经标记核苷酸及其用途

申请号 CN201980003331.1 申请日 2019-02-13 公开(公告)号 CN111051324A 公开(公告)日 2020-04-21
申请人 伊鲁米纳公司; 发明人 J·曼德尔; S·巴纳德; J·穆恩; M·C·罗杰·巴西加卢波;
摘要 经标记核苷酸包含核苷酸,连接至所述核苷酸的 磷酸 基团的连接分子,和连接至所述连接分子的 氧 化还原活性电荷标签。所述氧化还原活性电荷标签当保持在导电通道的感测区附近时,将被所述导电通道氧化或还原。
权利要求

1.一种经标记核苷酸,其包含:
核苷酸;
连接至所述核苷酸的磷酸基团的连接分子;和
连接至所述连接分子的化还原活性电荷标签,所述氧化还原活性电荷标签当保持在导电通道的感测区附近时,将被所述导电通道氧化或还原。
2.权利要求1所述的经标记核苷酸,其中所述氧化还原活性电荷标签包含将进行氧化还原反应的配位金属原子
3.权利要求1或2所述的经标记核苷酸,其中所述连接分子包含连接至所述氧化还原活性电荷标签的特异性区域。
4.权利要求3所述的经标记核苷酸,其中所述特异性区域与与所述导电通道结合的系链上的受体区域相互作用,并且所述特异性区域包含亲和标签。
5.权利要求4所述的经标记核苷酸,其中所述特异性区域与与所述导电通道结合的系链上的受体区域杂交,并且所述亲和标签包含核苷酸序列或肽核酸序列,所述核苷酸序列包含约一个核苷酸至约十个核苷酸,所述肽核酸序列包含约一个肽核酸至约十个肽核酸。
6.权利要求1-5中任一项所述的经标记核苷酸,其中:
所述氧化还原活性电荷标签包含非氧化或非还原状态的10电荷或更少;和所述氧化还原活性电荷标签包含氧化或还原状态的约1电荷至约100电荷。
7.一种方法,其包括:
将模板核酸引入具有系接至其的聚合酶的导电通道;
将经标记核苷酸引入所述导电通道,所述经标记核苷酸中的至少一个包含核苷酸和连接至其的核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签,由此所述经标记核苷酸中的一个与所述聚合酶相关联;
当所述经标记核苷酸中的一个被关联时,启动所述核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签与所述导电通道之间的氧化还原反应,以改变所述核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签的电荷状态;和
响应于所述氧化还原反应,检测所述导电通道的响应。
8.权利要求7所述的方法,其中:
启动所述氧化还原反应包括向所述导电通道施加充电电压;和
检测所述响应包括向所述导电通道施加读取电压。
9.权利要求7或8所述的方法,其还包括:
使所述导电通道的所述响应与所述经标记核苷酸中的相关联的一个的所述核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签相关联;和
基于所述核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签,识别相关联的经标记核苷酸的所述核苷酸。
10.权利要求9所述的方法,其还包括从所述经标记核苷酸中的所述相关联的一个切割所述核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签,由此将所述相关联的经标记核苷酸的所述核苷酸掺入与所述模板核酸互补的新生链中。
11.权利要求10所述的方法,其中:
所述经标记核苷酸中的一个的关联,所述氧化还原反应的启动,所述检测,所述关联,和所述识别一起是测序循环;和
所述方法还包括:
通过以下进行下一个测序循环:
使所述经标记核苷酸中的下一个与所述聚合酶相关联;
在所述经标记核苷酸中的下一个被关联时,启动其他核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签和所述导电通道之间的其它氧化还原反应,以改变所述其它核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签的电荷状态;
响应于所述其它氧化还原反应,检测所述导电通道的其他响应;
使所述导电通道的所述其他响应与所述其它核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签相关联;和
基于所述其他核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签,识别所述经标记核苷酸中的所述下一个的所述核苷酸。
12.权利要求11所述的方法,其还包括:
切割所述其他核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签,由此将所述经标记核苷酸中的所述下一个的所述核苷酸掺入与所述模板核酸互补的新生链中;和
重复所述测序循环。
13.权利要求7-12中任一项所述的方法,其中所述氧化还原活性电荷标签包含将进行氧化还原反应的配位金属原子。
14.权利要求7-13中任一项所述的方法,其中:
所述氧化还原活性电荷标签包含非氧化或非还原状态的10电荷或更少;和所述氧化还原活性电荷标签包含改变的电荷状态的约1电荷至约100电荷。
15.权利要求7-14中任一项所述的方法,其中:
所述经标记核苷酸包括:
第一经标记核苷酸,其包含作为所述核苷酸的脱氧腺苷多磷酸和第一核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签;
第二经标记核苷酸,其包含作为所述核苷酸的脱氧苷多磷酸和第二核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签;
第三经标记核苷酸,其包含作为所述核苷酸的脱氧胞苷多磷酸和第三核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签;和
第四经标记核苷酸,其包含作为所述核苷酸的脱氧胸苷多磷酸和第四特定核苷酸氧化还原活性电荷标签;和
所述第一、第二、第三和第四核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签彼此不同。
16.权利要求15所述的方法,其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签中的两个以改变的电荷状态带正电,并且其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签中的其他两个以改变的电荷状态带负电。
17.权利要求7-16中任一项所述的方法,其中所述经标记核苷酸存在于低盐缓冲液中。
18.权利要求7-17中任一项所述的方法,其中所述导电通道是场效应晶体管的通道。
19.一种试剂盒,其包括:
流动池,其包括:
具有连接至其的系链的导电通道;和
经由所述系链连接至所述导电通道的聚合酶;将被引入所述流动池中的模板核酸;将被引入所述流动池中的试剂,所述试剂包含经标记核苷酸,所述经标记核苷酸中的至少一个包含:
核苷酸;
连接至所述核苷酸的磷酸基团的连接分子;和
连接至所述连接分子的氧化还原活性电荷标签,所述氧化还原活性电荷标签当保持在所述导电通道的感测区附近时,将被所述导电通道氧化或还原;和
当所述氧化还原活性电荷标签与所述导电通道之间发生氧化还原反应时,检测来自所述导电通道的响应的检测器。
20.权利要求19所述的试剂盒,其中所述氧化还原活性电荷标签选自二茂,四苯并卟啉锌,酞菁钴,三-(2,2'-联嘧啶)钌,4-二茂铁苄基醇,5-(4-羟甲基苯基)-10,15,20-三甲苯基卟啉锌(II),和氧化还原活性杯芳
21.权利要求19或20所述的试剂盒,其中:
所述氧化还原活性电荷标签包含非氧化或非还原状态的10电荷或更少;和所述氧化还原活性电荷标签包含氧化或还原状态的约1电荷至约100电荷。
22.权利要求19-21中任一项所述的试剂盒,其中所述导电通道是场效应晶体管的通道。

说明书全文

经标记核苷酸及其用途

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2018年2月16日提交的美国临时申请序列号62/710,465的权益,其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

[0003] 生物或化学研究中的各种方案涉及在局部支持表面上或在预定反应室内进行大量受控反应。然后可以观察或检测到指定的反应,后续分析可以帮助识别或揭示反应中涉及的化学物质的性质。在一些实例中,受控反应产生荧光,因此光学系统可用于检测。在其他实例中,受控反应改变电荷、电导率或一些其他电性质,因此电子系统可以用于检测。发明内容
[0004] 本文公开的第一方面是经标记核苷酸。数字1-6涉及该第一方面。
[0005] 1.在一个实例中,所述经标记核苷酸包含:核苷酸;连接至所述核苷酸的磷酸基团的连接分子;和连接至所述连接分子的化还原活性电荷标签,所述氧化还原活性电荷标签当保持在导电通道的感测区附近时,将被所述导电通道氧化或还原。
[0006] 2.在所述经标记核苷酸的实例(1)中,所述氧化还原活性电荷标签包含将进行氧化还原反应的配位金属原子
[0007] 3.在所述经标记核苷酸的实例(1)或(2)中,所述连接分子包含连接至所述氧化还原活性电荷标签的特异性区域。
[0008] 4.在实例(3)中,所述特异性区域与与所述导电通道结合的系链上的受体区域相互作用,并且所述特异性区域包含亲和标签。
[0009] 5.在实例(4)中,所述特异性区域与与所述导电通道结合的系链上的受体区域杂交,并且所述亲和标签包含核苷酸序列或肽核酸序列,所述核苷酸序列包含约一个核苷酸至约十个核苷酸,所述肽核酸序列包含约一个肽核酸至约十个肽核酸。
[0010] 6.在所述经标记核苷酸的实例(1)至(5)中任一项中,所述氧化还原活性电荷标签包含非氧化或非还原状态的10电荷或更少;和所述氧化还原活性电荷标签包含氧化或还原状态的约1电荷至约100电荷。
[0011] 应理解,本文公开的经标记核苷酸的任何特征,包括实例(1)-(6),可以以任何期望的方式和/或构型组合在一起。
[0012] 本文公开的第二方面是一种方法。数字7-18涉及该第二方面。
[0013] 7.在一个实例中,所述方法包括:将模板核酸引入具有系接至其的聚合酶的导电通道;将经标记核苷酸引入所述导电通道,所述经标记核苷酸中的至少一个包含核苷酸和连接至其的核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签,由此所述经标记核苷酸中的一个与所述聚合酶相关联;而当所述经标记核苷酸中的一个被关联时,启动所述核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签与所述导电通道之间的氧化还原反应,以改变所述核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签的电荷状态;和响应于所述氧化还原反应,检测所述导电通道的响应。
[0014] 8.在所述方法的实例(7)中,启动所述氧化还原反应包括向所述导电通道施加充电电压;和检测所述导电通道的响应包括向所述导电通道施加读取电压。
[0015] 9.所述方法(7)或(8)的实例还包括使所述导电通道的所述响应与所述经标记核苷酸中的相关联的一个的所述核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签相关联;和基于所述核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签,识别相关联的经标记核苷酸的所述核苷酸。
[0016] 10.实例(9)可还包括从所述经标记核苷酸中的所述相关联的一个切割所述核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签,由此将所述相关联的经标记核苷酸的所述核苷酸掺入与所述模板核酸互补的新生链中。
[0017] 11.在实例(10)中,所述经标记核苷酸中的一个的关联,所述氧化还原反应的启动,所述检测,所述关联,和所述识别一起是测序循环;和所述方法还包括通过以下进行下一个测序循环:使所述经标记核苷酸中的下一个与所述聚合酶相关联;而在所述经标记核苷酸中的下一个被关联时,启动另外的核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签和所述导电通道之间的另外的氧化还原反应,以改变所述其它核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签的电荷状态;响应于所述其它氧化还原反应,检测所述导电通道的另外的响应;使所述导电通道的所述其他响应与所述其它核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签相关联;和基于所述其他核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签,识别所述经标记核苷酸中的所述下一个的所述核苷酸。
[0018] 12.实例(11)可还包括切割所述经标记核苷酸中的所述下一个的所述其他核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签,由此将所述经标记核苷酸中的所述下一个的所述核苷酸掺入与所述模板核酸互补的新生链中;和重复所述测序循环。
[0019] 13.在所述方法的实例(7)至(12)中任一项中,所述氧化还原活性电荷标签包含将进行氧化还原反应的配位金属原子。
[0020] 14.在所述方法的实例(7)至(13)中任一项中,所述氧化还原活性电荷标签包含非氧化或非还原状态的10电荷或更少;和所述氧化还原活性电荷标签包含改变的电荷状态的约1电荷至约100电荷。
[0021] 15.在所述方法的实例(7)至(14)中任一项中,所述经标记核苷酸包括:第一经标记核苷酸,其包含作为所述核苷酸的脱氧腺苷多磷酸和第一核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签;第二经标记核苷酸,其包含作为所述核苷酸的脱氧苷多磷酸和第二核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签;第三经标记核苷酸,其包含作为所述核苷酸的脱氧胞苷多磷酸和第三核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签;和第四经标记核苷酸,其包含作为所述核苷酸的脱氧胸苷多磷酸和第四特定核苷酸氧化还原活性电荷标签;和所述第一、第二、第三和第四核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签彼此不同。
[0022] 16.在实例(15)中,所述第一、第二、第三和第四核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签中的两个以改变的电荷状态带正电,并且其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签中的另外两个以改变的电荷状态带负电。
[0023] 17.在所述方法的实例(7)至(16)中任一项中,所述经标记核苷酸存在于低盐缓冲液中。
[0024] 18.在所述方法的实例(7)至(17)中任一项中,所述导电通道是场效应晶体管的通道。
[0025] 应理解,所述方法的任何特征,包括实例(7)至(17),都可以以任何期望的方式组合在一起。此外,应理解,该方法的和/或所述经标记核苷酸的特征的任何组合可以一起使用,和/或与本文公开的任何实例组合。
[0026] 本文公开的第三方面是一种试剂盒。数字19-22与该第三方面有关。
[0027] 19.在一个实例中,所述试剂盒包括:流动池,其包括:具有连接至其的系链的导电通道;和经由所述系链连接至所述导电通道的聚合酶;将被引入所述流动池中的模板核酸;将被引入所述流动池中的试剂,所述试剂包含经标记核苷酸,所述经标记核苷酸中的至少一个包含:核苷酸;连接至所述核苷酸的磷酸基团的连接分子;和连接至所述连接分子的氧化还原活性电荷标签,所述氧化还原活性电荷标签当保持在所述导电通道的感测区附近时,将被所述导电通道氧化或还原;和当所述氧化还原活性电荷标签与所述导电通道之间发生氧化还原反应时,检测来自所述导电通道的响应的检测器。
[0028] 20.在所述试剂盒的实例(19)中,所述氧化还原活性电荷标签选自二茂,四苯并卟啉锌,酞菁钴,三-(2,2'-联嘧啶)钌,4-二茂铁苄基醇,5-(4-羟甲基苯基)-10,15,20-三甲苯基卟啉锌(II),和氧化还原活性杯芳
[0029] 21.在所述试剂盒的实例(19)或(20)中,所述氧化还原活性电荷标签包含非氧化或非还原状态的10电荷或更少;和所述氧化还原活性电荷标签包含氧化或还原状态的约1电荷至约100电荷。
[0030] 22.在所述试剂盒的实例(19)至(21)中任一项中,所述导电通道是场效应晶体管的通道。
[0031] 应理解,所述试剂盒的任何特征,包括实施方式(19)至(22),可以以任何期望的方式组合在一起。此外,应理解,该试剂盒的和/或所述方法的和/或所述经标记核苷酸的特征的任何组合可以一起使用,和/或与本文公开的任何实例组合。
[0032] 更进一步,应理解,任何所述经标记核苷酸的和/或任何所述方法的和/或任何所述试剂盒的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起,和/或可以与本文公开的任何实例组合。附图说明
[0033] 通过参考以下详细描述和附图,本公开的实例的特征将变得显而易见,在附图中,相似的附图标记对应于相似但可能不相同的组件。为了简洁起见,具有先前描述的功能的附图标记或特征可以或可以不与它们在其中出现的其它附图结合描述。
[0034] 图1是经标记核苷酸的实例的示意图;
[0035] 图2是本文公开的系统的实例的示意性局部透视图;
[0036] 图3是连接至电荷传感器的导电通道并与可基于电荷区分的经标记核苷酸相关联的聚合酶的示意图;
[0037] 图4是示意本文公开的方法的实例的流程图
[0038] 图5A是在测序方法中使用的经标记核苷酸的实例的示意图;和
[0039] 图5B是在本文公开的经标记核苷酸的实例的系链和特异性区域之间的相互作用的实例的示意图。

具体实施方式

[0040] 本文公开了经标记核苷酸,其可用于核酸测序程序中的单分子检测。用于单分子检测的传感器可以具有一个导电通道,该通道具有连接至其的一种聚合酶。这使得能够在每个个体传感器上一次检测一个掺入事件(即,通过聚合酶将基掺入新生链)。该经标记核苷酸提供了独特的检测方式,其通常可用于核酸测序以及核酸和其他分析物的检测。
[0041] 经标记核苷酸10的实例示意性地描绘于图1。如所示,经标记核苷酸10包含核苷酸12,连接至核苷酸12的磷酸基团16的连接分子14或14',和连接至连接分子14或14'的氧化还原活性电荷标签18,所述氧化还原活性电荷标签18当保持在导电通道32的感测区(附图标记31,图3)附近时将被导电通道(附图标记32,图2)氧化或还原。经标记核苷酸10可以被认为是非天然或合成核苷酸,因为它在结构或化学上与天然核苷酸不同。
[0042] 经标记核苷酸10的核苷酸12可以是天然核苷酸。天然核苷酸包括含氮杂环碱基20,糖22和一个或多个磷酸基团16。天然核苷酸的实例包括例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在核糖核苷酸中,糖22为核糖,而在脱氧核糖核苷酸中,糖22为脱氧核糖,即,缺少在核糖的2'位存在的羟基的糖。在一个实例中,核苷酸12为多磷酸酯形式,因为它包含多个磷酸基团16(例如,三磷酸(即,γ-磷酸),四磷酸,五磷酸,六磷酸等)。杂环碱基20(即,核碱基)可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),及其修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U),及其修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核酸类似物可以使磷酸主链、糖或核碱基中任一者改变。核酸类似物的实例包括例如通用碱基或磷酸-糖主链类似物,例如肽核酸(PNA)。
[0043] 经标记核苷酸10还包含连接分子14或14'。在一些实例中,连接分子(在图1中显示为14)不包含特异性区域24。在其他实例中,连接分子(在图1中显示为14')包含特异性区域24。如在图1中示意性地描绘,当特异性区域24是连接分子14'的一部分时,区域24可以位于与氧化还原活性电荷标签18化学键合的端部。下文将进一步描述特异性区域24。
[0044] 经标记核苷酸10的连接分子14或14'可以是任何长链分子,其可以在一端化学键合至核苷酸12的磷酸基团16,且可以在另一端化学键合至氧化还原活性电荷标签18。连接分子14或14'也可以被选择为使得其不与本文公开的系统30(参见图2)中使用的聚合酶26相互作用。连接分子14或14'被选择为使得其足够长以允许氧化还原活性电荷标签18位于导电通道32(图2)的感测区31(图3)内。例如,连接分子14或14'可包含烷基链,聚(乙二醇)链,酰胺基,磷酸基团,杂环如三唑,核苷酸,或其组合。烷基链的实例可包含至少6个原子,聚(乙二醇)链的实例可包含至少3个乙二醇单元。
[0045] 以下实例说明了经标记核苷酸10的实例,其中连接分子14、14'包含烷基链,酰胺基,聚(乙二醇)链,和三唑:
[0046]
[0047] 以下实例说明了经标记核苷酸10的另一个实例,其中连接分子14、14'包含烷基链,酰胺基,聚(乙二醇)链,三唑,和磷酸基团:
[0048]
[0049] 以下实例说明了经标记核苷酸10的另一个实例,其中连接分子14、14'包含烷基链,酰胺基,聚(乙二醇)链,三唑,和磷酸基团:
[0050]
[0051] 以下实例说明了经标记核苷酸10的另一个实例,其中连接分子14、14'包含烷基链,酰胺基,聚(乙二醇)链,三唑,磷酸基团,和多核苷酸链:
[0052]
[0053] 虽然已经描述了多个实例连接分子14、14',然而应理解,可以使用其他连接分子14、14'。
[0054] 如图1和先前的实例所示,一些经标记核苷酸10还可包含特异性区域24作为连接分子14'的一部分。特异性区域24能够与结合至导电通道32的系链28(图2)上的受体区域相互作用。特异性区域24可包含亲和标签,其可以暂时连接至系链28的受体区域。当经标记核苷酸10被聚合酶26保持时,亲和标签的结合亲和可以足够强以将特异性区域24结合至系链28上的受体区域,但也可以足够弱以在掺入事件后(例如,当聚合酶26天然切割α磷酸和连接分子14、14'之间或α磷酸和β磷酸之间的键时)从受体区域释放特异性区域24。换句话说,可以选择特异性区域24(例如,亲和标签)来往受体区域的结合和解离速率以改善整体单分子感测。例如,由于在核苷酸掺入之前特异性区域24和因此亲和标签的有效高浓度,亲和标签/受体区域相互作用的结合速率可以高。这种高结合速率增加了亲和标签与受体区域结合的时间的部分。切割后,还可以选择相互作用的解离速率为足够高,使复合物(亲和标签和受体区域之间)足够迅速地解离,使当下一个经标记核苷酸10进入聚合酶26活性位点时有低概率的结合状态(在之前掺入的核苷酸的亲和标签和受体区域之间)。
[0055] 在特定的实例中,特异性区域24将与系链28上的受体区域杂交,因此亲和标签可包含能够暂时连接至系链28(图2)上的受体区域的核苷酸序列或肽核酸序列。在一个实例中,亲和标签包含核苷酸序列,其包含约一个核苷酸至约十个核苷酸或约一个肽核酸至约十个肽核酸。在其他实例中,亲和标签包含至多六个核苷酸或肽核酸。在另一个实例中(如图5B中进一步示出和描述的),特异性区域24可以进一步包含在核苷酸序列的两侧侧翼的肌苷。在又一些实例中,亲和标签可以是非核酸部分,例如彼此具有亲和力或对疏聚合物具有亲和力的肽。特定蛋白质实例包含卷曲螺旋,这是蛋白质中的结构基序,其中2-7α-螺旋盘绕在一起,就像绳索的线。换句话说,卷曲螺旋是由两个或多个彼此缠绕以形成超螺旋的α-螺旋构成。卷曲螺旋的实例包含癌蛋白,例如c-Fos和c-jun。
[0056] 氧化还原活性电荷标签18可以是能够在被导电通道32氧化(失去电子)或还原(获得电子)时增加其电荷的任何电荷标签,例如当保持在导电通道32的感测区31附近时。在发生氧化还原反应之前,电荷标签18可以是净中性的(零电荷),或者接近该状态(10电荷或更少)。换句话说,在非氧化或非还原状态下,氧化还原活性电荷标签18携带10电荷或更少。由氧化还原活性电荷标签18携带的电荷不包括经标记核苷酸10的磷酸16的或连接分子14、14'的任何电荷。在发生氧化还原反应之后,氧化还原活性电荷标签18的总净电荷发生变化(即,它携带更多的正电荷或更多的负电荷)。在一个实例中,氧化还原活性电荷标签18包含在非氧化或非还原状态下的10电荷或更少,和氧化还原活性电荷标签18包含在氧化或还原状态下的约1电荷至约100电荷。应理解,在非氧化或非还原状态下的氧化还原活性电荷标签18的电荷数量低于在氧化或还原状态下的氧化还原活性电荷标签18的电荷数量。在另一实例中,氧化还原活性电荷标签18包含在非氧化或非还原状态下的10电荷或更少,和氧化还原活性电荷标签18包含在氧化或还原状态下的约20电荷至约50电荷。
[0057] 氧化还原活性电荷标签18可包含可以发生氧化还原反应的任何配位(即,保持在适当位置)金属原子。金属原子的实例包含铁,钴,钌,锌,,锂,等。作为一些具体实例,氧化还原活性电荷标签18选自二茂铁,四苯并卟啉锌,酞菁钴,三-(2,2'-联嘧啶)钌,4-二茂铁苄基醇,5-(4-羟甲基苯基)-10,15,20-三甲苯基卟啉锌(II),和氧化还原活性杯芳烃。
[0058] 二茂铁可以是任何包含式Fe(C5H5)2的有机金属化合物。一个具体实例是二茂铁树枝状大分子:
[0059]
[0060] 其中Fe2+可以在氧化后变成Fe3+,从而在每个“Fe”处引入正电荷。
[0061] 四苯并卟啉锌具有以下结构:
[0062]
[0063] 其中R=C2H5,C6H13或C12H25。Zn1+可以在氧化后变成Zn2+,从而引入正电荷。
[0064] 酞菁钴的实例包含:
[0065]
[0066] 两者在溶液中都是中性分子。在氧化后,Co2+变成Co3+,从而在每个“Co”处引入正电荷(例如,对于第一结构为一个正电荷,而对于第二结构为五个正电荷)。氧化态范围-3至+5内的其他含钴化合物是已知的,并且可用作可带负电的氧化还原活性电荷标签18或可带正电的氧化还原活性电荷标签18。
[0067] 三-(2,2'-联嘧啶)钌具有以下结构:
[0068]
[0069] 其中Ru2+可以在氧化后变成Ru3+,从而引入一个正电荷。
[0070] 4-二茂铁苄基醇具有以下结构:
[0071]
[0072] 其中Fe2+可以在氧化后变成Fe3+,从而引入一个正电荷。
[0073] 5-(4-羟甲基苯基)-10,15,20-三甲苯基卟啉锌(II)具有以下结构:
[0074]
[0075] 其中Zn2+可以在氧化后变成Zn1+,从而引入负电荷。
[0076] 氧化还原活性杯芳烃的一些实例包含:
[0077]
[0078] 每个先前描述的氧化还原反应是可逆的,因此化合物可以以其较高的氧化态使用并且可以当在导电通道的感测区31中时被还原,或者可以以其较低的氧化态使用并且可以当在导电通道的感测区31中时被氧化。
[0079] 如上所述,本文公开的氧化还原活性电荷标签18在溶液中可以是中性或接近中性的,并且直到其经历氧化还原反应时才携带较大的电荷。这样,溶液中的经标记核苷酸10不被认为是带高电荷的分子,并且带相反电荷的经标记核苷酸10(包含带相反电荷的近中性氧化还原活性电荷标签18)之间的团聚不太可能发生。
[0080] 经标记核苷酸10可以在试剂盒和/或系统30中使用(后者的一个实例在图2中示出)。试剂盒或系统30可包括导电通道32。导电通道32可以在容器内或容器的一部分内,所述容器例如是孔,管,通道,比色皿,培养皿,瓶等。合适的容器的另一个实例是流动池34。可以使用适合于本文所述的实施方式的任何流动池配置。一些实例流动池是可商购自Illumina,Inc.(San Diego,CA)的那些。在反应组分(例如,模板核酸,经标记核苷酸10等)连接至各自的导电通道32期间或在以反应组分在各自的导电通道32上进行的后续反应期间,流动池34便于将大量试剂递送至可单独寻址的导电通道32的阵列。循环过程,例如核酸测序反应,特别适用于流动池34。另一种特别有用的容器是多孔板或微量滴定板中的孔。
[0081] 在图2所示的实例中,流动池34包含导电通道32。如本文所用,术语“导电通道”旨在表示检测装置的一部分,该部分将在其表面处或在其周围的电场中的扰动转化为电信号。例如,导电通道32可以将反应组分(例如,经标记核苷酸10)到达或离开转化成电信号。在本文公开的实例中,导电通道32还可以通过其与经标记核苷酸10的氧化还原活性电荷标签18的相互作用将两个反应组分(模板核酸和经标记核苷酸10的核苷酸20)之间的相互作用转化为可检测信号。
[0082] 导电通道32可以是电荷传感器35的通道。电荷传感器35可包含源极和漏极端子S、D和连接端子S、D的通道32。通道32可以具有任何合适的几何形状,例如,管,线,板等。
[0083] 端子S、D可以是任何合适的导电材料。合适的源极和漏极材料的实例包含钴,化钴,镍,硅化镍,,钨,铜,,钼,氧化铟(ITO),氧化铟锌,金,铂,碳等。
[0084] 导电通道32可包含可以氧化或还原氧化还原活性电荷标签18的任何导电或半导电材料。材料可包括有机材料,无机材料,或两者。合适的通道材料的一些实例包括硅,碳(例如,玻璃碳,石墨烯,等),聚合物,如导电聚合物(例如,聚吡咯,聚苯胺,聚噻吩,掺杂有聚(4-苯乙烯磺酸盐)的聚(3,4-亚乙基二氧噻吩)(PEDOT-PSS)等),金属,等等。
[0085] 在一些实例中,导电通道26也可以是纳米结构,其具有至少一个在纳米尺度上的维度(范围为1nm至小于1μm)。在一个实例中,该维度是指最大维度。作为实例,导电通道26可以是半导体纳米结构,石墨烯纳米结构,金属纳米结构和导电聚合物纳米结构。纳米结构可以是多壁或单壁纳米管纳米线纳米带等。
[0086] 实例电荷传感器35是场效应晶体管(FET),例如基于碳纳米管(CNT)的FET,基于单壁碳纳米管(SWNT)的FET,硅纳米线(SiNW)FET,聚合物纳米线FET,石墨烯纳米带FET(和从2D材料(例如MoS2,硅烯等)制造的相关纳米带FET),隧道FET(TFET),和陡峭亚阈值斜率器件。
[0087] 图2所示的实例电荷传感器35是纳米结构FET,其包含源极S,漏极D,和源极S与漏极D之间的导电通道32。导电通道32可以是碳纳米管,单壁碳纳米管,硅纳米线,聚合物纳米线等。导电通道32用作栅极端子,因此在图2中也显示为“G”。在本文公开的实例中,栅极G/导电通道32可以用作经标记核苷酸10的氧化还原活性电荷标签18的氧化还原电极(提供或接受电子)。更具体地,栅极G/导电通道32可以用于传递电子至氧化还原活性电荷标签18或从氧化还原活性电荷标签18传递电子。可以通过隧穿穿过栅极G/导电通道32的表面的至少一部分上的栅极氧化物(未示出)而发生电子传递。在一些实例中,栅极氧化物的厚度可以用于调节电流传递效率,使得在氧化还原活性电荷标签18变得充分激活之前经过最小量的接触时间。接触时间可以是指将氧化还原活性电荷标签18保持在栅极G/导电通道32的足够接近内以使电子传递以高可能性发生的时间。该时间段将取决于许多因素,包含氧化还原活性电荷标签18的类型,栅极氧化物的厚度,和电荷标签18与栅极G/导电通道32的距离。这可用于确保电荷传感器35在瞬时接触栅极G/导电通道32但实际上不与连接至栅极G/导电通道32的聚合酶26相关联的扩散经标记核苷酸10之间充分区分。预期与聚合酶26的活性位点相关联的核苷酸10在相关联状态保持显著长于发生瞬时相互作用的时间的时间段。例如,经标记核苷酸10可以保持与聚合酶活性位点(例如,聚合酶26)相关联数百微秒至数百毫秒。瞬时相互作用将在多个数量级更快的扩散时间尺度上发生。
[0088] 在该实例中,聚合酶26用系链28固定在电荷传感器32的栅极G/导电通道32上。系链28用作用于聚合酶26的锚。系链28可以表现出电子运输能力。合适系链28的实例包含核酸链(例如,具有5-25个核苷酸),肽,单碳链,非导电或低导电寡聚物或聚合物等。
[0089] 在一些实例中,系链28将聚合酶26保持在距电荷传感器35的栅极G/导电通道32至少10nm的位置。这可以是期望的,例如,当不期望感测聚合酶26的电荷和/或聚合酶26保持的模板核酸36的负电荷时。然而,如果期望感测聚合酶26和/或模板核酸36的电荷,则系链28可以保持聚合酶26离电荷传感器32的栅极G小于约10nm,小于约9nm,小于约8nm,小于约
7nm,小于约6nm,小于约5nm,小于约4nm,小于约3nm,小于约2nm,或约1nm。
[0090] 使用基于FET的电荷传感器35可以使以下成为可能:(1)通过适当设计的FET可以实现单分子灵敏度,和(2)可以促进高度并行化(也称为“多路复用”),由于检测到的电荷变化位于栅极G/导电通道32的附近,从而避免相邻的、可单独寻址的FET位置(例如,在阵列中)之间的串扰。此外,可以使用与半导体制造设备兼容的工艺来制造硅纳米结构FET。
[0091] 试剂盒和/或系统30的实例还可包括待引入流动池34中的模板核酸36和待引入流动池34中的试剂(图2中未示出)。
[0092] 模板核酸36可以是待测序的任何样品,并且可以包含DNA,RNA或其类似物。模板(或靶)核酸36的来源可以是基因组DNA,信使RNA,或来自天然来源的其他核酸。在一些情况下,可以在用于本文的方法或系统30之前扩增衍生自这样的来源的模板核酸36。可以使用多种已知扩增技术中的任一种,包含但不限于聚合酶链反应(PCR),滚环扩增(RCA),多置换扩增(MDA),或随机引物扩增(RPA)。应理解,在用于本文阐述的方法或系统30之前的靶核酸26的扩增是任选的。这样,在一些实例中,模板核酸36在使用前不被扩增。模板/靶核酸可以任选地衍生自合成文库。合成核酸可以具有天然DNA或RNA组成,或者可以是其类似物。
[0093] 可以从其衍生模板核酸36的生物样品包括,例如,来自哺乳动物的那些,例如啮齿动物,小鼠,大鼠,兔子,豚鼠,类动物,绵羊,猪,山羊,,猫,狗,灵长类动物,人,或非人灵长类动物;植物,如拟南芥,玉米,高粱,燕麦,小麦,水稻,油菜,或大豆;藻类,如莱茵衣藻;线虫,如秀丽隐杆线虫;昆虫,如果蝇,蚊子,果蝇,蜜蜂或蜘蛛;鱼,如斑马鱼;爬行动物;两栖动物,如青蛙或非洲爪蟾;盘基网柄菌;真菌,如卡氏孢子虫,红鳍东方鲀,酵母酿酒酵母或裂殖酵母;或恶性疟原虫。模板核酸36也可以衍生自原核生物,例如细菌,大肠杆菌,葡萄球菌或肺炎支原体;古细菌;病毒,如丙肝病毒,埃博拉病毒或人免疫缺陷病毒;或类病毒。模板核酸36可以衍生自上述生物的同质培养物或群体,或者衍生自例如社区或生态系统中的多种不同生物的集合。
[0094] 此外,模板/靶核酸36可以不是衍生自天然来源,而是可以使用已知技术合成。例如,基因表达探针或基因分型探针可以被合成并用于本文阐述的实施方式中。
[0095] 在一些实例中,模板/靶核酸36可以作为一种或多种较大核酸的片段获得。可以使用本领域已知的多种技术中的任一种来进行片段化,包含例如雾化,超声处理,化学切割,酶促切割或物理剪切。片段化也可通过使用通过仅复制较大核酸的一部分而产生扩增子的特定扩增技术产生。例如,PCR扩增产生片段,该片段具有由在扩增期间侧翼引物杂交的位置之间的原始模板上的核苷酸序列的长度限定的大小。
[0096] 模板/靶核酸36的群体或其扩增子可以具有对于本文阐述的方法、试剂盒或系统30的特定应用而言期望或合适的平均链长。例如,平均链长可以小于约100,000个核苷酸,
50,000个核苷酸,10,000个核苷酸,5,000个核苷酸,1,000个核苷酸,500个核苷酸,100个核苷酸或50个核苷酸。替代地或另外地,平均链长可以大于约10个核苷酸,50个核苷酸,100个核苷酸,500个核苷酸,1,000个核苷酸,5,000个核苷酸,10,000个核苷酸,50,000个核苷酸或100,000个核苷酸。靶核酸的群体或其扩增子的平均链长可以在上述最大值和最小值之间的范围内。
[0097] 在一些情况下,模板/靶核酸36的群体可以在具有其成员的最大长度的条件下产生或以其他方式配置为具有其成员的最大长度。例如,成员的最大长度可以小于约100,000个核苷酸,50,000个核苷酸,10,000个核苷酸,5,000个核苷酸,1,000个核苷酸,500个核苷酸,100个核苷酸或50个核苷酸。替代地或另外地,模板核酸36的群体或其扩增子可以在具有其成员的最小长度的条件下产生或以其他方式配置为具有其成员的最小长度。例如,成员的最小长度可以大于约10个核苷酸,50个核苷酸,100个核苷酸,500个核苷酸,1,000个核苷酸,5,000个核苷酸,10,000个核苷酸,50,000个核苷酸或100,000个核苷酸。群体中的模板核酸36的最大和最小链长可以在上述最大和最小值之间的范围内。
[0098] 如图2所示,待测序的模板核酸36(例如,单链DNA链)在已与试剂(例如先前描述的经标记核苷酸10(图2中未显示))一起或与所述试剂分开引入流体中后,与聚合酶26结合。
[0099] 模板核酸36和/或试剂(例如,经标记核苷酸10)可存在于流体中并且引入流动池34中。流体可包括低盐缓冲液。作为实例,低盐缓冲剂可包含大于0mM至约50mM的盐。作为一个实例,低盐缓冲液可在Tris缓冲液(pH 8.0)中包含至多5mM Mg2+。低盐缓冲液的使用可以是期望的,使得感测区31(即,德拜长度)不会受到不利影响,即,不会太长以至于阻止感测电荷标签18。流体也可包含催化剂,例如促进反应的酶,其他添加剂,和溶剂(例如水,二甲基亚砜(DMSO),甜菜碱,甲酰胺等)。
[0100] 在一些实例中,多种不同经标记核苷酸10可以在引入电荷传感器35的流体中一起使用。在这些实例中,应理解,连接分子14、14'对于所有经标记核苷酸类型可以相同,或者可以不同。可以改变连接分子14、14'的性质,例如长度和刚性,以影响氧化还原反应的速率。可以针对经标记核苷酸10及其相关的氧化还原活性电荷标签18单独地调节这样的性质。也可以改变连接分子14'的特异性区域24的性质以影响氧化还原反应的速率。可以改变连接分子14、14'以增加或减少氧化还原活性电荷标签18在导电通道32的附近的时间。这样的改变可以用于影响电子传递的速率。这样做,可以使来自扩散经标记核苷酸10的电荷标签18和导电通道32之间的瞬时相互作用不太可能导致电子传递。或者,将氧化还原活性电荷标签18在导电通道32附近保持更长的时间可以导致更高可能性的电子传递。
[0101] 在一个实例中,在引入电荷传感器35的流体中使用四种不同的经标记核苷酸10,各自包含不同的核苷酸12(特别是不同的碱基20)和不同的核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签18。一个实例在图3中显示。在该实例中,经标记核苷酸10包括:第一经标记核苷酸10A,其包含作为核苷酸的脱氧腺苷多磷酸和第一核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签(图
3中显示具有四个正电荷);第二经标记核苷酸10G,其包含作为核苷酸的脱氧鸟苷多磷酸和第二核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签(图3中显示具有四个负电荷);第三经标记核苷酸10C,其包含作为核苷酸的脱氧胞苷多磷酸和第三核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签(图3中显示具有两个负电荷);第四经标记核苷酸10T,其包含作为核苷酸的脱氧胸苷多磷酸和第四核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签(图3中显示具有一个正电荷)。在该实例中,第一、第二、第三和第四核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签彼此不同。
[0102] 在图3所示的实例中,第一、第二、第三和第四核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签中的两个在改变的电荷状态下(即,在发生氧化还原反应之后)带正电(例如,dATP和dTTP),并且第一、第二、第三和第四核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签中的另外两个在改变的电荷状态下(即,在发生氧化还原反应之后)带负电(例如dGTP和dCTP)。
[0103] 在图3所示的实例中,即使两个核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签上的电荷相同(正或负),标签18仍可用于区分不同类型的核苷酸,因为电荷具有不同的强度(例如,在氧化还原激活之后)。图3所示的实例配置基于单个系链杂交位置和四种不同的氧化还原活性电荷标签18提供了四状态区别。具体地,dGTP和dCTP两者含有带负电的氧化还原活性电荷标签18,其将它们与dATP和dTTP区分开;并且dGTP由于明显高于dCTP上的电荷的电荷而可与dCTP区分开。同样,dATP和dTTP由于dATP部分上的正电荷比dTTP部分高而可以彼此区分。
[0104] 在一些实例中,使具有正和负大小两者的氧化还原活性电荷标签18在相同流体中操作可能是不可行的,因为使负标签带电所需的电压可以使正标签放电,反之亦然。这样,在其他实例中,可以期望利用本文公开的包含具有一个极性的氧化还原活性电荷标签18的经标记核苷酸10的实例,并使用包含永久带电(即,非氧化还原)标签的其他经标记核苷酸。永久带电标签的实例包含带负电的标签,例如磷酸基团,DMT和/或FMOC;或带正电的标签,例如伯胺。例如,可以使用一种至三种不同的经标记核苷酸10(包含氧化还原活性电荷标签
18),而其余的经标记核苷酸将包含永久带电标签而不是氧化还原活性电荷标签18。这尤其是在使用还原或氧化条件(但非两者)的情况下非常有用。应理解,在这些情况下不应该发生团聚,因为没有相对高浓度的两种电荷类型的大部分同时在溶液中。
[0105] 图3还说明了感测区31(栅极G/导电通道32周围的阴影区域)。电荷传感器35可以在生物学上相关的盐条件下操作,例如在约1mM至约100mM的范围内。这样的盐溶液的德拜屏蔽长度可以在约0.3nm至约10nm的范围内,这可以将感测区31限制在栅极G的表面外的几nm处,并且经常可以将信号电平减小到可检测性极限。
[0106] 尽管在图3中在导电通道32上显示了多个系链聚合酶28,然而应理解,在特定电荷传感器35中,一个聚合酶28系接至一个导电通道32。这样,图3所示的实例说明了在四种不同核苷酸掺入事件期间的聚合酶28,以及在各个掺入事件期间对不同氧化还原活性电荷标签18的影响。
[0107] 现在参考图4,描述了方法的实例。方法100包括将模板核酸36引入具有系接至其的聚合酶26的导电通道32(附图标记102);将经标记核苷酸10引入导电通道32,经标记核苷酸10中的至少一个包含核苷酸12和连接至其的核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签18,由此经标记核苷酸10中的一个与聚合酶26相关联(附图标记104);当经标记核苷酸10中的一个被关联时,启动核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签18和导电通道32之间的氧化还原反应以改变核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签18的电荷状态(附图标记106);和响应于所述氧化还原反应,检测所述电荷传感器32的响应(附图标记108)。在方法100的整个讨论中还将参考图5A和5B。
[0108] 如图5A所示,引入电荷传感器32的模板核酸36可以通过聚合酶26保持在适当位置,该聚合酶系接至电荷传感器32。图5A所示的模板核酸36可以是DNA的模板链。
[0109] 同样如图5A所示,经标记核苷酸10可包含与模板核酸36的靶核酸互补的碱基20。经标记核苷酸10将部分地通过也与模板核酸36结合的聚合酶26固定在适当位置。如果存在,则经标记核苷酸10的连接分子14'的特异性区域24可以与系链28相互作用。
[0110] 与系链28相关联的经标记核苷酸10的实例在图5B中示出。在该实例中,经标记核苷酸10的连接分子14'包含对系链28的一部分(例如,A,B,C)具有亲和力的特异性区域24(例如,A',B',C')。在该特定实例中,特异性区域24(例如,A',B',C')包含与系链28的部分(例如,A,B,C)的核苷酸或肽核酸互补的核苷酸或肽核酸。在另一个实例中,系链28的特异性区域24和接受区域可以是彼此具有亲和力的非核酸部分。在又一实例中,特异性区域24可以是对疏水聚合物(系链28的一个实例)具有亲和力的非核酸部分。这些区域之间的特异性结合可以是因为标准Watson-Crick碱基成对。在该实例中,特异性区域24还可包含A',B',C'核苷酸序列侧翼的肌苷(I)。肌苷是通用碱基,因此可以与DNA的所有四种天然核苷酸成对。这样,另外的结合相互作用可以是因为通用碱基(例如,肌苷I)与系链28上的天然核苷酸的相互作用。因此,当掺入过程中经标记核苷酸10与聚合酶26结合时,经标记核苷酸10和系链28的特异性区域24之间发生协同结合,其大大增加了经标记核苷酸10和系链28之间的相互作用的稳定性
[0111] 当经标记核苷酸10的连接分子14不包含特异性区域24时,应理解,经标记核苷酸10将通过与聚合酶26的相互作用而保持在适当的位置。连接分子14的长度可以帮助确保氧化还原活性电荷标签18被保持在栅极G/导电通道32的感测区域31内。
[0112] 经标记核苷酸10与聚合酶26之间或经标记核苷酸10与聚合酶26与系链28之间的相互作用导致氧化还原活性电荷标签18进入导电通道32的感测区31内。相互作用还有助于将氧化还原活性电荷标签18保持在感测区31内足够长的时间,以进行有效和完整的电荷传递。该时间可以为至多数十毫秒。这种相对长的相互作用不同于可以扩散并短暂接触导电通道32的溶液中存在的其他经标记核苷酸10。短暂相互作用不足够长以使充分的电荷传递发生,因此在这些情况下,氧化还原活性充电标签18不带电,并且充电传感器32未检测到响应。
[0113] 在图5A所示的实例中,经标记核苷酸的铜酞菁氧化还原活性电荷标签18进入在导电通道32的约1nm至约2nm内的场(例如,感应区31)。由于经标记核苷酸10被保持在适当的位置,因此氧化还原活性电荷标签18处于栅极G/导电通道32使其带电的位置。
[0114] 为了启动栅极G/导电通道32(例如,硅纳米线,碳纳米管等)和氧化还原活性电荷标签18之间的氧化还原反应,施加到栅极G/导电通道32的电压可以调节为氧化还原活性电荷标签18的氧化电压或还原电压。当氧化时,氧化还原活性电荷标签18失去电子,因此栅极G/导电通道32向氧化还原活性电荷标签18产生净正电荷。当还原时,氧化还原活性电荷标签18获得电子,因此栅极G/导电通道32向氧化还原活性电荷标签18注入净负电荷。作为氧化还原反应的结果,氧化还原活性电荷标签18的电荷状态被改变。这种改变的高度带电状态(例如,与带电之前的氧化还原活性电荷标签18的状态相比,其是非氧化或非还原状态)扰乱了导电通道32周围的场并产生了可检测信号。
[0115] 在氧化还原反应期间和检测期间施加到导电通道32的电压可取决于所使用的氧化还原活性电荷标签18。例如,充电电压可以与读取电压不同,因此导电通道32可以在充电电压和读取电压之间循环。在一个实例中,启动氧化还原反应包括向导电通道32施加充电电压,并且检测导电通道32的响应包括向导电通道32施加读取电压。
[0116] 在氧化还原反应之后导电通道32的响应指示氧化还原活性电荷标签18的改变的电荷状态。在氧化还原反应之后导电通道32的响应也可以指示经标记核苷酸10的碱基20,因为氧化还原活性电荷标签18是核苷酸特异性的(即,为特定碱基20选择了特定标签18)。这样,方法100还可包括将导电通道32的响应与经标记核苷酸10的相关联的一个(即,已与聚合酶26相关联的经标记核苷酸10)的核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签18相关联,并基于核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签18,识别相关联的经标记核苷酸10(即,已与聚合酶26相关联的经标记核苷酸10)的核苷酸(例如碱基20)。
[0117] 相关联的经标记核苷酸10的碱基20将被掺入与模板核酸36杂交的新生链38。这反过来将自然地破坏经标记核苷酸10的磷酸基团16与新掺入的核苷酸碱基20之间的键。例如,在将核苷酸碱基20引入新生链38之后,α磷酸和连接分子16之间或α磷酸与β磷酸之间的键被自然地切割。结果,经标记核苷酸10的其余部分(例如,组分14或14'和18)自由地从核苷酸碱基20解离并从导电通道32扩散走,从而使围绕导电通道32的场返回到在经标记核苷酸10与聚合酶26相关联之前的状态。当导电通道32周围的场被扰动并返回到不受扰动的状态时的信号的出现和消失分别可以与将核苷酸碱基20掺入模板核酸36的新生链38中相关。这样,方法100的实例还包括从经标记核苷酸10的相关联的一个切割(例如,在磷酸基团16处)核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签18和连接分子14、14',由此将相关联的经标记核苷酸10的核苷酸碱基20掺入与模板核酸36互补的新生链38中。切割可包括等待自然切割发生。由于信号返回到连续经标记核苷酸碱基20掺入之间的基线状态,因此沿着模板链36检测新生链38内的均聚物片段是可能的。
[0118] 本文公开的一些实例利用了经标记核苷酸10与单独或与系链28组合的聚合酶26的协同结合,以使氧化还原活性电荷标签18在导电通道32的感测区31附近并保持。在系链28和特异性区域24之间形成的复合物的稳定性可以相对较低,使得对于未也结合至聚合酶
26的经标记核苷酸10(即,溶液中游离的经标记核苷酸10基本上不与系链28结合)不形成该复合物(在特异性区域24和系链28之间)。换句话说,复合物的解离速率可以足够高,使寿命短。然而,当在经标记核苷酸10和聚合酶26之间形成稳定关联时,连接分子14、14'的局部浓度在系链28周围增加,因此导致特异性区域24对系链28的高结合速率。以这种方式,与自由浮动的经标记核苷酸10的非关联状态相比,在经标记核苷酸10的聚合酶关联状态下的总关联时间大大增加。经标记核苷酸10对于单独或与系链28组合的聚合酶30的亲和力的协同作用允许总体上实质性的结合亲和力。在核苷酸碱基20掺入后通过聚合酶26进行的自然切割后,协同作用丧失,电荷标签18也将从导电通道32解离。
[0119] 在实例方法100中,经标记核苷酸10中的一个与聚合酶28关联,氧化还原反应的启动,检测,响应的关联,和掺入的核苷酸碱基20的识别一起是测序周期。方法100可以还包括用与聚合酶26关联的另一个经标记核苷酸10进行另一个测序循环。进行下一个测序循环可包括使经标记核苷酸10中的下一个与聚合酶26相关联;在经标记核苷酸10中的下一个被关联时,启动另外的核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签18和电荷传感器32之间的另外的氧化还原反应以改变其他核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签18的电荷状态;响应于其他氧化还原反应,检测电荷传感器32的另外的响应;将电荷传感器32的其他响应与其他核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签相关联;和基于其他核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签18,识别经标记核苷酸10中的下一个(即,已与聚合酶26相关联的)的核苷酸(碱基20)。可以切割其他核苷酸特异性氧化还原活性电荷标签,并且将经标记核苷酸10中的下一个的核苷酸(碱基20)掺入与模板核酸36互补的新生链38中。测序循环可以重复。
[0120] 在本文公开的实例中,也可以利用波形。可以监视波形以确定何时达到具有不同氧化还原电势的氧化还原活性电荷标签18的氧化还原电势的一个或多个阈值电压。在这些情况下,通过栅极G/导电通道32的所得电流的变化可以用作识别包含与特定阈值电压相关联的氧化还原活性电荷标签18的经标记核苷酸10的碱基20的信息。
[0121] 在本文公开的实例中,也可以监视传递到氧化还原活性电荷标签18或从氧化还原活性电荷标签18传递的电子的数量。传递的电子的数量可用于识别与聚合酶26相关联、并且聚合酶26引入新生链38中的核苷酸碱基20。
[0122] 本文公开的经标记核苷酸10和系统10可以用于多种应用中的任一种。如参照图4、5A和5B所述,特别有用的应用是核酸测序,例如单分子合成测序(SBS)。在单分子SBS中,监测核酸引物沿模板核酸36(例如,靶核酸或其扩增子)的延伸,以确定模板36中的核苷酸的序列。潜在的化学过程可以是聚合反应(例如,如本文所述由聚合酶26催化)。在特定的基于聚合酶的单分子SBS实例中,以模板依赖性方式将核苷酸(例如碱基20)添加至引物(从而延伸引物并形成新生链38),使得对添加至引物的核苷酸的顺序和类型的检测可用于确定模板的序列。阵列的不同导电通道32处的多个不同模板36可以在其中针对不同模板36发生的事件可以通过可操作地连接至每个导电通道32的个体检测器来区分的条件下进行单分子SBS技术。每个导电通道32(及其源极和漏极端子S、D)可位于流动池的凹陷或孔内,这有助于将一个通道32与阵列中的相邻通道32物理隔离。
[0123] 本文公开的经标记核苷酸10、试剂盒和系统30的其他合适应用包括连接测序和杂交测序。本文公开的经标记核苷酸10和系统30的另一个有用应用是基因表达分析。可以使用RNA测序技术(例如那些称为数字RNA测序的技术)检测或定量基因表达。RNA测序技术可以使用本领域已知的测序方法进行,例如上文所述的那些,除了经光学标记核苷酸的荧光检测可以用本文所述的基于电荷的检测方法代替。还可以使用通过与阵列直接杂交进行的杂交技术或使用在阵列上检测其产物的多重测定法来检测或定量基因表达。通过用基于电荷的检测技术和本文阐述的氧化还原活性电荷标签18代替光学标记和荧光检测,可以使这些方法容易地适应。
[0124] 应认识到,前述概念和下文更详细讨论的另外概念的所有组合(条件是这样的概念不相互矛盾)被设想为是本文公开的发明主题内容的一部分。特别地,出现在本公开的结尾处的要求保护的主题内容的所有组合被设想为是本文公开的发明主题内容的一部分。还应认识到,本文明确采用的、也可出现在通过引用并入的任何公开中的术语应被赋予与本文公开的特定概念最一致的含义。
[0125] 在整个说明书中提到“一个实例”、“另一个实例”,“实例”等是指结合该实例描述的特定要素(例如,特征,结构和/或特性)是包括在本文所述的至少一个实例中,并且在其他实例中可以存在或可以不存在。另外,应理解,除非上下文另外明确指出,否则用于任何实例的所述要素可以以任何适当的方式在各种实例中组合。
[0126] 在包括权利要求书的整个本公开中使用的术语“基本上”和“约”用于描述和解释小的波动,例如由于处理中的变化而引起的波动。例如,它们可以指小于或等于±5%,例如小于或等于±2%,例如小于或等于±1%,例如小于或等于±0.5%,例如小于或等于±0.2%,例如小于或等于±0.1%,例如小于或等于±0.05%。
[0127] 此外,应理解,本文提供的范围包括所述范围和所述范围内的任何值或子范围,如同这样的值或子范围被明确记载。例如,由约1电荷至约100电荷表示的范围应解释为不仅包括约1电荷至约100电荷的明确记载的限制,还应包含个体值,例如约5电荷,50电荷,75电荷等,以及子范围,例如约15电荷至约85电荷等。
[0128] 尽管已经详细描述了多个实例,然而应理解,可以改变所公开的实例。因此,前述描述应被认为是非限制性的。
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