[0001] 本发明涉及基于成纤维细胞激活蛋白(iFAP)抑制剂((R)‑1‑((6‑肼基烟酰基)‑D‑丙氨酰基)吡咯烷‑2‑基)硼酸(HYNIC‑iFAP)的新型放射性药物，其中HYNIC的肼氮充当HYNIC‑iFAP分子与成纤维细胞激活蛋白(FAP)的本质活性中心苯丙氨酸(Phe‑350和Phe‑351)、谷氨酸(Glu‑203和Glu‑204)和丝氨酸(Ser‑624)的相互作用的有利的化学基团，连同
99m 99m
常规使用HYNIC作为放射性金属 Tc的螯合剂。特别地，用 Tc标记的新型放射性药物HYNIC‑iFAP，通过核医学中的SPECT分子成像技术在体内以高亲和力检测肿瘤微环境中表达的FAP。

[0002] 成纤维细胞激活蛋白(FAP)是一种II型丝氨酸蛋白酶，具有二肽基‑肽酶和内肽酶活性，切割位于脯氨酸残基下游的肽。FAP在大多数人上皮肿瘤中存在的激活基质成纤维细胞的细胞表面上高度表达，但在正常成纤维细胞中不表达。癌症相关的成纤维细胞占肉眼可见的肿瘤块的最高达90％[Hamson et al.Understanding fibroblast activation protein(FAP):substrates,activities,expression and targeting for cancer therapy.Proteomics Clin.Appl.,2014,8,454‑463]。

[0003] 特异性FAP抑制剂最初作为潜在的抗癌药物而开发[Aertgeerts  et al.Structural and kinetic analysis of the substrate specificity of human fibroblast activation proteinα.J.Biol.Chem.,2005,280,19441‑19444；Edosada et al.Selective inhibition of fibroblast activation protein protease based on dipeptide substrate specificity.J.Biol.Chem.2006,281,7437‑7444；Tran et al.Synthesis and structure‑activity relationship of N‑acyl‑Gly‑,N‑acyl‑Sar‑and N‑blocked‑boroPro inhibitors of FAP,DPP4,and POP.Bioorg.Med.Chem.Lett.,
17,2007,1438‑1442]。这些中，最相关的是两组高选择性化合物，一组基于喹啉‑氰基吡咯烷结构，并且另一组基于吡咯烷‑硼酸或也称为脯氨酸‑硼酸(boronPro)。关于第一组，Jansen等人最初报道了39种新型FAP抑制剂的合成，以探索4‑喹啉基‑甘氨酰基氰基吡咯烷(4‑quinolinoyl‑Glycyanopyrrolidin)支架的结构‑活性关系[Jansen et al.Extended structure activity relationship and pharmacokinetic investigation of(4‑quinolinoyl)‑glycyl‑2‑cyanopyrrolidin inhibitors of fibroblast activation protein J.Med.Chem.,2014,57,3053‑3074]。作者报道了，为了在酶和这些分子中存在的腈基团之间形成共价键，FAP施加了严格的结构要求[Jansen et al.Selective inhibitors of fibroblast activation protein(FAP)with a(4‑quinolinoyl)‑glycyl‑
2‑cyanopyrrolidin scaffold.ACS Med.Chem.Lett.,2013,4,491‑496]。他们还发现，N‑吡啶产生对其他脯氨酸后裂解酶诸如二肽基‑肽酶(DPP)和脯氨酰基‑寡肽酶(PREP)具有高选择性的FAP抑制剂。虽然喹啉基片段赋予分子对FAP更高的亲和力，但当该残基被其他氮杂芳香族取代基代替时，对FAP的亲和力急剧下降。此外，发现在氰基吡咯烷环片段上加入氟或二氟提高了对FAP的亲和力和选择性。当作者用一些其他氨基酸代替甘氨酸残基时，对PREP的亲和力增加，而FAP的效力显著降低。作为该研究的结果，作者确认N‑(4‑喹啉基)‑甘氨酰基‑(2‑氰基吡咯烷)支架为最佳的FAP的抑制剂。所选FAP抑制剂在小鼠中的药代动力学研究示出，口服给药后生物利用度高，血浆半衰期短，且体内FAP抑制持续时间长。

[0004] 同时，Poplawsky等人设计并表征了超过20种FAP和PREP的基于脯氨酸‑硼的抑制剂[Poplawski et al.Identification of selective and potent inhibitors of fibroblast activation protein and prolyl oligopeptidase.J.Med.Chem.2013,56,3467‑3477]。作者报道了，通过使用质子化吡啶氮原子可以增加对FAP的亲和力，因为它与FAP中存在的谷氨酸(Glu‑204)的羰基氧形成氢键，而PREP中不存在。作者还发现FAP的内肽酶活性具有极其严格的要求，只接受小氨基酸诸如甘氨酸或D‑丙氨酸。而D‑丙氨酸是优选的，因为该抑制剂在纳摩尔范围内保留FAP抑制效力，并且提供的对FAP的选择性是PREP的
360倍。基于这些结果，Poplawski等人确定N‑(吡啶‑4‑羰基)‑D‑Ala‑boroPro是发现的最佳成纤维细胞激活蛋白抑制剂。

[0005] 尽管有大量合成和表征的FAP抑制剂，但它们中仅有限数量的被放射性标记用于125
医疗目的。2015年，第一个用碘‑125放射性标记的硼酸基FAP抑制剂( I‑MIP‑1232)被报道用于动脉粥样硬化斑块成像，尽管重要要澄清的是，I‑125不是单光子发射计算机体层成像(SPECT)或正电子发射体层成像(PET)成像的有用的放射性核素[Meletta  et 
al.Evaluation of the radiolabeled boronic acid based FAP inhibitor MIP‑
1232for atherosclerotic plaque imaging.Molecules,2015,20,2081‑2099]。

[0006] 2018年，Lindner和Loktev报道了将2,2',2”,2”'‑(1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑1,4,7,10‑四基)四乙酸(DOTA)缀合至4‑喹啉基‑Gly‑氰基吡咯烷支架，以便用合适的放射性核素将其标记以用于诊断成像或治疗目的[Lindner et al.Development of quinoline‑based theranostic ligands for the targeting of fibroblast activation protein.J.Nucl.Med.,2018,59,1415‑1422；Loktev et al.A tumor‑imaging method targeting cancer‑associated fibroblasts.J.Nucl.Med.,2018,59,1423‑1429]。作者使用不同位置将DOTA缀合至4‑喹啉基‑Gly‑氰基吡咯烷支架上开发了十五种衍生物，以便提
177 90 68
高FAP抑制剂(FAPI)衍生物的肿瘤摄取和保留时间。这15种不同的FAPI用 Lu、Y或 Ga进
68 68
行放射性标记。在所有放射性标记和报道的FAPI复合物中，Ga‑FAPI‑02和 Ga‑FAPI‑04被证明是最适合用于诊断应用的剂。随后，相同作者报道了同一框架的其他衍生物，从FAPI‑
21到FAPI‑55连续编号[Loktev et al.Development of Fibroblast Activation Protein‑Targeted Radiotracers with Improved Tumor Retention.J.Nucl.Med.,2019,
60,1421‑1429]。用1,4,7‑三氮杂环壬烷‑N,N',N”‑三乙酸(NOTA)取代DOTA得到衍生物
68 18 18
FAPI‑74，其可以用 Ga和 F( F‑AlF，在AlCl3存在下)标记[Giesel et al.FAPI‑74PET/CT 
18 68
Using Either  F‑AlF or Cold‑Kit  Ga Labeling:Biodistribution,Radiation Dosimetry,and Tumor Delineation in Lung Cancer Patients.J.Nucl.Med.,2021,62,
99m 188
201‑207]。特别地，FAPI‑35被开发用于用 Tc和可能地 Re标记[Lindner et al.Design 
99m 188
and Development of  Tc‑Labeled FAPI Tracers for SPECT Imaging and  Re Therapy.J.Nucl.Med.,2020,61,1507‑1513]。

[0007] 用于PET扫描的用于人中的第一FAP抑制剂是68Ga‑FAPI‑02和68Ga‑FAPI‑0468
[Giesel et al. Ga‑FAPIPET/CT:biodistribution and preliminary dosimetry estimate of 2DOTA‑containing FAP‑targeting agents in patients with various 
68
cancers.J.Nucl.Med.,2019,60,386‑392；Kratochwil et al. Ga‑FAPI PET/CT:Tracer Uptake in 28Different Kinds of Cancer.J.Nucl.Med.,2019,60,801‑805]。

[0008] 有趣的是，64Cu‑/225Ac‑FAPI‑04治疗诊断学对在鼠模型中显示出其在治疗过表达FAP的胰腺癌中的效用。靶向成纤维细胞激活蛋白的治疗在癌症治疗中是有效的，并可以有助于建立新的治疗策略[Watabe et al.Theranostics Targeting Fibroblast 64 22
Activation Protein in the Tumor Stroma: Cu‑and  Ac‑Labeled FAPI‑04in Pancreatic Cancer Xenograft Mouse Models.J.Nucl.Med.,2020,61,563‑569]。

[0009] 然而，在任何放射疗法治疗之前，必须通过核成像来评估肿瘤或其转移对放射性药物的摄取以便确认治疗是否将对患者有用，以及确定必要的管理活动以便向肿瘤递送消融辐射剂量，即实行个性化医疗。为此，有必要使用FAP抑制剂诊断放射性药物，以便通过PET或SPECT获得分子图像。在这两种技术中，PET是具有最高空间分辨率和灵敏度的一种，68
因此，如上所述，迄今为止开发并应用于临床研究的诊断性FAP抑制剂放射性药物，使用 Ga
18
和 F结合至4‑喹啉基‑Gly‑氰基吡咯烷衍生物，其是用于PET的放射性药物，且只有一项研
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究使用 Tc也结合至喹啉‑氰基吡咯烷的衍生物(参见下表)。尽管如此，在国内和国际上，SPECT研究占核医学总量的超过70％，因为其成本较低且设备和放射性核素的可得性更高，
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因为不需要在医院内或附近有回旋加速器。对于SPECT成像，最常用的放射性核素是 Tc，并且没有专门研究用于FAP成像的基于吡咯烷‑硼酸衍生物或硼‑Pro的放射性药物的出版物。

[0010] 表1：迄今为止开发的且在临床研究中被PET和SPECT技术使用的68Ga、18F和99mTc FAP抑制剂的放射性药物的化学结构。

[0011]

[0012] 提出基于((R)‑1‑((6‑肼基烟酰基)‑D‑丙氨酰基)吡咯烷‑2‑基)硼酸(HYNIC‑iFAP)分子的新颖成纤维细胞激活蛋白(iFAP)抑制性放射性药物用于专利目的，其中HYNIC的肼氮充当HYNIC‑iFAP分子与成纤维细胞激活蛋白(FAP)的活性中心中的苯丙氨酸(Phe‑350和Phe‑351)、谷氨酸(Glu‑203和Glu‑204)和丝氨酸(Ser‑624)的相互作用的有利的化学
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基团，连同常规使用HYNIC作为放射性金属 Tc的螯合剂，其中乙二胺二乙酸(EDDA)用于完
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成放射性金属的配位层。来自 Tc‑EDDA/HYNIC‑iFAP( Tc‑HYNIC‑iFAP)的新型放射性药物，使用核医学SPECT分子成像技术，在体内以高亲和力检测上皮源性恶性肿瘤的微环境中
99m
表达的FAP。图1示意性地示出了申请专利的基于HYNIC‑iFAP结构的 Tc放射性药物的结构。

[0013] 基于分子对接研究，设计并合成了HYNIC‑iFAP衍生物[((R)‑1‑((6肼基烟酰基‑)‑D丙氨酰基)‑吡咯烷‑2‑基)硼酸]，并将其与文献中报道的boronPro的最具代表性的两种结构N‑酰基‑Gly‑boroPro[Tran et al.Synthesis and structure‑activity relationship of N‑acyl‑Gly‑,N‑acyl‑Sar‑and N‑blocked‑boroPro inhibitors of FAP,DPP4,and POP.Bioorg.Med.Chem.Lett.,17,2007,1438‑1442]和N‑(吡啶‑4‑羰基)‑D‑Ala‑boroPro[Poplawski et al.Identification of selective and potent inhibitors of fibroblast activation protein and prolyl oligopeptidase.J.Med.Chem.2013,56,3467‑3477]进行亲和力和抑制常数(Ki)的比较。还获得了HYNIC‑iFAP分子的另一种衍生物的亲和力，其中它与S‑2‑(4‑异硫氰酸基苄基)‑DOTA缀合(DOTA‑Bz‑NCS‑HYNIC‑iFAP)，以便
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研究该衍生物的亲和力是否适合用其他类似DOTA的放射性金属诸如 Ga、 Lu、Cu、 Ac等进行潜在的标记。为此目的，所有结构都在ChemDraw(.cdx格式)中生成且3D结构通过Chem3D软件导出为.pdb格式。使用分子编辑器AVOGADRO 1.2.0，使用universal力场(UFF)对分子几何结构进行优化，由于每个结构中存在硼原子，总共10,000步。随后，使用半经验量子化学软件MOPAC2016与PM7理论水平进行第二次几何结构优化，将所得空间构型导出为.pdb格式。

[0014] 从RSCB蛋白质数据库中获得成纤维细胞激活蛋白(FAP)的α亚基的晶体结构(PDB ID:1Z68)。为了将其作为受体大分子用于分子对接计算，在BIOVIA Discovery Studio 2021中对该分子进行编辑以去除X射线衍射中显示的水分子和残基，只留下主氨基酸链在.pdb文件中。模型中表示的二聚体的A链也被去除，只留下B链。由于大分子的三维模型涉及的分辨率，因此通过SWISS‑MODEL在线平台进行同源建模步骤。所得结构以pdb格式保存以用作受体。受体和HYNIC‑iFAP衍生的结构都是用OPEN BABEL GUI 2006文库制备的，指示缺失的氢的添加以及其对于生理pH(pH＝7.4)的分子优化，再次以.pdb格式生成结构。
使用AutoDock Tools 1.5.6软件包将受体配置为大分子，并每个配体在单独的文件中，以.pdbqt扩展名导出文件。根据Poplawsky和同事2013年建议的，将搜索框配置在受体的Ser‑
624周围的疏水位点S1处，设置XYZ坐标分别为18.948、10.676、28.989为中心，且框的每个轴上的尺寸为90。关于配体，有必要修改<>文件以添加硼原子的参数，可在http://mgldev.scripps.edu/pipermail/autodock/2009‑March/005439.html获得。

[0015] 蛋白质‑配体分子对接的执行用AutoDock 4.2.6包进行，之前使用AutoGrid 4.2.6工具计算必要的.map网格。通过将亲和力得分最好的复合物导出为.pdb格式，在AutoDock Tools中可视化具有分子对接结果的日志文件。距离和相互作用的可视化和分析通过BIOVA Discovery Studio Visualizer 2021进行。

[0016] 抑制常数(Ki)使用以下方程式计算：

[0017]

[0018] 其中：

[0019] 亲和力：对应于AutoDock 4.2.6评分函数中获得的值。

[0020] R：对应于理想气体的热力学常数的值(0.00198179kcal/mol K)。

[0021] T：对应于AutoDock 4.2.6在分子耦合计算中处理的以绝对尺度298.15K计的温度值。

[0022] Ki值以摩尔单位(M)获得。表2呈现了每种配体的亲和力得分、Ki抑制常数和到Ser624的距离。如表2所示，HYNIC‑iFAP分子示出更低的抑制常数(Ki＝0.536nM)，是N‑(吡啶‑4‑羰基)‑D‑Ala‑boroPro衍生物(Ki＝14.07)的26分之一，这意味着HYNIC‑iFAP对FAP更高的抑制效力。

[0023] 表2.对于每种boroPro配体，通过分子对接(AutoDock)确定的亲和力得分，以及抑制常数(Ki)，以及在硼残基与成纤维细胞激活蛋白(FAP)的丝氨酸624之间的相互作用距离。

[0024]

[0025] 与分子对接研究中获得的HYNIC‑iFAP与FAP活性中心的氨基酸残基的相互作用图一致，HYNIC‑iFAP相对于N‑(吡啶‑4‑羰基)‑D‑Ala‑boroPro亲和力增加是由于存在HYNIC的肼氮，这有利于HYNIC‑iFAP分子在其偶联至FAP活性中心的范德瓦尔斯型(van der Waals‑type)相互作用和氢键，主要是与残基Glu‑203、Glu‑204、Phe‑350和Phe‑351，以及与Ser‑624相互作用的更近的邻近(FAP的氨基酸残基与HYNIC‑iFAP配体的相互作用图，用上述分子对接方法获得)。DOTA‑Bz‑NCS‑HYNIC‑iFAP配体的高亲和力和FAP抑制效力表明了它有潜能用于制备新型诊断与治疗放射性药物，因为它可以是有用的配体以用能够被DOTA大环螯
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合的放射性核素诸如 Ga、Cu、 Lu和 Ac标记。

[0026] 本发明的放射性药物的制备方法

[0027] 为了合成HYNIC‑iFAP分子，首先在氮气气氛下和‑40℃下将Boc‑吡咯烷溶解在乙醚/TMEDA中。随后将其与s‑BuLi(在环己烷中)的溶液在5℃下反应。然后添加B(OMe)3并进行萃取纯化工艺(首先用2M NaOH萃取，然后用2M HCl酸化，最后用EtOAc萃取并蒸发溶剂)，获得Boc‑吡咯烷‑硼酸，向其中添加蒎烷二醇并通过HPLC分离(microporasil柱)获得R非对映异构体。在Boc脱保护后，进行D‑丙氨酸偶联，然后使用HATU/DIPEA进行琥珀酰亚胺基‑N‑boc‑HYNIC偶联。最后，将化合物用TFA脱保护，通过反相HPLC纯化并冻干。最终产物是((R)‑1‑((‑6肼基烟酰基‑)‑D丙氨酰基)吡咯烷‑2‑基)硼酸(HYNIC‑iFAP)，其呈现预期的质谱：m/+ + 1
z 322(计算值321)[M+H]；m/z 642(计算值321)2×[M+H] 。H‑NMR(300MHz,DMSO),δ(ppm):
6
8.5‑6.7(s,1H,‑CH ‑,芳香族吡啶),9.7(s,1H,‑NH‑NH‑),8.3(s,1H,‑CH2‑NHCO),3.1‑3.3(m,1H,CH2 CHB)。

[0028] 冻干的白色固体的反相HPLC分析示出该化合物的化学纯度为95％。

[0029] HYNIC‑iFAP(30μg)被配制为冻干剂型，包含10mg EDDA、20mg的N‑三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、20μg氯化亚锡和50mg甘露醇。所述制剂，当用1mL的0.2M的pH 7的溶液和99m 99 99m
1mL的高锝酸钠溶液( TcO4Na)(从 Mo/ Tc发生器原位获得)重构时，产生申请专利的化
99m 99m
合物 Tc‑EDDA/HYNIC‑iFAP( Tc‑HYNIC‑iFAP)，通过反相HPLC确定的放射化学纯度大于
98％。

[0030] 在标记24h后，该放射性药物保持稳定，放射化学纯度大于95％。人血清中的体外99m
稳定性测试示出血清蛋白结合为2.1±0.3％且放射化学稳定性高(>95％)。为了评估 Tc HYNIC‑iFAP的体外特异性，我们使用来自两种不同分子亚型的乳腺癌的肿瘤基质(患者活检)：以雌激素受体(ER)和人表皮生长因子受体2型(HER2)的高表达为特征的luminal B，和由于ER、孕酮受体(PR)和HER2的表达水平为零的三阴性(TNBC)。我们之所以选择这些肿瘤基质，是因为在之前的研究中，在不同的乳腺肿瘤表型中，TNBC肿瘤示出表达最高水平的FAP，而luminal B肿瘤表达最低水平的FAP[Park et al.Differential expression of cancer‑associated fibroblast‑related proteins according to molecular subtype and stromal histology in breast cancer Breast.Cancer Res.Treat.,2015,149,727‑
99m
741]。结果示出，对 Tc HYNIC‑iFAP的摄取为添加到TNBC肿瘤基质的放射性活度的7.8±
1.2％，这显著高于(P<0.05，t‑学生(t‑student))被luminal B肿瘤基质摄取的放射性活度(添加的放射性活度的2.3±0.3％)。

[0031] 当以40mg/kg的剂量给药至实验室balb‑C小鼠时，该化合物示出没有毒性或不良99m
反应。在具有诱导的三阴性乳腺癌肿瘤(MBCDF‑T细胞)的无胸腺小鼠中的 Tc‑HYNIC‑iFAP的Micro‑SPECT/CT成像示出，肿瘤摄取为每克组织9.2±1.4％的给药的活度(％ID/g)(图
2)，主要通过肾脏快速消除。

[0032] 健康志愿者中的生物动力学和剂量学测试示出快速的血液清除与增加的肾脏摄取和排泄，且有效剂量为2.0±0.5mSv/给药的740MBq。图3示出了健康志愿者中在给药后1h99m
获得的放射性药物 Tc‑HYNIC‑iFAP的SPECT图像。图4示出了同一三阴性乳腺癌患者的PET
18
和SPECT图像，该患者被给药了 F‑FDG(PET，对照放射性药物，用于检测肿瘤代谢的金标准
99m
物)和 Tc‑HYNIC‑iFAP(SPECT)两者，示出两种放射性药物对乳腺癌肿瘤的检测都具有高灵敏度；图5示出了同一肺癌患者(以实性图案为主的低分化肺腺癌)的PET和SPECT图像，该
18 99m
患者被给药了 F‑FDG(PET，对照放射性药物，用于检测肿瘤代谢的金标准物)和 Tc‑HYNIC‑iFAP(SPECT)两者，示出两种放射性药物对肺肿瘤的检测都具有高灵敏度，尽管在
99m
Tc‑HYNIC‑iFAP的情况下，高摄取与肿瘤微环境中FAP表达的识别有关。这些图像证实并
99m
且是主要证据：由于HYNIC肼中存在的氮增强了其FAP活性抑制特性， Tc‑HYNIC‑iFAP能够以特异性的方式检测肿瘤病变。

[0033] 综上所述，获得99mTc‑HYNIC‑iFAP具有以下特点：

[0034] ·放射化学纯度大于98％。

[0035] ·该放射性药物通过核医学单光子发射计算机体层成像(SPECT)在体内且特异性地检测表达成纤维细胞激活蛋白的肿瘤的微环境的能力。

[0036] ·除了对boronPro残基的分子识别外，基于99mTc的申请专利的该放射性药物，具有以高灵敏度显著捕获和检测表达FAP的肿瘤微环境的能力，由于HYNIC分子中存在肼氮而赋予的增加的亲和力(低Ki值；Ki＝0.536)，这允许它在对接中与FAP酶的活性位点有效地相互作用，用于通过SPECT成像进行检测。