[0001] 本发明涉及一种基于单宁酸递送花色苷核壳结构纳米粒子及其制备方法，属于纳米递送技术领域。

[0002] 花色苷是许多水果、花卉和蔬菜中普遍存在的黄酮类化合物，由于其理想的颜色和潜在的营养效益，已被用作商业食品和饮料产品中的天然色素。众所周知，花色苷是一种不稳定的化合物，很容易暴露在氧气、pH值、温度、酶、光以及金属离子中，这就降低了食物的颜色和质量。提高花色苷的稳定性是提高花色苷产品质量的有效方法之一。

[0003] 目前花色苷的稳态化方法主要有结构修饰、高酸改性、微胶囊包埋等，但存在得率低、安全性差、色泽损失等问题，难以实际应用。而本研究构建的核壳结构，选用的单宁酸不仅可以对花色苷起到辅色作用，还可以避免恶劣的肠道环境的破坏，在肠道炎症部位的时候智能响应和释放花色苷。

[0004] 为了解决花色苷稳定性差、利用度低的问题，本发明提供一种基于单宁酸递送花色苷核壳结构纳米粒子的制备方法。载体基于分子间相互作用构建，可与花色苷之间形成核壳结构，通过酚酸辅色技术，不仅能对花色苷色泽上有所保护，提高花色苷的颜色稳定性，还能通过核壳结构协同作用，共同发挥单宁酸及花色苷的生物活性，由于符合纳米体系，可有效实现肠道吸收，当口服复合物，炎症部位高表达的酯酶及活性氧存在时，就会加快酯键断裂，释放出花色苷，发挥抗炎作用。

[0005] 一种基于单宁酸递送花色苷核壳结构纳米粒子，所述纳米粒子具有核壳结构，其中，

[0006] 芯材为花色苷；

[0007] 壳材为以单宁酸和泊洛沙姆188为原料制备所得的球形载体。

[0008] 优选地，所述球形载体与花色苷的质量比为2～40:20。

[0009] 本发明的另一目的是提供上述基于单宁酸递送花色苷核壳结构纳米粒子的制备方法。

[0010] 一种基于单宁酸递送花色苷核壳结构纳米粒子的制备方法，将单宁酸与泊洛沙姆188在70％乙醇中搅拌结合，形成壳材溶液；将花色苷溶解于50％乙醇水溶液，待完全溶解后将溶液超声处理，得到花色苷溶液；将壳材溶液和花色苷融合混合后加入水中，并调节体系的pH值为3.0，混合均匀，室温避光磁力搅拌10～12h，得复合体系，3KD超滤离心管离心，分离，内管即为纳米粒子。

[0011] 优选地，将单宁酸、泊洛沙姆188分别溶于70％乙醇中，配置浓度为20mg/mL的溶液；再将单宁酸溶液和泊洛沙姆188溶液按体积比为1：1混合后涡旋1min，得壳材溶液。

[0012] 优选地，所述花色苷溶液的浓度为40mg/mL。

[0013] 优选地，所述花色苷溶液与壳材溶液的体积比为5：1～20。

[0014] 优选地，复合体系置于3KD超滤离心管中，冷冻离心机8000rpm离心60～80min，内管中溶液即为所制备的纳米粒子。

[0015] 本发明的有益效果为：本发明以多酚类物质单宁酸及两亲性表面活性剂泊洛沙姆188为主要原料制备球形载体，并以其为载体包覆花色苷，载体与花色苷形成核壳结构，且单宁酸具有酚酸辅色花色苷的功能，以期提高花色苷的加工稳定性及口服吸收利用率，由于载体之间通过酯键连接，在肠道炎症部位，高表达活性氧及酯酶存在时，实现花色苷智能释放及缓释作用。

[0016] 本发明选取了天然多酚单宁酸为主要载体，不仅来源绿色，且同时具有多种生理活性，在包覆花色苷的同时，不仅能够辅色花色苷，还能保护花色苷色泽稳定性，也会增强花色苷的生理功能。核壳复合纳米材料能够兼具外壳和内核材料的优良特点，将内外两种材料的特性复合，克服单一结构材料性能的不足。

[0017] 本发明方法具有操作简单方便、过程安全可控等特点，所得产品不仅适用于个性化精准营养食品的创制开发，还能应用于功能食品、医药、化妆品等多个领域。附图说明

[0018] 图1实施例3所得花色苷核壳结构纳米粒子透射电镜图及粒径分布图(A/B)，包封率及载药量(C)，丁达尔效应图(D)；图1A和B为本发明的花色苷与复合物透射电镜图及粒径分布图，纳米粒子平均粒径127.4nm，电位‑18mV,且载体与花色苷之间呈核壳结构。图1C为包封率及载药量结果，纳米粒子包封率为35.80±0.66％，载药量为12.64±0.73％，通过丁达尔效应图看出，泊洛沙姆188与单宁酸结合后可形成胶束，与花色苷结合为核壳结构，而单独的花色苷不成胶束形态；

[0019] 图2实施例3所得花色苷及花色苷核壳结构纳米粒子的加工贮藏稳定性及纳米粒子稳定性。图2分别为复合物的光照(A)，90℃热处理(B)，37℃贮藏(C)，4℃贮藏(D)，37℃时置于PBS(7.4)(E)纳米粒子稳定性；纳米粒子的粒径，花色苷及其复合物的光照处理(F)，90℃热处理(G)的稳定性。纳米颗粒的稳定性决定了其递送AN的能力。通过DLS对不同处理条件下的纳米粒子进行了表征。如图4A所示，在光照箱中放置7d后，分别在0、1、3、5、7d测得粒径的变化，随着处理时间的延长，粒径略有变大，但PDI非常稳定，仅在第7d出现增加增加情况。从图4B中可以看出，在90℃处理3h期间监测纳米粒子的稳定性，粒径和PDI的波动并不显著。将纳米颗粒在37℃和4℃下储存48h。PDI很平稳，颗粒尺寸分别在放置37℃后24h内保持稳定，在放置4℃后36h内保持稳定性。当将纳米颗粒置于PBS溶液中时，颗粒尺寸和PDI有一些波动，但总体变化不显著(p<0.05)，颗粒稳定性良好。总之，分别在常见的加工和储存条件以及体内消化道pH下对纳米粒子进行了检查，纳米粒子稳定良好，PDI波动很小，保持在0.1以内。由图2(F)花色苷及其纳米粒子的光照处理，90℃热处理(G)的保留率结果可知。花色苷在储存过程中不稳定，C4羟基环在恶劣环境中很容易断裂。因此，它们最终会转化为无色物质，导致褪色和降解。花色苷的稳定性决定了其在生产加工中的利用价值和功能活性。加热和光照是花色苷产品加工过程中最常见的加工条件(图2F/G)。与游离花色苷相比，具有载体保护的花色苷在光照9d内，表现出稳定性保护作用。光照第3d，它显示出显著的保护作用，第9d的保留率比对照组高15.50±1.48％。同时加热结果也显示出明显的保护作用。随着加热时间的延长，对花色苷的保护作用也逐渐显现。这可能是因为纳米颗粒通过非共价相互作用紧密结合，从而保护花色苷的B环上的酚羟基不被破坏，对花色苷具有良好的保护作用。

[0020] 图3实施例3所得花色苷核壳结构纳米粒子的体外模拟稳定性(A)及在模拟胃液(B)，模拟肠液(C)，模拟肠液加入酯酶刺激(D)的药物释放率。花色苷在胃消化过程中没有降解，在酸性条件下主要以黄杨基阳离子的形式降解，而在小肠消化阶段，花色苷的稳定性受到pH和消化酶的破坏，保留率迅速降至59.05±5.04％，而纳米粒子在整个消化阶段的保留率显著高于花色苷组。载体和花色苷之间的核壳结构防止了花色苷的降解，因此，纳米粒子表现出比单独的花色苷更高的稳定性。在模拟肠液中，载体的非共价结合为分散的小颗粒提供了更强的空间障碍，从而抑制了花色苷的快速降解。因此，这种基于核壳结构的递送系统可以控制花色苷的释放行为。比较游离花色苷和纳米粒子在模拟胃液(SGF)和模拟肠液(SIF)中的花色苷释放。花色苷的游离水溶液在SGF中快速释放，最终释放率为30.34±1.07％。然而，纳米粒子显示花色苷的延迟释放(图3B)。在肠道释放阶段也发现了类似的现象(图3C)。这些结果表明，使用由递送花色苷的纳米载体组成的核壳结构可以保护生物活性物质在消化环境中免受快速破坏。有趣的是，在肠道释放开始时添加30U/mL的酯酶刺激了结肠炎环境，花色苷释放的百分比增加到12.97±0.62％。这种酯酶反应性释放行为可能与载体的降解有关。为了研究降解行为，将样品与没有酯酶的样品进行比较，在没有酯酶的情况下，只有9.27±1.05％的样品被释放(图3D)。炎症性肠病患者的肠道环境与正常人不同。由于氧化应激损伤，一些指标如酯酶可能上调。在肠道释放过程中，载体的酯键在受到酯酶刺激时断裂。负载花色苷的纳米载体主要通过酯键连接，并在高表达酯酶的刺激下进行切割，实现了花色苷在炎症部位的刺激响应下的释放，为花色苷的智能递送提供了理论基础。

[0021] 图4实施例3所得花色苷花色苷核壳结构纳米粒子的抑制RAW264.7细胞活性氧情况及过氧化物酶的调节情况：空白(A)，丙烯酰胺模型组(B)，花色苷(C)，载体(D)复合物(E)；及其对超氧化物歧化酶(F)，过氧化氢酶(G)，谷胱甘肽(H)，丙二醛(I)的调节情况。通过荧光捕获不同样品组的荧光强度，从而进行显微镜观察。不同样品处理后，细胞内活性氧(ROS)水平通过DCFDA进行检测，DCFDA是一种ROS探针，只有被ROS氧化才能显示荧光发射。经丙烯酰胺(AA)处理的细胞发出明亮的绿色荧光，证实成功产生了ROS，而经花色苷、载体组和纳米粒子组处理的细胞则观察到不同程度的绿色荧光减少，表明这些样品清除了细胞内的ROS。其中，纳米粒子组的ROS清除效果最好。如图4F‑I所示，AA处理组的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平显著降低，而丙二醛(MDA)水平显著升高。用纳米粒子预孵育细胞6h后，CAT、SOD和GSH水平明显升高。随后，可通过检测MDA和ROS水平来确定细胞氧化损伤的程度。如图4D所示，对照组的MDA水平明显低于阳性组蛋白组。
这是因为当细胞暴露于AA时，外源性AA应激会攻击内源性抗氧化防御系统，导致细胞间ROS的异常积累和脂质过氧化产物MDA的产生。与AA损伤阳性组相比，纳米粒子处理组的细胞MDA水平明显接近正常水平(p<0.05)。细胞间MDA水平与细胞总抗氧化能力呈负相关。上述结果表明，纳米粒子对炎症反应有较好的疗效，具有载体保护作用的花色苷比游离花色苷有更好的疗效，在炎症表达较高的部位能发挥更好的疗效。

[0022] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0023] 下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0024] 实施例1

[0025] 将80mg单宁酸与80mg泊洛沙姆188分别溶解于4mL 70％的乙醇，搅拌均匀，将单宁酸溶液及泊洛沙姆188溶液以1：1(V/V)的比例混合后涡旋1min，得载体溶液。将花色苷100mg溶解于2.5mL 50％的乙醇中，将花色苷溶液(0.5mL)与载体溶液结合(0.1mL)，补充加入1.9mL的70％乙醇，使得最终载体与花色苷的质量比为10：1。将上述复合溶液逐滴滴加至
50mL去离子水中，调节体系pH值(1M HCl溶液调节)为3.0，搅拌10h后，得到负载花色苷的复合体系。使用超滤离心管(分子截留量为3KD)以8000rpm离心75min。收集内管和外管的样品，内管即为纳米粒子。

[0026] 实施例2

[0027] 将80mg单宁酸与80mg泊洛沙姆188分别溶解于4mL 70％的乙醇，搅拌均匀，将单宁酸溶液及泊洛沙姆188溶液以1：1(V/V)的比例混合后涡旋1min，得载体溶液。将花色苷100mg溶解于2.5mL 50％的乙醇中，将花色苷溶液(0.5mL)与载体溶液结合(0.25mL)，补充加入1.75mL的70％乙醇，使得最终载体与花色苷的质量比为4：1。将上述复合溶液逐滴滴加至50mL去离子水中，调节体系pH值(1M HCl溶液调节)为3.0。搅拌10h后，得到负载花色苷的复合体系。使用超滤离心管(分子截留量为3KD)以8000rpm离心75min。收集内管和外管的样品，内管即为纳米粒子。

[0028] 实施例3

[0029] 将80mg单宁酸与80mg泊洛沙姆188分别溶解于4mL 70％的乙醇，搅拌均匀，将单宁酸溶液及泊洛沙姆188溶液以1：1(V/V)的比例混合后涡旋1min，得载体溶液。将花色苷100mg溶解于2.5mL 50％的乙醇中，将花色苷溶液(0.5mL)与载体溶液结合(0.5mL)，补充加入1.5mL的70％乙醇，使得最终载体与花色苷的质量比为2：1。将上述复合溶液逐滴滴加至
50mL去离子水中，调节体系pH值(1M HCl溶液调节)为3.0。搅拌10h后，得到负载花色苷的复合体系。使用超滤离心管(分子截留量为3KD)以8000rpm离心75min。收集内管和外管的样品，内管即为纳米粒子。

[0030] 实施例4

[0031] 将80mg单宁酸与80mg泊洛沙姆188分别溶解于4mL 70％的乙醇，搅拌均匀，将单宁酸溶液及泊洛沙姆188溶液以1：1(V/V)的比例混合后涡旋1min，得载体溶液。将花色苷100mg溶解于2.5mL 50％的乙醇中，将花色苷溶液(0.5mL)与载体溶液结合(1mL)，补充加入
1mL的70％乙醇，使得最终载体与花色苷的质量比为1：1。将上述复合溶液逐滴滴加至50mL去离子水中，调节体系pH值(1M HCl溶液调节)为3.0。搅拌10h后，得到负载花色苷的复合体系。使用超滤离心管(分子截留量为3KD)以8000rpm离心75min。收集内管和外管的样品，内管即为纳米粒子。

[0032] 实施例5

[0033] 将80mg单宁酸与80mg泊洛沙姆188分别溶解于4mL 70％的乙醇，搅拌均匀，将单宁酸溶液及泊洛沙姆188溶液以1：1(V/V)的比例混合后涡旋1min，得载体溶液。将花色苷100mg溶解于2.5mL 50％的乙醇中，将花色苷溶液(0.5mL)与载体溶液结合(1.5mL)，补充加入0.5mL的70％乙醇，使得最终载体与花色苷的质量比为2：3。将上述复合溶液逐滴滴加至
50mL去离子水中，调节体系pH值(1M HCl溶液调节)为3.0。搅拌10h后，得到负载花色苷的复合体系。使用超滤离心管(分子截留量为3KD)以8000rpm离心75min。收集内管和外管的样品，内管即为纳米粒子。

[0034] 实施例6

[0035] 将80mg单宁酸与80mg泊洛沙姆188分别溶解于4mL 70％的乙醇，搅拌均匀，将单宁酸溶液及泊洛沙姆188溶液以1：1(V/V)的比例混合后涡旋1min，得载体溶液。将花色苷100mg溶解于2.5mL 50％的乙醇中，将花色苷溶液(0.5mL)与载体溶液结合(2mL)，使得最终载体与花色苷的质量比为1：2。将上述复合溶液逐滴滴加至50mL去离子水中，调节体系pH值为3.0。搅拌10h后，得到负载花色苷的复合体系。使用超滤离心管(分子截留量为3KD)以
8000rpm离心75min。收集内管和外管的样品，内管即为纳米粒子。

[0036] 根据包封率及载药量选取最佳制备比例。选取实施例3的核壳结构纳米粒子，使用马尔文ZetasizerNano ZS90颗粒分析仪测量了平均粒径、多分散指数(PDI)和zeta电位。测定纳米粒子在不同处理条件下的稳定性。(Ⅰ)在水浴中将纳米粒子在90℃下加热180min，并在30、60、90、120、150和180min时取样，以测定纳米粒子的热稳定性。(Ⅱ)将纳米粒子放在光照箱(5000lx，50uW)中7d，在0、1、3、5和7d时取样，以测定纳米颗粒的光稳定性。(Ⅲ)将纳米粒子溶于PBS(pH＝7.4)溶液中，在37℃水浴中处理48h。(Ⅳ)分别在4℃、25℃和37℃下对样品进行储存温度稳定性分析。上述数据使用马文粒度分析仪在25℃下测量粒度和电位。所有样品均重复测量3次。分别通过粒度分布和PDI评估其稳定性状况。并测定光照及热处理后的保留率。

[0037] 使用胃肠模拟消化模型对花色苷和纳米粒子进行体外消化。样品分别在胃和肠道阶段消化2h。此外，所有样本都在固定的时间点采集，以备将来使用。利用紫外‑可见吸收光谱测定了不同消化样品中AN的保留率。

[0038] 将样品放入一个透析袋(截留分子量3500Da)中，透析袋中装有2mL样品，透析袋外是模拟的胃肠消化液。胃消化4h后，再次将样品放入肠道消化液中，在指定时间点取出释放介质。立即加入相同体积的新鲜培养基以保持固定体积。测定花色苷的释放率。为了研究纳米颗粒的酯酶反应释放特性，在肠道消化期给予酯酶(30U/mL)刺激，测量不同时间点的花色苷含量，并计算释放率。

[0039] 分别用花色苷、纳米粒子和载体处理细胞6h，用含30mMAA的培养基刺激细胞产生ROS，培养4h后弃培养基，用PBS洗细胞3次，然后加入ROS探针DCFDA(10μM)，再用PBS洗细胞(2‑3次)。在黑暗中培养30min后，用荧光倒置显微镜观察细胞，量化细胞内ROS的荧光水平。

[0040] 然后将细胞暴露于花色苷、纳米粒子和载体6h。去除培养基后，加入含丙烯酰胺(30mM)的培养基(1mL)，再刺激细胞12h。粉碎细胞，按照北京索瑞宝科技有限公司的生化试剂盒检CAT、SOD、GSH和MDA生化试剂盒进行检测。