具有改善的性质的淀粉酶多肽 |
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| 申请号 | CN202280032528.X | 申请日 | 2022-04-06 | 公开(公告)号 | CN117769596A | 公开(公告)日 | 2024-03-26 |
| 申请人 | 杜邦营养生物科学有限公司; | 发明人 | S·多伊格; R·弗里施; S·哈宁; F·沃特库普曼; K·马蒂亚斯克拉格; L·克拉格; C·莱夫朗; S·普莱斯鲁斯; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及多肽，更特别地 淀粉 酶多肽和编码这些多肽的核酸，以及它们例如作为非生麦芽糖外切淀粉酶在生产食物产品或 饲料 产品中的用途。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)淀粉酶(PS4)变体或其淀粉酶活性片段，其中所述变体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，并且其中所述PS4变体在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、172、 |
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| 说明书全文 | 具有改善的性质的淀粉酶多肽技术领域背景技术[0002] 淀粉酶可以改善谷类淀粉转化中(如烘焙中)固有的问题。面包瓤的特征可以在于其中存在分子网络。面包老化是一个动态过程，其中面包瓤中的分子网络发生变化。当面包老化时，面包失去了面包瓤的柔软度和面包瓤的水分，伴随着面包弹性的丧失。因此，面包瓤的弹性变差，面包形成坚韧的面包皮。 [0003] 不受任何特定理论的束缚，据信两个分子网络对面包的质地性质(如面包柔软度和面包弹性)特别重要；1)由面筋蛋白形成的网络和2)由淀粉聚合物支链淀粉形成的网络。支链淀粉是非常大的支链分子，由通过(1‑4)键连接的α‑D‑吡喃葡萄糖基单元组成，其中这些链通过α‑(1‑6)键附接形成分支(也称为侧链)。面筋网络和支链淀粉网络两者的性质都会受到淀粉修饰淀粉酶的影响，即使对面筋网络的影响是间接的。在面团中，大部分支链淀粉以结晶形式存在于淀粉颗粒内。在烘焙过程中，淀粉颗粒会在称为糊化的过程中吸收水分，并且一些支链淀粉会从淀粉颗粒中漏出。在刚出炉的面包中，大部分支链淀粉将不再是结晶形式，而是在整个面包中形成无定形网络。随着时间的推移，支链淀粉将重结晶(称为回生的过程)，从而形成更强的网络，这进而导致与面包老化相关的面包柔软度和弹性降低。支链淀粉回生的速度和程度取决于支链淀粉侧链的长度，较短的侧链减慢回生速度。 [0004] 当支链淀粉重结晶时，它结合水，这导致面包瓤内的水迁移。这种水迁移的重要后果是面筋网络失去了一些塑化水(plasticizing water)，柔性变差。这与面包弹性的丧失有关。 [0005] 为了减缓面包产品的老化，在面包制作工业中使用所谓的抗老化淀粉酶是非常常见的。有效的抗老化淀粉酶需要对温度失活具有高度抵抗力，以便在整个烘焙过程中保持活性。此外，需要有效地缩短支链淀粉侧链，以延缓支链淀粉重结晶。大多数用于抗老化的淀粉酶主要是外切作用的，这意味着它们主要在侧链末端附近的键处水解支链淀粉，从而缩短侧链，但对支链淀粉的大小几乎没有影响。然而，大多数抗老化淀粉酶也具有一些有限的内切活性，这意味着它们能够水解支链淀粉主链内部的键，这对支链淀粉的大小有更大的影响。 [0006] 据信，一些有限的内切活性在面包柔软度、体积和面包瓤水分方面是有益的，但过多的内切活性会通过产生粘性或胶状面包瓤而对最终面包产品的质量产生负面影响。不受任何特定理论的束缚，据信有效的抗老化淀粉酶需要同时具有外切和内切活性。市场上一些最成功的抗老化淀粉酶是来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的成麦芽四糖淀粉酶(G4淀粉酶)的变体。 [0007] 然而，市场上有延长保质期的趋势，即预期面包即使在储存21天后仍能保持高水平的柔软度和弹性。为了实现更长的保质期，市场上需要更好的抗老化G4淀粉酶，在延长的储存时间内提供更高的弹性和柔软度。 发明内容[0008] 根据本发明的一个方面，提供了嗜糖假单胞菌淀粉酶(PS4)变体或其淀粉酶活性片段，其中该变体具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，并且其中该PS4变体或其淀粉酶活性片段在以下位置中的一个或多个处具有氨基酸取代：31、58、172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0009] 根据本发明的任何方面，关于氨基酸序列的同一性程度可以在SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:23(如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:22)的残基1至429上确定。 [0010] 任选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少 71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。 [0011] 任选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有对应于以下的一个或多个氨基酸取代：31V、58P、172R、230S、362P、118E、209N、249S、301P、369F、377Q、404L、407F或421S。 [0012] 任选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有以下氨基酸取代中的一个或多个：68S、145Q、155P、220M、3V、110I、169H、179V、188E、188R、205Q、313A、313W、367T、399E、422Y、 110I、179N、188E或313W。 [0013] 任选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有以下取代中的一个或多个：34Q、145D、179R、200G、223W、169R、179N或420G。 [0014] 任选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:17具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。 [0015] 任选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:17具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、 78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸序列。 [0016] 任选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:17的氨基酸序列。 [0017] 任选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有比SEQ ID NO:18的解链温度高至少约0.5℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃或7℃的解链温度。 [0018] 任选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有SEQ ID NO:18的外切与内切活性比率的至少约50％、75％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％或800％的外切与内切活性比率。 [0019] 在本发明的另一方面，提供了如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段作为食物添加剂或饲料添加剂的用途。 [0020] 在本发明的另一方面，提供了用于通过以下处理淀粉的方法：使淀粉与如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段接触，以及允许该PS4变体或其淀粉酶活性片段从该淀粉产生一种或多种线性产物。 [0021] 在本发明的另一方面，提供了如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段在制备食物产品或饲料产品中的用途。 [0022] 在本发明的另一方面，提供了用于制备食物产品或饲料产品的方法，该方法具有将如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段与食物或饲料成分混合的步骤。 [0023] 任选地，该用途或方法中的食物产品是面团或面团产品。更优选地，面团产品是经加工的面团产品。 [0024] 任选地，该用途或方法中的食物产品是烘焙产品。 [0025] 根据本发明的另一方面，提供了用于制作烘焙产品的方法，该方法具有以下步骤：(a)提供淀粉培养基；(b)向该淀粉培养基中添加如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段； 以及(c)在步骤(b)期间或之后对该淀粉培养基加热以生产烘焙产品。 [0026] 在本发明的另一方面，提供了通过如上所述的用途或方法获得的食物产品、饲料产品、面团产品或烘焙产品。 [0027] 根据本发明的另一方面，提供了制作糖浆的方法，该方法具有将如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段添加到颗粒状淀粉液化物中以形成糖浆的步骤。 [0028] 在本发明的另一方面，提供了面团，其包含如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。任选地，面团具有用于改善面团和/或由其制得的烘焙产品的至少一种额外的酶。任选地，额外的酶是以下中的一种或多种：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫化物异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶，其中该淀粉酶不同于如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。任选地，额外的酶是淀粉酶。任选地，淀粉酶是外切淀粉酶。任选地，外切淀粉酶是生麦芽糖淀粉酶。任选地，生麦芽糖淀粉酶是根据SEQ ID NO:24的多肽。任选地，外切淀粉酶是非生麦芽糖淀粉酶。任选地，额外的酶是磷脂酶或半乳糖脂酶。 [0029] 在另一方面，提供了制备烘焙产品的方法，该方法具有对如上所述的面团进行烘焙的步骤。另一方面是这样的烘焙产品。 [0030] 在本发明的另一方面，提供了方法，该方法具有以下步骤：将选自由以下组成的组的面团组分与如上所述的PS4变体混合：面粉、盐、水、糖、脂肪、卵磷脂、油和酵母。任选地，该方法具有添加用于改善面团和/或由其制得的烘焙产品的至少一种额外的酶的另外的步骤。任选地，额外的酶是以下中的一种或多种：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫化物异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶，其中该淀粉酶不同于如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。任选地，额外的酶是淀粉酶。任选地，淀粉酶是外切淀粉酶。任选地，外切淀粉酶是生麦芽糖淀粉酶。任选地，生麦芽糖淀粉酶是根据SEQ ID NO:24的多肽。任选地，外切淀粉酶是非生麦芽糖淀粉酶。任选地，额外的酶是磷脂酶或半乳糖脂酶。 [0031] 在另一方面，提供了核酸，其能够编码如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。换句话说，提供了核酸，其编码如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。另一方面是具有或包含核酸的表达载体。又另一方面是具有或包含表达载体的宿主细胞。任选地，宿主细胞是细菌、真菌或酵母细胞。 附图说明 [0032] 图1：SEQ ID NO:1列出了来自嗜糖假单胞菌的非生麦芽糖外切淀粉酶的成熟蛋白质序列。 [0033] 图2：SEQ ID NO:2列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑23946的成熟蛋白质序列。 [0034] 图3：SEQ ID NO:3列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑23979的成熟蛋白质序列。 [0035] 图4：SEQ ID NO:4列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑23208的成熟蛋白质序列。 [0036] 图5：SEQ ID NO:5列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑20494的成熟蛋白质序列。 [0037] 图6：SEQ ID NO:6列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑20494_1的成熟蛋白质序列。 [0038] 图7：SEQ ID NO:7列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑21508的成熟蛋白质序列。 [0039] 图8：SEQ ID NO:8列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑21508_3的成熟蛋白质序列。 [0040] 图9：SEQ ID NO:9列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑21508_1的成熟蛋白质序列。 [0041] 图10：SEQ ID NO:10列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体WAAA249的成熟蛋白质序列。 [0042] 图11：SEQ ID NO:11列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑14814的成熟蛋白质序列。 [0043] 图12：SEQ ID NO:12列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑16556的成熟蛋白质序列。 [0044] 图13：SEQ ID NO:13列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑20554的成熟蛋白质序列。 [0045] 图14：SEQ ID NO:14列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑20060的成熟蛋白质序列。 [0046] 图15：SEQ ID NO:15列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑20509的成熟蛋白质序列。 [0047] 图16：SEQ ID NO:16列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑20971的成熟蛋白质序列。 [0048] 图17：SEQ ID NO:17列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA‑21726的成熟蛋白质序列。 [0049] 图18：SEQ ID NO:18列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA的成熟蛋白质序列。 [0050] 图19：SEQ ID NO:19列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体SAS3的成熟蛋白质序列。 [0051] 图20：SEQ ID NO:20列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体SAS2的成熟蛋白质序列。 [0052] 图21：SEQ ID NO:21列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体SAS1的成熟蛋白质序列。 [0053] 图22：SEQ ID NO:22列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA223G的成熟蛋白质序列。 [0054] 图23：SEQ ID NO:23列出了非生麦芽糖外切淀粉酶变体NBA223W的成熟蛋白质序列。 [0055] 图24：SEQ ID NO:24列出了生麦芽糖淀粉酶变体的成熟蛋白质序列。 [0056] 图25：SEQ ID NO:25列出了生麦芽糖淀粉酶变体的成熟蛋白质序列。 具体实施方式[0057] 一般定义 [0058] 除非另外定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开的实施例的实践或测试。数值范围包括限定范围的数值在内。 [0059] 本文提供的标题并不是对本公开的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过将本说明书作为一个整体来参考而得到。因此，把本说明书作为一个整体参考时，以下即将定义的术语得以更全面地定义。 [0060] 如本文所用，术语“多核苷酸”与术语“核苷酸序列”和/或术语“核酸序列”同义。除非另有指示，任何核酸序列都是以5’到3’方向从左到右书写的。 [0061] 如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在本公开和权利要求中，可以使用氨基酸的名称、氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)的定义。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一种核苷酸序列编码。除非另有指示，否则任何氨基酸序列都是以氨基到羧基方向从左向右书写的。 [0062] 术语的其他定义可以在本说明书通篇出现。在更详细地描述示例性的实施例之前，应理解本公开并不限于所描述的特定实施例，因为这些实施例当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅是为了描述特定实施例的目的，而并不意图是限制性的，因为本公开的范围仅由所附权利要求限定。 [0063] 在提供数值范围的情况下，应当理解，在该范围的上限与下限之间的每个中间值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被特别公开。在所陈述的范围中的任何规定值或中间值与所陈述的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括在该范围中或从该范围中排除，而且其中任一个、没有一个或两个限值被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开中，但依据所陈述的范围中的任何被特别排除的限值而定。在所陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，将这些所包括的一个或两个限值排除在外的范围也包括在本公开中。 [0064] 必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。 [0065] 如本文所用，术语“包含”(“comprising”、“comprises”)、“具有”(“has”、“having”)和“由……组成”(“comprised of”)与“包括”(“including”、“includes”)或“含有”(“containing”、“contains”)同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除额外的、未列举的成员、要素或方法步骤。术语“包含”(“comprising”、“comprises”)、“具有”(“has”、“having”)和“由……组成”(“comprised of”)还包括术语“由……组成”(“consisting of”)。 [0067] 序列同一性 [0068] 除了本文提到的特定氨基酸序列和多核苷酸之外，本发明还涵盖其变体、同源物、衍生物和片段。 [0069] 术语“变体”用于意指不同于野生型序列的核苷酸序列或氨基酸序列。 [0070] 例如，变体可以包括相对于野生型序列的一个或多个位置处的取代、插入、缺失、截短、颠换和/或倒位。可以使用本领域已知的方法(例如位点扫描诱变、插入诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化)以及使用本领域众所周知的重组方法来制备变体。使用本领域已知的方法可以容易地合成编码变体氨基酸序列的多核苷酸序列。 [0071] 在一些方面，变体是不同于野生型序列的天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。例如，变体可以是天然遗传变体。 [0072] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段是分离的PS4变体或其分离的淀粉酶活性片段。 [0073] 术语“分离的”意指序列至少基本上不含与序列在自然界中天然缔合以及在自然界中发现的至少一种其他组分。 [0074] 在一个方面，如本文所用，“分离的变体”或其分离的淀粉酶活性片段是指如通过SDS‑PAGE确定的是至少30％纯、至少40％纯、至少60％纯、至少80％纯、至少90％纯、和至少95％纯的多肽。 [0075] 在一些方面，变体是工程化的变体。例如，变体可以通过重组方法工程化。 [0076] 在一个实施例中，“野生型序列”是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:22。 [0077] 术语“同源物”意指与主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。 [0078] 在本发明上下文中，同源序列包括可与主题序列至少70％、75％、80％、85％或90％同一，优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸或核苷酸序列。典型地，同源物将包含例如与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管同源性也可以按照相似性(即，氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。 [0079] 适当地，根据本发明的PS4变体的同源物是活性淀粉酶。换句话说，根据本发明的PS4变体的同源物具有淀粉酶活性。 [0080] 在一个方面，同源序列包括与主题序列相比具有一个或几个添加、缺失和/或取代的氨基酸序列或核苷酸序列。同源性比较可以通过眼睛或更通常地借助容易获得的序列比较程序来进行。这些可商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的％同源性。 [0081] 可以在连续序列上计算同源性百分比，即将一个序列与其他序列进行比对，并且将一个序列中的每个氨基酸与其他序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，这样的无空位比对仅在相对短数目的多个残基上进行。 [0082] 尽管这是非常简单且一致的方法，但它没有考虑到，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而当进行全局比对时可能导致同源性％大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计来产生最佳比对，这些最佳比对考虑了可能的插入和缺失，而不会不当地减损整体同源性得分。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。 [0083] 然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋予“空位罚分”使得对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对‑反映两个比较序列之间更高的相关性‑将获得比具有许多空位的序列比对更高的得分。典型地使用“仿射空位成本(affine gap cost)”，其对空位的存在索取相对高的成本，而对空位中每一个后续的残基索取较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。当然，高的空位罚分将会产生最佳比对且空位较少。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，优选的是当使用这样的软件进行序列比较时使用默认值。 [0084] 因此，最大同源性％或同一性％的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。 [0085] 蛋白质序列之间的关系通常是通过将它们在一起比对并为这种比对分配得分来发现的。序列比对有两种主要类型。成对序列比对一次仅比较两个序列，而多序列比对比较许多序列。用于比对序列对的两个重要算法是德尔曼‑翁施(Needleman‑Wunsch)算法和史密斯‑沃特曼(Smith‑Waterman)算法。用于序列比对的常用工具包括用于成对比对的BLAST，以及用于多重比对的ClustalW、MUSCLE或MAFFT。 [0086] 成对比对有两种类型：局部比对和全局比对。局部比对是一对序列的两个子区域的比对。这种类型的比对适合于非同源序列背景中具有局部区域相似性的两个序列的比对。对于局部比对，史密斯‑沃特曼算法是最常用的。其他成对比对工具包括BLAST。全局比对是在两个或更多个蛋白质序列的整个长度上的序列比对。在全局比对中，假设序列沿其整个长度是同源的。Needleman和Wunsch 1970描述了用于全局比对的有效的算法。应用多种蛋白质序列比对工具(如CLUSTALW、MAFFT和MUSCLE)来评估多个蛋白质序列之间的相似性。 [0087] 用于进行这样的比对的合适的计算机程序可在Vector NTI(英杰公司(Invitrogen Corp.))软件包中获得，该软件包使用与CLUSTAL W迭代多序列比对算法(Higgins DG和Sharp PM(1988),Gene[基因]73(1),237‑244)相当的算法。可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于例如BLAST包(参见Ausubel等人,1999,Short Protocols in Molecular Biology[分子生物学中的简短方案],第4版‑第18章)、BLAST 2(参见FEMS Microbiol Lett[FEMS微生物学快报],1999,174(2):247‑50；FEMS Microbiol Lett[FEMS微生物学快报],1999,177(1):187‑8)、FASTA(Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],403‑410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人,1999,第7‑58至7‑60页)。 [0088] 尽管同源性％可以按照同一性来测量，但比对过程本身典型地不是基于全或无配对比较。相反，通常使用标度化相似性得分矩阵(scaled similarity score matrix)，该矩阵基于化学相似性或进化距离对每一个成对比较来分配得分。通常使用的这样的矩阵的实例是BLOSUM62矩阵‑BLAST程序套件的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(进一步的细节请参见用户手册)。对于一些应用，优选的是使用Vector NTI程序包的默认值。 [0089] 一旦软件已经产生最佳比对，就有可能计算同源性％，优选序列同一性％。典型地，作为序列比较的一部分，软件进行此计算，并且生成数值结果。 [0090] 当确定序列同一性时，可以使用空位罚分。用于成对比对的参数的实例如下表1和表2所示。 [0091] 表1. [0092] [0093] 表2. [0094] 对于CLUSTAL DNA 蛋白质权重矩阵 IUB Gonnet 250 空位开放 15 10 空位延伸 6.66 0.1 [0095] 在一个实施例中，可使用采用如上定义的空位罚分和空位延伸组的CLUSTAL。 [0096] 适当地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上、优选在至少30个连续核苷酸上、优选在至少40个连续核苷酸上、优选在至少50个连续核苷酸上、优选在至少60个连续核苷酸上、优选在至少100个连续核苷酸上确定的。 [0097] 适当地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少100个连续核苷酸上、优选在至少200个连续核苷酸上、优选在至少300个连续核苷酸上、优选在至少400个连续核苷酸上、优选在至少500个连续核苷酸上、优选在至少600个连续核苷酸上、优选在至少700个连续核苷酸上、优选在至少800个连续核苷酸上确定的。 [0098] 适当地，关于蛋白质(氨基酸)序列的同一性程度是在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上、优选在至少300个连续氨基酸上确定的。 [0099] 例如，关于片段的氨基酸序列的同一性程度可以在片段序列的长度上确定。换句话说，关于片段的氨基酸序列的同一性程度可以在较短序列的长度上确定。 [0100] 优选地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可以在本文传授的整个成熟序列上，如在本文公开的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18上确定。 [0101] 在一个实施例中，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可以在SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:23的残基1至429上确定。在一个实施例中，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可以在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:22的残基1至429上确定。 [0102] 在本发明上下文中，术语“查询序列”意指与主题序列比对以便查看其是否落入本发明的范围内的同源序列或外来序列。因此，这样的查询序列可以例如是现有技术序列或第三方序列。 [0103] 在一个优选的实施例中，通过全局比对程序进行序列比对，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。 [0104] 在一个实施例中，查询序列与主题序列之间的序列同一性程度通过以下方式来确定：1)通过任何合适的比对程序，使用默认评分矩阵和默认空位罚分，将这两个序列进行对比，2)鉴定精确匹配数，其中精确匹配是比对程序已于比对过程中在两个受比对序列中的给定位置上鉴定出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)用精确匹配数除以主题序列的长度。 [0105] 在又进一步优选的实施例中，全局比对程序选自由CLUSTAL和BLAST(优选BLAST)组成的组，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。 [0106] 序列(如PS4变体序列或其淀粉酶活性片段)还可以具有产生沉默改变和导致功能上等效的物质的氨基酸残基的缺失、插入或取代。只要保留物质的二级结合活性，就可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的含不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。 [0107] 例如根据下表，可以进行保守取代。第二列相同框中的氨基酸，并且优选第三列同行的氨基酸可以彼此取代，如表3所示。 [0108] 表3. [0109] [0110] 本发明还涵盖可能出现的同源取代(取代和替代两者在本文中都用于意指现有氨基酸残基与替代性残基的互换)，即对等取代，如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等。也可能发生非同源取代，即从一类残基至另一类氨基酸或可替代地包含非天然氨基酸如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡喃丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯基甘氨酸。 [0111] 替代也可以由合成氨基酸(例如，非天然氨基酸)来进行，包括：α*和α‑二取代*氨基酸、N‑烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物(如三氟酪氨酸*、对‑Cl‑苯丙氨酸*、对‑Br‑苯丙氨酸*、对‑I‑苯丙氨酸*)、L‑烯丙基‑甘氨酸*、β‑丙氨酸*、L‑a‑氨基丁酸*、# #*L‑g‑氨基丁酸*、L‑a‑氨基异丁酸*、L‑e‑氨基己酸 、7‑氨基庚酸*、L‑甲硫氨酸砜 、L‑正亮# 氨酸*、L‑正缬氨酸*、对硝基‑L‑苯丙氨酸*、L‑羟基脯氨酸 、L‑硫代脯氨酸*、苯丙氨酸# (Phe)的甲基衍生物(如4‑甲基‑Phe*、五甲基‑Phe*)、L‑Phe(4‑氨基) 、L‑Tyr(甲基)*、L‑# Phe(4‑异丙基)*、L‑Tic(1,2,3,4‑四氢异喹啉‑3‑甲酸)*、L‑二氨基丙酸 和L‑Phe(4‑苄基)*。 [0112] 出于上面论述的目的(与同源或非同源取代相关)，符号*用于指示衍生物的疏水性质，而#用于指示衍生物的亲水性质，#*指示两亲特征。 [0113] 变体氨基酸序列可以包含可插入在序列的任何两个氨基酸残基之间的合适间隔基团，除了氨基酸间隔基团如甘氨酸或b‑丙氨酸残基之外，还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。另外的变异形式(涉及存在呈类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员充分了解的。为避免疑问，“类肽形式”用于是指变体氨基酸残基，其中a‑碳取代基基团在残基的氮原子上，而不是在a‑碳上。用于制备呈类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人,PNAS[美国国家科学院院刊](1992)89(20),9367‑9371和Horwell DC,Trends Biotechnol.[生物技术趋势](1995)13(4),132‑134。 [0114] 用于本发明的核苷酸序列可以在它们中包含合成的或修饰的核苷酸。针对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。它们包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解，本文所述的核苷酸序列可以通过本领域可用的任何方法修饰。可以进行这样的修饰以便增强本发明核苷酸序列的体内活性或寿命。 [0115] 本发明还涵盖使用与本文呈现的序列互补的核苷酸序列。 [0116] 本文所述序列的其他变体可以例如通过用探测(probing)从一系列个体(例如，来自不同群体的个体)制备的DNA文库来获得。另外，可以获得其他同源物并且这样的同源物及其片段通常将能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。这样的序列可以通过以下方式获得：探测从其他动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并且在中等至高严格条件下用包含于随附的序列表中的任一序列的全部或一部分的探针来探测这样的文库。类似的考虑适用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。 [0117] 变体和菌株/物种同源物还可以使用简并PCR来获得，简并PCR将使用被设计来靶向变体和同源物内的序列的引物，该序列编码本发明序列内的保守氨基酸序列。保守序列可以例如通过比对来自几种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可以使用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。 [0118] 简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置，并且将在比用于以单序列引物从已知序列克隆序列的那些严格条件低的严格条件下使用。 [0119] 可替代地，这样的多核苷酸可以通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化其中表达多核苷酸序列的特定宿主细胞的密码子偏好的情况下，这可能是有用的。其他序列改变可能是希望的以便引入限制性酶识别位点，或以便改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。 [0120] 通用重组DNA方法技术 [0121] 除非另有指示，否则本发明采用常规的生物化学、分子生物学、微生物学和重组DNA技术，这些技术在本领域普通技术人员的能力之内。这样的技术在文献中进行了解释。参见例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版,第1‑3册,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]；Ausubel,F.M.等人(1995年和定期补编； Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学的当前方案],第9、13和16章,John Wiley&Sons[约翰威利父子公司],纽约,纽约州)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques[DNA分离和测序：基本技术],John Wiley&Sons[约翰威利父子公司]；M.J.Gait(编辑),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach[寡核苷酸合成：实用方法],IrIPress[IrI出版社]；以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology[酶学方法：DNA结构A部分：酶学中DNA方法的合成和物理分析],Academic Press[学术出版社]。将这些一般文本中的每一个通过引用并入本文。 [0122] 优选的实施例的详细描述 [0123] 根据本发明的一个方面，提供了嗜糖假单胞菌淀粉酶(PS4)变体或其淀粉酶活性片段，其中该变体具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，并且其中该PS4变体或其淀粉酶活性片段在以下位置中的一个或多个处具有氨基酸取代：31、58、172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0124] 根据本发明的PS4变体是“活性淀粉酶”或“具有淀粉酶活性”。换句话说，根据本发明的PS4变体具有淀粉酶活性。 [0125] 本发明提供了作为活性淀粉酶的PS4变体的片段。换句话说，PS4变体的片段具有淀粉酶活性。 [0126] 可以通过任何合适的方法(例如通过本领域已知的或本文所述的测定)来确定根据本发明的PS4变体或其淀粉酶活性片段的淀粉酶活性。 [0127] 例如，可以通过使用合适的测定(如测定1或实例9中所述的测定)来确定淀粉酶活性。 [0128] 可以通过测量淀粉酶变体、其淀粉酶活性片段或参比多肽与小麦淀粉孵育时生成的还原性麦芽糖糊精的浓度来确定PS4变体或其淀粉酶活性片段或参比多肽的淀粉酶活性。 [0129] 测定原理如下：二喹啉甲酸测定(BCA测定)用于定量淀粉酶变体、其淀粉酶活性片段或参比多肽与小麦淀粉孵育时生成的还原性麦芽糖糊精。可以使用本领域已知的BCA蛋白质测定试剂盒，如PierceTM BCA蛋白质测定试剂盒。 [0130] 测定1–淀粉酶活性 [0131] 1.使用2％(w/w)小麦淀粉于50mM乙酸钠、5mM CaCl2、0.001％Triton(pH 5.5)中作为底物。 [0132] 2.将55μL底物与5μL酶溶液混合，并在80℃孵育15分钟。 [0133] 3.孵育后，将90μl BCA试剂(PierceTM BCA蛋白质测定试剂盒，皮尔斯化学公司(Pierce Chemical)，目录号23225，如制造商所述制备)与10μl酶‑淀粉悬浮液混合，并在95℃孵育10分钟。 [0134] 4.然后将70μl的混合物转移到含有80μL H2O的微量滴定板中，混合并在562nm处测量吸光度。 [0135] 在一个实施例中，本发明提供了PS4变体的淀粉酶活性片段。 [0136] 优选地，根据本发明的PS4变体或淀粉酶活性片段是非生麦芽糖变体。 [0137] 生麦芽糖淀粉酶(EC 3.2.1.133，葡聚糖‑1,4‑α‑麦芽糖水解酶)水解淀粉，并从多糖链的非还原末端除去连续的α‑麦芽糖。 [0138] 优选地，根据本发明的PS4变体或淀粉酶活性片段是外切淀粉酶变体。 [0139] 优选地，根据本发明的PS4变体或淀粉酶活性片段是非生麦芽糖外切淀粉酶变体。 [0140] 多肽的酶活性“片段”(如淀粉酶活性片段)比全长蛋白质包含更少的氨基酸，但表现出相应全长蛋白质的至少一种活性(如淀粉酶活性)。例如，淀粉酶活性片段可以包含具有PS4淀粉酶变体的至少一种活性的结构域或基序，如催化结构域。本公开的PS4变体的淀粉酶活性片段可以是长度例如为约50、100、150、200、250、300、350、400个氨基酸的多肽。本公开的PS4变体的淀粉酶活性片段可以是比SEQ ID NO:1短的多肽，例如比SEQ ID NO:1短至少一个、至少两个、至少3个、至少4个氨基酸，或者比SEQ ID NO:1短至少约5、10、15、20、25、30、40、50、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸的多肽。 [0141] 根据本发明的PS4变体或其淀粉酶活性片段在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421，所述位置参考SEQ ID NO:1定义。 [0142] 可以被取代以获得本公开的变体的位置参考SEQ ID NO:1定义。当与如SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列比对时，变体或其淀粉酶活性片段具有氨基酸序列，该氨基酸序列在对应于参考SEQ ID NO:1的以下位置中的任一个的位置处包含氨基酸残基的至少一个取代：31、58、172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0143] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、172、 230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0144] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、172、 230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0145] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、172、 230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0146] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、172、 230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0147] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、172、 230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0148] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、172、 230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0149] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、172、 230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0150] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、172、 230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0151] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0152] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0153] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0154] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0155] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0156] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0157] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0158] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0159] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0160] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0161] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0162] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0163] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0164] 在一个方面，PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少70％(如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％)序列同一性，并且在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、 172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0165] 在一个实施例中，本发明提供了PS4变体或其淀粉酶活性片段，该PS4变体或其淀粉酶活性片段包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，并且其中该PS4变体或其淀粉酶活性片段在对应于参考SEQ ID NO:1的以下位置中的任一个的位置处包含氨基酸残基的至少一个取代：31、58、172、230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421，所述位置参考SEQ ID NO:1定义。 [0166] 优选地，PS4变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。 [0167] 优选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有对应于以下的一个或多个氨基酸取代：31V、58P、172R、230S、362P、118E、209N、249S、301P、369F、377Q、404L、407F或421S。 [0168] 更优选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有以下氨基酸取代中的一个或多个：68S、145Q、155P、220M、3V、110I、169H、179V、188E、188R、205Q、313A、313W、367T、399E、422Y、 110I、179N、188E或313W。 [0169] 仍更优选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有以下取代中的一个或多个：34Q、145D、179R、200G、223W、169R、179N或420G。 [0170] 又更优选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:17具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。 [0171] 更优选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:17具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸序列。 [0172] 在最优选的实施例中，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:17的氨基酸序列。 [0173] 优选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有比SEQ ID NO:18的解链温度高至少约0.5℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃或7℃的解链温度。 [0174] 可以通过任何合适的方法(例如通过本领域已知的或本文所述的测定)来确定根据本发明的PS4变体或其淀粉酶活性片段的解链温度。 [0175] 可以通过使用合适的技术(如纳米差示扫描荧光测定(nanoDSF)技术，例如实例10中所述的技术)来确定解链温度。 [0176] 在一个实施例中，根据本发明的变体或其淀粉酶活性片段表现出高于SEQ ID NO 18的解链温度的解链温度。 [0177] 优选地，PS4变体或其淀粉酶活性片段具有SEQ ID NO:18的外切与内切活性比率的至少约50％、75％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％或800％的外切与内切活性比率。 [0178] 可以通过任何合适的方法(例如通过本领域已知的或本文所述的测定)来确定根据本发明的PS4变体或其淀粉酶活性片段的“外切活性(EXO activity)”。 [0179] 可以通过使用合适的测定(如Betamyl‑G6测定，例如实例7中所述的测定)来确定外切活性。 [0180] 可以通过任何合适的方法(例如通过本领域已知的或本文所述的测定)来确定根据本发明的PS4变体或其淀粉酶活性片段的“内切活性(ENDO activity)”。 [0181] 可以通过使用合适的测定(如Ceralpha测定，例如实例8中所述的测定)来确定内切活性。 [0182] 在本发明的另一方面，提供了如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段作为食物添加剂或饲料添加剂的用途。 [0183] 在本发明的另一方面，提供了用于通过以下处理淀粉的方法：使淀粉与如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段接触，以及允许该PS4变体或其淀粉酶活性片段从该淀粉产生一种或多种线性产物。 [0184] 在本发明的另一方面，提供了如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段在制备食物产品或饲料产品中的用途。 [0185] 在本发明的另一方面，提供了用于制备食物产品或饲料产品的方法，该方法具有将如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段与食物或饲料成分混合的步骤。 [0186] 优选地，该用途或方法中的食物产品是面团或面团产品。更优选地，面团产品是经加工的面团产品。 [0187] 优选地，该用途或方法中的食物产品是烘焙产品。 [0188] 在一个实施例中，根据本发明的PS4变体或其淀粉酶活性片段表现出如本文所述的改善的性能指数(PI)值。在一个实施例中，根据本发明的PS4变体或其淀粉酶活性片段表现出如本文所述的改善的烘焙性能指数(PI)值。适当地，根据本发明的PS4变体或其淀粉酶活性片段可以表现出以下中的至少一个的改善的性能指数(PI)值：PI外切活性；PI外切与内切活性比率；对小麦淀粉的PI活性；PI柔软度和/或PI弹性。在外切活性、外切与内切活性比率、对小麦淀粉的活性、柔软度和弹性方面，高于1的PI值被认为是理想的。 [0189] 适当地，根据本发明的PS4变体或其淀粉酶活性片段可以表现出以下中的至少一个的高于1.0的PI值：PI外切活性；PI外切与内切活性比率；对小麦淀粉的PI活性；PI柔软度和/或PI弹性。可以在第7天或第21天计算柔软度的PI值。可以在第7天或第21天计算弹性的PI值。 [0190] PI外切活性；PI外切与内切活性比率；对小麦淀粉的PI活性；可以如实例13中所述计算PI柔软度和PI弹性性能指数。 [0191] 简言之，外切活性、内切活性和小麦淀粉的PI在相同的蛋白质浓度下可以计算为给定变体的OD除以SEQ ID NO:18的OD。外切/内切比率可以计算为外切活性测定的OD除以内切活性测定的OD。外切与内切比率的PI可以计算为给定变体的外切与内切比率除以SEQ ID NO:18的外切与内切比率。PI柔软度可以计算为SEQ ID NO:18的硬度值除以给定变体的硬度值。 [0192] 弹性的PI可以计算为给定变体的弹性除以SEQ ID NO:18的弹性。 [0193] 在一个实施例中，本发明提供了PS4变体或其淀粉酶活性片段用于改善如本文所述的至少一个PI值(如烘焙PI值)的用途。 [0194] 在一个实施例中，本发明提供了用于改善面团、面团产品、经加工的面团产品或烘焙产品的如本文所述的至少一个PI值(如烘焙PI值)的方法。 [0195] 在一个实施例中，本发明能够生产烘焙产品(如面包)，这些烘焙产品在储存21天后仍能保持高水平的柔软度和弹性。适当地，根据本发明的PSV变体或其淀粉酶活性片段能够生产烘焙产品(如面包)，这些烘焙产品当与用SEQ ID NO:18而不是根据本发明的PSV变体或淀粉酶活性片段生产的类似的烘焙产品(如面包)相比，在储存21天后表现出更高水平的柔软度和弹性。根据本发明的另一方面，提供了用于制作烘焙产品的方法，该方法具有以下步骤：(a)提供淀粉培养基；(b)向该淀粉培养基中添加如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段；以及(c)在步骤(b)期间或之后对该淀粉培养基加热以生产烘焙产品。 [0196] 在本发明的另一方面，提供了通过如上所述的用途或方法获得的食物产品、饲料产品、面团产品或烘焙产品。 [0197] 在本发明的另一方面，提供了用于通过以下处理淀粉的方法：使淀粉与如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段接触，以及允许该PS4变体或其淀粉酶活性片段从该淀粉产生一种或多种线性产物。 [0198] 在本发明的另一方面，提供了如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段在制备食物产品或饲料产品中的用途。 [0199] 在本发明的另一方面，提供了用于制备食物产品或饲料产品的方法，该方法具有将如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段与食物或饲料成分混合的步骤。 [0200] 优选地，该用途或方法中的食物产品是面团或面团产品。更优选地，面团产品是经加工的面团产品。 [0201] 优选地，该用途或方法中的食物产品是烘焙产品。 [0202] 根据本发明的另一方面，提供了用于制作烘焙产品的方法，该方法具有以下步骤：(a)提供淀粉培养基；(b)向该淀粉培养基中添加如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段； 以及(c)在步骤(b)期间或之后对该淀粉培养基加热以生产烘焙产品。 [0203] 在本发明的另一方面，提供了通过如上所述的用途或方法获得的食物产品、饲料产品、面团产品或烘焙产品。 [0204] 根据本发明的另一方面，提供了制作糖浆的方法，该方法具有将如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段添加到颗粒状淀粉液化物中以形成糖浆的步骤。 [0205] 在本发明的另一方面，提供了面团，其具有如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。优选地，面团具有用于改善面团和/或由其制得的烘焙产品的至少一种额外的酶。优选地，额外的酶是以下中的一种或多种：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫化物异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶，其中该淀粉酶不同于如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。更优选地，额外的酶是淀粉酶。仍更优选地，淀粉酶是外切淀粉酶。在又更优选的实施例中，外切淀粉酶是生麦芽糖淀粉酶。最优选地，生麦芽糖淀粉酶是根据SEQ ID NO:24的多肽。在其他优选的实施例中，外切淀粉酶是非生麦芽糖淀粉酶或磷脂酶或半乳糖脂酶。 [0206] 在另一方面，提供了制备烘焙产品的方法，该方法具有对如上所述的面团进行烘焙的步骤。另一方面是这样的烘焙产品。 [0207] 在本发明的另一方面，提供了用于制作面团的方法，该方法具有以下步骤：将选自由以下组成的组的面团组分与如上所述的PS4变体混合：面粉、盐、水、糖、脂肪、卵磷脂、油和酵母。优选地，额外的酶是以下中的一种或多种：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫化物异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶，其中该淀粉酶不同于如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。更优选地，额外的酶是淀粉酶。仍更优选地，淀粉酶是外切淀粉酶。在又更优选的实施例中，外切淀粉酶是生麦芽糖淀粉酶。最优选地，生麦芽糖淀粉酶是根据SEQ ID NO:24的多肽。在其他优选的实施例中，外切淀粉酶是非生麦芽糖淀粉酶或磷脂酶或半乳糖脂酶。 [0208] 在另一方面，提供了核酸，其能够编码如上所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。另一方面是具有核酸的表达载体。又另一方面是具有表达载体的宿主细胞。优选地，宿主细胞是细菌、真菌或酵母细胞。 [0209] 现在将参考以下编号段落来描述本发明的各种优选的特征和实施例。 [0210] 1.一种嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)淀粉酶(PS4)变体或其淀粉酶活性片段，其中所述变体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，并且其中所述PS4变体在以下位置中的一个或多个处包含氨基酸取代：31、58、172、 230、362、118、209、249、301、369、377、404、407和421。 [0211] 2.如段落1所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段，所述PS4变体或其淀粉酶活性片段与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性。 [0212] 3.如段落1或2所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段，其中所述氨基酸取代是以下中的一个或多个：31V、58P、172R、230S、362P、118E、209N、249S、301P、369F、377Q、404L、407F或421S。 [0213] 4.如段落1至3中任一项所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段，所述PS4变体或其淀粉酶活性片段进一步包含以下氨基酸取代中的一个或多个：68S、145Q、155P、220M、3V、110I、169H、179V、188E、188R、205Q、313A、313W、367T、399E、422Y、110I、179N、188E或313W。 [0214] 5.如前述段落中任一项所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段，所述PS4变体或其淀粉酶活性片段进一步包含34Q、145D、179R、200G、223W、169R、179N或420G。 [0215] 6.如前述段落中任一项所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段，所述PS4变体或其淀粉酶活性片段包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO: 17的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。 [0216] 7.如段落6所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段，所述PS4变体或其淀粉酶活性片段包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％和99％序列同一性的氨基酸序列。 [0217] 8.如段落7所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段，所述PS4变体或其淀粉酶活性片段包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:17的氨基酸序列。 [0218] 9.如前述段落中任一项所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段，所述PS4变体或其淀粉酶活性片段具有比SEQ ID NO:18的解链温度高至少约0.5℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃或7℃的解链温度。 [0219] 10.如前述段落中任一项所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段，所述PS4变体或其淀粉酶活性片段具有SEQ ID NO:18的外切与内切比率的至少约50％、75％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％或800％的外切与内切活性比率。 [0220] 11.如任一前述段落所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段作为食物添加剂或饲料添加剂的用途。 [0221] 12.一种用于处理淀粉的方法，所述方法包括使淀粉与如段落1至10中任一项所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段接触，以及允许所述多肽从所述淀粉产生一种或多种线性产物。 [0222] 13.如段落1至10中任一项所述的PS4变体的或其淀粉酶活性片段在制备食物产品或饲料产品中的用途。 [0223] 14.一种用于制备食物产品或饲料产品的方法，所述方法包括将如段落1至10中任一项所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段与食物成分或饲料成分混合。 [0224] 15.如段落11或段落13所述的用途或如段落14所述的方法，其中所述食物产品是面团或面团产品，优选地经加工的面团产品。 [0225] 16.如段落11或段落13所述的用途或如段落14所述的方法，其中所述食物产品是烘焙产品。 [0226] 17.一种用于制作烘焙产品的方法，所述方法包括：(a)提供淀粉培养基；(b)向所述淀粉培养基中添加如段落1至10中任一项所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段；以及(c)在步骤(b)期间或之后对该淀粉培养基加热以生产烘焙产品。 [0227] 18.一种通过如段落11至17中任一项所述的用途或方法获得的食物产品、饲料产品、面团产品或烘焙产品。 [0228] 19.一种制作糖浆的方法，所述方法包括将如段落1至10中任一项所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段添加到颗粒状淀粉液化物中以形成糖浆。 [0229] 20.一种面团，其包含如段落1至10中任一项所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。 [0230] 21.如段落20所述的面团，其进一步包含用于改善面团和/或由其制得的烘焙产品的至少一种额外的酶。 [0231] 22.如段落21所述的面团，其中所述额外的酶是以下中的一种或多种：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫化物异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶，其中所述淀粉酶不同于如段落1至10中所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。 [0232] 23.如段落22所述的面团，其中所述额外的酶是淀粉酶。 [0233] 24.如段落23所述的面团，其中所述淀粉酶是外切淀粉酶。 [0234] 25.如段落24所述的面团，其中所述外切淀粉酶是生麦芽糖淀粉酶。 [0235] 26.如段落25所述的面团，其中所述生麦芽糖淀粉酶是根据SEQ ID NO:24的多肽。 [0236] 27.如段落23所述的面团，其中所述外切淀粉酶是非生麦芽糖淀粉酶。 [0237] 28.如段落22所述的面团，其中所述额外的酶是磷脂酶或半乳糖脂酶。 [0238] 29.一种制备烘焙产品的方法，所述方法包括对如段落20至28中任一项所述的面团进行烘焙。 [0239] 30.如段落29所述的烘焙产品。 [0240] 31.一种制作面团的方法，所述方法包括将选自由以下组成的组的面团组分与如段落1至10中任一项所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段混合：面粉、盐、水、糖、脂肪、卵磷脂、油和酵母。 [0241] 32.如段落31所述的制作面团的方法，所述方法进一步包括添加用于改善面团和/或由其制得的烘焙产品的至少一种额外的酶。 [0242] 33.如段落32所述的方法，其中所述额外的酶选自由以下组成的组：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫化物异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶，其中所述淀粉酶不同于如权利要求1至10所述的PS4变体或其淀粉酶活性片段。 [0243] 34.如段落33所述的方法，其中所述额外的酶是淀粉酶。 [0244] 35.如段落34所述的方法，其中所述淀粉酶是外切淀粉酶。 [0245] 36.如段落35所述的方法，其中所述外切淀粉酶是生麦芽糖淀粉酶。 [0246] 37.如段落36所述的方法，其中所述生麦芽糖淀粉酶是根据SEQ ID NO:24的多肽。 [0247] 38.如段落35所述的方法，其中所述外切淀粉酶是非生麦芽糖淀粉酶。 [0248] 39.如段落33所述的方法，其中所述额外的酶是磷脂酶或半乳糖脂酶。 [0249] 40.一种核酸，其能够编码如段落1至10中任一项所述的PS4变体。 [0250] 41.一种表达载体，其包含如段落40所述的核酸。 [0251] 42.一种宿主细胞，其包含如段落1所述的表达载体。 [0252] 43.如段落42所述的宿主细胞，其是细菌、真菌或酵母细胞。 [0253] 现在将通过实例进一步描述本发明，这些实例意在用于帮助本领域普通技术人员实施本发明而不旨在以任何方式限制本发明的范围。 [0254] 将上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对本领域的技术人员将是清楚的。尽管本发明已经结合特定的优选的实施例进行了说明，但应当理解要求保护的本发明不应该不当地受限于这样的特定的实施例。确实，对于分子生物学或相关领域的技术人员显而易见的用于执行本发明的所述方式的各种修改均旨在落入以下权利要求的范围内。 [0255] 实例1 [0256] 淀粉酶变体文库克隆的生成 [0257] 使用本领域已知的分子技术进行变体文库的生成。携带待掺入最终变体中的所有突变的、编码成熟淀粉酶蛋白的主链DNA序列作为基因片段从特威斯特生物科学公司(Twist Bioscience)(旧金山，加利福尼亚州，美国)合成订购。扩增这些基因片段，以便在序列中掺入尿嘧啶。在通过PCR组装所有序列之前，通过本领域已知的方法将这些序列片段化。将所得编码成熟淀粉酶的DNA序列片段在5’端与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)amyL信号肽DNA序列框内融合，并且在3’端与地衣芽孢杆菌amyL转录终止子序列框内融合。此外，将组成型启动子与信号肽序列的5’端融合，并且将抗生素抗性标记DNA盒以及与地衣芽孢杆菌同源的侧翼于DNA区域的3’和5’端一起添加到表达盒中，使得地衣芽孢杆菌转化体能够同源重组和选择性生长。使用本领域已知的方法将这些DNA盒转化到地衣芽孢杆菌细胞中。通过利用适当的抗生素抗性选择，使转化体在选择性琼脂板上和在选择性液体培养基中生长。对于所有单个文库克隆，对编码淀粉酶变体表达盒的DNA序列进行PCR扩增，并通过Pac Bio下一代测序进行分析，以鉴定淀粉酶变体的DNA序列。 [0258] 实例2 [0259] 单个淀粉酶变体克隆的生成 [0260] 编码成熟淀粉酶蛋白的DNA序列作为基因片段从特威斯特生物科学公司(旧金山，加利福尼亚州，美国)或IDT(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies,BVBA)，比利时)合成订购。将这些编码成熟淀粉酶的DNA基因序列片段在5’端与地衣芽孢杆菌amyL信号肽DNA序列框内融合，并且在3’端与地衣芽孢杆菌amyL转录终止子序列框内融合。此外，将组成型启动子与信号肽序列的5’端融合，并且将抗生素抗性标记DNA盒以及与地衣芽孢杆菌同源的侧翼于DNA区域的3’和5’端一起添加到表达盒中，使得地衣芽孢杆菌转化体能够同源重组和选择性生长。使用本领域已知的方法将这些DNA盒转化到地衣芽孢杆菌细胞中。通过利用适当的抗生素抗性选择，使转化体在选择性琼脂板上和在选择性液体培养基中生长。对于每个单个克隆，对编码淀粉酶变体表达盒的DNA序列进行PCR扩增，并通过桑格(Sanger)测序进行分析，以鉴定淀粉酶变体的DNA序列。 [0261] 实例3 [0262] 淀粉酶变体蛋白质样品的生成 [0263] 对于淀粉酶蛋白质样品的生成，使用基于富集的MOPS的半定义液体培养基使单个(文库)克隆在微量滴定板规模下生长，并且在轨道振荡培养箱中培养。将细胞培养液样品旋转以过滤上清液样品，以供进一步使用。 [0264] 实例4 [0265] 用于测试目的的淀粉酶变体样品的生成 [0266] 对于用于测试目的的淀粉酶变体样品的生成，使所选菌株在摇瓶中或在2或10升生物反应器中生长。 [0267] 在摇瓶中，使用基于富集的MOPS的半定义液体培养基，并且将烧瓶在轨道振荡培养箱中孵育。将细胞培养液样品旋转，并将上清液无菌过滤以供使用。 [0269] 实例5 [0270] HPLC [0271] 应用HPLC确定蛋白质浓度。在384孔板中，通过将20μl的MTP上清液与80μl的MOPS缓冲液(pH 7.15)、10mM CaCl2和0.005％Tween80混合来制备样品。使用的系统是带有hip‑ALS注射系统的Agilent(U)HPLC,LC 1290infinity，并且使用的柱是Zorbax 300SB‑C3柱(2.1x50mm，珠粒尺寸为1.8μm)。用去离子水(demi‑water)冲洗针头3秒，然后注射5μL的样品。使用1.00ml/min的流速，所应用的梯度如下表4中所示。在220nm处读取光密度(OD)。每个板中都有SEQ ID NO:18的标准曲线，并提供每个单独板中的样品的校准点。 [0272] 表4：用于SEQ ID NO:18变体的HPLC分析的梯度 [0273] 时间(min) ％A ％B0 95 5 0.2 95 5 0.6 65 35 0.8 65 35 3.5 40 60 3.6 5 95 4.0 5 95 4.1 95 5 4.4 95 5 [0274] 上述溶剂A是水+0.1％TFA，溶剂B是乙腈+0.07％TFA。 [0275] 实例6 [0276] 通过标准无染料成像仪(StainFreeImagerCriterion)进行蛋白质测定 [0277] 使用Gel DocTMEZ成像系统通过SDS‑PAGE凝胶和光密度法对蛋白质进行定量。测定中使用的试剂：经浓缩的(2x)Laemmli样品缓冲液(伯乐公司(Bio‑Rad)，目录号1610737)；26孔TGX Any kDa凝胶(伯乐公司，目录号5678125)；蛋白质标记“Precision Plus TM Protein 未染色的蛋白质标准品，Strep标记的重组，1ml”(伯乐公司，目录号161‑0363)；蛋白质标准品BSA(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，目录号23208)和SimplyBlue Safestain(英杰公司，目录号LC 6060)。如下进行分析：在96孔PCR板中，将50μL经稀释的酶样品与含有2.7mg DTT*的50μL样品缓冲液混合。将板用来自伯乐公司的Microseal‘B’膜密封并放入PCR机器中加热至70℃，持续10分钟。然后用运行缓冲液填充腔室并插入凝胶盒。 接下来将10μL的各个样品和标准品(0.125‑1.00mg/mL SEQ ID NO:18)加载在凝胶上，并加TM 载10μL的标记。之后，将电泳在200V下运行34min。电泳后，然后将凝胶转移到Gel Doc EZ成像系统，并使用Image Lab软件和校准曲线确定样品中靶蛋白的量。 [0278] 实例7 [0279] Betamyl测定(外切活性) [0280] Betamyl‑G6测定基于PNP‑麦芽六糖苷的水解(在碱性条件下释放黄色PNP阴离子)，这可以通过UV/VIS光谱法进行定量。添加α‑葡糖苷酶作为辅助酶，水解淀粉酶水解后剩余的PNP‑麦芽吡喃糖苷产物。将在50mM乙酸钠、5mM CaCl2、0.001％Triton(pH 5.5)中的25μL 12mM4‑硝基苯基α‑D‑麦芽六糖苷(PNPG6)(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，目录号73681)、23U/mlα‑葡糖苷酶(麦格酶公司(Megazyme)，目录号E‑MALTS)与在MTP中的65μL 50mM乙酸钠、5mM CaCl2、0.001％Triton(pH 5.5)和10μL酶溶液混合。然后将板在30C下孵育15min。接下来添加150μL 4％TRIS碱，并且测量OD 410nm。 [0281] 实例8 [0282] Ceralpha测定(内切活性) [0283] Ceralpha测定基于PNP‑苯基‑麦芽七糖苷的水解(在碱性条件下释放黄色PNP阴离子)，这可以通过UV/VIS光谱法进行定量。该底物具有附接到非还原末端的苯基基团，在空间上阻碍了外切活性。因此，该底物对内切淀粉酶具有特异性。过量的α‑葡糖苷酶和葡糖淀粉酶是Ceralpha测定试剂盒的组成部分。这些辅助酶确保在初始内切水解后完全水解，释放PNP‑阴离子。将25μL Ceralpha底物(麦格酶公司，目录号R‑AMHR4，根据制造商说明制备)与在MTP中的50μL 50mM乙酸钠、5mM CaCl2、0.001％Triton(pH 5.5)和10μL酶溶液混合。然后将板在30C下孵育15min。接下来添加150μL 4％TRIS碱，并且测量OD 410nm。 [0284] 实例9 [0285] 对小麦淀粉的活性 [0286] 活性测定背后的原理是测量淀粉酶变体与小麦淀粉孵育时生成的还原性麦芽糖糊精的浓度。使用二喹啉甲酸(BCA)测定来定量还原性麦芽糖糊精。使用2％(w/w)小麦淀粉于50mM乙酸钠、5mM CaCl2、0.001％Triton(pH 5.5)中作为底物。将55μL底物与5μL酶溶液混合，并在80℃孵育15min。孵育后，将90μl BCA试剂(PierceTM BCA蛋白质测定试剂盒，皮尔斯化学公司，目录号23225，如制造商所述制备)与10μl酶‑淀粉悬浮液混合，并在95℃孵育10min。然后将70μl转移到含有80μL H2O的微量滴定板中，混合并在562nm处测量吸光度。 [0287] 实例10 [0288] 解链温度，Tm [0289] 使用应用来自诺坦普公司(Nanotemper)的Prometheus NT.48的nanoDSF技术测量蛋白质的解折叠温度。将所有样品在50mM乙酸钠、5mM CaCl2、0.001％Triton(pH 5.5)中稀释至0.25mg/ml，并且以1℃/min的梯度从60℃‑110℃进行解链扫描。 [0290] 实例11 [0291] 烘焙性能评估 [0292] 烘焙程序 [0293] 使用美国吐司的标准白面包直接发酵面团(straight dough)配方进行烘焙试验。直接发酵面团由以下制备：来自美国谷物工艺公司(Grain Craft,USA)的2000g的小麦面粉、1220g的自来水、40g的菜籽油(产品号3520，阿胡斯卡尔斯油脂公司(AAK)，丹麦)、160g蔗糖、40gNaCl、7g的丙酸钙(杜邦营养生物科学公司(Dupont Nutrition Bioscience)，丹麦)、80g压缩酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae)，HAGOLD HEFE公司，萨勒河畔施瓦岑巴赫(Schwarzenbach a.d.Saale)，德国)和0,15g抗坏血酸(杜邦营养生物科学公司，丹麦)。除了用于抗老化的酶之外，还使用了以下酶：50ppm SUREBake 800己糖氧 TM 化酶(杜邦营养生物科学公司，丹麦)、25ppm GRINDAMYL POWERBake 950木聚糖酶(杜邦营养生物科学公司，丹麦)和275ppm 1000真菌α‑淀粉酶作为靶标，取决于 面粉(杜邦营养生物科学公司，丹麦)的降落值(falling number)。 [0294] 随后，将所有成分在Hobart A200螺旋混合器中以速度2混合2min，然后以中速混合18分钟，面团温度为26℃‑27℃。然后将面团以703g＝5,11立方英寸/盎司面团块的比例分成4个面团块，在环境温度下静置5分钟，并在具有以下设置的斜行纹理成型机(cross grain moulder)Benier MS500上进行模制：预成型件(Preform)：‑18，立式圆筒挤浆机(Drum press)：3，压力板(Pressure board)：正面4,0cm，背面3,5cm，宽度：正面350mm，背面320mm。此后，将面团转移到盘/罐中，并在43℃、75％RH下醒发55min，然后搁架式烤箱(Reed Rack Oven)中在205℃下烘焙25min。最终的面包温度经验证为96℃‑98℃，并且烘焙后，将面包在环境温度下冷却60分钟，然后称重并测量体积。将用于硬度和弹性测量的面包用真空包装。 [0295] 实例12 [0296] 硬度和弹性的评估。 [0297] 面包硬度和弹性的质构分析(TPA)是通过使用来自英国稳定微系统公司(Stable Micro Systems,UK，SMS)的质地分析仪(Texture Analyser)通过TPA对面包片进行分析来确定的。根据稳定微系统公司提供的预设标准进行硬度和弹性计算。所用的探针是50mm圆形铝制探针。通过以下进行测量：将面包片(4片)切成宽度为45mm的小“圆片(discs)”，一次将一片/圆片放在质地分析仪上，然后以60％的深度压缩(两次压缩)。使用以下设置：测试前速度：2mm/s，测试速度：2mm/s，测试后速度：10mm/s，目标模式：应变，触发力：1.0g，测量之间的时间：2.00秒，计数：5，称重传感器：5kg，触发类型：自动。压缩模式是对标准方法AACC 74‑09中使用的压缩模式的修改。样品在测试中被压缩两次。 [0298] 硬度(以牛顿表示)以第一次压缩过程中最高峰值点的克力(gram force)来测量。硬度值越低，面包越软。测量的硬度值用于计算表6中给出的PI柔软度值。 [0299] 弹性计算为收缩(withdrawal)期间曲线下面积相对于压缩期间曲线下面积。 [0300] 实例13 [0301] 公开变体的数据。 [0302] 外切活性、内切活性和小麦淀粉的性能指数(PI)在相同的蛋白质浓度下计算为给定变体的OD除以SEQ ID NO:18的OD。外切/内切比率计算为外切活性测定的OD除以内切活性测定的OD。外切与内切比率的PI计算为给定变体的外切与内切比率除以SEQ ID NO:18的外切与内切比率。 [0303] 与表6中呈现的其他PI值相比，其中该PI计算为变体的值除以SEQ ID NO 18的值，PI柔软度计算为SEQ ID NO:18的硬度值除以给定变体的硬度值。这样做是为了反映柔软度是所需的性质，因此对于给定变体，柔软度的PI值高于1表示用该变体制作的面包比用SEQ ID NO 18制作的面包更软(即，具有更低的硬度)。 [0304] 弹性的PI计算为给定变体的弹性除以SEQ ID NO:18的弹性。 [0305] 在外切活性、外切与内切活性比率、对小麦淀粉的活性、柔软度和弹性方面，高于1的PI值被认为是理想的。另外，高于SEQ ID NO 18的解链温度的解链温度(Tm)被认为是理想的。 [0306] 一些公开变体的数据如下表6所示。 [0307] 表6. [0308] [0309] [0310] SEQ ID NO:18背景中一些单个取代的数据如下表7所示。 [0311] 表7. [0312] [0313] |
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