一种含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物及制备方法和应用 |
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| 申请号 | CN202111064163.2 | 申请日 | 2021-09-10 | 公开(公告)号 | CN113767983A | 公开(公告)日 | 2021-12-10 |
| 申请人 | 河北省生殖医院; | 发明人 | 刘鹏; 张建瑞; 周英杰; 张勇; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及食品技术领域，尤其涉及一种含有婴儿籍 益生菌 的人乳冻干粉组合物及制备方法和应用，以人乳冻干粉、 益生元 和来自于婴儿本体的益生菌为原料，选用的益生菌更适合人体的肠道环境，在人体肠道中的定植能 力 更强，低温 冷冻干燥 工艺制备的人乳冻干粉最大程度地保存了人乳中有效成分的活性，延长人乳保质期的同时还能提供充足的营养物质，进一步促进肠道菌群的稳定建立。三种原料相互配合，相互协同，制得的组合物可有效促进肠道菌群定植，抑制有害菌的侵入，改善 机体 肠道微环境健康，提高机体免疫能力。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物的制备方法，其特征在于，所述组合物以人乳冻干粉、益生元和婴儿籍益生菌菌粉为制备原料，制备方法具体包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物及制备方法和应用 技术领域[0001] 本发明涉及食品技术领域，尤其涉及一种含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物及制备方法和应用。 背景技术[0003] 人体肠道内的菌群在生命初期就开始建立，直到4周岁以上才发育到相对稳定，在人体肠道菌群建立初期—婴儿期，是肠道菌群定制和建立的关键阶段，能为成年期稳定的肠道菌群的建立提供坚实的基础，母乳是婴儿肠道中微生物菌群的主要来源之一，也是促进婴儿肠道菌群建立和免疫功能发育重要方式，有文献报道，新鲜母乳中含有母乳多糖，被称为“人乳低聚糖”(HMOs)，对婴儿有保护作用，起益生元的作用，可以选择性的刺激双歧杆菌、乳酸杆菌的生长。但是受各种客观因素的影响，在人体肠道菌群的建立过程中很难一直保持母乳喂养，尤其是3周岁以后，幼儿开始与外界环境频繁接触，加上饮食和生活方式的改变，在这一过程中肠道菌群的状态极不稳定，不利于肠道菌群的正常建立。 [0004] 人体肠道菌群在建立以后也不是一成不变的，与人体的身体状态、生活方式和生活习惯息息相关，各种不利因素如生活作息不规律，饮食不健康，生活环境恶劣等问题，都会引起人体肠道菌群的紊乱，引发不同的肠道疾病，严重的还会危及人的生命安全，在这类疾病的治疗过程中，常常使用抗生素进行治疗，也存在很大的副作用。 发明内容[0005] 针对现有技术中人体肠道菌群的建立初期受外界因素影响大，易受到有害菌的侵入影响，建立缓慢，抗生素调节紊乱状态的肠道菌群存在很大的副作用的技术问题，本发明提供一种含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物的制备方法，以从婴儿肠道中筛选的益生菌、人乳冻干粉和益生元为原料，制得的组合物能有效抑制有害菌的侵入，促进原籍菌株的定植，保证肠道菌群的稳定建立。 [0006] 为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案： [0007] 首先，本发明实施例提供了一种含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物的制备方法：以人乳冻干粉、益生元和婴儿籍益生菌菌粉为制备原料，该制备方法具体包括以下步骤： [0008] S1：取由婴儿肠道中分离纯化得到的益生菌菌株，活化培养3代后接种到无菌液体培养基中发酵培养，离心得到的婴儿籍益生菌菌泥，将所得婴儿籍益生菌菌泥与菌粉保护剂混合乳化后，低温冷冻干燥去除水分，粉碎过筛，即得婴儿籍益生菌菌粉； [0009] S2：取健康乳母人乳，进行巴氏灭菌后低温冷冻干燥，去除水分后粉碎过筛，即得人乳冻干粉； [0010] S3：将S1中所得婴儿籍益生菌菌粉、S2中所得人乳冻干粉与益生元在无菌条件下混合均匀，即得含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物。 [0011] 相对于现有技术，本申请公开的含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物的制备方法以人乳冻干粉、益生元和来自于婴儿肠道的益生菌菌粉为原料，婴儿肠道的益生菌相对于其他来源的益生菌而言更适合人体的肠道环境，结合特定的制备方法，能最大限度地保留益生菌的活性和状态，促进益生菌在人体肠道中的稳定定植，从而有利于肠道菌群的稳定建立；低温冷冻干燥制得的人乳冻干粉，不仅延长了人乳的保质期，还最大程度地保留了人乳中的有效活性物质，复原后的人乳冻干粉能为人体生长提供易吸收的营养物质，进一步促进肠道菌群的建立，维护肠道菌群的稳定状态；益生元对改善机体的胃肠道健康微生态也具有重要作用，可以促进肠道中有益菌的定植，还能对肠道中已经存在的菌群进行调节和充足，提高肠胃动力及消化吸收能力，改善胃管和食道蠕动收缩幅度低，胃排空延迟的状况，降低喂养不耐受的发生。 [0012] 三种原料相互配合，相互协同，制得的组合物能有效促进肠道菌群定植，改善机体肠道微环境健康，提高机体免疫能力。 [0013] 由于婴儿肠道的益生菌来源于母亲的口腔、产道、肠道、分娩前的以羊水为通路的母婴菌群传递、分娩过程中产道菌群的垂直传递、哺乳过程中微生物的传递、母婴亲密接触菌群的交叉传递等，相对于其他来源的益生菌而言更适合婴儿本人及与其共同生活的家庭成员的肠道环境，故该方法制得的产品对于该婴儿本人或与其共同生活的家庭成员更为适用，可应用于该婴儿本人或其家庭成员在3周岁之后的各个阶段，能调节该婴儿本人或其家庭成员肠道菌群稳定，为其本人和家庭成员的健康保驾护航。 [0014] 在发明人的研究过程中还发现，本发明提供的组合物在调节与该婴儿共同生活的家庭成员肠胃中的菌落状态过程中具有突出的效果，其家庭成员服用本发明提供的含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物后肠道微生物紊乱症状明显改善。 [0015] 优选地，S1中所用的菌粉保护剂为海藻糖、甘油、脱脂奶粉、乳糖和吐温‑80的混合物。 [0016] 优选地，该含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物中的活菌数≥1×108CFU/g。 [0017] 经发明人探究，1×108CFU/g的活菌数含量是改善机体肠道微环境健康，提高机体免疫力，抵御致病菌侵入，维持肠道的屏蔽功能，防止其他条件致病菌的定植的最低浓度。 [0018] 优选地，益生元包括低聚果糖和低聚半乳糖，其中两者的质量和不低于益生元总质量的2/3。 [0019] 低聚果糖和低聚半乳糖是促进双歧杆菌和植物乳杆菌在肠道中定植的有效成分，同时还能促进肠道对营养成分的吸收，改善肠道、促进肠道蠕动的功能，对肠道菌群的建立和肠道功能的完善有重要作用。 [0020] 优选地，S2中的低温冷冻干燥过程在冷冻干燥机中进行，具体包括预冷冻过程和冻干过程，整个低温冷冻干燥过程维持冷冻干燥机内冷肼温度在‑30℃～‑40℃之间，真空度＜30Pa，预冷冻过程持续为2.5～3.5h。 [0021] 冷冻干燥与喷雾干燥相比处理温度更低，可有效避免乳液中的有效成分因高温而被破坏，预冷冻工序的加入还能使待干燥样品在冷冻干燥前凝固成固态，避免液态的样品在真空干燥过程中飞溅造成损失，也有助于保护样品中有效成分的含量稳定。 [0022] 优选地，在冷冻干燥机中进行的冻干过程前后共分为7个阶段，其中第1‑6阶段每阶段的持续时间为1.5～2.5h，第7阶段持续时间为8～10h，整段冻干过程中控制样品温度在‑25℃～35℃的区间内随冻干阶段的变化梯度上升。 [0023] 样品温度在特定范围中的梯度上升，能在提高水分去除效率，缩短冻干时间的同时，最大限度地除去样品中的水分，保护样品中活性物质的性质稳定。 [0024] 本发明还提供了一种含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物，采用上述含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物制备方法制得，其中婴儿籍益生菌菌粉为两歧双歧杆菌HRHCC001，乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003制成的菌粉的混合物。 [0025] 优选该含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物的各制备原料的质量百分含量为：婴儿籍益生菌菌粉2％‑4％，人乳冻干粉28％‑32％和益生元65％‑70％；婴儿籍益生菌菌粉中两歧双歧杆菌HRHCC001制成的菌粉、乳双歧杆菌HRHCC002制成的菌粉和植物乳杆菌HRHCC003制成的菌粉的质量比为：0.8‑1.2：0.8‑1.2：1.6‑2.4，组合物中的活菌数含量≥1 8 ×10 CFU/g。当质量百分比、活菌数含量、质量比均采用上述优选范围时，所得产品的抑菌性能最突出、在肠道中的定植能力最优。 [0026] 本发明所用到的两歧双歧杆菌HRHCC001，其分类名称为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，已于2021年6月4日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号：CGMCC No.22656； [0027] 本发明用到的乳双歧杆菌HRHCC002，其分类名称为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，已于2021年6月4日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号：CGMCC No.22657。 [0028] 本发明用到的植物乳杆菌HRHCC003，其分类名称为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，已于2021年6月4日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号：CGMCC No.22658。 [0029] 研究发现，分离于健康婴儿肠道中的两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003在抗菌性能方面具有相互促进，相配合的协同作用，能在促进肠道中益生菌定植的同时抑制肠道中有害菌的侵入，更有助于肠道菌群的建立，维护肠道菌群的稳定，调节紊乱状态下的肠道菌群。由以上两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003作为婴儿籍益生菌原料的人乳冻干粉组合物不仅能够显著改善该婴儿家庭成员的肠道菌群紊乱状态，对于其他人的肠道菌群紊乱状态也有明显的改善作用。 [0030] 优选地，该组合物可制成的剂型包括粉剂，颗粒剂或片剂。 [0031] 第二方面，本发明实施例还提供了上述含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物在幼儿饮品、食品以及成人饮品食品领域中的应用，制备供3周岁以上幼儿服用的幼儿饮品、食品或成人饮品、食品，其中幼儿食品包括幼儿主食和辅助食品。 具体实施方式[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0033] 人体内的肠道菌群在保持人体健康中起着至关重要的作用，肠道菌群在生命初期就开始建立，直到4周岁以上才发育到相对稳定，在人体肠道菌群建立初期—婴儿期，是肠道菌群定制和建立的关键阶段，能为成年期稳定的肠道菌群的建立提供坚实的基础，母乳是婴儿肠道中微生物菌群的主要来源之一，也是促进婴儿肠道菌群建立和免疫功能发育重要方式，有文献报道，新鲜母乳中含有母乳多糖，被称为“人乳低聚糖”(HMOs)，对婴儿有保护作用，起益生元的作用，可以选择性的刺激双歧杆菌、乳酸杆菌的生长。但是受各种客观因素的影响，在人体肠道菌群的建立过程中很难一直保持母乳喂养，尤其是3周岁以后，婴儿开始与外界环境频繁接触，加上饮食和生活方式的改变，在这一过程中肠道菌群的状态极不稳定，不利于肠道菌群的正常建立。人体肠道菌群在建立以后也不是一成不变的，与人体的身体状态、生活方式和生活习惯息息相关，各种不利因素如生活作息不规律，饮食不健康，生活环境恶劣等问题，都会引起人体肠道菌群的紊乱，引发不同的肠道疾病，严重的还会危及人的生命安全，在这类疾病的治疗过程中，也常常使用抗生素等灭活的方式进行治疗，副作用很大。 [0034] 为了得到一种能有效促进肠道菌群的稳定建立，促进原籍菌株定殖，调节肠道菌群稳定的组合物，本申请提供了一种含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物的制备方法：以人乳冻干粉、益生元和婴儿籍益生菌菌粉为原料，该制备方法具体包括以下步骤： [0035] S1：取由婴儿肠道中分离纯化得到的益生菌菌株，活化培养3代后接种至无菌液体培养基中发酵培养，离心得到的婴儿籍益生菌菌泥，将所述婴儿籍益生菌菌泥与菌粉保护剂混合乳化后，低温冷冻干燥去除水分，粉碎过筛，即得婴儿籍益生菌菌粉； [0036] S2：取健康乳母人乳，进行巴氏灭菌后低温冷冻干燥，去除水分后粉碎过筛，即得人乳冻干粉； [0037] S3：将S1中所得婴儿籍益生菌、S2中所得人乳冻干粉与益生元在无菌条件中混合均匀，即得含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物。以人乳冻干粉、益生元和来自于婴儿肠道的益生菌菌粉为原料，婴儿肠道的益生菌相对于其他来源的益生菌而言更适合人体的肠道环境，结合特定的制备方法，能使最大限度地保留益生菌的活性和状态，促进益生菌在人体肠道中的稳定定植，从而有利于肠道菌群的稳定建立；低温冷冻干燥制得的人乳冻干粉，不仅延长了人乳的保质期，还最大程度地保留了人乳中的有效活性物质，复原后地人乳冻干粉能为人体生长提供易吸收的营养物质，进一步促进肠道菌群的建立，维护肠道菌群的稳定状态；益生元对改善机体的胃肠道健康微生态具有重要作用，可以促进肠道中有益菌的定植，还能对肠道中已经存在的菌群进行调节和充足，提高肠胃动力及消化吸收能力，改善胃管和食道蠕动收缩幅度低，胃排空延迟的状况，降低喂养不耐受的发生。 [0038] 三种原料相互配合，相互协同，制得的组合物能有效促进肠道菌群定植，改善机体肠道微环境健康，提高机体免疫能力。 [0039] 由于婴儿肠道的益生菌来源于母亲的口腔、产道、肠道、分娩前的以羊水为通路的母婴菌群传递、分娩过程中产道菌群的垂直传递、哺乳过程中微生物的传递、母婴亲密接触菌群的交叉传递等，相对于其他来源的益生菌而言更适合婴儿本人及与其共同生活的家庭成员的肠道环境，故该方法制得的产品对于该婴儿本人或与其共同生活的家庭成员更为适用，可应用于该婴儿本人或其家庭成员在3周岁之后的各个阶段，能调节该婴儿本人或其家庭成员肠道菌群稳定，为其本人和家庭成员的健康保驾护航。 [0040] 在发明人的研究过程中还发现，本发明提供的组合物在调节与该婴儿共同生活的家庭成员肠胃中的菌落状态过程中具有突出的效果，其家庭成员服用本发明提供的含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物后肠道微生物紊乱症状明显改善。 [0041] 示例性的，S1中所用的菌粉保护剂为海藻糖、甘油、脱脂奶粉、乳糖和吐温‑80的混合物。 [0042] 经发明人探究，含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物的活菌数为1×108CFU/g时是改善机体肠道微环境健康，提高机体免疫力，抵御致病菌侵入，维持肠道的屏蔽功能，防止其他条件致病菌的定植的最低含量，因此含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物中的8 活菌数≥1×10CFU/g。 [0043] 示例性的，本申请采用的益生元包括低聚果糖和低聚半乳糖，其中两者的质量和不低于益生元总质量的2/3，作为促进双歧杆菌和植物乳杆菌在肠道中定植的有效成分，低聚半乳糖和低聚果糖还能促进肠道对营养成分的吸收，改善肠道功能，促进肠道蠕动的功能，对肠道菌群的建立和肠道功能的完善有重要作用。 [0044] 为了避免在真空干燥过程中样品飞溅，避免有效成分的损失，最大限度地保护有效成分的功能和含量的稳定，S2中的低温冷冻干燥过程在冷冻干燥机中进行，具体包括预冷冻过程和干燥过程，其中预冷冻过程时间为2.5～3.5h，整个低温冷冻干燥过程维持冷冻干燥机内冷肼温度在‑30℃～‑40℃之间，真空度＜30Pa。 [0045] 为了保证待干燥样品中水分的去除效率，缩短冻干时间，保证有效成分活性，在冷冻干燥机中进行的冻干过程共分为7个阶段，其中第1‑6阶段每阶段持续时间均为1.5h～2.5h，第7阶段持续时间为8～10h，整个干燥过程中控制样品温度在‑25℃～35℃的区间内随冻干阶段的变化梯度上升。 [0046] 本发明还提供了一种含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物，采用上述含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物的制备方法制得，其中婴儿籍益生菌菌粉为两歧双歧杆菌HRHCC001，乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003制成的菌粉的混合物。该含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物的各制备原料的质量百分含量为：婴儿籍益生菌菌粉2％‑4％，人乳冻干粉28％‑32％和益生元65％‑70％；其中该组合物中的活菌数含量≥1× 8 10CFU/g，婴儿籍益生菌菌粉中两歧双歧杆菌HRHCC001制成的菌粉、乳双歧杆菌HRHCC002制成的菌粉和植物乳杆菌HRHCC003制成的菌粉的质量比为：0.8‑1.2：0.8‑1.2：1.6‑2.4。 [0047] 本发明所用到的两歧双歧杆菌HRHCC001，其分类名称为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，已于2021年6月4日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号：CGMCC No.22656； [0048] 具体筛选方法为： [0049] A1：取18个月健康婴儿的新鲜粪便，用无菌生理盐水进行倍数稀释后，得到粪便的‑4 ‑510 ，10 稀释液： [0050] A2：取稀释液分别涂布于MRS固体培养基和含有莫匹罗星锂盐的MRS固体培养基中厌氧培养48‑72h，分别选取培养后的单菌落，挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养18‑24h，培养基浑浊后，于首次培养相同的培养基中划线，厌氧培养48‑72h，至少重复3次，直至得到菌落，菌体形态均一的菌； [0051] A3：利用基因组提取试剂盒提取分离到菌株的基因组，以该基因组DNA为模板，用细菌通用引物27F和1492R进行16s rDNA(序列如SEQ ID NO.1所示)扩增后，电泳检测PCR产物在1.5KB处有条带，将PCR产物进行测序，将所得序列上传至NCBI进行BLAST比对，结果与两歧双歧杆菌相似度较高，且均大于97％，则认定该菌归属于两歧双歧杆菌，命名为两歧双歧杆菌HRHCC001，将该菌保存于可立式细菌冻存管中，送至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号：CGMCC No.22656。 [0052] 本发明用到的乳双歧杆菌HRHCC002，其分类名称为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，已于2021年6月4日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号：CGMCC No.22657。 [0053] 具体筛选方法为： [0054] B1：取与两歧双歧杆菌HRHCC001来源相同婴儿24个月时的新鲜粪便，用无菌生理‑4 ‑5盐水进行倍数稀释后，得到粪便的10 ，10 稀释液： [0055] B2：取稀释液分别涂布于MRS固体培养基和含有莫匹罗星锂盐的MRS固体培养基中厌氧培养48‑72h，分别选取培养后的单菌落，挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养18‑24h，培养基浑浊后，于首次培养相同的培养基中划线，厌氧培养48‑72h，至少重复3次，直至得到菌落，菌体形态均一的菌； [0056] B3：利用基因组提取试剂盒提取分离到菌株的基因组，以该基因组DNA为模板，用细菌通用引物27F和1492R进行16s rDNA(序列如SEQ ID NO.2所示)扩增后，电泳检测PCR产物在1.5KB处有条带，将PCR产物进行测序，将所得序列上传至NCBI进行BLAST比对，结果与乳双歧杆菌相似度较高，且均大于97％，则认定该菌归属于乳双歧杆菌，命名为乳双歧杆菌HRHCC002，将该菌保存于可立式细菌冻存管中，送至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号：CGMCC No.22657。 [0057] 本发明用到的植物乳杆菌HRHCC003，其分类名称为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，已于2021年6月4日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号：CGMCC No.22658。 [0058] 具体筛选方法为： [0059] C1：取与两歧双歧杆菌HRHCC001来源相同婴儿30个月时的新鲜粪便，用无菌生理‑4 ‑5盐水进行倍数稀释后，得到粪便的10 ，10 稀释液： [0060] C2：取稀释液分别涂布于MRS固体培养基和含有莫匹罗星锂盐的MRS固体培养基中厌氧培养48‑72h，分别选取培养后的单菌落，挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养18‑24h，培养基浑浊后，于首次培养相同的培养基中划线，厌氧培养48‑72h，至少重复3次，直至得到菌落，菌体形态均一的菌； [0061] C3：利用基因组提取试剂盒提取分离到菌株的基因组，以该基因组DNA为模板，用细菌通用引物27F和1492R进行16s rDNA(序列如SEQ ID NO.3所示)扩增后，电泳检测PCR产物在1.5KB处有条带，将PCR产物进行测序，将所得序列上传至NCBI进行BLAST比对，结果与植物乳杆菌的相似度较高，且均大于97％，则认定该菌归属于植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌HRHCC003，将该菌保存于可立式细菌冻存管中，送至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号：CGMCC No.22658。 [0062] 据研究，分离于健康婴儿肠道中的两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003在抗菌性能方面具有相互促进，相配合的协同作用，能在促进肠道中益生菌定植的同时抑制肠道中有害菌的侵入，更有助于肠道菌群的建立，维护肠道菌群的稳定，调节紊乱状态下的肠道菌群。由以上两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003作为婴儿籍益生菌原料的人乳冻干粉组合物不仅能够显著改善该婴儿家庭成员的肠道菌群紊乱状态，对于其他人的肠道菌群紊乱状态也有明显的改善作用。 [0063] 优选地，该组合物可制成的剂型包括粉剂，颗粒剂或片剂。 [0064] 第二方面，本发明实施例还提供了上述含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物在幼儿饮品、食品以及成人饮品食品领域中的应用，制备供3周岁以上幼儿服用的幼儿饮品、食品或成人饮品、食品，其中幼儿食品包括幼儿主食和辅助食品。 [0065] 下面分为多个实施例对本发明进行进一步的说明。 [0066] 实施例1 [0067] 本实施例提供一种含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物，该含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉组合物以人乳冻干粉、益生元、以及由两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003制成的菌粉为原料制成，该组合物的制备方法具体包括以下步骤： [0068] S1：分别取两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003，将菌株进行活化，连续培养3代后，分别接种至120L已经灭菌后的液体培养基中，在37℃的条件下发酵，监测pH值、OD值和耗碱量，至收获点后离心收获，分别得到相应益生菌的菌泥，将菌泥与海藻糖、甘油、脱脂奶粉、乳糖和吐温‑80所组成的菌粉保护剂以1：1.7的质量比混合乳化，置于预冷的冻干机中冻干，收集冻干物质，即得三种益生菌的对应的菌粉； [0069] S2：收集健康乳母多余的乳汁，用母乳分析仪检测营养成分状况后，在65℃的环境中巴氏灭菌30min，将巴氏灭菌后的人乳转移至冷冻干燥托盘中，以在冷冻干燥机中进行冻干，具体的冻干程序为： [0070] 预冷冻：冷肼温度‑35℃，3小时； [0071] 一段冻干：冷肼温度‑35℃，样本温度‑25℃，2小时，真空度＜30Pa； [0072] 二段冻干：冷肼温度‑35℃，样本温度‑15℃，2小时，真空度＜30Pa； [0073] 三段冻干：冷肼温度‑35℃，样本温度‑5℃，2小时，真空度＜30Pa； [0074] 四段冻干：冷肼温度‑35℃，样本温度5℃，2小时，真空度＜30Pa； [0075] 五段冻干：冷肼温度‑35℃，样本温度15℃，2小时，真空度＜30Pa； [0076] 六段冻干：冷肼温度‑35℃，样本温度25℃，2小时，真空度＜30Pa； [0077] 七段冻干：冷肼温度‑35℃，样本温度35℃，9小时，真空度＜30Pa，冻干程序结束后，关闭冷冻干燥机，将剩余物质粉碎过筛后，即得人乳冻干粉。 [0078] S3：取0.5kg两歧双歧杆菌HRHCC001制成的菌粉、0.5kg乳双歧杆菌HRHCC002制成的菌粉、1.0kg植物乳杆菌HRHCC003制成的菌粉、30kg人乳冻干粉，34kg低聚果糖、34kg低聚半乳糖，于无菌混料罐中搅拌10min后混合均匀，即得该含有婴儿籍益生菌的人乳冻干粉混8 合物，经检测该组合物中益生菌的含量达5×10cfu/g，将所得混合物密封包装备用。 [0079] 实施例2 [0080] 本实施例提供3种益生菌：两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003的抑菌实验； [0081] (1)：取两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003，分别混合后得到4组样品，其中第1‑3组样品分别为两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003单菌株，第4组样品为两歧双歧杆菌HRHCC001+乳双歧杆菌HRHCC002+植物乳杆菌HRHCC003混合菌，将4组混合菌粉分别接种于100mlMRS液体培养基中，于37℃静置培养48h，得到对应的益生菌培养物； [0082] (2)：取活化后的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，分别加入5wt％胰蛋白大6 豆肉汤中配制成浓度为1×10 CFU/ml的细菌培养液，将所制得的大肠杆菌培养液、沙门氏菌培养液和金黄色葡萄球菌培养液分别涂布于装有胰蛋白大豆肉汤培养基的培养皿中，每种细菌培养液准备4组培养皿；与步骤(1)中所制得的4种益生菌培养物相对应； [0083] (3)：用毛细血管将步骤(1)中所得的4组益生菌培养物分别滴于圆形滤纸片上，并将其对称贴于步骤(2)中所得培养皿的中央区域，于37℃的培育箱中培育24h，测量各培养皿中抗菌区域的直径，结果如表1所示： [0084] 表1不同组成的益生菌抑菌实验所得的抑菌圈直径 [0085] [0086] 根据表1中的数据可以知晓：第4组的混合菌在抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的实验中的抑菌圈直径均大于第1‑3组中的单一菌，说明两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003三者在抑菌方面可以相互配合，相互促进，共同提高抗菌性能，从而有效抑制肠道中有害菌的侵入，促进肠道菌群的正常建立，维持肠道菌群的健康状态。 [0087] 实施例3 [0088] 本实施例进行实施例1中所得人乳冻干粉的复原实验 [0089] 向实施例1中步骤S2所制得的人乳冻干粉原料分别按原体积的80％、100％，120％加水溶解，利用母乳分析仪检测复原乳中的有效成分，与原人乳中的有效成分含量做对比，判断人乳冻干粉的冻干情况，结果如表2所示： [0090] 表2人乳及冻干粉复原乳中主要成分分布 [0091] 项目 原乳 80％复原 100％复原 120％复原 单位脂肪 3.84 4.91 3.71 2.9 g/100g 蛋白质 0.94 1.13 0.91 0.67 g/100g 乳糖 7.11 8.18 7.26 5.83 g/100g 能量 63.52 79.9 61.41 51.53 kcal/100g 矿物质 0.19 0.25 0.16 0.12 g/100g 密度 88.28 109.16 87.96 74.07 g/100g 锌 1.56 1.63 1.48 1.11 μg/ml 铁 1.42 1.82 1.55 1.29 μg/ml 钙 214.5 254.21 209.6 175.52 μg/ml [0092] 根据表2中的数据可知，本申请提供的人乳冻干工艺不影响人乳中的主要成分，能最大限度地除去人乳中的原有成分，更适合作为组合物的成分，有效替代人乳，对婴儿肠道中菌群的建立有突出的贡献。 [0093] 对比例1 [0094] 本对比例提供一种含有益生菌的人乳冻干粉组合物(非婴儿本体)，与实施例1相比，除所用两歧双歧杆菌菌粉和植物乳杆菌菌粉采购自山东中科嘉亿生物工程有限公司、乳双歧杆菌菌粉采购自威凯海思(山东)生物工程有限公司外，其余制备工艺参数与实施例1保持一致。 [0095] 对比例2 [0096] 本对比例提供一种含有婴儿籍益生菌的牛乳冻干粉组合物，与实施例1相比，除所用人乳冻干粉用牛乳冻干粉和其他的添加剂参照人乳中的成分配比所制得的混合物代替以外，其余制备工艺参数与实施例1保持一致，其中牛乳冻干粉与添加剂所组成的混合物包括以下质量份数的组分：生牛乳40份，脱盐乳清粉29份，白砂糖6份，3’唾液酸乳糖1.6份，磷脂0.5份，DHA藻油粉0.16份，花生四烯酸粉剂0.12份，唾液酸0.15份，核苷酸0.03份，复合维生素0.35份，复合矿物质0.16份。 [0097] 效果例： [0098] 取实施例1，对比例1和对比例2所制得的组合物样品，分别作为幼儿食品和成人饮品检验其对幼儿肠道菌群的定植效果和成人紊乱的肠道菌群的调节效果，具体实验方案如下： [0099] 一、幼儿肠道菌群定植实验 [0100] 选取21名3周岁以上正常发育的幼儿，具体选取标准为：同地区，同年龄且近一个月未服用任何药物，无急慢性疾病，健康状态良好，不患有艾滋病、结核病、乙肝等传染性疾病，符合赫尔辛基宣言，且与父母签订知情同意书。 [0101] 21名幼儿中，其中一名幼儿为筛选出两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003的幼儿本体，作为实验组1，其余20名幼儿等分为4组，分别作为实验组2‑实验组5，取等量实施例1、对比例1和对比例2所制得的组合物，加等量水溶解后分别喂养21名幼儿，具体喂养方案为，实验组1和实验组2服用实施例1所制得的组合物，实验组3服用对比例1所制得的组合物，实验组4服用对比例2所制得的组合物，实验组5为空白对照组不服用，每日2次，每次2g，服用两周。利用RT‑PCR检测方法，检测试服前、试服2周、停服1周后，各实验组幼儿肠道中的双歧杆菌、乳酸菌的含量，各实验组所得数据的平均值如表4所示： [0102] 其中，利用RT‑PCR检测方法检测益生菌含量的具体方法如下： [0103] 用RT‑PCR对基因组进行PCR，检测婴儿粪便中双歧杆菌、乳杆菌的含量。双歧杆菌体系检测方法为，天根SYBR green Mix(probe)10μL、引物各0.6μL、模板2μL、水6.4μL，探针0.4μL，模板2μL，反应条件为：50℃保持120s，95℃预变性15min，95℃15s，60℃1min，45个循环。 [0104] 乳杆菌检测采用30微升的体系，包括SYBR green Mix 10μL，水6.8μL，引物各0.6μL，模板2μL反应条件为：50℃保持120s，95℃预变性900s，95℃15s，60℃30s，72℃45s，45个循环，熔解温度65℃‑95℃，具体引物见表3 [0105] 表3双歧杆菌、乳杆菌检测引物序列 [0106] [0107] 表4 [0108] [0109] [0110] 从表3中实验组2和实验组5的数据对比中可以看出，本发明实施例1所制得的组合物具有突出的促进肠道菌群定植能力；从实验组2和实验组3、实验组4数据对比可以看出，本发明实施例1所制得的组合物在促进肠道菌群定植能力上优于对比例1和对比例2所制得的组合物，从实验组1和实验组2的数据对比中可以看出，从本体中筛选得到的益生菌制备的组合物在促进幼儿肠道菌群的效果优于从非本体中筛选得到的益生菌制备的组合物。 [0111] 二、成人肠道菌群紊乱调节实验 [0112] 选取21名肠道菌群处于紊乱状态的患者，具体的选取标准为：同地区年龄相近，患有肠道菌群紊乱所致的便秘，腹泻患者，不患有艾滋病、结核病、乙肝等传染性疾病，符合赫尔辛基宣言，且签订知情同意书。 [0113] 21名患者中，其中一名为筛选出两歧双歧杆菌HRHCC001、乳双歧杆菌HRHCC002和植物乳杆菌HRHCC003幼儿的父亲(共同生活)，作为实验组a，其余20名患者等分为4组，分别作为实验组b‑实验组e。取等量实施例1，对比例1和对比例2所制得的组合物，加等量水溶解后分别给21名患者服用，其中实验组a和实验组b服用实施例1所制得的组合物，实验组c服用对比例1所制得的组合物，实验组d服用对比例2所制得的组合物，实验组e空白对照组不服用，每日3次，服用两周。利用与实验一相同的RT‑PCR检测方法，检测试服前、试服2周、停服1周后，各实验组患者肠道中的双歧杆菌、乳酸菌的含量，各实验组所得数据的平均值结果如表5所示： [0114] 表5 [0115] [0116] 从表5中实验组b和实验组e的数据对比中可以看出，本发明实施例1所制得的组合物能有效调节成年人紊乱的肠道菌群系统；从实验组b和实验组c、实验组d数据对比可以看出，本发明实施例1所制得的组合物在调节肠道菌群紊乱，维护肠道菌群健康方面对于共同生活的家庭成员以及非共同生活的其他人都具有显著的改善作用，且优于对比例1和对比例2所制得的组合物，从实验组a和实验组b的数据对比中可以看出，同家族婴儿体内筛选得到的益生菌制备的组合物调节肠道菌群紊乱状态效果优于非同家族婴儿体内筛选得到的益生菌制备的组合物。 |
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