[0001] 本发明涉及的是一种中医药领域的技术，具体是一种石斛叶抗氧化应用。

[0002] 自由基是高度活性氧分子来源于机体正常代谢或外源性的因素如：电离辐射、某些药物、酒精、吸烟等刺激产生，它可以攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，在膜脂质过氧化，降低膜流动性，酶和受体活性的丧失，并损坏膜蛋白导致细胞失活。自由基与诸多疾病相关，如癌症，动脉粥样硬化，糖尿病，神经退行性疾病和衰老。抗氧化剂可以减少自由基对一些重要生物大分子，包括蛋白质和DNA在内的氧化损伤。近年来抗氧化剂的研究受到众多学者的关注，特别是天然抗氧化剂及其潜在的健康效益方面意义的研究。中药抗氧化剂具有低毒、高效等优点，从传统的中药中筛选出中药抗氧化剂具有重要意义。

[0003] 现行2010版《中国药典》规定，石斛以茎入药，但其叶产量很大不属于药用部位，造成了大量资源浪费,已有种植企业将原叶直接干燥,分装,泡茶饮的使用方法,但功效不明确。石斛属国家批准的药食两用中药品种目录，民间有以叶子泡茶饮的用法，但功效不明确。

[0004] 目前国内外学者对于石斛叶的研究较少，仅有叶多糖、叶挥发油及叶黄酮碳苷类化学成分的研究报道，还未见石斛叶抗氧化部位及其制备方法的研究报道。因此对石斛叶的研究具有重大意义。为了更有效、合理的利用石斛我们有必要对石斛叶进行进一步的活性研究。

[0005] 本发明克服现有石斛叶资源利用及研究的不足以及化学抗氧化剂的毒性，提出一种石斛叶抗氧化应用。

[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0007] 本发明通过采集石斛叶经剪碎后加水回流提取，对提取液浓缩后离心处理并通过大孔树脂洗脱并减压浓缩，最后去除溶剂制成可食用添加物。

[0008] 所述的加水回流提取是指：将干燥石斛叶剪碎后，添加其重量5～15倍的水回流提取2～3次，每次0.5～2h，趁热滤过，合并水溶液。

[0009] 所述的干燥，可采用本领域通常的干燥方法，40℃烘干。

[0010] 所述的浓缩是指：浓缩到浓缩液体积与干燥石斛叶的质量比为3:1～5:1。

[0011] 所述的大孔树脂洗脱是指：用30％～70％乙醇洗脱，将各部位减压浓缩至干，其中石斛叶总提物及30％～70％乙醇洗脱部位即为石斛叶抗氧化活性部位。

[0012] 将本发明成品通过Folin-Ciocalteu比色法测定总酚含量，通过三氯化铝显色反应测定总黄酮含量。

[0013] 所述的石斛叶抗氧化活性采用DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、铁原子还原能力、β-胡萝卜素漂白实验、超氧阴离子清除活性测定。

[0014] 技术效果

[0015] 与现有技术相比，本发明石斛叶抗氧化活性部位与石斛茎相比，具有下述优点：1.原料来源丰富，价格低。2.石斛叶经提取纯化活性部位，利于功能食品开发。附图说明

[0016] 图1为本发明流程图；

[0017] 图2为实施例中总离子流色谱图；

[0018] 图3为实施例中N-p-香豆酰酪胺、反式或顺式阿魏酸酰对羟基苯乙胺、反式桂皮酸酰对羟基苯乙胺的一级质谱图。

[0019] 实施例1

[0020] 如图1所示，本实施例包括以下步骤：将石斛叶40℃干燥，剪碎，加药材重量10倍水回流提取3次，每次2h，趁热滤过，合并水溶液，水溶液减压浓缩至干，即为石斛叶抗氧化活性部位。

[0021] 实施例2

[0022] 如图1所示，本实施例包括以下步骤：将石斛叶40℃干燥，剪碎，加药材重量12倍水回流提取3次，每次2h，趁热滤过，合并水溶液，浓缩(浓缩至体积与药材总量比为5:1),将浓缩液离心，上样到预处理过的非极性大孔树脂玻璃柱中，依次用2～6BV蒸馏水(即0％乙醇)、30％乙醇洗脱。30％乙醇洗脱部位减压浓缩至干，即为石斛叶抗氧化活性部位。

[0023] 实施例3

[0024] 如图1所示，本实施例包括以下步骤：将石斛叶40℃干燥，剪碎，加药材重量12倍水回流提取3次，每次2h，趁热滤过，合并水溶液，浓缩(浓缩至体积与药材总量比为5:1),将浓缩液离心，将浓缩液上样到预处理过的中极性大孔树脂玻璃柱中，依次用2～6BV蒸馏水(即0％乙醇)、25％～35％乙醇、60％乙醇洗脱。60％乙醇洗脱部位减压浓缩至干，即为石斛叶抗氧化活性部位。

[0025] 实施例4

[0026] 本实施例包括以下步骤：将实施例1、实施例2、实施例3所得样品采用DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、铁原子还原能力、β-胡萝卜素漂白实验、超氧阴离子清除活性5种抗氧化模型检测抗氧化活性。结果如表1至表5所示，可见，石斛叶30％乙醇部位及60％乙醇部位具有较强抗氧化活性，且60％乙醇部位的抗氧化活性高于石斛茎水提总样。

[0027] 表1石斛叶各化学部位DPPH法IC50值

[0028]

[0029] “-”表示样品IC50值＞1000μg/mL

[0030] 表2石斛叶各化学部位ABTS法IC50值

[0031]

[0032] 表3石斛叶各化学部位Trolox当量

[0033]

[0034] 表4石斛叶各化学部位抑制β-胡萝卜素自氧化能力

[0035]

[0036]

[0037] 表5石斛叶各化学部位抗超氧阴离子活力

[0038]

[0039] “-”表示样品浓度大于1000μg/mL仍无清除超氧阴离子自由基活力[0040] 实施例6

[0041] 本实施例包括以下步骤：对实施例1、实施例2、实施例3所得的石斛叶抗氧化活性部位进行总酚、总黄酮含量测定，结果见表6。

[0042] 可以看出在实施例1、实施例2、实施例3中，60％乙醇部位总酚含量最高达到116.21μg/mg没食子酸当量，其次是30％乙醇部位56.91μg/mg没食子酸当量。总酚含量依次为茶多酚>60％乙醇部位>30％乙醇部位>茎水提总样>叶水提总样。

[0043] 总黄酮的含量测定结果显示，在实施例1、实施例2、实施例3中60％乙醇部位总黄酮含量最高。总黄酮含量依次为60％乙醇部位>30％乙醇部位>叶水提总样>茶多酚>茎水提总样。

[0044] 表6石斛叶各化学部位总酚、总黄酮含量测定结果

[0045]

[0046] 实施例7

[0047] 本实施例包括以下步骤：将实施例3制得的60％乙醇部位进行HPLC-MS分析，总离子流色谱见图2。采用MassLynx质谱分析软件计算可能的分子组成，并结合石斛化合物的文献报道，对色谱峰进行比对，鉴定了其中的3个成分，见表7，分别是N-p-香豆酰酪胺、反式或顺式阿魏酸酰对羟基苯乙胺、反式桂皮酸酰对羟基苯乙胺，其化学结构式分别为：

[0048]

[0049]

[0050]

[0051] 对应的一级质谱图如图3所示。

[0052] 表7石斛叶60％乙醇部位色谱峰鉴定结果

[0053]

[0054] 上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。