473号和第WO 2011015347号中 描述的那些5′‑帽结构，各案的全部内容以引用的方式并入本文中。 [0216] 在各个实施方案中，5′‑末端帽可包括帽类似物。帽类似物在本文中又称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物、或者结构或功能性帽类似物，其化学结构不同于天然(即， 内源性、野生型或生理性)5′‑帽，同时保留帽功能。帽类似物可按化学方式(即，非酶方式) 或酶方式合成和/或连接至聚核苷酸。 [0217] 举例来说，抗反向帽类似物(ARCA)帽含有经5′‑5′‑三磷酸酯基团连接的两个鸟苷，其中一个鸟苷含有N7‑甲基以及3′‑O‑甲基(即，N7，3′‑O‑二甲基‑鸟苷‑5′‑三磷酸‑5′‑鸟苷，即m7G‑3′mppp‑G，其可等效地称为3′O‑Me‑m7G(5′)ppp(5′)G)。另一个未改变的鸟苷的3′‑O原子与戴帽聚核苷酸(例如mRNA)的5′‑末端核苷酸连接。N7‑和3′‑O‑甲基化的鸟苷提供戴帽聚核苷酸(例如mRNA)的末端部分。另一个示例性的帽结构为mCAP，其类似于ARCA， 但在鸟苷上具有2′‑O‑甲基(即，N7，2′‑O‑二甲基‑鸟苷‑5′‑三磷酸‑5′‑鸟苷，即m7Gm‑ppp‑G)。 [0218] 在一些实施方案中，帽类似物可为二核苷酸帽类似物。作为非限制性实例，二核苷酸帽类似物可在不同磷酸酯位置处用硼烷磷酸酯基(boranophosphate)或硒代磷酸酯基 (phophoroselenoate)进行修饰，如美国专利第8,519,110号中所描述的二核苷酸帽类似 物，该案的全部内容以全文引用的方式并入本文中。 [0219] 在一些实施方案中，帽类似物可为此项技术中已知和/或本文所描述的N7‑(4‑氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物。N7‑(4‑氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物的 非限制性实例包括N7‑(4‑氯苯氧基乙基)‑G(5′)ppp(5′)G和N7‑(4‑氯苯氧基乙基)‑m3′‑OG(5′)ppp(5′)G帽类似物(参见例如Kore等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry 2013 21： 4570‑4574中所述的各种帽类似物和合成帽类似物的方法；该文献的全部内容以引用的方 式并入本文中)。在其他实施方案中，可与本公开的核酸分子结合使用的帽类似物是4‑氯/ 溴苯氧基乙基类似物。 [0220] 在各个实施方案中，帽类似物可包括鸟苷类似物。有用的鸟苷类似物包括但不限于肌苷、N1‑甲基‑鸟苷、2′‑氟‑鸟苷、7‑脱氮‑鸟苷、8‑氧代‑鸟苷、2‑氨基‑鸟苷、LNA‑鸟苷和 2‑叠氮基‑鸟苷。 [0221] 不受理论束缚，预期尽管帽类似物允许在活体外转录反应中同时进行聚核苷酸的戴帽，但高达20％的转录物仍未戴帽。此情况以及帽类似物与细胞内源转录机构产生的聚 核苷酸的天然5′‑帽结构的结构差异可能导致转译能力减弱和细胞稳定性降低。 [0222] 因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子还可使用酶在转录后戴帽，以便产生更真实(authentic)的5′‑帽结构。如本文所使用，短语“更真实”是指一种特征在结构上或 功能上密切反映或模仿内源或野生型特征。也就是说，与现有技术的合成特征或类似物相 比，“更真实”的特征更好地代表内源性、野生型、天然或生理细胞功能和/或结构，或者其在 一个或多个方面胜过相应内源性、野生型、天然或生理特征。可与本公开的核酸分子结合使 用的更真实的5′‑帽结构的非限制性实例为相较于此项技术中已知的合成5′‑帽结构(或相 较于野生型、天然或生理性5′‑帽结构)，尤其具有增强的与帽结合蛋白的结合、增加的半衰 期、降低的对5′‑核酸内切酶的敏感性和/或减少的5′‑脱帽的结构。举例来说，在一些实施 方案中，重组牛痘病毒戴帽酶和重组2′‑O‑甲基转移酶可在聚核苷酸的5′‑末端核苷酸与鸟 苷帽核苷酸之间产生经典的5′‑5′‑三磷酸酯键联其中帽鸟苷含有N7‑甲基化，并且聚核苷 酸的5′‑末端核苷酸含有2′‑O‑甲基。这种结构称为帽1结构。与例如此项技术中已知的其他 5′帽类似物结构相比，这种帽引起更高的转译能力、细胞稳定性和减少的细胞促炎性细胞 因子的活化。其他示例性帽结构包括7mG(5’)ppp(5’)N，pN2p(帽0)、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp (帽1)、7mG(5’)‑ppp(5’)NlmpN2mp(帽2)和m(7)Gpppm(3)(6，6，2’)Apm(2’)Apm(2’)Cpm(2)(3，2’)Up(帽4)。 [0223] 不受理论束缚，预期本公开的核酸分子可在转录后戴帽，并且由于这种方法较为高效，因此几乎100％的核酸分子可经戴帽。 [0224] 非转译区(UTR) [0225] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含一个或多个非转译区(UTR)。在一些实施方案中，UTR位于核酸分子中编码区的上游，并被称为5′‑UTR。在一些实施方案中，UTR位 于核酸分子中编码区的下游，并被称为3′‑UTR。UTR的序列可与核酸分子中所发现的编码区 的序列同源或异源。多个UTR可包括在核酸分子中，并且可具有相同或不同的序列和/或基 因起源。根据本公开，核酸分子中UTR的任何部分(包括没有任何部分)可经密码子优化，并 且任何部分可在密码子优化之前和/或之后独立地含有一个或多个不同的结构或化学修 饰。 [0226] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含相对于彼此为同源的UTR和编码区。在其他实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含相对于彼此为异源的UTR 和编码区。在一些实施方案中，为了监测UTR序列的活性，可在活体外(例如细胞或组织培养 物)或在活体内(例如向受试者)施用包含UTR和可检测探针的编码序列的核酸分子，并且可 使用此项技术中已知的方法测量UTR序列的作用(例如调节表达水平、编码产物的细胞定位 或编码产物的半衰期)。 [0227] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)的UTR包含至少一个转译强化子元件(TEE)，所述TEE起到增加由所述核酸分子产生的多肽或蛋白质的量的作用。在一些 实施方案中，TEE位于核酸分子的5′‑UTR中。在其他实施方案中，TEE位于核酸分子的3′‑UTR 处。在其他实施方案中，至少两个TEE分别位于核酸分子的5′‑UTR和3′‑UTR处。在一些实施 方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)可包含一个或多个拷贝的TEE序列或包含多于一个 不同的TEE序列。在一些实施方案中，存在于本公开的核酸分子中的不同TEE序列可相对于 彼此为同源的或异源的。 [0228] 各种TEE序列是此项技术中已知的，并且可与本公开结合使用。举例来说，在一些实施方案中，TEE可为内部核糖体进入位点(IRES)、HCV‑IRES或IRES元件。Chappell等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：9590‑9594，2004；Zhou等人，Proc.Natl.Acad.Sci.102： 6273‑6278，2005。可与本公开结合使用的额外内部核糖体进入位点(IRES)包括但不限于美 国专利第7,468,275号、美国专利公布第2007/0048776号和美国专利公布第2011/0124100 号，以及国际专利公布第WO2007/025008号和国际专利公布第WO2001/055369号中所述的 IRES，各案的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，TEE可为Wellensiek 等人，Genome‑wide profiling of human cap‑independent translation‑ enhancingelements，Nature Methods，2013年8月；10(8)：747‑750的补充表1和补充表2中 所述的TEE；每篇文献的内容以全文引用的方式并入本文中。 [0229] 可与本公开结合使用的额外示例性TEE包括但不限于美国专利第6,310,197号、美国专利第6,849,405号、美国专利第7,456,273号、美国专利第7,183,395号、美国专利公布 第2009/0226470号、美国专利公布第2013/0177581号、美国专利公布第2007/0048776号、美 国专利公布第2011/0124100号、美国专利公布第2009/0093049号、国际专利公布第WO2009/ 075886号、国际专利公布第WO2012/009644号和国际专利公布第WO1999/024595号、国际专 利公布第WO2007/025008号、国际专利公布第WO2001/055371号、欧洲专利第2610341号、欧 洲专利第2610340号中所述的TEE序列，各案的内容以全文引用的方式并入本文中。 [0230] 在各种实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含至少一个UTR，其包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少 19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或超过60个TEE序列。在一些实施方案中，核酸分 子UTR中的TEE序列是相同TEE序列的拷贝。在其他实施方案中，核酸分子UTR中的至少两个 TEE序列具有不同的TEE序列。在一些实施方案中，多个不同的TEE序列以一种或多种重复模 式布置于核酸分子的UTR区中。仅出于说明的目的，重复模式可为例如ABABAB、 AABBAABBAABB、ABCABCABC等，其中在这些示例性模式中，每个大写字母(A、B或C)代表不同 的TEE序列。在一些实施方案中，在核酸分子的UTR中，至少两个TEE序列彼此为连续的(即， 其间无间隔子序列)。在其他实施方案中，至少两个TEE序列通过间隔子序列隔开。在一些实 施方案中，UTR可包含TEE序列‑间隔子序列模块，所述模块在UTR中重复至少一次、至少两 次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次或更多次。在本段中描述的任何实施方案中，UTR可为核酸分子的5′‑UTR、3′‑UTR或5′‑UTR和3′‑UTR两者。 [0231] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)的UTR包含至少一个转译抑制元件，所述元件起到减少由所述核酸分子产生的多肽或蛋白质的量的作用。在一些实施方 案中，核酸分子的UTR包含经一个或多个微小RNA识别的一个或多个miR序列或其片段(例如 miR种子序列(seed sequence))。在一些实施方案中，核酸分子的UTR包含下调核酸分子的 转译活性的一个或多个茎‑环结构。用于抑制与核酸分子相关的转译活性的其他机制是此 项技术中已知的。在本段中描述的任何实施方案中，UTR可为核酸分子的5′‑UTR、3′‑UTR或 5′‑UTR和3′‑UTR两者。 [0232] 聚腺苷酸化(Poly‑A)区 [0233] 在天然RNA加工过程中，通常将长链腺苷核苷酸(poly‑A区)添加至信使RNA(mRNA)分子中以增加分子的稳定性。转录后，立即将转录物的3′‑端裂解以释放3′‑羟基。接着， poly‑A聚合酶将一连串腺苷核苷酸添加至RNA中。该过程称为聚腺苷酸化，添加一个长度在 100与250个残基之间的poly‑A区。不受理论束缚，预期poly‑A区可赋予本公开的核酸分子 多个优点。 [0234] 因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含一个或多个聚腺苷酸化(poly‑A)区。 在一些实施方案中，poly‑A区完全由腺嘌呤核苷酸或其功能性类似物构成。在一些实施方 案中，核酸分子在其3′端包含至少一个poly‑A区。在一些实施方案中，核酸分子在其5′端包 含至少一个poly‑A区。在一些实施方案中，核酸分子在其5′端包含至少一个poly‑A区且在 其3′端包含至少一个poly‑A区。 [0235] 根据本公开，在不同实施方案中，poly‑A区可具有不同长度。具体地说，在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少30个核苷酸。在一些实施方案中，本 公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少35个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸 分子的poly‑A区的长度为至少40个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑ A区的长度为至少45个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为 至少50个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少55个核 苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少60个核苷酸。在一些 实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少65个核苷酸。在一些实施方案中， 本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少70个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核 酸分子的poly‑A区的长度为至少75个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的 poly‑A区的长度为至少80个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的 长度为至少85个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少 90个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少95个核苷酸。 在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少100个核苷酸。在一些实施 方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少110个核苷酸。在一些实施方案中，本 公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少120个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸 分子的poly‑A区的长度为至少130个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的 poly‑A区的长度为至少140个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的 长度为至少150个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少 160个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少170个核苷 酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少180个核苷酸。在一些 实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少190个核苷酸。在一些实施方案 中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少200个核苷酸。在一些实施方案中，本公开 的核酸分子的poly‑A区的长度为至少225个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子 的poly‑A区的长度为至少250个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区 的长度为至少275个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至 少300个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少350个核 苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少400个核苷酸。在一 些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少450个核苷酸。在一些实施方案 中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开 的核酸分子的poly‑A区的长度为至少600个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子 的poly‑A区的长度为至少700个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区 的长度为至少800个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至 少900个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少1000个核 苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少1100个核苷酸。在一 些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少1200个核苷酸。在一些实施方 案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少1300个核苷酸。在一些实施方案中，本公 开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少1400个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸 分子的poly‑A区的长度为至少1500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的 poly‑A区的长度为至少1600个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区 的长度为至少1700个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为 至少1800个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少1900 个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少2000个核苷酸。 在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少2250个核苷酸v在一些实 施方案中，本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少2500个核苷酸。在一些实施方案中， 本公开的核酸分子的poly‑A区的长度为至少2750个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的 核酸分子的poly‑A区的长度为至少3000个核苷酸。 [0236] 在一些实施方案中，核酸分子中poly‑A区的长度可基于核酸分子的总长度或其部分(例如核酸分子的编码区的长度或开放阅读框的长度等)来选择。举例来说在一些实施方 案中，poly‑A区占含有poly‑A区的核酸分子的总长度的约5％、10％、15％、20％、25％、 30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高百分比。 [0237] 不受理论束缚，预期某些RNA结合蛋白可结合至位于mRNA分子3′端的poly‑A区。这些poly‑A结合蛋白(PABP)可调节mRNA表达，例如与细胞中的转译起始机构相互作用和/或 保护3′‑poly‑A尾免于降解。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含 poly‑A结合蛋白(PABP)的至少一个结合位点。在其他实施方案中，在将核酸分子装载至递 送媒介物(例如脂质纳米颗粒)中的前，使其与PABP形成结合物或复合物。 [0238] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含poly‑A‑G四联体。G四联体是可由DNA和RNA中富含G的序列形成的氢键合的四个鸟苷核苷酸的环状阵列。在此实施方 案中，G四联体并入poly‑A区的一端。可分析所得聚核苷酸(例如mRNA)的稳定性、蛋白质产 量和其他参数，包括在不同时间点的半衰期。已发现，poly‑A‑G四联体结构的蛋白质产量等 于仅使用含120个核苷酸的poly‑A区所观察到的蛋白质产量的至少75％。 [0239] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)可包括poly‑A区且可通过添加3′‑稳定区来稳定。在一些实施方案中，可用于使核酸分子(例如mRNA)稳定的3′‑稳定区包 括国际专利公布第WO2013/103659号中所述的poly‑A或poly‑A‑G四联体结构，所述公布的 内容以全文引用的方式并入本文中。 [0240] 在其他实施方案中，可与本公开的核酸分子结合使用的3′‑稳定区包括链终止核苷，例如但不限于3′‑脱氧腺苷(虫草素(cordycepin))；3′‑脱氧尿苷；3′‑脱氧胞嘧啶；3′‑脱氧鸟苷；3′‑脱氧胸腺嘧啶；2’，3’‑双脱氧核苷，例如2’，3’‑双脱氧腺苷、2’，3’‑双脱氧尿苷、2’，3’‑双脱氧胞嘧啶、2’，3’‑双脱氧鸟苷、2’，3’‑双脱氧胸腺嘧啶；2′‑脱氧核苷；或O‑甲基核苷∶3′‑脱氧核苷；2’，3’‑双脱氧核苷；3′‑O‑甲基核苷；3′‑O‑乙基核苷；3′‑阿拉伯糖苷，以及此项技术中已知和/或本文所描述的其他替代性核苷。 [0241] 二级结构 [0242] 不受理论束缚，预期茎‑环结构可引导RNA折叠，保护核酸分子(例如mRNA)的结构稳定性，提供RNA结合蛋白的识别位点，并用作酶反应的底物。举例来说，miR序列和/或TEE 序列的并入将改变茎‑环区的形状，由此可增加和/或减少转译(Kedde等人，A Pumilio‑ induced RNA structure switch in p27‑3’UTR controls miR‑221and miR‑ 222accessibility.Nat Cell Biol.，2010年10月；12(10)：1014‑20，所述文献的内容以全 文引用的方式并入本文中)。 [0243] 因此，在一些实施方案中，本文所述的核酸分子(例如mRNA)或其一部分可呈茎‑环结构，例如但不限于组蛋白茎‑环。在一些实施方案中，茎‑环结构由长度为约25个或约26个 核苷酸的茎‑环序列形成，例如但不限于国际专利公布第WO2013/103659号中所述的结构， 该案内容以全文引用的方式并入本文中。茎‑环序列的额外实例包括国际专利公布第 WO2012/019780号和国际专利公布第WO201502667号中所述的序列，各案内容以引用的方式 并入本文中。在一些实施方案中，茎‑环序列包含如本文所述的TEE。在一些实施方案中，茎‑ 环序列包含如本文所述的miR序列。在特定实施方案中，茎‑环序列可包括miR‑122种子序 列。在特定实施方案中，核酸分子包含茎‑环序列CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA(SEQ ID NO： 1)。在其他实施方案中，核酸分子包含茎‑环序列CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA(SEQ ID NO： 2)。 [0244] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含位于核酸分子中编码区上游(在5′端)的茎‑环序列。在一些实施方案中，茎‑环序列位于核酸分子5′‑UTR内。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含位于核酸分子中编码区下游(在3′端)的茎‑ 环序列。在一些实施方案中，茎‑环序列位于核酸分子3′‑UTR内。在一些情况下，核酸分子可 含有多于一个茎‑环序列。在一些实施方案中，核酸分子在5′‑UTR中包含至少一个茎‑环序 列且在3′‑UTR中包含至少一个茎‑环序列。 [0245] 在一些实施方案中，包含茎‑环结构的核酸分子进一步包含稳定区。在一些实施方案中，稳定区包含至少一个链终止核苷，其起到减慢降解并由此增加核酸分子的半衰期的 作用。可与本公开的核酸分子结合使用的示例性链终止核苷包括但不限于3′‑脱氧腺苷(虫 草素)；3′‑脱氧尿苷；3′‑脱氧胞嘧啶；3′‑脱氧鸟苷；3′‑脱氧胸腺嘧啶；2’，3’‑双脱氧核苷，例如2’，3’‑双脱氧腺苷、2’，3’‑双脱氧尿苷、2’，3’‑双脱氧胞嘧啶、2’，3’‑双脱氧鸟苷、2’， 3’‑双脱氧胸腺嘧啶；2′‑脱氧核苷；或O‑甲基核苷；3′‑脱氧核苷；2’，3’‑双脱氧核苷；3′‑O‑甲基核苷；3′‑O‑乙基核苷；3′‑阿拉伯糖苷，以及此项技术中已知和/或本文所描述的其他 替代性核苷。在其他实施方案中，茎‑环结构可通过改变聚核苷酸的3′‑区域来稳定，所述改 变可防止和/或抑制寡聚(U)的添加(国际专利公布第WO2013/103659号，其以全文引用的方 式并入本文中)。 [0246] 在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含至少一个茎‑环序列和poly‑A区或聚腺苷酸化信号。包含至少一个茎‑环序列和poly‑A区或聚腺苷酸化信号的聚核苷酸序列的 非限制性实例包括国际专利公布第WO2013/120497号、国际专利公布第WO2013/120629号、 国际专利公布第WO2013/120500号、国际专利公布第WO2013/120627号、国际专利公布第 WO2013/120498号、国际专利公布第WO2013/120626号、国际专利公布第WO2013/120499号和 国际专利公布第WO2013/120628号中所述的序列，各案内容以全文引用的方式并入本文中。 [0247] 在一些实施方案中，包含茎‑环序列和poly‑A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码病原体抗原或其片段，例如国际专利公布第WO2013/120499号和国际专利公布第 WO2013/120628号中所述的聚核苷酸序列，各案内容以全文引用的方式并入本文中。 [0248] 在一些实施方案中，包含茎‑环序列和poly‑A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码治疗性蛋白质，例如国际专利公布第WO2013/120497号和国际专利公布第WO2013/ 120629号中所述的聚核苷酸序列，各案内容以全文引用的方式并入本文中。 [0249] 在一些实施方案中，包含茎‑环序列和poly‑A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码肿瘤抗原或其片段，例如国际专利公布第WO2013/120500号和国际专利公布第WO2013/ 120627号中所述的聚核苷酸序列，各案内容以全文引用的方式并入本文中。 [0250] 在一些实施方案中，包含茎‑环序列和poly‑A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码致敏性抗原或自体免疫性自体抗原，例如国际专利公布第WO2013/120498号和国际专 利公布第WO2013/120626号中所述的聚核苷酸序列，各案内容以全文引用的方式并入本文 中。 [0251] 功能性核苷酸类似物 [0252] 在一些实施方案中，本文所述的有效负载核酸分子仅含有选自A(腺苷)、G(鸟苷)、C(胞嘧啶)、U(尿苷)和T(胸苷)的经典核苷酸。不受理论束缚，预期某些功能性核苷酸类似 物可赋予核酸分子有用的特性。在本公开的上下文中，此类有用特性的实例包括但不限于 核酸分子的稳定性增加、核酸分子在诱导先天免疫反应中的免疫原性降低、由核酸分子编 码的蛋白质的产量增加、核酸分子的细胞内递送和/或保留增加，和/或核酸分子的细胞毒 性降低等。 [0253] 因此，在一些实施方案中，有效负载核酸分子包含至少一种如本文所述的功能性核苷酸类似物。在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有至少一个针对核碱基、糖基 和/或磷酸酯基的化学修饰。因此，包含至少一种功能性核苷酸类似物的有效负载核酸分子 含有至少一个针对核碱基、糖基和/或核苷间键联的化学修饰。本文提供对核酸分子的核碱 基、糖基或核苷间键联的示例性化学修饰。 [0254] 如本文所述，有效负载核酸分子中所有核苷酸的0％至100％范围的核苷酸可以为如本文所述的功能性核苷酸类似物。举例来说，在各个实施方案中，核酸分子中的所有核苷 酸中约1％至约20％、约1％至约25％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约 1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％ 至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至 约95％、约10％至约100％、约20％至约25％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至 约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约50％至 约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约 100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约 90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至 约100％的核苷酸是本文所述的功能性核苷酸类似物。在这些实施方案中的任一个中，功能 性核苷酸类似物可存在于核酸分子的任何位置处，包括5′‑末端、3′‑末端和/或一个或多个 内部位置。在一些实施方案中，单个核酸分子可含有不同的糖修饰、不同的核碱基修饰和/ 或不同类型的核苷间键联(例如主链结构)。 [0255] 如本文所述，有效负载核酸分子中一种类型的所有核苷酸(例如作为一种类型的所有含嘌呤核苷酸、或作为一种类型的所有含嘧啶核苷酸、或作为一种类型的所有A、G、C、T 或U)中范围自0％至100％的核苷酸可为本文所述的功能性核苷酸类似物。举例来说，在各 个实施方案中，核酸分子中一种类型的核苷酸中约1％至约20％、约1％至约25％、约1％至 约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、 约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约 10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约25％、约 20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约 20％至约95％、约20％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约 50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约 70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约 90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的核苷酸是本文所述的功能性核苷 酸类似物。在这些实施方案中的任一个中，功能性核苷酸类似物可存在于核酸分子的任何 位置处，包括5′‑末端、3′‑末端和/或一个或多个内部位置。在一些实施方案中，单个核酸分子可含有不同的糖修饰、不同的核碱基修饰和/或不同类型的核苷间键联(例如主链结构)。 [0256] 核碱基的修饰 [0257] 在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有非经典核碱基。在一些实施方案中，核苷酸中的经典核碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)可经修饰或置换 以提供所述核苷酸的一种或多种功能性类似物。核碱基的示例性修饰包括但不限于一个或 多个取代或修饰，包括但不限于烷基、芳基、卤基、氧代、羟基、烷氧基和/或硫代取代；一个 或多个稠环或开环、氧化和/或还原。 [0258] 在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的尿嘧啶。具有经修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶‑4‑酮核糖核苷、5‑氮杂尿嘧啶、6‑氮杂尿嘧啶、2‑硫代‑5‑氮杂尿嘧啶、2‑硫代尿嘧啶(s2U)、4‑硫代‑尿嘧啶(s4U)、4‑硫代‑假尿苷、2‑硫代‑假尿苷、5‑羟基‑尿嘧啶(ho5U)、5‑氨基烯丙基‑尿嘧啶、5‑卤代尿嘧啶(例如5‑碘尿嘧啶或 5‑溴尿嘧啶)、3‑甲基尿嘧啶(m3U)、5‑甲氧基尿嘧啶(mo5U)、尿嘧啶5‑氧乙酸(cmo5U)、尿嘧啶5‑氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5‑羧甲基‑尿嘧啶(cm5U)、1‑羧甲基‑假尿苷、5‑羧基羟甲基‑尿嘧啶(chm5U)、5‑羧基羟甲基‑尿嘧啶甲酯(mchm5U)、5‑甲氧基羰基甲基‑尿嘧啶(mcm5U)、5‑甲氧基羰基甲基‑2‑硫代尿嘧啶(mcm5s2U)、5‑氨基甲基‑2‑硫代尿嘧啶(nm5s2U)、5‑甲基氨基甲基尿嘧啶(mnm5U)、5‑甲基氨基甲基‑2‑硫代尿嘧啶(mnm5s2U)、5‑甲基氨基甲基‑2‑硒 代尿嘧啶(mnm5se2U)、5‑氨甲酰基甲基尿嘧啶(ncm5U)、5‑羧甲基氨基甲基‑尿嘧啶 (cmnm5U)、5‑羧甲基氨基甲基‑2‑硫代尿嘧啶(cmnm5s2U)、5‑丙炔基‑尿嘧啶、1‑丙炔基‑假尿嘧啶、5‑牛磺酸甲基‑尿嘧啶(τm5U)、1‑牛磺酸甲基‑假尿苷、5‑牛磺酸甲基‑2‑硫代‑尿嘧啶(τm55s2U)、1‑牛磺酸甲基‑4‑硫代‑假尿苷、5‑甲基‑尿嘧啶(m5U，即，具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1‑甲基‑假尿苷(m1ψ)、1‑乙基‑假尿苷(Et1ψ)、5‑甲基‑2‑硫代‑尿嘧啶(m5s2U)、1‑甲基‑4‑硫代‑假尿苷(m1s4ψ)、4‑硫代‑1‑甲基‑假尿苷、3‑甲基‑假尿苷(m3ψ)、2‑硫代‑1‑甲基‑假尿苷、1‑甲基‑1‑脱氮‑假尿苷、2‑硫代‑1‑甲基‑1‑脱氮‑假尿苷、二氢尿嘧啶(D)、二氢假尿苷、5，6‑二氢尿嘧啶、5‑甲基‑二氢尿嘧啶(m5D)、2‑硫代‑二氢尿嘧啶、2‑硫代‑二氢假尿苷、2‑甲氧基‑尿嘧啶、2‑甲氧基‑4‑硫代‑尿嘧啶、4‑甲氧基‑假尿苷、4‑甲氧基‑2‑硫代‑假尿苷、N1‑甲基‑假尿苷、3‑(3‑氨基‑3‑羧基丙基)尿嘧啶(acp3U)、1‑甲基‑3‑(3‑氨基‑3‑羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5‑(异戊烯基氨基甲基)尿嘧啶(m5U)、5‑(异戊烯基氨基甲基)‑ 2‑硫代‑尿嘧啶(m5s2U)、5，2’‑O‑二甲基‑尿苷(m5Um)、2‑硫代‑2’‑O‑甲基‑尿苷(s2Um)、5‑甲氧基羰基甲基‑2’‑O‑甲基‑尿苷(mcm5Um)、5‑氨甲酰基甲基‑2’‑O‑甲基‑尿苷(ncm5Um)、 5‑羧甲基氨基甲基‑2’‑O‑甲基‑尿苷(cmnm5Um)、3，2’‑O‑二甲基‑尿苷(m3Um)和5‑(异戊烯基氨基甲基)‑2’‑O‑甲基‑尿苷(inm5Um)、1‑硫代‑尿嘧啶、脱氧胸苷、5‑(2‑甲氧羰基乙烯基)‑尿嘧啶、5‑(氨甲酰基羟甲基)‑尿嘧啶、5‑氨甲酰基甲基‑2‑硫代‑尿嘧啶、5‑羧甲基‑2‑硫代‑尿嘧啶、5‑氰基甲基‑尿嘧啶、5‑甲氧基‑2‑硫代‑尿嘧啶和5‑[3‑(1‑E‑丙烯基氨基)]尿嘧啶。 [0259] 在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5‑氮杂胞嘧啶、6‑氮杂胞嘧啶、假异胞苷、3‑甲基胞嘧啶(m3C)、N4‑ 乙酰基胞嘧啶(ac4C)、5‑甲酰基胞嘧啶(f5C)、N4‑甲基‑胞嘧啶(m4C)、5‑甲基‑胞嘧啶 (m5C)、5‑卤代‑胞嘧啶(例如5‑碘‑胞嘧啶)、5‑羟甲基‑胞嘧啶(hm5C)、1‑甲基‑假异胞苷、吡咯并胞嘧啶、吡咯并假异胞苷、2‑硫代胞嘧啶(s2C)、2‑硫代‑5‑甲基胞嘧啶、4‑硫代假异胞苷、4‑硫代‑1‑甲基‑假异胞苷、4‑硫代‑1‑甲基‑1‑脱氮‑假异胞苷、1‑甲基‑1‑脱氮‑假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5‑氮杂‑泽布拉林、5‑甲基‑泽布拉林、5‑氮杂‑2‑硫代‑泽布拉林、2‑硫代‑泽布拉林、2‑甲氧基‑胞嘧啶、2‑甲氧基‑5‑甲基‑胞嘧啶、4‑甲氧基‑假异胞苷、 4‑甲氧基‑1‑甲基‑假异胞苷、赖西丁(lysidine)(k2C)、5，2’‑O‑二甲基‑胞苷(m5Cm)、N4‑乙酰基‑2’‑O‑甲基‑胞苷(ac4Cm)、N4，2’‑O‑二甲基‑胞苷(m4Cm)、5‑甲酰基‑2’‑O‑甲基‑胞苷(fSCm)、N4，N4，2’‑O‑三甲基‑胞苷(m42Cm)、1‑硫代‑胞嘧啶、5‑羟基‑胞嘧啶、5‑(3‑叠氮基丙基)‑胞嘧啶和5‑(2‑叠氮基乙基)‑胞嘧啶。 [0260] 在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有替代性腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括2‑氨基‑嘌呤、2，6‑二氨基嘌呤、2‑氨基‑6‑卤代‑嘌呤(例如2‑氨基‑6‑氯‑嘌呤)、6‑卤代‑嘌呤(例如6‑氯‑嘌呤)、2‑氨基‑6‑甲基‑嘌呤、8‑叠氮基‑腺嘌呤、7‑脱氮‑腺嘌呤、7‑脱氮‑8‑氮杂‑腺嘌呤、7‑脱氮‑2‑氨基‑嘌呤、7‑脱氮‑8‑氮杂‑2‑氨基‑嘌呤、 7‑脱氮‑2，6‑二氨基嘌呤、7‑脱氮‑8‑氮杂‑2，6‑二氨基嘌呤、1‑甲基‑腺嘌呤(m1A)、2‑甲基‑腺嘌呤(m2A)、N6‑甲基‑腺嘌呤(m6A)、2‑甲硫基‑N6‑甲基‑腺嘌呤(ms2m6A)、N6‑异戊烯基‑腺嘌呤(i6A)、2‑甲硫基‑N6‑异戊烯基‑腺嘌呤(ms2i6A)、N6‑(顺‑羟基异戊烯基)腺嘌呤 (io6A)、2‑甲硫基‑N6‑(顺‑羟基异戊烯基)腺嘌呤(ms2io6A)、N6‑甘氨酰基氨甲酰基‑腺嘌 呤(g6A)、N6‑苏氨酰基氨甲酰基‑腺嘌呤(t6A)、N6‑甲基‑N6‑苏氨酰基氨甲酰基‑腺嘌呤 (m6t6A)、2‑甲硫基‑N6‑苏氨酰基氨甲酰基‑腺嘌呤(ms2g6A)、N6,N6‑二甲基‑腺嘌呤 (m62A)、N6‑羟基正缬氨酰基氨甲酰基‑腺嘌呤(hn6A)、2‑甲硫基‑N6‑羟基正缬氨酰基氨甲 酰基‑腺嘌呤(ms2hn6A)、N6‑乙酰基‑腺嘌呤(ac6A)、7‑甲基‑腺嘌呤、2‑甲硫基‑腺嘌呤、2‑甲氧基‑腺嘌呤、N6，2’‑O‑二甲基‑腺苷(m6Am)、N6，N6，2’‑O‑三甲基‑腺苷(m62Am)、1，2’‑O‑二甲基‑腺苷(m1Am)、2‑氨基‑N6‑甲基‑嘌呤、1‑硫代‑腺嘌呤、8‑叠氮基‑腺嘌呤、N6‑(19‑氨基‑五氧杂十九烷基)‑腺嘌呤、2，8‑二甲基‑腺嘌呤、N6‑甲酰基‑腺嘌呤和N6‑羟甲基‑腺嘌呤。 [0261] 在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1‑甲基‑肌苷(m1I)、怀俄苷(wyosine)(imG)、甲基怀俄苷 (mimG)、4‑脱甲基‑怀俄苷(imG‑14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(wybutosine)(yW)、过氧怀丁 苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OHyW)、修饰不足(undermodified)的羟基怀丁苷(OHyW*)、7‑脱氮‑ 鸟嘌呤、辫苷(queuosine)(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基‑辫苷(galQ)、甘露糖基‑辫苷 (manQ)、7‑氰基‑7‑脱氮‑鸟嘌呤(preQO)、7‑氨基甲基‑7‑脱氮‑鸟嘌呤(preQ1)、古嘌苷 (archaeosine)(G+)、7‑脱氮‑8‑氮杂‑鸟嘌呤、6‑硫代‑鸟嘌呤、6‑硫代‑7‑脱氮‑鸟嘌呤、6‑硫代‑7‑脱氮‑8‑氮杂‑鸟嘌呤、7‑甲基‑鸟嘌呤(m7G)、6‑硫代‑7‑甲基‑鸟嘌呤、7‑甲基‑肌苷、6‑甲氧基‑鸟嘌呤、1‑甲基‑鸟嘌呤(m1G)、N2‑甲基‑鸟嘌呤(m2G)、N2，N2‑二甲基‑鸟嘌呤(m22G)、N2，7‑二甲基‑鸟嘌呤(m2，7G)、N2，N2，7‑二甲基‑鸟嘌呤(m2，2，7G)、8‑氧代‑鸟嘌呤、7‑甲基‑8‑氧代‑鸟嘌呤、1‑甲基‑6‑硫代‑鸟嘌呤、N2‑甲基‑6‑硫代‑鸟嘌呤、N2，N2‑二甲基‑6‑硫代‑鸟嘌呤、N2‑甲基‑2’‑O‑甲基‑鸟苷(m2Gm)、N2，N2‑二甲基‑2’‑O‑甲基‑鸟苷(m22Gm)、1‑甲基‑2’‑O‑甲基‑鸟苷(m1Gm)、N2，7‑二甲基‑2’‑O‑甲基‑鸟苷(m2，7Gm)、2’‑O‑甲基‑肌苷(Im)、1，2’‑O‑二甲基‑肌苷(m1Im)、1‑硫代‑鸟嘌呤和O‑6‑甲基‑鸟嘌呤。 [0262] 在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物的非经典核碱基可独立地为嘌呤、嘧啶、嘌呤类似物或嘧啶类似物。举例来说，在一些实施方案中，非经典核碱基可为经修饰的腺嘌 呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或次黄嘌呤。在其他实施方案中，非经典核碱基还可包括例如碱 基的天然存在的和合成的衍生物，包括吡唑并[3，4‑d]嘧啶；5‑甲基胞嘧啶(5‑me‑C)；5‑羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2‑氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6‑甲基和其他烷基衍生 物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2‑丙基和其他烷基衍生物；2‑硫代尿嘧啶、2‑硫代胸腺嘧啶和2‑硫代 胞嘧啶；5‑丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6‑偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5‑尿嘧啶(假尿嘧 啶)；4‑硫代尿嘧啶；8‑卤代(例如8‑溴)、8‑氨基、8‑硫醇、8‑硫代烷基、8‑羟基和其他8‑取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5‑卤代，尤其为5‑溴、5‑三氟甲基和其他5‑取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7‑甲基鸟嘌呤和7‑甲基腺嘌呤；8‑氮杂鸟嘌呤和8‑氮杂腺嘌呤；脱氮鸟嘌呤、7‑脱氮鸟嘌呤、 3‑脱氮鸟嘌呤；脱氮腺嘌呤、7‑脱氮腺嘌呤、3‑脱氮腺嘌呤；吡唑并[3，4‑d]嘧啶；咪唑并[1， 5‑a]1，3，5‑三嗪酮；9‑脱氮嘌呤；咪唑并[4，5‑d]吡嗪；噻唑并[4，5‑d]嘧啶；吡嗪‑2‑酮；1， 2，4‑三嗪；哒嗪；或1，3，5‑三嗪。 [0263] 糖的修饰 [0264] 在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有非经典糖基。在各个实施方案中，非经典糖基可为具有一个或多个取代的5‑碳或6‑碳糖(例如戊糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄 糖、半乳糖或其脱氧衍生物)，所述一个或多个取代例如为卤素、羟基、硫醇基、烷基、烷氧 基、烯基氧基、炔基氧基、环烷基、氨基烷氧基、烷氧基烷氧基、羟基烷氧基、氨基、叠氮基、芳基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基等。 [0265] 一般来说，RNA分子含有核糖基，所述核糖基是含氧5元环。示例性非限制性替代核苷酸包括核糖中的氧置换(例如用S、Se或亚烷基，如亚甲基或亚乙基置换)；双键的添加(例 如用环戊烯基或环己烯基置换核糖)；核糖的缩环(例如用于形成环丁烷或氧杂环丁烷的4 元环)；核糖的扩环(例如用于形成具有额外碳或杂原子的6元或7元环，如对于失水己糖醇、 阿卓糖醇(altritol)、甘露糖醇、环己烷基、环己烯基和N‑吗啉基(其还具有氨基磷酸酯主 链))；多环形式(例如三环和“未锁定”形式，如二醇核酸(GNA)(例如R‑GNA或S‑GNA，其中核 糖经连接至磷酸二酯键的二醇单元置换)、苏糖核酸(TNA，其中核糖经α‑L‑呋喃苏糖基‑(3’ →2’)置换)和肽核酸(PNA其中2‑氨基‑乙基‑甘氨酸键联置换核糖和磷酸二酯主链))。 [0266] 在一些实施方案中，糖基含有一个或多个碳，所述一个或多个碳具有与核糖中相应碳相反的立体化学构型。因此，核酸分子可包括含例如阿拉伯糖或L‑核糖作为糖的核苷 酸。在一些实施方案中，核酸分子包括至少一个其中糖是L‑核糖、2′‑O‑甲基核糖、2′‑氟核糖、阿拉伯糖、己糖醇、LNA或PNA的核苷。 [0267] 核苷间键联的修饰 [0268] 在一些实施方案中，本公开的有效负载核酸分子可含有一个或多个经修饰的核苷间键联(例如磷酸酯主链)。主链磷酸酯基可通过用不同取代基置换一个或多个氧原子来改 变。 [0269] 在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物可包括用本文所述的另一个核苷间键联置换未改变的磷酸酯部分。替代性磷酸酯基的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、 硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸 三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧均经硫置换。还可通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫 (桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)置换连接氧来改变磷酸酯连接体。 [0270] 替代性核苷和核苷酸可包括一个或多个非桥连氧被甲硼烷部分(BH3)、硫(硫代)、甲基、乙基和/或甲氧基置换。作为非限制性实例，在同一位置(例如alpha(α)、beta(β)或 gamma(γ)位置)处的两个非桥连氧可经硫(硫代)和甲氧基置换。置换磷酸酯部分(例如α‑ 硫代磷酸酯)位置处的一个或多个氧原子可经由非天然硫代磷酸酯主链键联赋予RNA和DNA 稳定性(例如针对核酸外切酶和核酸内切酶的稳定性)。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增加的核 酸酶抗性，并且因此在细胞环境中具有较长的半衰期。 [0271] 本文描述可根据本公开使用的其他核苷间键联，包括不含磷原子的核苷间键联。 [0272] 可结合本公开使用的核酸分子(例如mRNA)、相关组合物、制剂和/或方法的额外实例进一步包括WO2002/098443、WO2003/051401、WO2008/052770、WO2009127230、 WO2006122828、WO2008/083949、WO2010088927、WO2010/037539、WO2004/004743、WO2005/ 016376、WO2006/024518、WO2007/095976、WO2008/014979、WO2008/077592、WO2009/030481、 WO2009/095226、WO2011069586、WO2011026641、WO2011/144358、WO2012019780、 WO2012013326、WO2012089338、WO2012113513、WO2012116811、WO2012116810、 WO2013113502、WO2013113501、WO2013113736、WO2013143698、WO2013143699、 WO2013143700、WO2013/120626、WO2013120627、WO2013120628、WO2013120629、 WO2013174409、WO2014127917、WO2015/024669、WO2015/024668、WO2015/024667、WO2015/ 024665、WO2015/024666、WO2015/024664、WO2015101415、WO2015101414、WO2015024667、 WO2015062738、WO2015101416中所述者，各案的内容以全文并入本文中。 [0273] 制剂 [0274] 根据本公开，本文所述的纳米颗粒组合物可包含至少一种脂质组分和一种或多种额外组分，例如治疗剂和/或预防剂。纳米颗粒组合物可设计成用于一种或多种特定应用或 目标。纳米颗粒组合物的成分可基于特定应用或目标，和/或基于一种或多种成分的功效、 毒性、费用、易用性、可用性或其他特征来选择。类似地，纳米颗粒组合物的特定配方可根据 例如每种成分的特定组合的功效和毒性，针对特定应用或目标来选择。 [0275] 纳米颗粒组合物的脂质组分可包括例如本文所述的根据式(I)(和其子式)之一的脂质、磷脂(例如不饱和脂质，例如DOPE或DSPC)、PEG脂质和结构脂质。脂质组分各成分可以 特定分率提供。 [0276] 在一个实施方案中，本文提供一种纳米颗粒组合物，其包含本文所提供的阳离子或可电离的脂质化合物、治疗剂和一种或多种赋形剂。在一个实施方案中，阳离子或可电离 的脂质化合物包含如本文所述的根据式(I)(和其子式)之一的化合物，以及任选地选用的 一种或多种额外可电离的脂质化合物。在一个实施方案中，所述一种或多种赋形剂选自中 性脂质、类固醇和聚合物结合的脂质。在一个实施方案中，治疗剂是包封于脂质纳米颗粒内 或与脂质纳米颗粒缔合。 [0277] 在一个实施方案中，本文提供一种纳米颗粒组合物(脂质纳米颗粒)，其包含： [0278] i)40摩尔％至50摩尔％的阳离子脂质； [0279] ii)中性脂质； [0280] iii)类固醇； [0281] iv)聚合物结合的脂质；以及 [0282] v)治疗剂。 [0283] 如本文所使用，“摩尔百分比”是指一种组分相对于LNP中所有脂质组分的总摩尔数(即，阳离子脂质、中性脂质、类固醇和聚合物结合的脂质的总摩尔数)的摩尔百分比。 [0284] 在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含41摩尔％至49摩尔％、41摩尔％至48摩尔％、42摩尔％至48摩尔％、43摩尔％至48摩尔％、44摩尔％至48摩尔％、45摩尔％至48摩 尔％、46摩尔％至48摩尔％或47.2摩尔％至47.8摩尔％的阳离子脂质。在一个实施方案中， 脂质纳米颗粒包含约47.0摩尔％、47.1摩尔％、47.2摩尔％、47.3摩尔％、47.4摩尔％、47.5 摩尔％、47.6摩尔％、47.7摩尔％、47.8摩尔％、47.9摩尔％或48.0摩尔％的阳离子脂质。 [0285] 在一个实施方案中，中性脂质以在5摩尔％至15摩尔％、7摩尔％至13摩尔％或9摩尔％至11摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，中性脂质以约9.5摩尔％、10摩 尔％或10.5摩尔％的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约 4.1∶1.0至约4.9∶1.0、约4.5∶1.0至约4.8∶1.0、或约4.7∶1.0至4.8∶1.0范围内。 [0286] 在一个实施方案中，类固醇以在39摩尔％至49摩尔％、40摩尔％至46摩尔％、40摩尔％至44摩尔％、40摩尔％至42摩尔％、42摩尔％至44摩尔％或44摩尔％至46摩尔％范围 内的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇以40摩尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44 摩尔％、45摩尔％或46摩尔％的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔 比在1.0∶0.9至1.0∶1.2、或1.0∶1.0至1.0∶1.2范围内。在一个实施方案中，类固醇是胆固 醇。 [0287] 在一个实施方案中，LNP中治疗剂与脂质的比率(即，N/P，其中N表示阳离子脂质的摩尔数，P表示作为核酸主链的一部分存在的磷酸酯的摩尔数)在2∶1至30∶1范围内，例如在 3∶1至22∶1范围内。在一个实施方案中，N/P在6∶1至20∶1或2∶1至12∶1范围内。示例性N/P范围包括约3∶1、约6∶1、约12∶1和约22∶1。 [0288] 在一个实施方案中，本文提供一种脂质纳米颗粒，其包含： [0289] i)有效pKa大于6.0的阳离子脂质； [0290] ii)5摩尔％至15摩尔％的中性脂质； [0291] iii)1摩尔％至15摩尔％的阴离子脂质； [0292] iv)30摩尔％至45摩尔％的类固醇； [0293] v)聚合物结合的脂质；以及 [0294] vi)治疗剂，或其药学上可接受的盐或前药， [0295] 其中摩尔百分比是基于脂质纳米颗粒中存在的脂质的总摩尔数确定。 [0296] 在一个实施方案中，阳离子脂质可为在选定pH值，例如生理pH值下带有净正电荷的多种脂质种类中的任一种。示例性阳离子脂质在下文描述。在一个实施方案中，阳离子脂 质的pKa值大于6.25。在一个实施方案中，阳离子脂质的pKa值大于6.5。在一个实施方案中， 阳离子脂质的pKa值大于6.1，大于6.2，大于6.3，大于6.35，大于6.4，大于6.45，大于6.55， 大于6.6，大于6.65或大于6.7。 [0297] 在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含40摩尔％至45摩尔％的阳离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含45摩尔％至50摩尔％的阳离子脂质。 [0298] 在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约2∶1至约8∶1范围内，优选约49:10。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含5摩尔％至10摩尔％的中性脂质。 [0299] 示例性阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)或1，2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸‑(1′‑外消旋‑甘油)(DSPG)。 [0300] 在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1摩尔％至10摩尔％的阴离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1摩尔％至5摩尔％的阴离子脂质。在一个实施方案中，脂质 纳米颗粒包含1摩尔％至9摩尔％、1摩尔％至8摩尔％、1摩尔％至7摩尔％或1摩尔％至6摩 尔％的阴离子脂质。在一个实施方案中，阴离子脂质与中性脂质的摩尔比在1∶1至1∶10范围 内。 [0301] 在一个实施方案中，类固醇是胆固醇。在一个实施方案中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约5∶1至1∶1范围内。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含32摩尔％至40摩尔％ 的类固醇。 [0302] 在一个实施方案中，中性脂质的摩尔百分比与阴离子脂质的摩尔百分比的总和在5摩尔％至15摩尔％范围内。在一个实施方案中，中性脂质的摩尔百分比与阴离子脂质的摩 尔百分比的总和在7摩尔％至12摩尔％范围内。 [0303] 在一个实施方案中，阴离子脂质与中性脂质的摩尔比在1∶1至1∶10范围内。在一个实施方案中，中性脂质的摩尔百分比与类固醇的摩尔百分比的总和在35摩尔％至45摩尔％ 范围内。 [0304] 在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含： [0305] i)45摩尔％至55摩尔％的阳离子脂质； [0306] ii)5摩尔％至10摩尔％的中性脂质； [0307] iii)1摩尔％至5摩尔％的阴离子脂质；以及 [0308] iv)32摩尔％至40摩尔％的类固醇。 [0309] 在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1.0摩尔％至2.5摩尔％的聚合物结合的脂质。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是以约1.5摩尔％的浓度存在。 [0310] 在一个实施方案中，中性脂质以在5摩尔％至15摩尔％、7摩尔％至13摩尔％或9摩尔％至11摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，中性脂质以约9.5摩尔％、10摩 尔％或10.5摩尔％的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约 4.1∶1.0至约4.9∶1.0、约4.5∶1.0至约4.8∶1.0、或约4.7∶1.0至4.8∶1.0范围内。 [0311] 在一个实施方案中，类固醇是胆固醇。在一个实施方案中，类固醇以在39摩尔％至49摩尔％、40摩尔％至46摩尔％、40摩尔％至44摩尔％、40摩尔％至42摩尔％、42摩尔％至 44摩尔％或44摩尔％至46摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇以40摩 尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44摩尔％、45摩尔％或46摩尔％的浓度存在。在一个 实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0∶0.9至1.0∶1.2、或1.0∶1.0至1.0∶1.2范 围内。 [0312] 在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在5∶1至1∶1范围内。 [0313] 在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1.0摩尔％至2.5摩尔％的聚合物结合的脂质。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是以约1.5摩尔％的浓度存在。 [0314] 在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约100∶1至约20∶1范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约35∶1至约25∶1 范围内。 [0315] 在一个实施方案中，脂质纳米颗粒的平均直径在50nm至100nm或60nm至85nm范围内。 [0316] 在一个实施方案中，所述组合物包含本文所提供的阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG‑脂质，以及mRNA。在一个实施方案中，本文所提供的阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG‑脂 质的摩尔比为约50∶10∶38.5∶1.5。 [0317] 纳米颗粒组合物可设计成用于一种或多种特定应用或目标。举例来说，纳米颗粒组合物可设计成用于将治疗剂和/或预防剂，例如RNA递送至哺乳动物体内的特定细胞、组 织、器官或系统或其组。纳米颗粒组合物的物理化学特性可经改变以增加对特定身体目标 的选择性。举例来说，可基于不同器官的开窗大小来调整粒度。纳米颗粒组合物中所包含的 治疗剂和/或预防剂还可基于一个或多个所希望的递送目标进行选择。举例来说，治疗剂 和/或预防剂可针对特定适应症、疾患、疾病或病症和/或针对递送至特定细胞、组织、器官 或系统或其组(例如局部或特异性递送)进行选择。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物可 包含编码感兴趣多肽的mRNA，其能够在细胞内转译以产生感兴趣多肽。此类组合物可设计 成特异性递送至特定器官。在某些实施方案中，组合物可设计成特异性递送至哺乳动物肝 脏。 [0318] 纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂的量可取决于纳米颗粒组合物的大小、组成、期望目标和/或应用，或其他特性，以及治疗剂和/或预防剂的特性。举例来说，可用于纳 米颗粒组合物中的RNA的量可取决于RNA的大小、序列和其他特征。纳米颗粒组合物中治疗 剂和/或预防剂和其他成分(例如脂质)的相对量也可变化。在一些实施方案中，纳米颗粒组 合物中脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比率可为约5∶1至约60∶1，例如为5∶1、6∶1、7 ∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、16∶1、17∶1、18∶1、19∶1、20∶1、25∶1、30∶1、 35∶1、40∶1、45∶1、50∶1和60∶1。举例来说，脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比率可为约10∶1至约40∶1。在某些实施方案中，wt/wt比率为约20∶1。纳米颗粒组合物中治疗剂和/或 预防剂的量可例如使用吸收光谱法(例如紫外‑可见光谱法)测量。 [0319] 在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含一种或多种RNA，并且可选择一种或多种RNA、脂质和其量来提供特定N∶P比。组合物的N∶P比是指一种或多种脂质中的氮原子与RNA 中磷酸酯基的数量的摩尔比。在一些实施方案中，选择较低的N∶P比。可选择一种或多种 RNA、脂质和其量以提供约2∶1至约30∶1，例如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1、22∶1、24∶1、26∶1、28∶1或30∶1的N∶P比。在某些实施方案中，N∶P比可为约2∶1至约8∶1。在其他实施方案中，N∶P比为约5∶1至约8∶1。举例来说，N∶P比可为约 5.0∶1、约5.5∶1、约5.67∶1、约6.0∶1、约6.5∶1或约7.0∶1。举例来说，N∶P比可为约5.67∶1。 [0320] 纳米颗粒组合物的物理特性可取决于其组分。举例来说，包含胆固醇作为结构脂质的纳米颗粒组合物可具有与包含不同结构脂质的纳米颗粒组合物不同的特征。类似地， 纳米颗粒组合物的特征可取决于其组分的绝对或相对量。举例来说，包含较高摩尔分率的 磷脂的纳米颗粒组合物可具有与包含较低摩尔分率的磷脂的纳米颗粒组合物不同的特征。 特征还可取决于纳米颗粒组合物的制备方法和条件而变化。 [0321] 纳米颗粒组合物可通过多种方法表征。举例来说，可使用显微镜检查(例如透射电子显微镜检查或扫描电子显微镜检查)来检查纳米颗粒组合物的形态和大小分布。可使用 动态光散射或电位测定法(例如电位滴定法)来测量ζ电位。动态光散射还可用于确定粒度。 还可使用仪器，例如Zetasizer Nano ZS(Malvem Instruments Ltd，Malvem， Worcestershire，UK)来测量纳米颗粒组合物的多个特征，例如粒度、多分散指数和ζ电位。 [0322] 在各个实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可在数十纳米至数百纳米之间。举例来说平均大小可为约40nm至约150nm，例如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、 75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、 140nm、145nm或150nm。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约50nm至约 100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约 100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约 90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm、或约90nm至约100nm。在某些实 施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约70nm至约100nm。在一些实施方案中，平均大 小可为约80nm。在其他实施方案中，平均大小可为约100nm。 [0323] 纳米颗粒组合物可为相对均质的。多分散指数可用于指示纳米颗粒组合物的均匀性，例如纳米颗粒组合物的粒度分布。较小(例如小于0.3)的多分散指数一般指示较窄的粒 度分布。纳米颗粒组合物的多分散指数可为约0至约0.25，例如0.01、0.02、0.03、0.04、 0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、 0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的多分散指数可 为约0.10至约0.20。 [0324] 纳米颗粒组合物的ζ电位可用于指示组合物的动电位。举例来说，ζ电位可描述纳米颗粒组合物的表面电荷。具有相对较低正或负电荷的纳米颗粒组合物一般是合意的，因 为带较高电荷的物质可与体内的细胞、组织和其他成分发生不合意的相互作用。在一些实 施方案中，纳米颗粒组合物的ζ电位可为约‑10mV至约+20mV、约‑10mV至约+15mV、约‑10mV至 约+10mV、约‑10mV至约+5mV、约‑10mV至约0mV、约‑10mV至约‑5mV、约‑5mV至约+20mV、约‑5mV至约+15mV、约‑5mV至约+10mV、约‑5mV至约+5mV、约‑5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV、或约+5mV 至约+10mV。 [0325] 治疗剂和/或预防剂的包封效率描述相对于所提供的初始量，在制备后经纳米颗粒组合物包封或以其他方式与纳米颗粒组合物缔合的治疗剂和/或预防剂的量。包封效率 合意地较高(例如接近100％)。包封效率可例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或清洁 剂破坏纳米颗粒组合物之前与之后含有纳米颗粒组合物的溶液中治疗剂和/或预防剂的量 来测量。荧光可用于测量溶液中游离治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的量。对于本文所述的 纳米颗粒组合物，治疗剂和/或预防剂的包封效率可为至少50％，例如50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％。在一些实施方案中，包封效率可为至少80％。在某些实施方案中，包封效率可为至少 90％。 [0327] 药物组合物 [0328] 根据本公开，纳米颗粒组合物可整体或部分地配制成药物组合物。药物组合物可包含一种或多种纳米颗粒组合物。举例来说，药物组合物可包含一种或多种纳米颗粒组合 物，所述一种或多种纳米颗粒组合物包含一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂。药物组合 物可进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助成分，例如本文所述者。关于药 物组合物和剂的配制和制造的一般准则可见于例如Remington’s The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro；Lippincott，Williams&Wilkins， Baltimore，Md.，2006。常规赋形剂和辅助成分可用于任何药物组合物中，除非任何常规赋 形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的一种或多种组分不相容。如果赋形剂或辅助成分与纳 米颗粒组合物的组分的组合会导致任何不希望的生物作用或其他有害作用，则赋形剂或辅 助成分与纳米颗粒组合物的组分不相容。 [0329] 在一些实施方案中，所述一种或多种赋形剂或辅助成分可构成包含纳米颗粒组合物的药物组合物的总质量或体积的超过50％。举例来说，所述一种或多种赋形剂或辅助成 分可构成医药惯例(pharmaceutical convention)的50％、60％、70％、80％、90％或更高百 分比。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂为至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂经批准用于人类和兽医用途。在一些 实施方案中，赋形剂得到美国食品与药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂是医药级 的。在一些实施方案中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药 典的标准。 [0330] 根据本公开的药物组合物中的一种或多种纳米颗粒组合物、一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将取决于所治疗受试者的身分、体格和/或状况 且进一步取决于组合物的施用途径而变化。举例来说，药物组合物可包含在0.1％与100％ (wt/wt)之间的一种或多种纳米颗粒组合物。 [0331] 在某些实施方案中，本公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物经冷藏或冷冻储存和/或运输(例如在4℃或更低温度下，例如在约‑150℃与约0℃之间或在约‑80℃与约‑20 ℃之间(例如约‑5℃、‑10℃、‑15℃、‑20℃、‑25℃、‑30℃、‑40℃、‑50℃、‑60℃、‑70℃、‑80℃、‑90℃、‑130℃或‑150℃)的温度下储存)。举例来说，包含式(I)(和其子式)中任一个的 化合物的药物组合物是在例如约‑20℃、30℃、‑40℃、‑50℃、‑60℃、‑70℃或‑80℃下冷藏储存和/或运输的溶液。在某些实施方案中，本公开还涉及一种通过在4℃或更低温度下，例如 在约‑150℃与约0℃之间或在约‑80℃与约‑20℃之间的温度下，例如在约‑5℃、‑10℃、‑15℃、‑20℃、‑25℃、‑30℃、‑40℃、‑50℃、‑60℃、‑70℃、‑80℃、‑90℃、‑130℃或‑150℃温度下储存包含式(I)(和其子式)中任一个的化合物的纳米颗粒组合物和/或药物组合物来增加 所述纳米颗粒组合物和/或药物组合物的稳定性的方法。举例来说，本文所公开的纳米颗粒 组合物和/或药物组合物在例如4℃或更低(例如约4℃与‑20℃之间)的温度下稳定保持约 至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少1个月、至少2个月、至少4个 月、至少6个月、至少8个月、至少10个月、至少12个月、至少14个月、至少16个月、至少18个 月、至少20个月、至少22个月或至少24个月。在一个实施方案中，制剂在约4℃下稳定保持至 少4周。在某些实施方案中，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合物和药学 上可接受的载体，所述载体选自以下中的一种或多种：Tris、乙酸盐(例如乙酸钠)、柠檬酸 盐(例如柠檬酸钠)、盐水、PBS和蔗糖。在某些实施方案中，本公开的药物组合物的pH值在约 7与8之间(例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，或在7.5与8之间或在7与7.8之间)。举例来说，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合 物、Tris、盐水和蔗糖，并且具有约7.5‑8的pH值，其适于在例如约‑20℃下储存和/或运输。 举例来说，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合物和PBS，并且具有约7‑ 7.8的pH值，其适于在例如约4℃或更低温度下储存和/或运输。在本公开的上下文中，“稳定 性”、“稳定化”和“稳定的”是指本文所公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物在给定制 造、制备、转运、储存和/或使用条件下，例如当施加压力，如剪切力、冷冻/解冻压力等时，对 化学或物理变化(例如降解、粒度变化、聚集、包封的变化等)具有抗性。 [0332] 可将纳米颗粒组合物和/或包含一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物施用于任何患者或受试者，包括可受益于通过将治疗剂和/或预防剂递送至一种或多种特定细胞、 组织、器官或系统或其组，如肾脏系统所提供的治疗作用的患者或受试者。尽管本文所提供 的关于纳米颗粒组合物和包含纳米颗粒组合物的药物组合物的描述主要针对适于施用于 人类的组合物，但所属领域的技术人员应理解，此类组合物一般适于施用于任何其他哺乳 动物。为了使组合物适于施用于各种动物而对适于施用于人类的组合物的改进是众所周知 的，并且有普通技术的兽医药理学家仅通过普通实验(如果有的话)即可设计和/或进行此 类改进。经考虑，施用所述组合物的受试者包括但不限于人类、其他灵长类动物和其他哺乳 动物，包括商业上相关的哺乳动物，例如山羊、牛、猪、狗、猫、驴、猴、猿，诸如小鼠、仓鼠、兔子的啮齿类动物等。 [0333] 包含一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物可通过药理学领域中已知或以后将开发的任何方法制备。一般来说，此类制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多 种其他辅助成分结合，并且接着，如果需要或必要，则将产物分成、成型成和/或包装成所希 望的单剂量或多剂量单元。 [0334] 根据本公开的药物组合物可以散装、作为单次单位剂量和/或作为多个单次单位剂量制备、包装和/或出售。如本文所使用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分(例如纳米 颗粒组合物)的药物组合物的离散量。活性成分的量一般等于将被施用于受试者的活性成 分的剂量和/或此类剂量的便利部分，例如此类剂量的一半或三分之一。 [0335] 药物组合物可制备成适合多种施用途径和方法的多种形式。举例来说，药物组合物可制备成液体剂型(例如乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂)、可注射形 式、固体剂型(例如胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂)、用于局部和/或经皮施用的剂型(例如 软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和贴片)、悬浮液、粉剂和其他形式。 [0336] 经口和肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性成分外，液体剂型还可包含此项技术中常用的 惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、 苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3‑丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其为棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸 酯，以及其混合物。除情性稀释剂外，口服组合物还可包含额外治疗剂和/或预防剂、额外 剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或加香剂。在供肠胃外施用的某些实 施方案中，将组合物与增溶剂混合，所述增溶剂例如为CremophorTM、醇、油、改性油、二醇、 聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合。 [0337] 可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液，可根据已知技术，使用适合分散剂、润湿剂和/或助悬剂来配制。无菌可注射制剂可为在无毒肠胃外可接受的稀释剂和/或 溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如在1，3‑丁二醇中的溶液。可以使用的可 接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、USP和等张氯化钠溶液。无 菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成 甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。 [0339] 本公开的特征在于向哺乳动物细胞或器官递送治疗剂和/或预防剂，在哺乳动物细胞中产生感兴趣多肽，以及治疗有需要的哺乳动物的疾病或病症的方法，所述方法包括 向哺乳动物施用包含治疗剂和/或预防剂的纳米颗粒组合物和/或使哺乳动物细胞与所述 纳米颗粒组合物接触。 [0340] 药物用途 [0341] 根据本公开，其还涉及上述脂质纳米颗粒或药物组合物作为药物的用途。在替代性实施例中，本发明涉及该药物组合物或脂质纳米颗粒在制备药物中的用途。特别地，所述 药物用于治疗性或预防性地提高有需要的受试者的免疫应答。 [0342] 在优选的实施例中，该药物用于预防或治疗癌症或肿瘤疾病、传染病、过敏症或自身免疫性疾病或与其相关的病症。 [0343] 特别地，该药物是疫苗。在优选的实施例中，该药物是肿瘤、流感或狂犬病疫苗。在优选的实施例中，该药物是用于狂犬病治疗的狂犬病疫苗。 [0344] 特别地，该受试者是脊椎动物，优选哺乳动物。在优选的实施例中，该受试者是鸟，优选鸡，或哺乳动物，该哺乳动物优选地选自包括山羊、牛、猪、狗、猫、驴、猴、猿，诸如小鼠、仓鼠、兔子的啮齿类动物，特别是人的组。 [0345] 特别地，该药物用于肠胃外施用，并且其中肠胃外施用包括注射。 [0346] 在优选的实施例中，所述注射选自包括经粘膜注射、皮内注射、静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射的组。 [0348] 实施例 [0349] 本节中的实施例仅作为示例提供，而不是作为限制。 [0350] 实施例1：溴代物的合成 [0351] 1.8‑溴辛酸己酯的合成 [0352] [0353] 己烷‑1‑醇(5.50g,52.7mmol)溶于二氯甲烷二氯甲烷(60mL)中，分别加入8‑溴辛酸(6.00g,26.4mmol)，4‑二甲氨基吡啶(657mg,5.27mmol)和碳二亚胺(4.18g,26.4mmol)， 反应在25度搅拌过夜。TLC监测反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(乙酸乙酯/正己烷 ＝0‑5％)得到8‑溴辛酸己酯(5.18g,16.9mmol,64.0％)为无色液体。 [0354] 2.8‑溴辛酸庚‑3‑基酯的合成 [0355] [0356] 庚‑3‑醇(6.25g,52.7mmol)溶于二氯甲烷二氯甲烷(60mL)中，分别加入8‑溴辛酸(6.00g,26.4mmol)，4‑二甲氨基吡啶(657mg,5.27mmol)和碳二亚胺(4.18g,26.4mmol)，反 应在25度搅拌过夜。TLC监测反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(乙酸乙酯/正己烷＝ 0‑5％)得到8‑溴辛酸庚‑3‑基酯(5.73g,17.8mmol,67.6％)为无色液体。 [0357] 3.(1R，3aS，3bS，7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊烷[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯的合成 [0358] [0359] 8‑溴辛酸(3.35g,14.7mmol)与胆固醇(5.75g,14.7mmol)溶于二氯甲烷二氯甲烷(30mL)中，加入4‑二甲氨基吡啶(360mg,2.89mmol)和碳二亚胺(3.46g,22.1mmol)，反应在 25度搅拌过夜。TLC监测反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(乙酸乙酯/正己烷＝0‑ 5％)得到(1R，3aS，3bS，7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2, 3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊烷[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(3.48g,5.88mmol,40.0％)为白色固体。 [0360] 4.(1S，3aR，7S，9aR，9bR，11aS)‑1‑[(2R，3E，5S)‑5,6‑二甲基庚‑3‑烯‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，6,7,8,9,9a，9b，10,11,11‑十氢‑1H‑环戊并[1，2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯的合成 [0361] [0362] 8‑溴辛酸(1.00mg,4.39mmol)与麦角固醇(1.80g,4.39mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入4‑二甲氨基吡啶(108mg,0.878mmol)和碳二亚胺(1.03g,6.59mmol)，反应在25度搅 拌过夜。TLC监测反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(乙酸乙酯/正己烷＝0‑5％)得到 (1S，3aR，7S，9aR，9bR，11aS)‑1‑[(2R，3E，5S)‑5,6‑二甲基庚‑3‑烯‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑ 2,3a，6,7,8,9,9a，9b，10,11,11‑十氢‑1H‑环戊并[1，2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(970mg, 1.61mmol,36.7％)为白色固体。 [0363] 5.(1R，3aS，3bS，7S，9aR，9bS，11aR)‑1‑[(2R，5R)‑5‑乙基‑6‑甲基庚‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11,11‑四氢‑1H‑环戊[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯的合成 [0364] [0365] 8‑溴辛酸(1.00g,4.39mmol)与β‑谷甾醇(1.92g,4.39mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入4‑二甲氨基吡啶(108mg,0.878mmol)和碳二亚胺(1.03g,6.59mmol)，反应在25度搅 拌过夜。TLC监测反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(乙酸乙酯/正己烷＝0‑5％)得到 (1R，3aS，3bS，7S，9aR，9bS，11aR)‑1‑[(2R，5R)‑5‑乙基‑6‑甲基庚‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑ 2,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11,11‑四氢‑1H‑环戊[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯 (1.28g,2.06mmol,47.1％)为白色固体。 [0366] 实施例2：乙醇胺中间体的合成 [0367] 1.8‑[(2‑羟乙基)氨基]辛酸己基酯的合成 [0368] [0369] 8‑溴辛酸己酯(1.00g,3.25mmol)溶于乙腈乙腈(10mL)中，分别加入乙醇胺(264mg,4.23mmol)，碳酸钾(450mg,3.25mmol)和碘化钾(55.2mg,0.325mmol)，反应在油浴 加热80度搅拌过夜。TLC监测反应，反应液过滤，滤液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二 氯甲烷＝ [0370] 0％‑15％)，得到8‑[(2‑羟乙基)氨基]辛酸己基酯(280mg,0.974mmol,29.9％)为无色油状液体。 [0371] 2.8‑[(2‑羟乙基)氨基]辛酸庚‑3‑基酯的合成 [0372] [0373] 8‑溴辛酸庚‑3‑基酯(1.00g,3.11mmol)溶于乙腈(10mL)中，分别加入乙醇胺(252mg,4.05mmol)，碳酸钾(439mg,3.11mmol)和碘化钾(52.7mg,0.311mmol)，反应在油浴 加热80度搅拌过夜。TLC监测反应，反应液过滤，滤液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二 氯甲烷＝ [0374] 0％‑15％)，得到8‑[(2‑羟乙基)氨基]辛酸庚‑3‑基酯(270mg,0.896mmol,28.7％)为无色油状液体。 [0375] 实施例3：胆固醇系列可电离脂质的合成 [0376] 1.(1R，3aS，3bS，7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(9‑己基‑22羟基‑10‑氧代‑18‑氮杂‑11‑恶多糖‑18‑基)辛酸酯的合成 [0377] [0378] (1R，3aS，3bS，7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊烷[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(400mg,676μmol)中分别加入乙醇(3mL),6‑[(4‑羟基丁基)氨基]2‑己基癸酸己酯(292mg, 676μmol)和N,N‑二异丙基乙胺(176mg,1.35mmol)，反应在油浴加热65度搅拌过夜。TLC监测 反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷＝0％‑4％)，得到(1R，3aS，3bS， 7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a， 9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(9‑己基‑22羟基‑10‑氧代‑18‑氮杂‑11‑恶多糖‑18‑基)辛酸酯为无色油状液体。(图1) [0379] 2.(1R，3aS，3bS，7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(21‑羟基‑9‑辛基‑11‑氧代‑19‑氮杂‑10‑苯十九基)辛酸酯的合成 [0380] [0381] (1R，3aS，3bS，7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊烷[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(200mg,338μmol)中分别加入乙醇(3mL)，十八烷‑9‑基8‑[(2‑羟乙基)氨基]辛酸酯(151mg, 338μmol)和N,N‑二异丙基乙胺(88.2mg,676μmol)，反应在油浴加热65度搅拌过夜。TLC监测 反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷＝0％‑4％)，得到(1R，3aS，3bS， 7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a， 9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(21‑羟基‑9‑辛基‑11‑氧代‑19‑氮杂‑10‑苯十九基)辛酸酯为无色油状液体。(图2) [0382] 3.(1R，3aS，3bS，7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(1‑羟基‑9‑氧代‑3‑氮杂‑10‑苯甲酸‑3‑基)辛酸酯的合成 [0383] [0384] (1R，3aS，3bS，7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊烷[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(200mg,338μmol)中分别加入乙醇(3mL)，6‑[(2‑羟乙基)氨基]己酸十一烷基酯(118mg,338 μmol)和N,N‑二异丙基乙胺(88.2mg,676μmol)，反应在油浴加热65度搅拌过夜。TLC监测反 应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷＝0％‑4％)，得到(1R，3aS，3bS，7R， 9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b， 10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊烷[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯为无色油状液体。(图3) [0385] 4.(1R，3aS，3bS，7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(18‑羟基‑8‑氧代‑16‑氮杂‑7‑氧十八碳十六烷基)辛酸酯的合成 [0386] [0387] (1R,3aS,3bS,7R,9aS,9bR,11aR)‑9a,11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a,3b,4,6,7,8,9,9a,9b,10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯 (200mg,338μmol)中分别加入乙醇(3mL)，8‑[(2‑羟乙基)氨基]辛酸己酯(97.2mg,338μmol) 和N,N‑二异丙基乙胺(88.2mg,676μmol)，反应在油浴加热65度搅拌过夜。TLC监测反应，反 应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷＝0％‑10％)，得到(1R，3aS，3bS，7R，9aS， 9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10, 11,11‑四十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(18‑羟基‑8‑氧代‑16‑氮杂‑7‑氧十八碳十六烷基)辛酸酯(86.0mg,0.108mmol,31.9％)为无色油状液体。(图4) [0388] 5.(1R，3aS，3bS，7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(5‑乙基‑17‑羟基‑7‑氧代‑15‑氮杂‑6‑恶庚十五基)辛酸酯的合成 [0389] [0390] (1R，3aS，3bS，7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊烷[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(200mg,338μmol)中分别加入乙醇(3mL)，8‑[(2‑羟乙基)氨基]辛酸庚‑3‑基酯(102mg,338μ mol)和N,N‑二异丙基乙胺(88.2mg,676μmol)，反应在油浴加热65度搅拌过夜。TLC监测反 应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷＝0％‑10％)，得到(1R，3aS，3bS， 7R，9aS，9bR，11aR)‑9a，11a‑二甲基‑1‑[(2R)‑6‑甲基庚‑2‑基]‑2,3,3a，3b，4,6,7,8,9,9a， 9b，10,11,11a‑四十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(5‑乙基‑17‑羟基‑7‑氧代‑15‑氮杂‑6‑恶庚十五基)辛酸酯为无色油状液体。(图5) [0391] 实施例4：麦角固醇系列可电离脂质分子合成 [0392] 1.(1S，3aR，7S，9aR，9bR，11aS)‑1‑[(2R，3E，5S)‑5,6‑二甲基庚‑3‑烯‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，6,7,8,9,9a，9b，10,11,11‑十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(9‑己基‑22羟基‑10‑氧代‑18‑氮杂‑11‑恶docos‑18‑基)辛酸酯的合成 [0393] [0394] (1S，3aR，7S，9aR，9bR，11aS)‑1‑[(2R，3E，5S)‑5,6‑二甲基庚‑3‑烯‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，6,7,8,9,9a，9b，10,11,11‑十氢‑1H‑环戊并[1，2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(140mg,233μmol)中分别加入乙醇(3mL)，6‑[(4‑羟基丁基)氨基]2‑己基癸酸己酯 (100.51mg,233μmol)和N,N‑二异丙基乙胺(60.8mg,465μmol)，反应在油浴加热65度搅拌过 夜。TLC监测反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷＝0％‑10％)，得到 (1S，3aR，7S，9aR，9bR，11aS)‑1‑[(2R，3E，5S)‑5,6‑二甲基庚‑3‑烯‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑ 2,3a，6,7,8,9,9a，9b，10,11,11‑十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(9‑己基‑22羟基‑ 10‑氧代‑18‑氮杂‑11‑恶docos‑18‑基)辛酸酯(50.0mg,52.7μmol,22.7％)为白色固体。 [0395] (图6) [0396] 2.(1S，3aR，7S，9aR，9bR，11aS)‑1‑[(2R，3E，5S)‑5,6‑二甲基庚‑3‑烯‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，6,7,8,9,9a，9b，10,11,11‑十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(21‑羟基‑9‑辛基‑11‑氧代‑19‑氮杂‑10‑苯十九基)辛酸酯的合成 [0397] [0398] (1S，3aR，7S，9aR，9bR，11aS)‑1‑[(2R，3E，5S)‑5,6‑二甲基庚‑3‑烯‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，6,7,8,9,9a，9b，10,11,11‑十氢‑1H‑环戊并[1，2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(200mg,332μmol)中分别加入乙醇(3mL)，十八烷‑9‑基8‑[(2‑羟乙基)氨基]辛酸酯(148mg, 332μmol)和N,N‑二异丙基乙胺(86.8mg,665μmol)，反应在油浴加热65度搅拌过夜。TLC监测 反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷＝0％‑10％)，得到(1S，3aR，7S， 9aR，9bR，11aS)‑1‑[(2R，3E，5S)‑5,6‑二甲基庚‑3‑烯‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，6,7,8, 9,9a，9b，10,11,11‑十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(21‑羟基‑9‑辛基‑11‑氧代‑19‑氮杂‑10‑苯十九基)辛酸酯(115mg,0.119mmol,36.0％)为白色固体。 [0399] (图7) [0400] 3.(1S，3aR，7S，9aR，9bR，11aS)‑1‑[(2R，3E，5S)‑5,6‑二甲基庚‑3‑烯‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，6,7,8,9,9a，9b，10,11,11‑十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(1‑羟基‑9‑氧代‑3‑氮杂‑10‑羟基苯‑3‑基)辛酸酯的合成 [0401] [0402] (1S，3aR，7S，9aR，9bR，11aS)‑1‑[(2R，3E，5S)‑5,6‑二甲基庚‑3‑烯‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，6,7,8,9,9a，9b，10,11,11‑十氢‑1H‑环戊并[1，2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(200mg,332μmol)中分别加入乙醇(3mL)，6‑[(2‑羟乙基)氨基]己酸十一烷基酯(116mg,332 μmol)和N,N‑二异丙基乙胺(86.8mg,665μmol)，反应在油浴加热65度搅拌过夜。TLC监测反 应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷＝0％‑10％)，得到(1S，3aR，7S， 9aR，9bR，11aS)‑1‑[(2R，3E，5S)‑5,6‑二甲基庚‑3‑烯‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，6,7,8, 9,9a，9b，10,11,11‑十氢‑1H‑环戊二烯[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(1‑羟基‑9‑氧代‑3‑氮杂‑10‑羟基苯‑3‑基)辛酸酯(82.0mg,96.4μmol,29.0％)为白色固体。(图8) [0403] 实施例5：β‑谷甾醇系列可电离脂质分子合成 [0404] 1.(1R，3aS，3bS，7S，9aR，9bS，11aR)‑1‑[(2R，5R)‑5‑乙基‑6‑甲基庚‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11,11‑四氢‑1H‑环戊[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(1‑羟基‑9‑氧代‑3‑氮杂‑10‑羟基‑3‑基)辛酸酯的合成 [0405] [0406] (1R，3aS，3bS，7S，9aR，9bS，11aR)‑1‑[(2R，5R)‑5‑乙基‑6‑甲基庚‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11,11‑四氢‑1H‑环戊[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(200mg,323μmol)中分别加入乙醇(3mL)，6‑[(2‑羟乙基)氨基]己酸十一烷基酯(112mg,323μmol)和N,N‑二异丙基乙胺(84.3mg,645μmol)，反应在油浴加热65度搅拌过夜。TLC监测 反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷＝0％‑10％)，得到(1R，3aS，3bS， 7S，9aR，9bS，11aR)‑1‑[(2R，5R)‑5‑乙基‑6‑甲基庚‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，3b，4,6, 7,8,9,9a，9b，10,11,11,11‑四氢‑1H‑环戊[1,2‑i]菲‑7‑基8‑(1‑羟基‑9‑氧代‑3‑氮杂‑10‑羟基‑3‑基)辛酸酯(68.0mg,78.3μmol,24.3％)为无色油状液体。(图9) [0407] 2.(1R，3aS，3bS，7S，9aR，9bS，11aR)‑1‑[(2R，5R)‑5‑乙基‑6‑甲基庚‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11,11‑四十氢‑1H‑环戊[1，2‑i]菲‑7‑基8‑(9‑己基‑22羟基‑10‑氧代‑18‑氮杂‑11‑恶docos‑18‑基)辛酸酯的合成 [0408] [0409] (1R，3aS，3bS，7S，9aR，9bS，11aR)‑1‑[(2R，5R)‑5‑乙基‑6‑甲基庚‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11,11‑四氢‑1H‑环戊[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(150mg,242μmol)中分别加入乙醇(3mL)，6‑[(4‑羟基丁基)氨基]2‑己基癸酸己酯(104mg,242μmol)和N，N‑二异丙基乙胺(63.2mg,484μmol)，反应在油浴加热65度搅拌过夜。 TLC监测反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷＝0％‑10％)，得到(1R， 3aS，3bS，7S，9aR，9bS，11aR)‑1‑[(2R，5R)‑5‑乙基‑6‑甲基庚‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a， 3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11,11‑四十氢‑1H‑环戊[1，2‑i]菲‑7‑基8‑(9‑己基‑22羟基‑ 10‑氧代‑18‑氮杂‑11‑恶docos‑18‑基)辛酸酯(82.0mg,84.8μmol,35.0％)为无色油状液 体。(图10) [0410] 3.(1R，3aS，3bS，7S，9aR，9bS，11aR)‑1‑[(2R，5R)‑5‑乙基‑6‑甲基庚‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11,11‑四十氢‑1H‑环戊[1，2‑i]菲‑7‑基8‑(21‑羟基‑9‑辛基‑11‑氧代‑19‑氮杂‑10‑苯十九基)辛酸酯的合成 [0411] [0412] (1R，3aS，3bS，7S，9aR，9bS，11aR)‑1‑[(2R，5R)‑5‑乙基‑6‑甲基庚‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a，3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11,11‑四氢‑1H‑环戊[1,2‑i]菲‑7‑基8‑溴辛酸酯(200mg,323μmol)中分别加入乙醇(3mL)，十八烷‑9‑基8‑[(2‑羟乙基)氨基]辛酸酯(144mg,323μmol)和N，N‑二异丙基乙胺(84.3mg,645μmol)，反应在油浴加热65度搅拌过夜。 TLC监测反应，反应液浓缩，加入硅胶，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷＝0％‑10％)，得到(1R， 3aS，3bS，7S，9aR，9bS，11aR)‑1‑[(2R，5R)‑5‑乙基‑6‑甲基庚‑2‑基]‑9a，11a‑二甲基‑2,3a， 3b，4,6,7,8,9,9a，9b，10,11,11,11‑四十氢‑1H‑环戊[1，2‑i]菲‑7‑基8‑(21‑羟基‑9‑辛基‑ 11‑氧代‑19‑氮杂‑10‑苯十九基)辛酸酯(98.0mg,99.9μmol,31.0％)为无色油状液体。(图 11) [0413] 实施例6：LNP的制备 [0414] 合成新型载体LNP的配方比例(摩尔比％)为：可离子化脂质分子/DSPC/胆固醇(Chol)/DMG‑PEG2000＝49/10/39.5/1.5(mol％)。制备包封Luciferase mRNA的新型载体 LNP，具体过程如下： [0415] 1.准备各脂质组分工作液 [0416] (1)配制各脂质组分母液：可电离脂质分子：50mg/mL，DSPC：20mg/mL，胆固醇(Chol)：20mg/mL，DMG‑PEG2000：20mg/mL。 [0417] (2)根据上述(1)的浓度，用无水乙醇充分溶解各脂质组分。将可离子化脂质分子、DSPC、胆固醇(Chol)、DMG‑PEG2000置于40℃的超声波清洗器中超声溶解20分钟。可离子化 脂质分子可根据其在乙醇中的溶解度降低母液浓度。 [0418] (3)按照合成新型载体LNP的配方比例：可电离脂质1‑9按照可电离脂质/DSPC/胆固醇/DMG‑PEG2000的摩尔比例为49％/10％/39.5％/1.5％的配方进行luciferase mRNA的 包封，加入各脂质组分的母液并混合均匀，剩余体积用无水乙醇补足并充分混合，作为各脂 质组分的工作液，MC3按照MC3/DSPC/胆固醇/DMG‑PEG2000的摩尔比例为50％/10％/ 38.5％/1.5％的配方进行luciferase mRNA的包封。 [0419] 2.稀释Luciferase mRNA溶液 [0420] 将mRNA溶液用50mM柠檬酸盐缓冲液pH4.0稀释至0.2mg/mL。 [0421] 3.通过微流控制备LNP [0422] 用迈安纳微流控设备和迈安纳的微流控芯片制备LNP。用无水乙醇和无酶水清洁微流控芯片通道并排空，用注射器吸取1mL的各脂质组分的工作液装入设备左侧，用注射器 吸取3mL的mRNA溶液装入设备右侧。微流控设备软件参数设置：总体积为4.000mL，总流速为 12mL/min，左右侧流速比为1：3，初始废液体积为0.500mL，结束废液体积为0.100mL。按设定 的参数重复几次，收集所有的产物LNP溶液，并加入DPBS溶液进行稀释，降低溶液中乙醇比 例。 [0423] 4.通过切向流过滤(TFF)纯化LNP [0424] 用瑞普利金KR2i TFF系统和中空纤维柱进行换液，先将LNP溶液浓缩至大约0.5mg/mL，再用DPBS进行超滤换液，换液体积8‑10DV，除去LNP溶液中的乙醇成分，使LNP分 散在DPBS中，再将LNP溶液浓缩至大约0.67mg/mL，收集LNP溶液，加入1.2M蔗糖溶液，最终蔗 糖浓度为0.3M。LNP样品于‑80℃保存。按照Ribogreen试剂盒说明，测试计算产品的包封率； 于马尔文公司的Zetasizer nano仪器上使用标准检测方法进行粒径与多分散系数(PDI)检 测、Zeta电位分析其包封效率大部分均高于96％，且粒径范围在70～110nm，电位在‑8mV～ 0mV之间，PDI在0.004～0.2之间。(表2) [0425] 表2 LNP的理化检测结果 [0426] 可电离脂质编号 粒径(nm) 电位(mV) PDI 包封率(％)1 98.94 ‑4.32 0.053 97.55 2 101.30 ‑1.75 0.006 98.74 3 77.55 ‑4.25 0.167 73.69 4 81.13 ‑2.20 0.053 97.72 5 93.13 ‑7.64 0.018 96.49 6 105.90 ‑3.24 0.014 97.37 7 94.49 ‑2.66 0.004 98.65 8 74.45 ‑0.25 0.059 99.02 9 69.85 ‑0.83 0.048 99.34 10(MC3) 101.6 ‑4.13 0.007 96.80 [0427] 实施例7：体外验证LNP递送载体的性能 [0428] 1.LNP的制备 [0429] 新型可电离脂质在微流控的条件下制备包封有Luci‑mRNA的LNP制剂，其组分为可电离脂质、中性磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质缀合物。可离子化脂质分子/DMG‑PEG2000/ DSPC/胆固醇(Chol)＝40‑49/1.0‑1.5/10.0‑11.8/38.5‑47.2(mol％)加入各脂质组分的母 液并混合均匀，Acuitas的制剂配方组成作为阳性对照。(表3) [0430] 表3用可电离脂质制备的LNP制剂配方为(摩尔比例，mol％) [0431] 编号 可电离脂质 DSPC 胆固醇 DMG‑PEG2k1 40.0 11.8 47.2 1.0 2 42.0 10.0 46.5 1.5 3 44.0 10.0 44.5 1.5 4 46.0 10.0 42.5 1.5 5 49.0 10.0 39.5 1.5 [0432] 2.细胞实验 [0433] 将包裹有Luci‑mRNA的LNP制剂与293T细胞共培养24h，使用酶标仪检测细胞内荧光素酶表达水平。 [0434] (1)细胞复苏与传达：将293T细胞复苏，于培养瓶中培养传达至所需的细胞数目。 [0435] (2)铺板：将培养瓶中的细胞消化计数，以每孔2.5万个细胞铺在96孔板中，过夜培养至细胞贴壁。 [0436] (3)加样：将96孔板中的培养基吸干，加入DPBS清洗一遍后，吸干培养基中的液体，向孔中加入40ng的LNP制剂以及100ul的培养基，于培养箱中培养24小时。 [0437] (4)24小时后，吸去孔中的培养基，加入100ul的DPBS以及100ul的检测试剂，避光室温孵育3min后在酶标仪上进行检测。 [0439] 实施例8：动物实验检测LNP递送载体的性能 [0440] 1、LNP的制备 [0441] 新型可电离脂质在微流控的条件下制备的可高效包封mRNA分子的LNP制剂，其组分为可电离脂质、中性磷脂、甾族脂质和聚乙二醇脂质缀合物。可离子化脂质分子/DMG‑ PEG2000/DSPC/胆固醇(Chol)＝40‑49/1.0‑1.5/10.0‑11.8/38.5‑47.2(mol％)加入各脂质 组分的母液并混合均匀，MC3作为阳性对照。(表4) [0442] 表4用可电离脂质制备的LNP制剂配方为(摩尔比例，mol％) [0443]编号 可电离脂质 DSPC 胆固醇 DMG‑PEG2k 1 40.0 11.8 47.2 1.0 2 42.0 10.0 46.5 1.5 3 44.0 10.0 44.5 1.5 4 46.0 10.0 42.5 1.5 5 49.0 10.0 39.5 1.5 6(MC3) 50.0 10.0 38.5 1.5 [0444] 2、小鼠肌肉注射LNP [0445] 雌性Balb/c小鼠(6‑8week，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司)，饲养在22±2℃以及相对湿度为45％～75％的实验条件下，使用编码荧光素酶的mRNA作为报告基因 (luciferase mRNA)，荧光素酶催化荧光素产生生物发光，通过检测单位时间内(15min)生 物荧光强度，反应LNP的转染效率。以荧光素酶mRNA为例，获得mRNA‑LNP样品1‑5，将现有商 业化可得的化合物MC3包luciferase mRNA制备的6作为对比样品，以5ug/只mRNA的剂量给 药到小鼠左腿肌肉处，取特定时间点(6h、24h)于小鼠腹腔注射荧光素钠盐(15mg/mL， 200uL)，15min后，将小鼠置于小动物活体成像仪测定荧光强度。 [0446] (1)将小鼠随机分组，每组3只，每组小鼠的体重差异不超过20％，对小鼠进行编号； [0447] (2)供试品溶液配置：从‑80℃冰箱中取出供试品后至于低温保存箱中，带至动物房中。取出供试品室温融化30min，将制剂样品在涡旋混匀仪上混匀30s，使用移液器按照供 试品表单配置各组供试液； [0448] (3)将供试品分别吸入注射器中，排除注射器内空气后，保持注射器内液体体积为100uL，然后将注射器盖好保护套放置于冰上备用； [0450] (5)一只手抓住小鼠尾巴，另一只手用拇指和食指抓住鼠耳和颈部皮肤，将小鼠抓在掌心后，将小鼠的尾巴和右后腿固定在无名指和小拇指间，并用无名指将小鼠的左后腿 固定住，使得小鼠的左后腿肌肉暴露在掌心； [0451] (6)另一只手用酒精棉片擦拭小腿腿部肌肉处，然后将注射器与半健肌呈60°‑90°角迅速插入1/4，回抽无回流物后，注入各组供试品。 [0452] (7)将注射器拔出，扔进利器盒中，将小鼠放回笼子内，并对下一只小鼠重复操作；全部注射完后，将笼子放回饲养架上； [0453] (8)使用75％的酒精溶液喷洒工作台面，清洁消毒，并将垃圾扔入医疗废物垃圾袋中； [0455] 3、小鼠活体成像 [0456] 15mg/mL D‑luciferin荧光素钠盐配制：取1g D‑luciferin荧光素钠盐溶于67mL PBS中，用0.22um滤膜过滤后保存备用； [0457] (1)将15mg/mL D‑luciferin荧光素钠盐分别吸入注射器中，排除注射器内空气后，保持注射器内液体体积为200uL，然后将注射器盖好保护套放置于冰上备用； [0459] (3)一只手抓住小鼠尾巴，另一只手用拇指和食指抓住鼠耳和颈部皮肤，将小鼠抓在掌心，使小鼠头部向下，腹部向上； [0460] (4)另一只手用酒精棉片擦拭小鼠腹部，然后将注射器与小鼠腹部呈60°‑90°角迅速插入1/4，回抽无回流物后，将D‑luciferin荧光素钠盐注入各组小鼠腹腔内； [0461] (5)将小鼠放回笼盒，10min后，将小鼠置于含有异氟烷的麻醉箱中麻醉，麻醉3min后，将各组麻醉完毕后的小鼠放置在小动物多功能成像仪的暗箱平台上，侧位放置，保持小 鼠左侧腿部肌肉朝上，便于观察小鼠左腿肌肉的生物发光信号强度； [0462] (6)调节电脑端仪器界面，设置参数组别信息，在D‑luciferin荧光素钠盐注射时间达15min后立即拍照并保存实验数据。 [0463] 表5小动物荧光成像结果 [0464] [0465] 从表中的结果可以看到用可电离脂质1制备的5种配方的携载Luciferase mRNA的LNP的体内转染效果均显著高于MC3。(表5) [0466] 表6注射LNP制剂后小鼠体重变化率为 [0467] 编号 D0(％) D1(％) D2(％)1 0 0.25±3.36 2.63±4.73 2 0 ‑2.16±2.60 ‑1.35±1.92 3 0 ‑0.55±0.44 0.66±3.61 4 0 ‑3.79±0.80 ‑2.59±0.93 5 0 ‑1.20±1.09 ‑0.89±2.95 6(MC3) 0 ‑4.96±0.89 ‑5.20±1.60 [0468] 从表中数据可以看到在注射化合物1制备的不同配方的LNP后，小鼠在两天内(D1、D2)体重的变化率均小于MC3分子，说明该类可电离脂质具有较好的生物安全性。(表6) [0469] 上述实验结果表明，本公开提供了通过全新结构的可电离脂质化合物制备得到的mRNA‑LNP体内mRNA转染效率高，显著优于商业化的可电离脂质分子DLin‑MC3‑DMA(MC3)；生 物安全性高，毒副低于市场主流的LNP；合成所需原料易得、反应条件温和、仪器设备要求 低、操作简单，适于大规模生产，取得明显的有益技术效果。 |
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