[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求于2017年1月24日提交的美国临时申请号62/450,038和于2017年11月9日提交的美国临时申请号62/584,011的优先权，其各自的内容通过引用以其全文特此并入本文。

[0003] 节肢动物(如，蟋蟀、蝉、蚱蜢、蚊、昆虫幼虫、毛虫和蝎)分别在人类和动物的食物和饲料的生产中具有许多传统用途和潜在的新用途。由于动物蛋白成本上升、食物和饲料不安全、环境压力、人口增长以及对人类和动物(例如，牲畜)可负担的和可持续的营养物来源的需求增加，作为食物和饲料的昆虫成为了一个尤其相关的问题。为了培育用于在食物和饲料工业中使用的有益节肢动物，本领域需要促进此类节肢动物的生长和增加其适合度的方法。发明内容

[0004] 本文披露了用于调节用于制造食物和饲料的昆虫的适合度的组合物和方法。该组合物包括药剂，该药剂改变寄宿于宿主中的一种或多种微生物的水平、活性或代谢，该改变导致宿主的适合度的调节。

[0005] 在一个方面，本文提供了用于提高昆虫的营养特征的方法，该方法包括向该昆虫递送有效量的产甲硫氨酸细菌。

[0006] 在一些实施例中，该昆虫是蟋蟀、蚱蜢、或蝗虫。

[0007] 在一些实施例中，该昆虫在发育上可以是胚、幼虫、蛹或成虫。

[0008] 在一些实施例中，该递送可以包括向该昆虫生长、生活、繁殖或进食的至少一个生境递送组合物。

[0009] 在一些实施例中，可以将该产甲硫氨酸细菌以昆虫可食用组合物进行递送，从而被该昆虫摄取。

[0010] 在一些实施例中，该产甲硫氨酸细菌可与农业上可接受的载体一起配制为液体、固体、气溶胶、膏剂、凝胶、或气体组合物。

[0011] 在一些实施例中，该载体可以是种子涂层。

[0012] 在第二方面，本文提供了修饰的昆虫，该修饰的昆虫包含寄宿于该昆虫中的外源性产甲硫氨酸细菌。

[0013] 在第二方面的一些实施例中，该昆虫在发育上是胚、幼虫、蛹或成虫。

[0014] 在第二方面的一些实施例中，该产甲硫氨酸细菌改变该昆虫的肠和/或血腔中的微生物区系。

[0015] 在又另一个方面，该组合物包括药剂，该药剂改变寄宿于昆虫宿主中的一种或多种微生物的水平、活性或代谢，该改变导致该昆虫宿主的适合度提高。

[0016] 在上述组合物的任一个的一些实施例中，该一种或多种微生物可以是寄宿于宿主中的细菌或真菌。在一些实施例中，寄宿于宿主中的细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：暂定属物种(Candidatus spp)、布赫纳氏菌属物种(Buchenera spp)、布拉特杆菌属物种(Blattabacterium spp)、鲍曼属物种(Baumania spp)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp)、沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp)、立克次体属物种(Rickettsia spp)、东方体属物种(Orientia spp)、伴突属物种(Sodalis spp)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp)、贪铜菌属物种(Cupriavidus spp)、弗兰克氏菌属物种(Frankia spp)、中华根瘤菌属物种(Snirhizobium spp)、链球菌属物种(Streptococcus spp)、沃廉菌属物种(Wolinella spp)、木杆菌属物种(Xylella spp)、欧氏杆菌属物种(Erwinia spp)、农杆菌属物种(Agrobacterium spp)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、链霉菌属物种(Streptomyces spp)、微球菌属物种(Micrococcus spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、醋杆菌属物种
(Acetobacter spp)、蓝细菌属物种(Cyanobacteria spp)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp)、红球菌属物种(Rhodococcus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)、肠球菌属物种(Enterococcus spp)、产碱杆菌属物种
(Alcaligenes spp)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp)、类芽孢杆菌属物种
(Paenibacillus  spp)、节杆菌属物种(Arthrobacter spp)、棒状杆菌属物种
(Corynebacterium spp)、短杆菌属物种(Brevibacterium spp)、栖热菌属物种(Thermus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、梭菌属物种(Clostridium spp)、以及埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp)。在一些实施例中，寄宿于宿主中的真菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：假丝酵母属(Candida)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、德巴利酵母属(Debaromyces)、Starmerella、毕赤酵母属(Pichia)、隐球菌属(Cryptococcus)、南极假丝酵母属(Pseudozyma)、Symbiotaphrina bucneri、Symbiotaphrina kochii、休哈塔假丝酵母(Scheffersomyces shehatae)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipites)、隐球菌属(Cryptococcus)、毛孢子菌属(Trichosporon)、Amylostereum areolatum、香柱菌属物种(Epichloe spp)、松果毕赤酵母(Pichia pinus)、荚膜汉逊酵母(Hansenula capsulate)、Daldinia decipien、长喙壳属物种(Ceratocystis spp)、长喙壳菌属物种(Ophiostoma spp)、以及Attamyces bromatificus。在某些情况下，该细菌是能够产生营养物(例如，氨基酸，例如甲硫氨酸)的天然存在的细菌。

[0017] 在上述组合物的任一个中，该药剂(下文中也可称为调节剂)可以改变寄宿于宿主中的微生物的生长、分裂、生存力、代谢、和/或寿命。在上述实施例的任一个中，该调节剂可以降低寄宿于宿主中的一种或多种微生物的生存力。在一些实施例中，该调节剂增加寄宿于宿主中的一种或多种微生物的生长或生存力。

[0018] 在上述实施例的任一个中，该调节剂是噬菌体、多肽、小分子、抗生素、细菌、或其任何组合。

[0019] 在一些实施例中，该噬菌体结合寄宿于宿主中的细菌上的细胞表面蛋白。在一些实施例中，该噬菌体对寄宿于宿主中的细菌具有毒性。在一些实施例中，该噬菌体是选自下组的至少一种，该组由以下组成：肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、Ampullaviridae、Bicaudaviridae、Clavaviridae、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌科(Cystoviridae)、纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、Gluboloviridae、滴状病毒科(Guttaviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、光滑噬菌体科(Leviviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、以及复层病毒科(Tectiviridae)。

[0020] 在一些实施例中，该多肽是细菌素、R‑型细菌素、根瘤富含半胱氨酸肽(nodule C‑rich peptide)、抗微生物肽、溶素、或含菌细胞调节肽中的至少一种。

[0021] 在一些实施例中，该小分子是代谢物。

[0022] 在一些实施例中，该抗生素是广谱抗生素。

[0023] 在一些实施例中，该调节剂是天然存在的细菌。在一些实施例中，该细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：Bartonella apis，Parasaccharibacter apium，Frischella perrara，Snodgrassella alvi，Gilliamela apicola、双歧杆菌属物种
(Bifidobacterium spp)、以及乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)。在一些实施例中，该细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：暂定属物种(Candidatus spp)、布赫纳氏菌属物种(Buchenera spp)、布拉特杆菌属物种(Blattabacterium spp)、鲍曼属物种(Baumania spp)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp)、沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp)、立克次体属物种(Rickettsia spp)、东方体属物种(Orientia spp)、伴突属物种(Sodalis spp)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp)、贪铜菌属物种(Cupriavidus spp)、弗兰克氏菌属物种(Frankia spp)、中华根瘤菌属物种(Snirhizobium spp)、链球菌属物种(Streptococcus spp)、沃廉菌属物种(Wolinella spp)、木杆菌属物种(Xylella spp)、欧氏杆菌属物种(Erwinia spp)、农杆菌属物种(Agrobacterium spp)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、链霉菌属物种
(Streptomyces spp)、微球菌属物种(Micrococcus  spp)、棒状杆菌属物种
(Corynebacterium  spp)、醋杆菌属物种(Acetobacter  spp)、蓝细菌属物种
(Cyanobacteria spp)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp)、红球菌属物种(Rhodococcus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)、肠球菌属物种(Enterococcus spp)、产碱杆菌属物种(Alcaligenes spp)、克雷伯氏菌属物种
(Klebsiella  spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus  spp)、节杆菌属物种
(Arthrobacter spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、短杆菌属物种
(Brevibacterium spp)、栖热菌属物种(Thermus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、梭菌属物种(Clostridium spp)、以及埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp)。

[0024] 在上述组合物的任一个中，宿主适合度可以通过宿主的存活、繁殖、或代谢来测量。在一些实施例中，该调节剂通过降低该宿主的杀有害生物易感性(例如，对表12中列出的杀有害生物剂的易感性)来调节该宿主的适合度。在一些实施例中，该杀有害生物易感性是杀细菌易感性或杀真菌易感性。在一些实施例中，该杀有害生物易感性是杀昆虫易感性。

[0025] 在上述组合物的任一个中，该组合物可以包括多种不同的调节剂。在一些实施例中，该组合物包括调节剂和杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)。在一些实施例中，该杀有害生物剂是杀细菌剂或杀真菌剂。在一些实施例中，该杀有害生物剂是杀昆虫剂。

[0026] 在上述组合物的任一个中，该调节剂可以连接至第二部分。在一些实施例中，该第二部分是调节剂。

[0027] 在上述组合物的任一个中，该调节剂可以连接至靶向结构域。在一些实施例中，该靶向结构域将调节剂靶向宿主中的靶位点。在一些实施例中，该靶向结构域将调节剂靶向寄宿于宿主中的一种或多种微生物。

[0028] 在上述组合物的任一个中，该调节剂可以包括失活的前序列(pre‑sequence或pro‑sequence)，从而形成前体调节剂。在一些实施例中，该前体调节剂在宿主中转化为活性形式。

[0029] 在上述组合物的任一个中，该调节剂可以包括接头。在一些实施例中，该接头是可裂解接头。

[0030] 在上述组合物的任一个中，该组合物可以进一步包括载体。在一些情况下，该载体可以是农业上可接受的载体。

[0031] 在上述组合物的任一个中，该组合物可以进一步包括宿主诱饵、粘性剂、或其组合。在一些实施例中，该宿主诱饵是可食用试剂和/或化学引诱剂。

[0032] 在上述组合物的任一个中，该组合物可以是处于有效调节宿主适合度的剂量。

[0033] 在上述实施例的任一个中，相对于参考水平，该组合物的调节剂可有效提高该宿主中营养物的产量。在一些实施例中，该调节剂是产生营养物的微生物。在一些实施例中，该微生物是细菌。在一些实施例中，该营养物是维生素、碳水化合物、氨基酸或多肽。在某些实施例中，该氨基酸是甲硫氨酸。

[0034] 在上述组合物的任一个中，可以将该组合物配制用于向寄生于宿主的肠中的微生物进行递送。

[0035] 在上述组合物的任一个中，可以将该组合物配制用于向寄生于宿主的含菌细胞和/或宿主的肠中的微生物进行递送。在一些实施例中，可以将该组合物配制用于向植物进行递送。在一些实施例中，可以将该组合物配制用于在宿主进食站中使用。

[0036] 在上述组合物的任一个中，可以将该组合物配制为液体、粉剂、粒剂或纳米颗粒。在一些实施例中，将该组合物配制为选自下组的一种，该组由以下组成：脂质体、聚合物、细菌分泌肽、以及合成纳米胶囊。在一些实施例中，该合成纳米胶囊向宿主中的靶位点递送组合物。在一些实施例中，该靶位点是宿主的肠。在一些实施例中，该靶位点是宿主中的含菌细胞。

[0037] 在另外的方面，本文还提供了包括上述组合物的任一个的宿主。在一些实施例中，该宿主是昆虫。在一些实施例中，该昆虫是属于以下目的物种：虱目(Anoplura)、蜘蛛目(Araneae)、蜚蠊目(Blattodea)、鞘翅目(Coleoptera)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)、纺足目(Embioptera)、蜉蝣目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、螳螂目(Mantidae)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨尾目(Thysanura)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)、或缺翅目(Zoraptera)。在某些实施例中，该昆虫是蟋蟀。在某些实施例中，该昆虫是蚱蜢。在某些实施例中，该昆虫是蝗虫。

[0038] 在又另外的方面，本文还提供了用于调节宿主适合度的系统，该系统包含靶向宿主适合度所需的微生物的调节剂，其中该系统对于调节该宿主的适合度是有效的，并且其中该宿主是昆虫。该调节剂可以包括本文所述的组合物的任一个。在一些实施例中，将该调节剂配制为粉剂。在一些实施例中，将该调节剂配制为溶剂。在一些实施例中，将该调节剂配制为浓缩物。在一些实施例中，将该调节剂配制为稀释剂。在一些实施例中，通过将先前组合物的任一个与载体组合来制备该调节剂用于递送。

[0039] 在另一个方面，本文还提供了使用本文所述的组合物的任一个来调节昆虫适合度的方法。在一种情况下，调节昆虫宿主的适合度的方法包括向宿主递送如先前权利要求中任一项所述的组合物，其中该调节剂靶向寄宿于宿主中的一种或多种微生物，从而调节宿主的适合度。在另一种情况下，调节昆虫宿主中的微生物多样性的方法包括向宿主递送如先前权利要求中任一项所述的组合物，其中该调节剂靶向寄宿于宿主中的一种或多种微生物，从而调节宿主中的微生物多样性。

[0040] 在上述方法的任一个的一些实施例中，该调节剂可以改变寄宿于宿主中的一种或多种微生物的水平。在上述方法的任一个的一些实施例中，该调节剂可以改变寄宿于宿主中的一种或多种微生物的功能。在一些实施例中，该一种或多种微生物可以是细菌和/或真菌。在一些实施例中，该一种或多种微生物是宿主适合度所需的。在一些实施例中，该一种或多种微生物是宿主存活所需的。

[0041] 在上述方法的任一个的一些实施例中，递送步骤可以包括以足以影响一种或多种微生物的剂量和时间来提供调节剂，从而调节宿主中的微生物多样性。在一些实施例中，该递送步骤包括将先前组合物的任一个局部施用至植物。在一些实施例中，该递送步骤包括通过基因工程化的植物来提供调节剂。在一些实施例中，该递送步骤包括将调节剂作为食物提供给宿主。在一些实施例中，该递送步骤包括提供携带调节剂的宿主。在一些实施例中，携带调节剂的宿主可以将调节剂传播给一种或多种另外的宿主。

[0042] 在上述方法的任一个的一些实施例中，该组合物有效提高该宿主的健康和/或存活。在一些实施例中，该组合物有效提高宿主适合度、提高宿主寿限、提高有效授粉、提高宿主产物的产生、提高宿主繁殖、或其组合。在一些实施例中，该组合物有效降低该宿主对杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)的敏感性。在一些实施例中，该杀有害生物剂是新烟碱。在一些实施例中，该组合物有效提高该宿主对植物产生的化感剂的抗性。在一些实施例中，在组合物递送之前，该化感剂对该宿主具有毒性。在一些实施例中，该化感剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂(soyacystatin)N、单萜类、二萜酸、或酚类化合物。在一些实施例中，该组合物有效提高该宿主中的营养物产量，从而提高了衍生自该宿主的产物中的营养物含量。在一些实施例中，该营养物是维生素、碳水化合物、氨基酸或多肽。

[0043] 在上述方法的任一个的一些实施例中，该宿主的至少一部分可用于制造可消费产品。在上述方法的任一个的一些实施例中，该宿主是昆虫。在一些实施例中，该昆虫是属于以下目的物种：虱目(Anoplura)、蜘蛛目(Araneae)、蜚蠊目(Blattodea)、鞘翅目(Coleoptera)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)、纺足目(Embioptera)、蜉蝣目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、螳螂目(Mantidae)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨尾目(Thysanura)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)、或缺翅目(Zoraptera)。在某些实施例中，该昆虫是蟋蟀。在某些实施例中，该昆虫是蚱蜢。在某些实施例中，该昆虫是蝗虫。在一些实施例中，该产品包括人类食品。在一些实施例中，该产品包括补充动物饲料或人类食品的营养补充剂。在一些实施例中，该产品包括动物饲料。
在一些实施例中，这些动物是牲畜或农场动物。

[0044] 在另一个方面，本文提供了制造人类或动物食品的方法，该方法包括(a)提供多个(例如，2个、>2个、>5个、>10个、>100个、>1000个、>5，000个、>10，000个、>50，000个、>100，000个)宿主昆虫，(b)以有效调节寄宿于该多个宿主昆虫中的一种或多种微生物的量，向该多个宿主昆虫递送本文所述的可摄取组合物，和(c)将该多个宿主昆虫加工(例如，研磨，任选地与载体或另一种食物组分混合)成食物、食品添加剂或食品补充剂。在一些实施例中，该可摄取组合物包含微生物。在一些实施例中，该微生物产生营养物，并且相对于参考水平，该微生物有效提高该宿主中的营养物产量。在一些实施例中，该微生物是细菌。在一些实施例中，该营养物是维生素、碳水化合物、氨基酸或多肽。在一些实施例中，该氨基酸是甲硫氨酸。

[0045] 在上述方法的任一个的一些实施例中，该递送步骤包括将先前组合物的任一个递送至植物。在一些实施例中，该植物是农作物。在一些实施例中，该作物在递送时是未收获的作物。在一些实施例中，该作物在递送时是收获的作物。在一些实施例中，该作物包括收获的水果或蔬菜。在一些实施例中，该组合物以有效增加作物生长的量和持续时间递送。在一些实施例中，该作物包括玉米、大豆或小麦植物。

[0046] 在另一个方面，本文还提供了筛选测定以鉴定调节宿主的适合度的调节剂。在一种情况下，鉴定调节宿主适合度的调节剂的筛选测定包括以下步骤：(a)将可以寄宿于宿主中的微生物暴露于一种或多种候选调节剂下，和(b)鉴定提高或降低宿主适合度的调节剂。

[0047] 在筛选测定的一些实施例中，该调节剂是寄宿于宿主中的微生物。在一些实施例中，该微生物是细菌。在一些实施例中，当寄宿于宿主中时，该细菌提高宿主适合度。在一些实施例中，该细菌降解杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)。在一些实施例中，该杀有害生物剂是新烟碱。在一些实施例中，该细菌分泌氨基酸。在一些实施例中，其中该氨基酸是甲硫氨酸。

[0048] 在筛选测定的一些实施例中，该调节剂影响降解化感物质的微生物。在一些实施例中，该调节剂是噬菌体、抗生素、或测试化合物。在一些实施例中，该抗生素是特美汀或阿奇霉素。

[0049] 在筛选测定的一些实施例中，该宿主可以是无脊椎动物。在一些实施例中，该无脊椎动物是昆虫。在一些实施例中，该昆虫是蟋蟀。在某些实施例中，该昆虫是蚱蜢。在某些实施例中，该昆虫是蝗虫。

[0050] 在筛选测定的上述实施例的任一个中，宿主适合度可以通过调节宿主微生物区系来调节。

[0051] 定义

[0052] 如本文所用的，术语“细菌素”是指具有抗微生物特性的肽或多肽。天然存在的细菌素是由某些原核生物产生的，并且对抗与生产菌株相关的生物，但不针对生产菌株本身。本文所预期的细菌素包括但不限于天然存在的细菌素(如由细菌产生的细菌素)及其衍生物(如工程化的细菌素、重组表达的细菌素、以及化学合成的细菌素)。在一些情况下，该细菌素是本文所述的细菌素的功能活性变体。在一些情况下，该细菌素的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的细菌素或天然存在的细菌素的序列具有至少70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。

[0053] 如本文所用的，术语“含菌细胞”是指在某些昆虫中发现的特化细胞，其中细胞内细菌具有共生细菌的特性。

[0054] 如本文所用的，术语“有效量”是指足以影响以下所列举的结果的调节剂(例如，噬菌体、溶素、细菌素、小分子、或抗生素)或者包括所述药剂的组合物的量：例如以提高或促进宿主生物(例如，昆虫)的适合度；达到靶宿主内调节剂浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；达到靶宿主肠内调节剂浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；达到靶宿主含菌细胞内调节剂浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；调节靶宿主中一种或多种微生物(例如，内共生体)的水平或活性。

[0055] 如本文所用的，术语“适合度”是指宿主生物存活和/或产生存活后代的能力。生物的适合度可以通过一个或多个参数来测量，包括但不限于寿限、营养物产量、繁殖速率、迁移、体重、以及代谢速率。适合度可另外地基于活动或产物产量的量度来测量。

[0056] 如本文所用的，术语“肠”是指宿主肠的任何部分，包括宿主的前肠、中肠、或后肠。

[0057] 如本文所用的，术语“宿主”是指携带寄宿微生物(例如，内源微生物、内共生微生物(例如，原生或次生内共生体)、共栖生物、和/或致病微生物)的生物(例如，昆虫)。

[0058] 如本文所用的，“提高宿主适合度”或“促进宿主适合度”是指由于给予调节剂而产生的宿主生理学或所述宿主进行的任何活动的任何有利的改变，包括但不限于以下所希望效果中的任何一种或多种：(1)使宿主的群体提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(2)使宿主(例如，昆虫)的繁殖速率提高约
10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(3)使宿主(例如，昆虫)的迁移提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、
99％、100％或更多；(4)使宿主(例如，昆虫)的体重提高约10％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(5)使宿主(例如，昆虫)的代谢速率或活动提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；
(6)使宿主副产物的产量提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、
99％、100％或更多；(7)使宿主(例如，昆虫)的营养物(例如，蛋白、脂肪酸、或氨基酸)含量提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；或(8)使宿主对杀有害生物剂的抗性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、
90％、95％、99％、100％或更多。可以确定与没有被给予调节剂的宿主生物相比宿主适合度的提高。

[0059] 术语“昆虫”包括在任何发育阶段(即，未成熟昆虫和成虫昆虫)的属于节肢动物门以及属于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物。

[0060] 如本文所用的，“溶素”(也称为内溶素、自溶素、胞壁质水解酶、肽聚糖水解酶、或细胞壁水解酶)是指可以通过裂解细菌细胞壁中的肽聚糖来溶解细菌的水解酶。本文所预期的溶素包括但不限于天然存在的溶素(如由噬菌体产生的溶素、由细菌产生的溶素)及其衍生物(如工程化的溶素、重组表达的溶素、以及化学合成的溶素)。细菌素的功能活性变体可以例如在指定区域或整个序列上与包括任何本文所述的合成的、重组的或天然衍生的细菌素的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、或99％同一性。

[0061] 如本文所用的，术语“微生物”是指细菌或真菌。微生物可以是指寄宿于宿主生物(例如，内源性微生物、内共生微生物(例如，原生或次生内共生体))的微生物或者对宿主为外源的微生物，包括那些可充当调节剂的微生物。如本文所用的，术语“靶微生物”是指寄宿于宿主中的并且直接或间接地受调节剂影响的微生物。

[0062] 如本文所用的，术语“调节剂”或“药剂”是指能够改变寄宿于宿主生物(例如，昆虫)中的微生物的水平和/或功能，并且从而调节(例如，提高)宿主生物(例如，昆虫)的适合度的药剂。

[0063] 如本文所用的，“提高昆虫的营养特征”是指提高营养物的产量，该营养物可提高该昆虫的蛋白含量、体质量、和/或整体营养价值。

[0064] 如本文所用的，术语“杀有害生物剂(pesticide或pesticidal agent)”是指可用于控制农业有害生物、环境有害生物、或家养/家居有害生物，如昆虫、真菌、细菌、或病毒的物质。术语“杀有害生物剂”被理解为涵盖天然存在的或合成的杀昆虫剂(杀幼虫剂或杀成虫剂(adulticide)、昆虫生长调节剂、杀螨剂(杀螨药)、杀线虫剂、杀外寄生物药、杀细菌剂、杀真菌剂、或除草剂(可用于农业以控制或改变植物生长的物质)。杀有害生物剂(pesticide或pesticidal agent)的另外的实例列于表12中。在一些情况下，该杀有害生物剂是化感物质。如本文所用的，“化感物质”或“化感剂”是由生物产生的物质，该生物可以影响另一种生物(例如，宿主昆虫)的生理功能(例如，萌发、生长、存活或繁殖)。

[0065] 如本文所用的，术语“肽”、“蛋白质”或“多肽”涵盖天然或非天然存在的氨基酸(D‑或L‑氨基酸)的任何链，无论长度(例如，至少2、3、4、5、6、7、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、100或更多个氨基酸)、存在或不存在翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)、或存在例如与肽共价连接的一个或多个非氨基酰基基团(例如，糖、脂质等)，并且包括例如天然蛋白、合成的或重组的多肽和肽、杂交分子、类肽或模拟肽。

[0066] 如本文所用的，两个序列之间的“百分比同一性”通过BLAST 2.0算法(描述于Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403‑410)确定。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。

[0067] 如本文所用的，术语“细菌噬菌体”或“噬菌体”是指在细菌中感染和复制的病毒。细菌噬菌体在将它们的基因组注射进入细胞质后在细菌内进行复制，并使用导致细菌细胞溶解的裂解性周期或使细菌细胞保持完整的溶原性(非裂解性)周期进行复制。噬菌体可以是天然存在的噬菌体分离物，或工程化的噬菌体，包括媒介或编码部分噬菌体基因组(例如，包括在宿主细菌内进行噬菌体生命周期所必需的至少所有的必需基因)或完整噬菌体基因组的核酸。

[0068] 如本文所用的，术语“植物”是指整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子、或它们的子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、枝、配子体、孢子体、花粉、或小孢子的细胞。植物部分包括分化的或未分化的组织，这些组织包括但不限于以下：根、茎、枝、叶、花粉、种子、肿瘤组织、以及各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚、或愈伤组织)。植物组织可以在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。此外，植物可以被基因工程化以产生例如本文所述的方法或组合物中的调节剂的任一个的异源蛋白或RNA。

[0069] 术语“通过......可获得”、“通过......可产生”或其他类似短语用于指示权利要求或实施例是指化合物、组合物、产物等本身，即该化合物、组合物、产物等可通过描述用于制造该化合物、组合物、产物等的方法获得或产生，但该化合物、组合物、产物等也可以通过该描述的方法以外的其他方法获得或产生。术语“通过......获得”、“通过......产生”或等等指示化合物、组合物、产物是通过所列举的具体方法获得或产生的。应理解，术语“通过......获得”、“通过......产生”和等等还披露了术语“通过......获得”、“通过......产生”和等等作为“通过......可获得”、“通过......可产生”和等等的优选的实施例。

[0070] 从以下详细说明以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将会是显而易见的。附图说明

[0071] 附图旨在说明本发明的一个或多个特征、方面或实施例，而非旨在进行限制。

[0072] 图1是示出黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)从胚到达成虫期的时间的图。将黑腹果蝇的胚用接种了谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(一种产生谷氨酸盐‑谷氨酸棒状杆菌谷氨酸盐(C.glutamicum Glu)的菌株)的饲料或者用不含任何细菌的无外来菌的饲料饲养。从第一只成虫出现开始，每12小时测量从它们的蛹中出现的成虫的百分比。用补充细菌的饲料饲养的生物比它们的无细菌的对应物更快地到达成虫期。

[0073] 图2A是示出黑腹果蝇中雄性性别对发育率差异的作用的图。将图11中出现的成虫按照性别分类并且将它们的出现率作图。

[0074] 图2B是示出黑腹果蝇中雌性性别对发育率差异的作用的图。将图1中出现的成虫按照性别分类并且将它们的出现率作图。由于饲料中细菌的出现，雌性发育率的提高显著高于它们的雄性对应物。相比在雄性中，蝇饲料中细菌存在的益处在雌性中更高。

[0075] 图3是示出谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)菌株促进幼虫生物量的图。用补充了产生谷氨酸盐或甲硫氨酸的谷氨酸棒状杆菌的菌株的饲料饲养的幼虫比用无菌饲料或补充了大肠杆菌(Escherichia coli)的饲料饲养的那些幼虫更大。以幼虫图像中的像素数测量幼虫区域。中位数和95％的置信区间示出为图上的线。

[0076] 图4是一组图，这些图显示了针对细菌呼吸的海马(Seahorse)通量测定的结果。如在方法中所述的，细菌生长至对数生长期并加载到海马(Seahorse)XFe96板中，用于氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)的时间测量。大约20分钟后将处理物注射入孔中，并监测细菌以检测生长变化。利福平＝100μg/mL；氯霉素＝25μg/mL；噬菌体(针对大肠杆菌为T7，以及针对黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)为ΦSmVL‑C1)是在SM缓冲液中以1∶2或1∶100稀释的裂解物。每条线上的标记仅作为每条线对应的条件的指标提供，并不指示数据点。

[0077] 图5是显示针对黏质沙雷氏菌的噬菌体降低了蝇死亡率的图。用黏质沙雷氏菌针刺的蝇都在一天内死亡，而用黏质沙雷氏菌和噬菌体针刺的相当大部分的蝇在处理后存活了五天。几乎所有未经处理的对照蝇无论如何都存活至实验结束。使用对数秩检验来比较统计学显著性的曲线，星号表示p＜0.0001。

[0078] 本文提供了用于食物和饲料应用的方法和组合物，例如，用于改变寄宿于宿主昆虫中的一种或多种微生物的水平、活性或代谢，该改变导致该宿主的适合度提高。本发明的特征在于组合物，该组合物包括调节剂(例如，噬菌体、肽、小分子、抗生素、或其组合)，该调节剂能以对宿主有益的方式改变该宿主的微生物区系。通过促进有利的微生物水平、微生物活性、微生物代谢、和/或微生物多样性，本文所述的调节剂可以用于提高在人类食物和动物饲料工业中使用的多种昆虫的适合度。

[0079] 本文所述的方法和组合物部分地基于以下实例，这些实例示出不同的药剂(例如，产甲硫氨酸微生物)如何可用在昆虫宿主(如蟋蟀、蝇、蚱蜢或蝗虫)中，以通过改变这些宿主中的微生物的水平、活性或代谢来间接改善这些宿主的健康(例如，提高甲硫氨酸含量、体质量、发育率、和/或存活)。产甲硫氨酸微生物是产氨基酸微生物的代表性实例并且更广泛地说代表产营养物的微生物，并且这一类型的其他微生物可用于本发明中。在此基础上，本披露描述了改变寄宿于宿主中的一种或多种微生物的水平、活动或代谢的药剂的使用的多种不同方法，该改变导致该宿主适合度的调节。

[0080] I.宿主

[0081] i.昆虫

[0082] 如本文所述的任何组合物或方法的宿主可以是属于节肢动物门(例如，昆虫)的任何生物，包括本文所述的任何节肢动物。在一些情况下，该宿主可以是为可消耗产品(例如，食物或饲料)而培育的昆虫或蛛形纲动物。例如，该宿主可以是蛾、蝴蝶、蝇、蟋蟀、蚱蜢、蝗虫、蜘蛛、或甲虫。在一些情况下，该宿主属于以下目：虱目(Anoplura)、蜘蛛目(Araneae)、蜚蠊目(Blattodea)、鞘翅目(Coleoptera)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)、纺足目(Embioptera)、蜉蝣目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、螳螂目(Mantidae)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨尾目(Thysanura)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)、或缺翅目(Zoraptera)。

[0083] 在一些实例中，该宿主是黑水虻(black soldier fly，Hermetia illucens)、家蝇、小粉虫(lesser mealworm)、编织蚊、蚕(家蚕(Bombyx mori))、蚱蜢、中华稻蝗(中华蚱蜢(Acrida cinerea))、黄粉虫(yellow mealworm)(Clarias gariepinns)、蛾(Anaphe infracta或家蚕(Bombyx mori))、海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)、家蟋蟀、白蚁、椰棕象虫(红棕象甲(Rhynchophorus ferruginens))、大负子蝽(印度田鳖(Lethocerus indicus))、龙虱、白蚁(非洲曼迪大白蚁(Macrotermes subhyalinus))、窃蠹甲(药材甲(Stegobium paniceum))、Imbrasia belina、紫棕象甲(Rhynchophorus phoenicis)、二疣犀甲(Oryctes rhinoceros)、非洲大白蚁(Macrotermes bellicosus)、Ruspolia 
differens、非洲蛀犀金龟甲(Oryctes Monoceros)、或黄猄蚊(Oecophylla smaragdina)。

[0084] 在具体情况下，本文披露的调节剂可用于提高蟋蟀、蚱蜢、或蝗虫的适合度。

[0085] 该宿主可处于任何发育阶段。例如，该宿主可以是胚、幼虫、蛹、或成虫。

[0086] ii.宿主适合度

[0087] 本文提供的方法和组合物可用于提高本文所述的宿主中任一种的适合度。适合度的提高可能是由于寄宿于宿主中的微生物的任何改变，其中这些改变是给予调节剂的结果并且对宿主具有有益或有利的作用。

[0088] 在一些情况下，由于给予调节剂，宿主适合度的提高可表现为宿主生理学的改善(例如，改善的健康或存活)。在一些情况下，生物的适合度可通过一种或多种参数来测量，这些参数包括但不限于相比于没有被给予调节剂的宿主生物的繁殖速率、寿限、迁移、繁殖力、体重、代谢速率或活动、或存活。例如，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可有效改善该宿主的整体健康或改善该宿主的整体存活。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，该宿主的改善的存活是约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，这些方法和组合物有效提高了宿主繁殖(例如，繁殖速率)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，这些方法和组合物可有效使其他的生理参数(如迁移、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于
100％。

[0089] 在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该宿主适合度提高可表现为在宿主中一种或多种营养物(例如，维生素、碳水化合物类、氨基酸、或多肽)产量的提高。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使该宿主中的营养物(例如，维生素、碳水化合物类、氨基酸、或多肽)的产量提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于
100％。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可通过提高由宿主中的一种或多种微生物(例如，内共生体)产生的营养物的产量来增加宿主中的营养物。

[0090] 在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度的提高可表现为该宿主对杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)的敏感性的降低和/或该宿主对杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)的抗性的提高。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使宿主对杀有害生物剂的敏感性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。该杀有害生物剂可以是本领域已知的任何杀有害生物剂，包括杀昆虫剂。在一些情况下，该杀有害生物剂是新烟碱。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可通过提高该宿主将杀有害生物剂代谢或降解为可用底物的能力来降低该宿主对杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)的敏感性。

[0091] 在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度的提高可表现为该宿主对化感剂的敏感性的降低和/或该宿主对化感剂的抗性的提高。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使该宿主对化感剂的抗性提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物相比，该化感剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂N、单萜类、二萜酸或酚类化合物。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可通过提高该宿主将化感剂代谢或降解为可用底物的能力来降低该宿主对化感剂的敏感性。

[0092] 在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可以有效提高宿主对寄生物或病原体(例如真菌的、细菌的、或病毒的病原体或寄生螨)的抗性。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使该宿主对病原体或寄生物(例如，真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体；或者寄生螨)的抗性提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。

[0093] 在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度提高可表现为其他适合度优点，如对某些环境因素(例如，高温或低温耐受性)的耐受性提高、在某些生境中的存活能力提高、或维持某种饲料的能力提高(例如，代谢大豆和玉米的能力提高)。在一些情况下，本文提供的方法或组合物能以本文所述的多种方式中的任一种来有效提高宿主适合度。此外，该调节剂可在任何数量的宿主纲、目、科、属、或物种(例如，1个宿主物种，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、200个、250个、500个、或更多个宿主物种)中提高宿主适合度。在一些情况下，该调节剂作用于单一宿主纲、目、科、属、或物种。

[0094] 可以使用本领域的任何标准方法来评估宿主适合度。在一些情况下，可以通过评估个体宿主来评估宿主适合度。可替代地，可以通过评估宿主群体来评估宿主适合度。例如，宿主适合度提高可表现为与其他昆虫的成功竞争的提高，从而导致该宿主群体的规模增加。

[0095] iii.饲料/食品生产中的宿主昆虫

[0096] 在达到所希望的生命阶段后，可以收获宿主，并且如果需要，可以对其进行处理以用于制造可消耗产品。在一些情况下，该收获的昆虫能以完整的形式(例如，作为完整的、未经加工的昆虫)作为可消耗产品分售。在一些情况下，该完整的收获的昆虫被加工(例如，研磨)并作为可消耗产品分售。可替代地，可以从该昆虫中提取该昆虫的一个或多个部分(例如，一个或多个身体部分或一种或多种物质)用于制造可消费产品。

[0097] 该可消耗产品可以是对于人类或动物消耗(例如，摄取)来说是安全的任何产品。在一些情况下，该宿主可用于制造动物饲料。在一些情况下，该动物是牲畜或农场动物(例如，鸡、牛、马或猪)。在一些情况下，该动物是鸟类、爬行动物、两栖动物、哺乳动物或鱼类。
在一些情况下，该宿主可用于制造替代动物的正常饲料的产品。可替代地，该宿主可用于制造补充动物的正常饲料的产品。该宿主还可用于制造人用食品、食品添加剂或食品成分。在一些情况下，该宿主用于制造人用营养补充剂(例如，蛋白补充剂)。

[0098] 该宿主可以是野生的昆虫或驯化的昆虫。另外地，在递送或施用本文所述的该组合物时，该宿主可以处于任何发育阶段。此外，在收获该宿主用于制造可消耗产品时，该宿主可处于任何发育阶段。在一些情况下，在收获、使用、加工或制造时，该宿主是幼虫、蛹、或成虫。该调节剂的递送和收获步骤可同时或不同时发生。

[0099] 在一些情况下，基于昆虫物种的天然营养特征，对其进行选择。在一些情况下，将调节剂用于改善该昆虫的营养特征，其中相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂导致营养物的产量提高。营养物的实例包括维生素、碳水化合物类、氨基酸、多肽、或脂肪酸。在一些情况下，该提高的产量可能是由于寄宿于该宿主中的微生物产生的营养物的产量提高。可替代地，该提高的产量可能是由于该宿主昆虫本身产生的营养物的产量的提高，其中在递送或给予调节剂之后，该宿主具有提高的适合度。

[0100] 在一些情况下，在最后加工中，将第一昆虫物种与第二昆虫物种结合，其中该第二昆虫物种的营养特征对食品或饲料产品的整体营养价值提供了补充性益处。例如，具有高蛋白特征的物种可与具有高ω3/6脂肪酸特征的物种结合。以这种方式，昆虫蛋白粉可以定制混合以满足人类或不同动物物种的需要。

[0101] II.靶微生物

[0102] 本文所述的调节剂靶向的微生物可以包括寄宿于宿主体内或体表的任何微生物，包括但不限于本文所述的任何细菌和/或真菌。寄宿于宿主中的微生物可以包括，例如，共生微生物(例如，为宿主提供有益的营养物或酶的内共生微生物)、共栖微生物、致病微生物、或寄生微生物。共生微生物(例如，细菌或真菌)可以是宿主的专性共生体或宿主的兼性共生体。寄宿于宿主中的微生物可以通过任何传播方式获得，包括垂直传播、水平传播或多个传播源。

[0103] i.细菌

[0104] 根据本文提供的方法和组合物可靶向的示例性细菌包括但不限于：致病杆菌属物种(Xenorhabdus spp)、发光杆菌属物种(Photorhabdus spp)、暂定属物种(Candidatus spp)、布赫纳氏菌属物种(Buchnera spp)、布拉特杆菌属物种(Blattabacterium spp)、鲍曼属物种(Baumania spp)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp)、沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp)、立克次体属物种(Rickettsia spp)、东方体属物种(Orientia spp)、伴突属物种(Sodalis spp)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp)、贪铜菌属物种(Cupriavidus spp)、弗兰克氏菌属物种(Frankia  spp)、中华根瘤菌属物种(Snirhizobium spp)、链球菌属物种(Streptococcus spp)、沃廉菌属物种(Wolinella spp)、木杆菌属物种(Xylella spp)、欧氏杆菌属物种(Erwinia spp)、农杆菌属物种
(Agrobacterium  spp)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)、类芽孢杆菌属物种
(Paenibacillus spp)、链霉菌属物种(Streptomyces spp)、微球菌属物种(Micrococcus spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、醋杆菌属物种(Acetobacter spp)、蓝细菌属物种(Cyanobacteria spp)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp)、红球菌属物种
(Rhodococcus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)、肠球菌属物种(Enterococcus spp)、产碱杆菌属物种(Alcaligenes spp)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、节杆菌属物种(Arthrobacter spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、短杆菌属物种
(Brevibacterium spp)、栖热菌属物种(Thermus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、梭菌属物种(Clostridium spp)、以及埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp)。可通过本文提供的方法和组合物靶向的细菌的非限制性实例显示于表1中。

[0105] 表1：靶细菌和宿主昆虫的实例

[0106]

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[0162] 本文所述的组合物或方法可以靶向任何数量的细菌物种。例如，在一些情况下，该调节剂可以靶向单一细菌物种。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、或更多种不同的细菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向约1至约5、约5至约10、约10至约20、约20至约50、约50至约100、约100至约200、约200至约500、约10至约50、约5至约20、或约10至约100种不同的细菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、或更多种细菌的门、纲、目、科或属中的任一者。

[0163] 在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种细菌(例如，共生细菌)的群体增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种细菌(例如，致病细菌或寄生细菌)的群体减少至少约10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，该调节剂可根除该宿主中的细菌(例如，致病细菌或寄生细菌)群体。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种共生细菌的水平提高至少约10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者和/或使宿主中一种或多种致病细菌的水平降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。

[0164] 在一些情况下，该调节剂可以改变宿主的细菌多样性和/或细菌组成。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，调节剂可使宿主中的细菌多样性相对于起始多样性增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，调节剂可使宿主中的细菌多样性相对于起始多样性减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。

[0165] 在一些情况下，该调节剂可以改变一种或多种细菌细胞的功能、活性、生长、和/或分化。例如，该调节剂可以改变细菌中一种或多种基因的表达。在一些情况下，该调节剂可以改变细菌中一种或多种蛋白质的功能。在一些情况下，该调节剂可以改变细菌中一种或多种细胞结构(例如，细胞壁、外膜或内膜)的功能。在一些情况下，该调节剂可以杀死(例如，裂解)细菌。

[0166] 靶细菌可以寄宿于昆虫的一个或多个部分中。此外，靶细菌可以是细胞内或细胞外的。在一些情况下，细菌可以寄宿于宿主肠内或肠表的一个或多个部分中，该肠包括例如，前肠、中肠和/或后肠。在一些情况下，细菌作为细胞内细菌寄宿于宿主昆虫的细胞内。在一些情况下，细菌寄宿于宿主昆虫的含菌细胞。

[0167] 可以通过本领域已知的任何方法(如微阵列、聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、流式细胞术、荧光显微镜法、透射电子显微术、荧光原位杂交技术(例如FISH)、分光光度计法、基质辅助激光解析电离‑质谱法(MALDI‑MS)、以及DNA测序)确定宿主中细菌的群体的改变。在一些情况下，对用调节剂处理的宿主样品进行测序(例如，通过16S rRNA或rDNA的宏基因组测序)以确定在递送或给予调节剂后宿主的微生物组。在一些情况下，还对未接受调节剂的宿主样品进行测序以提供参考。

[0168] ii.真菌

[0169] 根据本文提供的方法和组合物可靶向的示例性真菌包括但不限于：Amylostereum areolatum，香柱菌属物种(Epichloe spp)、松果毕赤酵母(Pichia pinus)、荚膜汉逊酵母(Hansenula capsulate)、Daldinia decipien、长喙壳属物种(Ceratocystis spp)、长喙壳菌属物种(Ophiostoma spp)、以及Attamyces bromatificus。昆虫中发现的酵母和酵母样共生体的非限制性实例包括假丝酵母属(Candida)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、德巴利酵母属(Debaromyces)、休哈塔假丝酵母(Scheffersomyces shehatae)和树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipites)、Starmerella、毕赤酵母属(Pichia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、隐球菌属(Cryptococcus)、南极假丝酵母属(Pseudozyma)，以及来自盘菌亚门(subphylum Pezizomycotina)的酵母样共生体(例如，Symbiotaphrina bucneri和Symbiotaphrina kochii)。本文的方法和组合物可靶向的酵母的非限制性实例列于表2中。

[0170] 表2

[0171]

[0172]

[0173]

[0174]

[0175]

[0176]

[0177]

[0178]

[0179]

[0180] 本文所述的组合物或方法可以靶向任何数量的真菌物种。例如，在一些情况下，该调节剂可以靶向单一真菌物种。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、或更多种不同的真菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向约1至约5、约5至约10、约10至约20、约20至约50、约50至约100、约100至约200、约200至约500、约10至约50、约5至约20、或约10至约100种不同的真菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、或更多种真菌的门、纲、目、科或属中的任一者。

[0181] 在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种真菌(例如，共生真菌)的群体增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种真菌(例如，致病真菌或寄生真菌)的群体减少至少约10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，该调节剂可根除该宿主中的真菌(例如，致病真菌或寄生真菌)群体。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种共生真菌的水平提高至少约10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者和/或可使宿主中一种或多种致病真菌的水平降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。

[0182] 在一些情况下，该调节剂可以改变宿主的真菌多样性和/或真菌组成。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中的真菌多样性相对于起始多样性增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中的真菌多样性相对于起始多样性减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。

[0183] 在一些情况下，该调节剂可以改变一种或多种真菌的功能、活性、生长、和/或分化。例如，该调节剂可以改变真菌中一种或多种基因的表达。在一些情况下，该调节剂可以改变真菌中一种或多种蛋白质的功能。在一些情况下，该调节剂可以改变真菌中一种或多种细胞组分的功能。在一些情况下，该调节剂可以杀死真菌。

[0184] 此外，靶真菌可以寄宿于昆虫的一个或多个部分中。在一些情况下，真菌可以寄宿于昆虫肠内或肠表的一个或多个部分中，该肠包括例如，前肠、中肠和/或后肠。在一些情况下，真菌在细胞外生活在宿主的血淋巴、脂肪体或在特化结构中。

[0185] 可以通过本领域已知的任何方法(如微阵列、聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、流式细胞术、荧光显微镜法、透射电子显微术、荧光原位杂交技术(例如FISH)、分光光度计法、基质辅助激光解析电离‑质谱法(MALDI‑MS)、以及DNA测序)确定宿主中真菌的群体的改变。在一些情况下，对用调节剂处理的宿主样品进行测序(例如，通过宏基因组测序)以确定在递送或给予调节剂后宿主的微生物组。在一些情况下，还对未接受调节剂的宿主样品进行测序以提供参考。

[0186] III.调节剂

[0187] 本文提供的方法和组合物的调节剂可以包括噬菌体、多肽、小分子、抗生素、次生代谢物、细菌、真菌、或其任何组合。

[0188] i.噬菌体

[0189] 本文所述的调节剂可以包括噬菌体(例如，裂解性噬菌体或非裂解性噬菌体)。在一些情况下，本文所述的有效浓度的任何噬菌体可以改变寄宿于本文所述的宿主中的一种或多种微生物(如本文所述)的水平、活性或代谢，该改变导致该宿主的适合度提高。在一些情况下，该调节剂包括选自以下目的至少一种噬菌体：复层病毒科(Tectiviridae)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、有尾噬菌体目(Caudovirales)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、或线状病毒目(Ligamenvirales)。在一些情况下，该组合物包括选自以下科的至少一种噬菌体：肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、Ampullaviridae，Bicaudaviridae，Clavaviridae、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌科(Cystoviridae)、纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、Gluboloviridae、滴状病毒科(Guttaviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、光滑噬菌体科(Leviviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、和复层病毒科(Tectiviridae)。在本方法和组合物中有用的噬菌体的另外的非限制性实例列于表3中。

[0190] 表3：噬菌体和靶细菌的实例

[0191]

[0192]

[0193]

[0194] 在一些情况下，调节剂包括裂解性噬菌体。因此，在将裂解性噬菌体递送至寄宿于宿主的细菌细胞后，该噬菌体引起靶细菌细胞中的裂解。在一些情况下，该裂解性噬菌体靶向并杀死寄宿于宿主昆虫中的细菌以提高该宿主的适合度。可替代地或另外地，该调节剂的噬菌体可以是非裂解性噬菌体(也称为溶原性噬菌体或温和噬菌体)。因此，在将非裂解性噬菌体递送至寄宿于宿主的细菌细胞后，该细菌细胞可保持存活并能够稳定地维持噬菌体基因组中编码的基因的表达。在一些情况下，非裂解性噬菌体用于改变寄宿于宿主昆虫中的细菌中的基因表达以提高该宿主的适合度。在一些情况下，该调节剂包括裂解性噬菌体和非裂解性噬菌体的混合物。

[0195] 本文所述的调节剂可包括具有窄的或宽的细菌靶范围的噬菌体。在一些情况下，该噬菌体具有窄的细菌靶范围。在一些情况下，该噬菌体是具有大的细菌靶范围的混杂的噬菌体。例如，该混杂的噬菌体可以靶向寄宿于宿主的至少约5、10、20、30、40、50、或更多中的任一者的细菌。具有窄细菌靶范围的噬菌体可靶向宿主中的特异性细菌菌株，而不影响该宿主中另一种细菌，例如非靶向的细菌。例如，该噬菌体可以靶向不超过寄宿于宿主的约50、40、30、20、10、8、6、4、2、或1中的任一者的细菌。

[0196] 本文所述的组合物可以包括任何数量的噬菌体，如至少约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100或更多个噬菌体中的任一者。在一些情况下，该组合物包括来自一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多种噬菌体)科，一个或多个目(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、
10、或多种噬菌体)，或一个或多个物种(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100、或多种噬菌体)的噬菌体。包括一种或多种噬菌体的组合物在本文中也称为“噬菌体混合物”。噬菌体混合物是有用的，因为它们允许靶向更广泛的细菌的宿主范围。此外，它们允许每种细菌菌株(即亚种)被多个正交噬菌体靶向，从而防止或显著延迟抗性的发作。在一些情况下，混合物包括靶向一种细菌物种的多种噬菌体。在一些情况下，混合物包括靶向多种细菌物种的多种噬菌体。在一些情况下，单噬菌体“混合物”包括靶向物种内的许多菌株的单个混杂的噬菌体(即具有大宿主范围的噬菌体)。

[0197] 本文所述的调节剂中噬菌体的合适浓度取决于如功效、存活率、噬菌体的可传递性、组合物中不同噬菌体的数量和/或溶素类型、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，噬菌体是处于液体或固体配制品的形式。在一些情况下，本文所述的组合物的任2 3 4 5 6 7 8 9 10
一个中每种噬菌体的浓度为至少约10、10 、10、10、10 、10、10、10 、10 或更多pfu/ml中的任一者。在一些情况下，本文所述的组合物的任一个中每种噬菌体的浓度为不超过约
2 3 4 5 6 7 8 9
10、10 、10、10 、10、10 、10、10pfu/ml中的任一者。在一些情况下，组合物中每种噬菌体
2 3 3 4 4 5 5 6 7 8 8
的浓度为约10 至约10、约10至约10 、约10至约10 、约10至约10、约10至约10、约10 至
9 2 4 4 6 6 9 3 8
约10、约10至约10 、约10至约10、约10至约10 、或约10至约10pfu/ml中的任一者。在一些情况下，其中组合物包括至少两种类型的噬菌体，每种类型的噬菌体的浓度可以相同或
8
不同。例如，在一些情况下，混合物中一种噬菌体的浓度为约10pfu/ml，并且混合物中第二
6
噬菌体的浓度为约10pfu/ml。

[0198] 包括如本文所述的噬菌体的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内噬菌体浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内噬菌体浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内噬菌体浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。

[0199] 如实例7和实例9所示，通过从昆虫宿主如蟋蟀中消除细菌病原体如黏质沙雷氏菌、Erwinia catotovora、和喜昆虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)，噬菌体可用作调节剂。

[0200] ii.多肽

[0201] 许多种多肽(例如，细菌素、R型细菌素、根瘤富含半胱氨酸肽、抗微生物肽、溶素、或含菌细胞调节肽)可用于本文所述的组合物和方法中。在一些情况下，本文所述的任何肽或多肽的有效浓度可以改变寄宿于宿主中的一种或多种微生物(如本文所述)的水平、活性或代谢，该改变导致该宿主的适合度提高。本文包括的多肽可以包括天然存在的多肽或重组产生的变体。例如，该多肽可以是本文所述的任何多肽的功能活性变体，例如在指定区域或整个序列上与本文所述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。

[0202] 包括如本文所述的多肽的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。

[0203] (a)细菌素

[0204] 本文所述的调节剂可以包括细菌素。在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阳性细菌天然产生的，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、或乳酸菌(LAB，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))。在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阴性细菌天然产生的，例如蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、Serratia plymithicum、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、或大肠杆菌
(Escherichia coli)。示例性细菌素包括但不限于I‑IV类LAB抗生素(例如羊毛硫抗生素)、大肠杆菌素、小菌素(microcin)和脓菌素。细菌素的非限制性实例列于表4中。

[0205] 表4：细菌素的实例

[0206]

[0207]

[0208]

[0209]

[0210] 在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阴性细菌产生的大肠杆菌素、脓菌素、或小菌素(microcin)。在一些情况下，该细菌素是大肠杆菌素。大肠杆菌素可以是A组大肠杆菌素(例如，使用Tol系统以渗透靶细菌的外膜)或B组大肠杆菌素(例如，使用Ton系统以渗透靶细菌的外膜)。在一些情况下，该细菌素是小菌素(microcin)。小菌素(microcin)可以是I类小菌素(microcin)(例如，<5kDa，具有翻译后修饰)或II类小菌素(microcin)(例如，5‑10kDa，具有或不具有翻译后修饰)。在一些情况下，II类小菌素(microcin)是IIa类小菌素(microcin)(例如，需要多于一个基因以合成和组装功能肽)或IIb类小菌素(microcin)(例如，在C‑末端具有或不具有翻译后修饰的线性肽)。在一些情况下，该细菌素是脓菌素。在一些情况下，该脓菌素是R‑脓菌素、F‑脓菌素、或S‑脓菌素。

[0211] 在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阳性细菌产生的I类、II类、III类、或IV类、细菌素。在一些情况下，该调节剂包括I类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的含有羊毛硫氨酸的抗生素(羊毛硫抗生素))。I类细菌素或羊毛硫抗生素可以是低分子量肽(例如，小于约5kDa)并且可以具有翻译后修饰的氨基酸残基(例如，羊毛硫氨酸、β‑甲基羊毛硫氨酸、或脱水氨基酸)。

[0212] 在一些情况下，该细菌素是II类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的非羊毛硫抗生素)。许多是带正电荷的不含羊毛硫氨酸的肽，这些肽(与羊毛硫抗生素不同)不进行广泛的翻译后修饰。II类细菌素可以属于以下子类之一：“片球菌素(pediocin)样”细菌素(例如，片球菌素(pediocin)PA‑1和肉食杆菌素(carnobacteriocin)X(IIa类))；双肽细菌素(例如，乳酸菌素F和ABP‑118(IIb类))；环形细菌素(例如，环状细菌素(carnocyclin)A和肠道菌素AS‑48(IIc类))；或未修饰的、线性的、非片球菌素(pediocin)样细菌素(例如，表皮菌素(epidermicin)NI01和乳球菌素A(IId类))。

[0213] 在一些情况下，该细菌素是III类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的)。III类细菌素可以具有大于10kDa的分子量并且可以是热不稳定的蛋白质。III类细菌素可以进一步细分为IIIA组细菌素和IIIB组细菌素。IIIA组细菌素包括溶菌酶，其通过细胞壁的裂解来杀死敏感菌株，例如Enterolisin A。IIIB组细菌素包括非裂解性蛋白质，例如Caseicin 80、Helveticin J和乳酸菌素B。

[0214] 在一些情况下，该细菌素是IV类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的)。IV类细菌素是一组复合物蛋白，与其他脂质或碳水化合物部分相关，似乎是活性所需的。它们是相对疏水且热稳定的。IV类细菌素的实例leuconocin S、乳酸菌素27、和乳酸菌素S。

[0215] 在一些情况下，该细菌素是R型细菌素。R型细菌素是收缩性杀菌蛋白复合物。一些R型细菌素具有收缩性的噬菌体尾样结构。噬菌体尾丝蛋白的C‑末端区域决定靶结合特异性。它们可以通过受体结合蛋白(例如尾丝)附着于靶细胞。附着之后是鞘收缩以及通过靶细菌的包膜插入核心。核心穿透导致细胞膜电位的快速去极化并促使细胞死亡。与单一R型细菌素颗粒接触可导致细胞死亡。例如，R型细菌素可以是不耐热的、温和酸抗性的、胰蛋白酶抗性的、可通过离心沉降的、可通过电子显微镜分辨的、或其组合。其他R型细菌素可以是包括多种蛋白质、多肽或亚单元的复合物分子，并且可以类似于肌尾噬菌体科(Myoviridae)的细菌噬菌体的尾结构。在天然存在的R型细菌素中，亚单元结构可以由细菌基因组编码，例如艰难梭状芽孢杆菌(C.Difficile)或铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)的基因组并形成R型细菌素以用作针对其他细菌的天然防御。在一些情况下，该R型细菌素是脓菌素。在一些情况下，该脓菌素是R‑脓菌素、F‑脓菌素、或S‑脓菌素。

[0216] 在一些情况下，该细菌素是本文所述的细菌素的功能活性变体。在一些情况下，该细菌素的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的细菌素或天然存在的细菌素的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、或99％同一性。

[0217] 在一些情况下，根据标准方法，该细菌素可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加或减少或调节)或指定其靶微生物。在其他情况下，该细菌素是由微生物细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该细菌素是化学合成的。一些细菌素可以衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生细菌素本身的多肽。因此，在一些情况下，该细菌素由前体多肽产生。在一些其他情况下，该细菌素包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。

[0218] 可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的细菌素。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的细菌素，如至少约1种细菌素、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100、或更多种细菌素中的任一者。本文所述的组合物中每种细菌素的合适的浓度取决于如功效、细菌素的稳定性、组合物中不同细菌素类型的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种细菌素是从约0.01ng/ml至约
100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种细菌素是从约0.01ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的细菌素，每种类型的细菌素的浓度可以相同或不同。在一些情况下，该细菌素提供于包括分泌该细菌素的细菌细胞的组合物中。在一些情况下，该细菌素提供于包括多肽(例如，从细菌细胞分离的多肽)的组合物中。

[0219] 细菌素可以中和(例如，杀死)除制备多肽的个体细菌细胞以外的至少一种微生物，包括与细菌细胞和其他微生物细胞克隆相关的细胞。因此，细菌细胞可通过分泌细菌素对多种微生物有机体发挥细胞毒性或生长抑制作用。在一些情况下，细菌素经由细胞质膜孔形成、细胞壁干扰(例如，肽聚糖酶活性)或核酸酶活性(例如，DNA酶活性、16S rRNA酶活性或tRNA酶活性)靶向并杀死寄宿于宿主中的一种或多种细菌。

[0220] 在一些情况下，该细菌素具有中和活性。细菌素的中和活性可以包括但不限于阻止微生物繁殖或细胞毒性。一些细菌素具有细胞毒活性，并且因此可以杀死微生物有机体，例如细菌、酵母、藻类等。一些细菌素可以抑制微生物有机体(例如细菌、酵母、藻类等)的繁殖，例如通过阻止细胞周期。

[0221] 在一些情况下，该细菌素具有杀伤活性。细菌素的杀伤机制对每组细菌素都是特异性的。在一些情况下，该细菌素具有窄谱生物活性。已知细菌素针对其靶菌株具有非常高的效力。一些细菌素活性仅限于与细菌素生产菌株密切相关的菌株(窄谱生物活性)。在一些情况下，该细菌素针对宽范围的属具有广谱生物活性。

[0222] 在一些情况下，细菌素与靶细菌细胞膜上的受体分子或对接分子相互作用。例如，乳链菌肽针对其靶细菌菌株非常有效，即使在一位数的纳摩尔浓度下也显示出抗微生物活性。乳链菌肽分子已被证明与脂质II结合，脂质II是肽聚糖亚单元从细胞质到细胞壁的主要转运体。

[0223] 在一些情况下，该细菌素具有抗真菌活性。已经鉴定了许多具有抗酵母或抗真菌活性的细菌素。例如，已经显示来自芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌素具有针对一些酵母菌株的中和活性(参见，例如，Adetunji和Olaoye，Malaysian Journal of Microbiology[马来西亚微生物学杂志]9：130‑13，2013)。在另一个实例中，已显示粪肠球菌(Enterococcus faecalis)肽具有针对假丝酵母属(Candida)物种的中和活性(参见，例如，Shekh和Roy，BMC Microbiology[BMC微生物学]12：132，2012)。在另一个实例中，已显示来自假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌素具有针对真菌的中和活性，如月状弯孢霉(Curvularia lunata)、镰刀菌属(Fusarium)物种、长蠕孢属(Helminthosporium)物种、和离蠕孢属(Biopolaris)物种(参见，例如，Shalani和Srivastava，The Internet Journal ofMicrobiology[网络微生物学杂志]，第5卷，第2期，2008)。在另一个实例中，已显示来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的botrycidin AJ1316和alirin B1具有抗真菌活性。

[0224] 包括如本文所述的细菌素的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内细菌素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内细菌素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内细菌素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。

[0225] (b)溶素

[0226] 本文所述的调节剂可包括溶素(例如，也称为胞壁质水解酶或肽聚糖自溶素)。可以使用任何适用于抑制寄宿于宿主的细菌的溶素。在一些情况下，该溶素是可以由细菌细胞天然产生的溶素。在一些情况下，该溶素是可以由细菌噬菌体天然产生的溶素。在一些情况下，该溶素从抑制寄宿于宿主的细菌的噬菌体获得。在一些情况下，该溶素是基于天然存在的溶素工程化的。在一些情况下，将该溶素工程化使其由宿主细菌分泌，例如通过向溶素中引入信号肽。在一些情况下，该溶素与噬菌体穴蛋白组合使用。在一些情况下，溶素由对溶素不敏感的重组细菌宿主表达。在一些情况下，该溶素用于抑制寄宿于宿主的革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。

[0227] 该溶素可以是任何类的溶素，并且可以具有一种或多种底物特异性。例如，该溶素可以是糖苷酶，内肽酶、羧肽酶或其组合。在一些情况下，该溶素裂解细胞壁的糖部分中的β‑1‑4糖苷键，连接细菌细胞壁的糖和肽部分的酰胺键，和/或细胞壁的肽部分之间的肽键。该溶素可以属于一个或多个特异性溶素组，这取决于肽聚糖内的切割位点。在一些情况下，该溶素是N‑乙酰基‑β‑D‑胞壁酸酶(例如溶菌酶)、裂解性转糖基酶、N‑乙酰基‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶、N‑乙酰胞壁酰基‑L‑丙氨酸酰胺酶、L，D‑内肽酶、D，D‑内肽酶、D，D‑羧肽酶、L，D‑羧肽酶或L，D‑转肽酶。溶素的非限制性实例及其活性列于表5中。

[0228] 表5：溶素的实例

[0229]

[0230]

[0231]

[0232]

[0233]

[0234]

[0235]

[0236]

[0237]

[0238]

[0239]

[0240]

[0241]

[0242]

[0243]

[0244]

[0245] 在一些情况下，该溶素是本文所述的溶素的功能活性变体。在一些情况下，该溶素的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的溶素或天然存在的溶素的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。

[0246] 在一些情况下，该溶素可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加或减少或调节)或指定其靶微生物。在一些情况下，该溶素是由微生物细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该溶素是化学合成的。在一些情况下，该溶素衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生溶素本身的多肽。因此，在一些情况下，该溶素由前体多肽产生。在一些情况下，该溶素包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。

[0247] 可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的溶素。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的溶素，如至少约1种溶素、2、3、4、5、10、15、20、或更多种溶素中的任一者。组合物中每种溶素的合适的浓度取决于如功效、溶素的稳定性、不同溶素的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种溶素是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种溶素是从约0.1ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的溶素，每种类型的溶素的浓度可以相同或不同。

[0248] 包括如本文所述的溶素的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内溶素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内溶素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内溶素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。

[0249] (c)抗微生物肽

[0250] 本文所述的调节剂可以包括抗微生物肽(AMP)。可以使用任何适用于抑制寄宿于宿主的微生物的AMP。AMP是一组多样化的分子，根据其氨基酸组成和结构分为亚组。AMP可以衍生或产生自天然产生AMP(包括衍生自植物的AMP(例如，copsin)、衍生自昆虫的AMP(例如，果蝇菌素、蝎肽(例如，Uy192、UyCT3、D3、D10、Uy17、Uy192)、蜂毒肽(Mastoparan)、poneratoxin、杀菌肽、家蚕抗菌肽、蜂毒素)、衍生自蛙类的AMP(例如，爪蟾抗菌肽、皮抑菌肽、aurein)，以及衍生自哺乳动物的AMP(例如，组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)、防御素和抗菌肽))的任何生物。例如，AMP可以是蝎肽，如Uy192(5’‑FLSTIWNGIKGLL‑3’；SEQ ID NO：221)、UyCT3(5’‑LSAIWSGIKSLF‑3；SEQ ID NO：222)、D3(5’‑LWGKLWEGVKSLI‑3’；SEQ ID NO：223)、和D10(5’‑FPFLKLSLKIPKSAIKSAIKRL‑3’；SEQ ID NO：224)、Uy17(5’‑ILSAIWSGIKGLL‑3’；SEQ ID NO：225)、或其组合。AMP的其他非限制性实例列于表6中。

[0251] 表6：抗微生物肽的实例

[0252]

[0253]

[0254]

[0255] AMP可以针对任何数量的靶微生物具有活性。在一些情况下，该AMP可具有抗细菌和/或抗真菌活性。在一些情况下，该AMP可具有窄谱生物活性或广谱生物活性。例如，一些AMP仅靶向并杀死很少数种类的细菌或真菌，而其他AMP则针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌两者以及真菌都具有活性。

[0256] 此外，该AMP可以通过许多已知的作用机制起作用。例如，细胞质膜是AMP的常见靶，但AMP也可以干扰DNA和蛋白质合成、蛋白质折叠和细胞壁合成。在一些情况下，具有净阳离子电荷和两亲性质的AMP破坏细菌膜，导致细胞裂解。在一些情况下，AMP可进入细胞并与细胞内靶相互作用以干扰DNA、RNA、蛋白质或细胞壁合成。除杀死微生物外，AMP已证明还具有许多免疫调节功能，这些功能与感染的清除有关，包括以下的能力：改变宿主基因表达、充当趋化因子和/或诱导趋化因子产生、抑制脂多糖诱导的促炎细胞因子产生、促进伤口愈合、并调节树突细胞和适应性免疫应答细胞的反应。

[0257] 在一些情况下，该AMP是本文所述的AMP的功能活性变体。在一些情况下，该AMP的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的AMP或天然衍生的AMP的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。

[0258] 在一些情况下，该AMP可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加或减少或调节)或指定其靶微生物。在一些情况下，该AMP是由细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该AMP是化学合成的。在一些情况下，该AMP衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生AMP本身的多肽。因此，在一些情况下，该AMP由前体多肽产生。在一些情况下，该AMP包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。

[0259] 可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的AMP。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的AMP，如至少约1种AMP、2、3、4、5、10、15、20、或更多种AMP中的任一者。例如，组合物可以包括AMP的混合物(例如，蝎肽(例如UyCT3、D3、D10和Uy17)的混合物)。组合物中每种AMP的合适的浓度取决于如功效、AMP的稳定性、组合物中不同AMP的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种AMP是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下周体组合物中每种AMP是从约0.1ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的AMP，每种类型的AMP的浓度可以相同或不同。

[0260] 包括如本文所述的AMP的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内AMP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内AMP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内AMP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。

[0261] (d)根瘤富含半胱氨酸肽

[0262] 本文所述的调节剂可以包括根瘤富含半胱氨酸肽(NCR肽)。NCR肽在某些豆科植物中产生，并且在植物与来自根瘤菌科(Rhizobiaceae，rhizobia)的细菌的互利、固氮共生中起重要作用，导致根瘤的形成，其中植物细胞含有数千个细胞内的内共生体。NCR肽具有抗微生物剂特性，其导致细菌的不可逆的终末分化过程，例如，使细菌膜透化、破坏细胞分裂或抑制蛋白质合成。例如，在感染了苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)根瘤细胞中，产生了数百种NCR肽，其导致细菌不可逆地分化成大的多倍体固氮拟杆菌。NCR肽的非限制性实例列于表7中。

[0263] 表7：NCR肽的实例

[0264]

[0265]

[0266]

[0267]

[0268]

[0269]

[0270]

[0271]

[0272]

[0273]

[0274]

[0275] 本领域已知的任何NCR肽都适用于在本文所述的方法或组合物中使用。产生NCR肽的植物包括但不限于碗豆(Pisum sativum，pea)、紫云英(Astragalus sinicus)(IRLC豆类)、菜豆(Phaseolus vulgaris)(豆(bean))、豇豆(Vigna unguiculata，cowpea)、蒺藜状苜蓿(Medicago  truncatula)(桶形三叶草(barrel  clover))、和百脉根(Lotusjaponicus)。例如，从蒺藜状苜蓿(M truncatula)基因组序列中预测了600多种潜在的NCR肽，并且已经在通过质谱法在从根瘤分离的细胞中检测到近150种不同的NCR肽。

[0276] 本文描述的NCR肽可以是成熟或未成熟的NCR肽。未成熟的NCR肽具有易位到内质网中所需的并且在易位后裂解的C‑末端信号肽。NCR肽的N‑末端包括可以是可裂解的信号肽，用于靶向分泌途径。NCR肽通常是具有稳定其结构的二硫桥的小肽。成熟的NCR肽具有在约20至约60个氨基酸、约25至约55个氨基酸、约30至约50个氨基酸、约35至约45个氨基酸、或其间任何范围的范围内的长度。NCR肽可以包括半胱氨酸残基的保守序列，其中肽序列的其余部分高度可变。NCR肽通常具有约四个或八个半胱氨酸。

[0277] NCR肽可以是阴离子的、中性的或阳离子的。在一些情况下，具有pI大于约八的合成阳离 子N CR肽 具有抗 微生 物活性 。例如 ，NC R2 47 (pI＝ 10 .15)(RNGCIVDPRCPYQQCRRPLYCRRR；SEQ ID NO：198)和NCR335(pI＝11.22)(MAQFLLFVYSLIIFLSLFFGEAAFERTETRMLTIPCTSDDNCPKVISPCHTKCFDGFCGWYIEGSYEGP；SEQ ID NO：199)针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌以及真菌均有效。在一些情况下，中性和/或阴离子NCR肽(例如NCR001)在pI大于约8时不具有抗微生物活性。

[0278] 在一些情况下，该NCR肽可有效杀死细菌。在一些情况下，该NCR肽可有效杀死S.meliloti、致病杆菌属物种(Xenorhabdus spp)、发光杆菌属物种(Photorhabdus spp)、暂定属物种(Candidatus spp)、布赫纳氏菌属物种(Buchnera spp)、布拉特杆菌属物种(Blattabacterium spp)、鲍曼属物种(Baumania spp)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp)、沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp)、立克次体属物种
(Rickettsia spp)、东方体属物种(Orientia spp)、伴突属物种(Sodalis spp)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp)、贪铜菌属物种(Cupriavidus spp)、弗兰克氏菌属物种(Frankia spp)、中华根瘤菌属物种(Snirhizobium spp)、链球菌属物种(Streptococcus spp)、沃廉菌属物种(Wolinella spp)、木杆菌属物种(Xylella spp)、欧氏杆菌属物种(Erwinia spp)、农杆菌属物种(Agrobacterium spp)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、链霉菌属物种(Streptomyces spp)、微球菌属物种(Micrococcus spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、醋杆菌属物种
(Acetobacter spp)、蓝细菌属物种(Cyanobacteria spp)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp)、红球菌属物种(Rhodococcus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)、肠球菌属(Enterococcus spp)、产碱杆菌属物种(Alcaligenes spp)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、节杆菌属物种(Arthrobacter spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、短杆菌属物种(Brevibacterium spp)、栖热菌属物种(Thermus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、梭菌属物种(Clostridium spp)、或埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp)。

[0279] 在一些情况下，该NCR肽是本文所述的NCR肽的功能活性变体。在一些情况下，该NCR肽的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的NCR肽或天然衍生的NCR肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、或99％的同一性。

[0280] 在一些情况下，该NCR肽可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加或减少或调节)或指定其靶微生物。在一些情况下，该NCR肽是由细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该NCR肽是化学合成的。在一些情况下，该NCR肽衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生NCR肽本身。因此，在一些情况下，该NCR肽由前体多肽产生。在一些情况下，该NCR肽包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。

[0281] 可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的NCR肽。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型的NCR肽，如至少约1种NCR肽、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100、或更多种NCR肽中的任一者。组合物中每种NCR肽的合适的浓度取决于如功效、NCR肽的稳定性、不同NCR肽的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种NCR肽是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种NCR肽是从约0.1ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的NCR肽，每种类型的NCR肽的浓度可以相同或不同。

[0282] 包括如本文所述的NCR肽的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内NCR肽浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内NCR肽浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内NCR肽浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。

[0283] (e)含菌细胞调节肽

[0284] 本文所述的调节剂可以包括含菌细胞调节肽(BRP)。BRP是在昆虫的含菌细胞中表达的肽。这些基因首先在与共生体的掺入一致的发育时间点表达，并且在整个昆虫的生命中维持它们的含菌细胞特异性表达。在一些情况下，该BRP具有预测为信号肽的疏水氨基末端结构域。此外，一些BRP具有富含半胱氨酸的结构域。在一些情况下，该含菌细胞调节肽是含菌细胞特异性富含半胱氨酸(BCR)的蛋白质。含菌细胞调节肽具有在约40至150个之间的氨基酸的长度。在一些情况下，该含菌细胞调节肽具有在约45至约145、约50至约140、约55至约135、约60至约130、约65至约125、约70至约120、约75至约115、约80至约110、约85至约105、或其间任何范围的范围内的长度。BRP的非限制性实例及其活性列于表8中。

[0285] 表8：含菌细胞调节肽的实例

[0286]

[0287]

[0288]

[0289] 在一些情况下，该BRP改变寄宿于宿主的含菌细胞中一种或多种细菌的生长和/或活性。在一些情况下，该BRP可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加、减少或调节)或指定其靶微生物。在一些情况下，该BRP是由细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该BRP是化学合成的。在一些情况下，该BRP衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生BRP本身的多肽。因此，在一些情况下，该BRP由前体多肽产生。在一些情况下，该BRP包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。

[0290] 如本文所述的BRP的功能活性变体也可用于本文所述的组合物和方法中。在一些情况下，该BRP的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的BRP或天然衍生的BRP的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、或99％的同一性。

[0291] 可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的BRP。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的BRP，如至少约1种BRP、2、3、4、5、10、15、20、或更多种BRP中的任一者。组合物中每种BRP的合适的浓度取决于如功效、BRP的稳定性、不同BRP的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种BRP是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种BRP是从约0.1ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的BRP，每种类型的BRP的浓度可以相同或不同。

[0292] 包括如本文所述的BRP的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内BRP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内BRP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内BRP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。

[0293] iii.小分子

[0294] 许多种小分子(例如，抗生素或代谢物)可用于本文所述的组合物和方法中。在一些情况下，本文所述的任何小分子的有效浓度可以改变寄宿于宿主中的一种或多种微生物(如本文所述)的水平、活性或代谢，该改变导致该宿主的适合度提高。

[0295] 包括如本文所述的小分子的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内小分子浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内小分子浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内小分子浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。

[0296] (a)抗生素

[0297] 本文所述的调节剂可以包括抗生素。可以使用本领域已知的任何抗生素。抗生素通常根据其作用机制、化学结构或活性谱进行分类。

[0298] 本文所述的抗生素可以靶向任何细菌的功能或生长过程，并且可以是抑细菌的(例如，减缓或阻止细菌生长)或杀细菌的(例如，杀死细菌)。在一些情况下，该抗生素是杀细菌抗生素。在一些情况下，该杀细菌抗生素是靶向细菌细胞壁的杀细菌抗生素(例如，青霉素和头孢菌素)；靶向细胞膜的杀细菌抗生素(例如，多粘菌素)；或者抑制必需细菌酶的杀细菌抗生素(例如，利福霉素、闰年霉素(lipiarmycins)、喹诺酮类和磺胺类)。在一些情况下，该杀细菌抗生素是氨基糖苷类。在一些情况下，该抗生素是抑细菌抗生素。在一些情况下，该抑细菌抗生素靶向蛋白质合成(例如，大环内酯类、林可胺类和四环素类)。本文使用的另外类的抗生素包括环脂肽(如达托霉素)、甘氨酰环素(如替加环素)、噁唑烷酮类(如利奈唑胺)、或闰年霉素(lipiarmycins)(如非达霉素)。抗生素的实例包括土霉素、强力霉素、利福平、环丙沙星、氨苄青霉素、和多粘菌素B。抗生素的其他非限制性实例见表9。

[0299] 表9：抗生素的实例

[0300]

[0301] 本文描述的抗生素可具有任何水平的靶特异性(例如，窄谱或广谱)。在一些情况下，该抗生素是窄谱抗生素，并且因此靶向特异性类型的细菌，如革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。可替代地，该抗生素可以是靶向宽范围的细菌的广谱抗生素。

[0302] 可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的抗生素。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的抗生素，如至少约1种抗生素、2、3、4、5、10、15、20、或更多种抗生素(例如，利福平和强力霉素的组合，或氨苄青霉素和利福平的组合)中的任一者。组合物中每种抗生素的合适的浓度取决于如功效、抗生素的稳定性、不同抗生素的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的抗生素，每种类型的抗生素的浓度可以相同或不同。

[0303] 包括如本文所述的抗生素的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内抗生素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内抗生素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内抗生素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。

[0304] (b)次生代谢物

[0305] 在一些情况下，本文所述的组合物和方法的调节剂包括次生代谢物。次生代谢物衍生自由生物产生的有机分子。次生代谢物可以充当(i)用于抗细菌、真菌、变形虫、植物、昆虫和大型动物的竞争剂；(ii)金属输送剂(metal transporting agent)；(iii)微生物与植物、昆虫和高等动物之间共生的药剂；(iv)性激素；以及(v)区分效应器。次生代谢物的非限制性实例见表10。

[0306] 表10：次生代谢物的实例

[0307]

[0308]

[0309] 本文使用的次生代谢物可以包括来自任何已知的次生代谢物组的代谢物。例如，次生代谢物可分类为以下几组：生物碱类、萜类、类黄酮类、糖苷类、天然酚类(例如，棉酚乙酸)、二烯醛类(例如，反式‑肉桂醛)、吩嗪类、联苯酚类和氧芴类、聚酮类、脂肪酸合酶肽类、非核糖体肽类、核糖体合成和翻译后修饰肽类、多酚类、多糖类(例如，壳聚糖)和生物聚合物。有关次生代谢物的深入审查，参见例如，Vining，Annu.Rev.Microbiol.[微生物学年鉴]44：395‑427，1990。有用于本文所述的组合物和方法的次生代谢物包括改变内共生体(例如，原生内共生体或次生内共生体)、含菌细胞或细胞外共生体的天然功能的那些次生代谢物。在一些情况下，本文所述的一种或多种次生代谢物是从抗微生物化合物的高通量筛选(HTS)中分离的。例如，HTS筛选鉴定了49种抗细菌提取物，这些提取物对来自生长于一个特定区域的不同生态系统中的生物的39，000多种粗提取物中的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌具有特异性。在一些情况下，该次生代谢物在含菌细胞内运输。

[0310] 在一些情况下，小分子是维生素合成的抑制剂。在一些情况下，维生素合成抑制剂是维生素前体类似物。在某些情况下，维生素前体类似物是泛醇。

[0311] 在一些情况下，小分子是氨基酸类似物。在某些情况下，氨基酸类似物是L‑刀豆氨酸、D‑精氨酸、D‑缬氨酸、D‑甲硫氨酸、D‑苯丙氨酸、D‑组氨酸、D‑色氨酸、D‑苏氨酸、D‑亮氨酸、L‑NG‑硝基精氨酸或其组合。

[0312] 在一些情况下，小分子是天然抗微生物化合物，如丙酸、乙酰丙酸、反式‑肉桂醛、乳链菌肽或低分子量壳聚糖。

[0313] 可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的次生代谢物。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的次生代谢物，如至少约1种次生代谢物、2、3、4、5、10、15、20、或更多种次生代谢物中的任一者。组合物中每种次生代谢物的合适的浓度取决于如功效、次生代谢物的稳定性、不同次生代谢物的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的次生代谢物，每种类型的次生代谢物的浓度可以相同或不同。

[0314] 包括如本文所述的次生代谢物的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内次生代谢物浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内次生代谢物浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内次生代谢物浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。

[0315] iv.细菌作为调节剂

[0316] 在一些情况下，本文所述的调节剂包括一种或多种细菌。许多种细菌在本文所述的组合物和方法中是有用的。在一些情况下，该药剂是在宿主中内源发现的细菌物种。在一些情况下，该细菌调节剂是内共生细菌物种。可用作调节剂的细菌的非限制性实例包括具体实施方式的部分II中本文所述的所有细菌物种和表1中列出的那些细菌物种。例如，该调节剂可以是来自昆虫肠和/或血腔中存在的任何细菌门的细菌物种，包括γ变形菌门(Gammaproteobacteria)、α变形菌门(Alphaproteobacteria)、β变形菌门
(Betaproteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)(例如，乳杆菌(Bacillus)和芽孢杆菌(Bacillus)属物种)、梭菌属(Clostridia)、放线菌属
(Actinomycetes)、螺旋体属(Spirochetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、和放线菌门(Actinobacteria)。

[0317] 在一些情况下，该调节剂是促进微生物多样性或以有利的方式改变该宿主的微生物区系的细菌。在一种情况下，可以提供细菌以促进昆虫中的微生物组发育。

[0318] 本文所讨论的细菌调节剂可用于改变靶微生物的水平、活性或代谢，如在提高昆虫(如，蟋蟀、蚱蜢、或蝗虫)的适合度的部分所指示的。

[0319] 在一些情况下，此类细菌调节剂是能够产生营养物(包括氨基酸(例如，甲硫氨酸))的细菌。该产营养物的细菌可以是天然存在的细菌，例如，对于该昆虫宿主是外源的天然存在的细菌。此类细菌可以分离自细菌群体，如在环境样品中发现的细菌群体。可以分离细菌，以相对于没有被给予产氨基酸细菌的宿主提高宿主中的氨基酸产量的方式产生一种或多种氨基酸。可以通过宿主中的细菌产生的氨基酸包括甲硫氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、谷氨酸盐、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、或缬氨酸。在某些情况下，该产氨基酸的细菌是产甲硫氨酸细菌。

[0320] 在一些情况下，该产营养物的细菌(例如，产氨基酸的细菌，例如，产甲硫氨酸细菌)处于以下浓度：至少100，000个细胞/ml(例如，至少约100，000个细胞/ml、至少约150，000个细胞/ml、至少约200，000个细胞/ml、至少约250，000个细胞/ml、至少约300，000个细胞/ml、至少约350，000个细胞/ml、至少约400，000个细胞/ml、至少约450，000个细胞/ml、或至少约500，000个细胞/ml)。

[0321] 实例1至实例4和实例8描述了如何可以鉴定产甲硫氨酸微生物，该产甲硫氨酸微生物然后可在昆虫宿主(如蟋蟀)中或在模式生物果蝇属(Drosophila)中用作调节剂以提高该宿主的适合度(例如，提高氨基酸含量(例如，甲硫氨酸含量)。例如，在某些情况下，在使用该宿主制造食物或饲料之前，宿主中的营养物含量提高了。

[0322] 在一些情况下，此类细菌调节剂是能够降解如表12中列出的杀有害生物剂(包括杀昆虫剂)的细菌。此类杀昆虫剂包括新烟碱，如吡虫啉、或有机磷杀昆虫剂，如杀螟松。在一些情况下，该代谢杀有害生物剂的细菌处于以下浓度：至少100，000个细胞/ml(例如，至少约100，000个细胞/ml、至少约150，000个细胞/ml、至少约200，000个细胞/ml、至少约250，000个细胞/ml、至少约300，000个细胞/ml、至少约350，000个细胞/ml、至少约400，000个细胞/ml、至少约450，000个细胞/ml、或至少约500，000个细胞/ml)。

[0323] 实例5和实例6描述了如何可以鉴定降解吡虫啉和杀螟松的微生物，该降解吡虫啉和杀螟松的微生物然后可在昆虫宿主(如蟋蟀)中用作调节剂，给予处理的昆虫宿主竞争优势。将此类降解杀有害生物剂的微生物(例如，降解吡虫啉或杀螟松的微生物)给予至昆虫宿主(如蜜蜂)被理解为被以下涵盖：改变寄宿于该宿主中一种或多种微生物的水平、活性或代谢。

[0324] v.对调节剂的修饰

[0325] (a)融合

[0326] 本文所述的任何调节剂可以与另外的部分融合或连接。在一些情况下，该调节剂包括一种或多种另外的部分(例如，1种另外的部分、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种另外的部分)的融合。在一些情况下，该另外的部分是本文所述的调节剂(例如，肽、多肽、小分子、或抗生素)中的任一者。可替代地，该另外的部分本身可以不充当调节剂，而是可以起辅助作用。例如，另外的部分可以帮助调节剂在宿主中的靶位点(例如，宿主肠或宿主含菌细胞)处或在寄宿于该宿主(例如，蟋蟀、蚱蜢、或蝗虫)中的靶微生物处接近、结合或变得活化。

[0327] 在一些情况下，该另外的部分可以帮助调节剂渗透寄宿于宿主中的靶宿主细胞或靶微生物。例如，该另外的部分可以包括细胞穿透肽。细胞穿透肽(CPP)可以是衍生自以下的天然序列：蛋白质；通过两个天然序列的融合形成的嵌合肽；或合成的CPP，它们是基于结构‑活性研究的合成设计的序列。在一些情况下，CPP具有普遍穿过具有有限毒性的细胞膜(例如，原核细胞膜和真核细胞膜)的能力。此外，CPP可以具有经由能量依赖性和/或独立机制，同时不需要特异性受体的手性识别而穿过细胞膜的能力。CPP可以与本文所述的任何调节剂结合。例如，CPP可以与抗微生物肽(AMP)(例如，蝎肽，例如与细胞穿透肽融合的UY192(例如，YGRKKRRQRRRFLSTIWNGIKGLLFAM；SEQ ID NO：226))结合。CPP的非限制性实例列于表11中。

[0328] 表11：细胞穿透肽(CPP)的实例

[0329]

[0330] 在其他情况下，该另外的部分帮助调节剂结合寄宿于宿主的靶微生物(例如，真菌或细菌)。该另外的部分可以包括一个或多个靶向结构域。在一些情况下，该靶向结构域可以将调节剂靶向寄宿于宿主肠中的一种或多种微生物(例如，细菌或真菌)。在一些情况下，该靶向结构域可以将调节剂靶向宿主的特异性区域(例如，宿主肠或含菌细胞)以接近通常存在于所述宿主区域中的微生物。例如，该靶向结构域可以将调节剂靶向宿主的前肠、中肠或后肠。在其他情况下，该靶向结构域可以将调节剂靶向宿主中的含菌细胞和/或寄宿于宿主含菌细胞中的一种或多种特异性细菌。

[0331] (b)前结构域(Pre‑domain或Pro‑domain)

[0332] 在一些情况下，该调节剂可以包括前氨基酸序列(pre‑amino acid sequence或pro‑amino acid sequence)。例如，该调节剂可以是可以通过前序列(pre‑sequence或pro‑sequence)的切割或翻译后修饰来激活的无活性蛋白质或肽。在一些情况下，该调节剂是用失活的前序列(pre‑sequence或pro‑sequence)工程化的。例如，该前序列(pre‑sequence或pro‑sequence)可以模糊调节剂上的激活位点(例如受体结合位点)，或可以诱导调节剂的构象变化。因此，在切割前序列(pre‑sequence或pro‑sequence)后，该调节剂被激活。

[0333] 可替代地，该调节剂可以包括前小分子(pre‑small molecule或pro‑small molecule)，例如抗生素。该调节剂可以是可以在宿主内的靶环境中被激活的本文所述的无活性小分子。例如，该小分子可在宿主肠中达到一定pH时被激活。例如，该靶向结构域可以是与本文所述的调节剂(例如AMP，例如蝎肽，如Uy192)结合的雪钟花(Galanthus nivalis)植物凝集素(lectin)或凝集素(agglutinin)(GNA)。

[0334] (c)接头

[0335] 在调节剂与另外的部分连接的情况下，该调节剂可以进一步包括接头。例如，该接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。在一些情况下，该接头可以是肽接头(例如，2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、或更多个氨基酸长)。该接头可以包括本文所述的任何柔性、刚性或可裂解的接头。

[0336] 柔性肽接头可以包括本领域常用的任何接头，包括具有主要具有Gly和Ser残基的序列的接头(“GS”接头)。柔性接头可以有用于连接需要一定程度的移动或相互作用的结构域，并且可以包括小的、非极性的(例如Gly)或极性的(例如Ser或Thr)氨基酸。

[0337] 可替代地，肽接头可以是刚性接头。刚性接头有用于保持各部分之间的固定距离并维持它们的独立功能。当结构域的空间分离对于保持融合中一种或多种组分的稳定性或生物活性至关重要时，刚性接头也可以是有用的。例如，刚性接头可以具有α螺旋结构或富含脯氨酸的序列(Pro‑rich sequence)、(XP)n，其中X表示任何氨基酸，优选Ala、Lys或Glu。

[0338] 在又其他情况下，肽接头可以是可裂解的接头。在一些情况下，接头可以在特异性条件下(例如在还原剂或蛋白酶的存在下)裂解。体内可裂解接头可利用二硫键的可逆性质。一个实例包括两个Cys残基之间的凝血酶敏感性序列(例如，PRS)。CPRSC的体外凝血酶处理导致凝血酶敏感性序列的切割，而可逆的二硫键保持完整。此类接头是已知的并且描述于，例如，Chen等人，Adv.Drug Deliv.Rev.[先进药物输送评论]65(10)：1357‑1369，2013。融合中接头的切割也可以通过在宿主或寄宿于宿主中的微生物的特异性细胞或组织的条件下体内表达的蛋白酶进行。在一些情况下，接头的切割可在到达靶位点或细胞时释放游离的功能调节剂。

[0339] 本文所述的融合可以可替代地通过连接分子连接，这些连接分子包括疏水接头，如带负电荷的磺酸酯基团；脂质，如聚(‑‑CH2‑‑)烃链，如聚乙二醇(PEG)基团，其不饱和变体，其羟基化变体，其酰胺化或其他含N的变体，非碳接头；碳水化合物接头；磷酸二酯接头，或能够共价连接两个或多个分子(例如两种调节剂)的其他分子。可以使用非共价接头(如调节剂与之连接的疏水性脂质小球)例如通过调节剂的疏水区域或调节剂的疏水延伸，如富含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、或者也可以是丙氨酸、苯丙氨酸、或甚至酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸的一系列残基或其他疏水残基。该调节剂可以使用基于电荷的化学连接，使得调节剂的带正电荷的部分与另一种调节剂或另外的部分的带负电荷的部分连接。

[0340] IV.配制品和组合物

[0341] 可以将本文所述的组合物以纯的形式(例如，组合物仅含有调节剂)配制或与一种或多种另外的药剂(如赋形剂、递送媒介物、载体、稀释剂、稳定剂等)一起配制以促进组合物的施用或递送。合适的赋形剂和稀释剂的实例包括但不限于：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水溶液、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。

[0342] 在一些情况下，该组合物包括递送媒介物或载体。在一些情况下，该递送媒介物包括赋形剂。示例性赋形剂包括但不限于：固体或液体载体材料、溶剂、稳定剂、缓释赋形剂、色素和表面活性物质(表面活性剂)。在一些情况下，该递送媒介物是稳定性媒介物。在一些情况下，该稳定性媒介物包括稳定赋形剂。示例性稳定赋形剂包括但不限于：环氧化植物油、消泡剂(例如硅油)、防腐剂、粘度调节剂、粘合剂和增粘剂。在一些情况下，该稳定性媒介物是适用于调节剂的缓冲液。在一些情况下，将组合物微囊包封在聚合物珠递送媒介物中。在一些情况下，该稳定性媒介物保护调节剂免受UV和/或酸性条件的影响。在一些情况下，该递送媒介物含有pH缓冲液。在一些情况下，将组合物配制为具有在约4.5至约9.0的范围内的pH，包括例如范围在5.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约6.5至约7.0中的任一者的pH。

[0343] 取决于预期的目的和当时环境，可以将组合物配制为可乳化的浓缩物、悬浮浓缩物、可直接喷雾的溶液或可稀释的溶液、可涂覆的膏剂、稀释的乳液、喷雾粉剂、可溶性粉剂、可分散性粉剂、可湿性粉剂、尘剂、粒剂、聚合物质中的包封物、微胶囊、泡沫、气溶胶、二氧化碳气体制剂、片剂、树脂制剂、纸制剂、非织造织物制剂、或针织织物制剂或机织织物制剂。在一些情况下，该组合物是液体。在一些情况下，该组合物是固体。在一些情况下，该组合物是气溶胶，如在加压气溶胶罐中。在一些情况下，该组合物存在于有害生物的废物(如粪便)中。在一些情况下，该组合物存在于活有害生物中或活有害生物上。

[0344] 在一些情况下，该递送媒介物是宿主的食物或水。在其他情况下，该递送媒介物是宿主的食物来源。在一些情况下，该递送媒介物是宿主的食物诱饵。在一些情况下，该组合物是被宿主食用的可食用试剂。在一些情况下，该组合物通过宿主被递送至第二宿主，并被第二宿主食用。在一些情况下，该组合物被宿主或第二宿主食用，并且该组合物经由宿主或第二宿主的废物(如粪便)释放到宿主或第二宿主的周围。在一些情况下，该调节剂包括于旨在由宿主食用或携带回其集落的食物诱饵中。

[0345] 在一些情况下，该调节剂可占该组合物的约0.1％至约100％，如约0.01％至约100％、约1％至约99.9％、约0.1％至约10％、约1％至约25％、约10％至约50％、约50％至约
99％、或约0.1％至约90％的活性成分(如噬菌体、溶素或细菌素)中的任一者。在一些情况下，该组合物包括0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、
90％、95％或更多活性成分(如噬菌体、溶素或细菌素)中至少任一者。在一些情况下，优选浓缩剂作为商业产品，最终使用者通常使用稀释药剂(具有显著较低浓度的活性成分)。

[0346] 本文所述的任何配制品能以诱饵、蚊香、电蚊香片、烟制剂、熏剂或片剂的形式使用。

[0347] i.液体配制品

[0348] 本文提供的组合物可以是液体配制品的形式。液体配制品通常与水混合，但在一些情况下可与作物油、柴油燃料、煤油或其他轻油一起用作载体。活性成分的量的范围通常为按重量计从约0.5％至约80％。

[0349] 可乳化的浓缩物配制品可含有液体活性成分，一种或多种基于石油的溶剂，和允许配制品与水混合形成乳液的药剂。此类浓缩物可用于农业、观赏植物和草坪、林业、建筑业、食品加工、畜牧业、和公共卫生有害生物配制品。这些可适用于从小型便携式喷雾器到液压喷雾器、小容量地面喷雾器、弥雾器弥雾机和小容量飞机喷雾器的施用设备。一些活性成分易溶于液体载体中。当与载体混合时，它们形成不会沉淀或分离的溶液，例如均相溶液。这些类型的配制品可以包括活性成分、载体和一种或多种其他成分。溶液可用于室内和室外任何类型的喷雾器。

[0350] 在一些情况下，可以将该组合物可以配制为逆乳液。逆乳液是分散在油载体中的水溶性活性成分。逆乳液需要乳化剂，其允许活性成分与大量基于石油的载体(通常为燃料油)混合。逆乳液有助于减少漂移。对于其他配制品，当水滴在到达靶表面之前开始蒸发时会产生一些喷雾漂移；结果，液滴变得非常小且重量轻。由于油的蒸发速度比水慢，因此逆乳液液滴收缩较少，并且更多的活性成分到达靶。油进一步有助于减少径流并改善抗雨性。它还通过改善表面覆盖和吸收作为粘展剂。由于液滴相对较大且较重，因此难以在叶子的下侧进行彻底覆盖。最常沿着路域(rights‑of‑way)(其中漂移到易受影响的非靶区域)使用的逆乳液可能是一个问题。

[0351] 可流动或液体配制品结合了可乳化浓缩物和可湿性粉剂的许多特征。当活性成分是不溶于水或油的固体时，制造商使用这些配制品。将浸渍在如黏土的物质上的活性成分研磨成非常细的粉剂。然后将粉剂悬浮在少量液体中。得到的液体产品很稠。可流动物和液体具有可乳化浓缩物的许多特征，并且它们具有类似的缺点。它们需要适度的搅拌以使它们保持悬浮并留下可见的残留物，类似于可湿性粉剂中的那些。

[0352] 可流动物/液体易于处理和施用。因为它们是液体，所以它们会溢出和溅出。它们含有固体颗粒，因此会导致喷嘴和泵的磨损。可流动物和液体悬浮液在其容器中沉淀。由于可流动物和液体配制品倾向于沉淀，因此在五加仑或更少的容器中包装使得更容易再混合。

[0353] 气溶胶配制品含有一种或多种活性成分和溶剂。大多数气溶胶含有低百分比的活性成分。有两种类型的气溶胶配制品‑通常可在加压密封容器中使用的即用型，和用于电动或汽油动力气溶胶发生器(将配制品释放为烟或雾)的那些产品。

[0354] 即用型气溶胶配制品通常是小型的独立单元，在喷嘴阀被触发时释放配制品。在压力下通过惰性气体驱动配制品穿过细孔，产生细小液滴。这些产品用于温室、建筑物内的小区域或小范围的室外区域。具有五至5磅的活性成分的商业模型通常是可再填充的。

[0355] 烟或雾气溶胶配制品不在压力条件下。它们用于使用快速旋转盘或加热表面将液体配制品破碎成细水雾或雾(气溶胶)的机器中。

[0356] ii.干配制品或固体配制品

[0357] 干配制品可分为两种类型：即用型和必须与水混合以作为喷雾施用的浓缩物。大多数尘剂配制品都可以即刻使用，并且含有低百分比的活性成分(按重量计小于约10％)，加上由滑石、白垩、黏土、坚果壳或火山灰制成的非常细的干惰性载体。单个尘剂颗粒的大小各不相同。一些尘剂配制品是浓缩物，并且含有高百分比的活性成分。在施用前将它们与干惰性载体混合。尘剂总是干燥使用，并且很容易漂移到非靶位点。

[0358] iii.粒剂或丸剂配制品

[0359] 在一些情况下，将该组合物配制为粒剂。粒剂配制品类似于尘剂配制品，除了粒剂颗粒更大更重。粗颗粒可以由如黏土、玉米芯或胡桃壳之类的材料制成。活性成分涂覆在粒剂外面或被吸收进其中。活性成分的量可以相对较低，通常范围为按重量计从约0.5％至约15％。粒剂配制品最常用于施用于土壤、生活在土壤中的昆虫、或通过根吸收到植物中。粒剂配制品有时通过飞机或直升机施用，以最小化漂移或以渗透茂密的植被。一旦施用，粒剂可缓慢释放活性成分。一些粒剂需要土壤水分来释放活性成分。粒剂配制品也用于控制幼虫蚊子和其他水生有害生物。粒剂用于农业、建筑业、观赏植物、草坪、水生动物、道路和公共卫生(咬虫)有害生物控制操作。

[0360] 在一些情况下，将该组合物配制为丸剂。大多数丸剂配制品与粒剂配制品非常相似；这些术语可互换使用。然而，在丸剂配制品中，所有颗粒具有相同的重量和形状。颗粒的均匀性允许与精密施用设备一起使用。

[0361] iv.粉剂

[0362] 在一些情况下，将该组合物配制为粉剂。在一些情况下，将该组合物配制为可湿性粉剂。可湿性粉剂是干燥的，精细研磨的配制品，看起来像尘剂。它们通常必须与水混合用于作为喷雾施用。然而，一些产品可以作为尘剂或可湿性粉剂施用‑选择取决于上涂装置。可湿性粉剂含有按重量计约1％至约95％的活性成分；在一些情况下超过约50％。这些颗粒不溶于水。它们很快沉淀，除非经常搅拌以使其悬浮。它们可用于大多数有害生物问题，并且也可用于大多数可以搅拌的喷雾设备。可湿性粉剂具有优异的残留活性。由于它们的物理特性，大多数配制品保留在经处理的多孔材料(例如混凝土)、石膏和未经处理的木材的表面上。在此类情况下，只有水渗透材料。

[0363] 在一些情况下，将该组合物配制为可溶性粉剂。可溶性粉剂配制品看起来像可湿性粉剂。然而，当与水混合时，可溶性粉剂容易溶解并形成真溶液。将它们彻底混合后，不需要另外的搅拌。可溶性粉剂中活性成分的量通常范围为按重量计从约15％至约95％，在一些情况下超过约50％。可溶性粉剂具有可湿性粉剂的所有优点，并且除了混合期间的吸入危害外，不具有可湿性粉剂的任何缺点。

[0364] 在一些情况下，将该组合物配制为水可分散性粒剂。水可分散性粒剂，也称为干可流动物，就像可湿性粉剂(除了不是尘剂样外)，它们被配制为易于测量的粒剂。水可分散性粒剂必须与水混合才能施用。一旦进入水中，粒剂就会分解成类似于可湿性粉剂的细颗粒。该配制品需要恒定搅拌以使其悬浮在水中。活性成分的百分比很高，通常按重量计高达
90％。水可分散性粒剂(除了它们更容易测量和混合)具有许多与可湿性粉剂相同的优点和缺点。由于尘剂较少，因此在处理期间对上涂装置的吸入危害较小。

[0365] v.诱饵

[0366] 在一些情况下，该组合物包括诱饵。诱饵可以处于任何合适的形式，如固体、膏剂、丸剂或粉剂形式。诱饵也可以被宿主带回到所述宿主的群体(例如，集落或蜂巢)。然后诱饵可以充当该集落的其他成员的食物来源，从而为大量宿主和潜在的整个宿主集落提供有效的调节剂。

[0367] 诱饵可以提供于合适的“壳体”或“捕获器”中。此类壳体和捕获器是可商购的，并且现有的捕获器可以被调适成包括本文所述的组合物。壳体或捕获器可以是例如盒形的，并且可以在预成型条件下提供，或者可以例如由可折叠纸板形成。用于壳体或捕获器的合适材料包括塑料和纸板，特别是瓦楞纸板。捕获器的内表面可以内衬有粘性物质，以限制宿主一旦在捕获器内的移动。壳体或捕获器可以内部含有合适的槽，它可以将诱饵保持在适当位置。捕获器与壳体是有区别的，因为宿主在进入后不能容易地离开捕获器，而壳体充当“进食站”，其为宿主提供优选的环境，在该环境中它们可以进食并且远离捕食者而感到安全。

[0368] vi.引诱剂

[0369] 在一些情况下，该组合物包括引诱剂(例如，化学引诱剂)。引诱剂可以将成虫宿主或未成熟宿主(例如，幼虫)吸引到组合物的附近。引诱剂包括信息素，一种由动物(尤其是昆虫)分泌的化学物质，其影响同一物种的其他个体的行为或发育。其他引诱剂包括糖和蛋白水解产物糖浆、酵母和腐肉。引诱剂还可以与活性成分组合并喷雾到处理区域中的叶子或其他物品上。

[0370] 已知各种引诱剂影响宿主行为，例如宿主对食物、产卵或交配地点或配偶的搜索。可用于本文所述方法和组合物的引诱剂包括，例如，丁香酚、丙酸苯乙酯、乙基二甲基异丁基环丙烷羧酸酯、丙基苯并二噁烷羧酸酯、顺式‑7，8‑环氧‑2‑甲基十八烷、反式‑8、反式‑0‑十二碳二烯醇、顺式‑9‑十四烯醛(具有顺式‑11‑十六烯醛)、反式‑11‑十四烯醛、顺式‑11‑十六烯醛、(Z)‑11，12‑十六碳二烯醛、顺式‑7‑十二烯基乙酸酯、顺式‑8‑十二烯基乙酸酯、顺式‑9‑十二烯基乙酸酯、顺式‑9‑十四碳烯基乙酸酯、顺式‑11‑十四碳烯基乙酸酯、反式‑
11‑十四碳烯基乙酸酯(具有顺式‑11)、顺式‑9、反式‑11‑十四碳二烯基乙酸酯(具有顺式‑
9、反式‑12)、顺式‑9、反式‑12‑十四碳二烯基乙酸酯、顺式‑7、顺式‑11‑十六碳双烯乙酸酯(具有顺式‑7、反式‑11)、顺式‑3、顺式‑13‑十八碳二烯基乙酸酯、反式‑3、顺式‑13‑十八碳二烯基乙酸酯、茴香脑和异戊基水杨酸盐。

[0371] 除化学引诱剂之外的其他方法也可用于吸引昆虫，包括各种波长或颜色的光。

[0372] vii.纳米胶囊/微胶囊/脂质体

[0373] 在一些情况下，将组合物以微胶囊化配制品提供。将微胶囊化配制品与水混合并以与其他可喷雾配制品相同的方式喷雾。喷雾后，塑料涂层破裂并缓慢释放活性成分。

[0374] viii.载体

[0375] 可配制本文所述的任何组合物以包括本文所述的调节剂和惰性载体。此类载体可以是固体载体、液体载体、凝胶载体和/或气体载体。在某些情况下，该载体可以是种子涂层。种子涂层是任何非天然存在的配制品，其全部或部分地粘附于种子表面。该配制品可以进一步包含佐剂或表面活性剂。该配制品还可以包含一种或多种调节剂以扩大作用光谱。

[0376] 用于配制品的固体载体包括黏土(例如高岭土、硅藻土、膨润土、Fubasami黏土、酸性黏土等)、合成水合氧化硅、滑石、陶瓷、其他无机矿物质(例如，绢云母、石英、硫磺、活性炭、碳酸钙、水合二氧化硅等)、可以升华并在室温下呈固体形式的物质(例如，2，4，6‑三异丙基‑1，3，5‑三氧杂环己烷、萘、对二氯苯、樟脑(camphor)、刚烷等)的细粉剂或粒剂；羊毛；蚕丝；棉花；大麻；纸浆；合成树脂(例如，聚乙烯树脂，如低密度聚乙烯、直低密度聚乙烯和高密度聚乙烯；乙烯‑乙烯酯共聚物，如乙烯‑乙酸乙烯酯共聚物；乙烯‑甲基丙烯酸酯共聚物，如乙烯‑甲基丙烯酸甲酯共聚物和乙烯‑甲基丙烯酸乙酯共聚物；乙烯‑丙烯酸酯共聚物，如乙烯‑丙烯酸甲酯共聚物和乙烯‑丙烯酸乙酯共聚物；乙烯‑乙烯基羧酸共聚物，如乙烯‑丙烯酸共聚物；乙烯‑四环十二烯共聚物；聚丙烯树脂，如丙烯均聚物和丙烯‑乙烯共聚物；聚‑4‑甲基戊烯‑1、聚丁烯‑1、聚丁二烯、聚苯乙烯；丙烯腈‑苯乙烯树脂；苯乙烯类弹性体，如丙烯腈‑丁二烯‑苯乙烯树脂、苯乙烯‑共轭二烯嵌段共聚物、和苯乙烯‑共轭二烯嵌段共聚物氢化物；氟树脂；丙烯酸树脂，如聚(甲基丙烯酸甲酯)；聚酰胺树脂，如尼龙6和尼龙
66；聚酯树脂，如聚乙烯对苯二甲酸酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚丁烯对苯二甲酸酯、和聚对苯二甲酸亚环己基二亚甲酯；聚碳酸酯、聚缩醛、聚丙烯酰砜、聚芳酯、羟基苯甲酸聚酯、聚醚酰亚胺、聚酯碳酸酯、聚苯醚树脂、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚氨酯、和有孔树脂(如发泡聚氨酯、发泡聚丙烯、或发泡乙烯等))、玻璃、金属、陶瓷、纤维、布料、针织物、片材、纸张、纱线、泡沫、有孔物质和复丝。

[0377] 液体载体可以包括，例如，芳香族或脂肪族碳氢化合物(例如，二甲苯、甲苯、烷基萘、苯基二甲苯基乙烷、煤油、瓦斯油、己烷、环己烷等)、卤代烃(例如，氯苯、二氯甲烷、二氯乙烷、三氯乙烷等)、醇类(例如，甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、己醇、苄基醇、乙二醇等)、醚类(例如，乙醚、乙二醇二甲醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单乙醚、丙二醇单甲醚、四氢呋喃、二噁烷等)、酯类(例如，乙酸乙酯、乙酸丁酯等)、酮类(例如，丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、环己酮等)、腈类(例如，乙腈、异丁腈等)、亚砜(例如，二甲亚砜等)、酰胺(例如，N，N‑二甲基甲酰胺、N，N‑二甲基乙酰胺)、环状亚胺(例如N‑甲基吡咯烷酮)、亚烷基碳酸酯(例如，碳酸丙烯酯等)、蔬菜油(例如，大豆油、棉花籽油等)、植物精油(例如，橙油、海索油、柠檬油等)、或水。

[0378] 气体载体可以包括，例如丁烷气、氟里昂气、液化石油气(LPG)、二甲醚和二氧化碳气体。

[0379] ix.佐剂

[0380] 在一些情况下，本文提供的组合物可以包括佐剂。佐剂是不具有活性的化学物质。将佐剂在配制品中预混合或添加至喷雾罐中以改善混合或改善施用或提高性能。它们广泛用于为叶子施用而设计的产品中。佐剂可用于为特异性需要而定制配制品并补偿局部条件。佐剂可以设计用于执行特异性功能，包括润湿、涂抹、粘附、减少蒸发、减少挥发、缓冲、乳化、分散、减少喷雾漂移和减少发泡。没有单一佐剂可以执行所有这些功能，但是通常可以组合相容的佐剂以同时执行多种功能。

[0381] 包含于配制品中的佐剂的非限制性实例包括：粘合剂、分散剂和稳定剂，具体为例如，酪蛋白、明胶、多糖(例如，淀粉、阿拉伯树胶、纤维素衍生物、海藻酸等)、木质素衍生物、膨润土、糖、合成水溶性聚合物(例如，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸等)、PAP(酸性异丙基磷酸酯)、BHT(2，6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚)、BHA(2‑叔丁基‑4‑甲氧基苯酚和3‑叔丁基‑4‑甲氧基苯酚的混合物)、植物油、矿物油、脂肪酸和脂肪酸酯。

[0382] x.表面活性剂

[0383] 在一些情况下，本文提供的组合物包括表面活性剂。表面活性剂，也称为润湿剂和涂布剂，在物理上改变喷雾液滴的表面张力。为了使配制品能够正常发挥其功能，喷雾液滴必须能够润湿叶子并均匀地散布在叶上。表面活性剂扩大了配制品的覆盖面积，从而增加了有害生物对化学物质的暴露。当将配制品施用于蜡质或多毛的叶时，表面活性剂特别重要。如果没有适当的润湿和涂布，喷雾液滴通常会流失或无法充分覆盖叶表面。然而，过多的表面活性剂会导致过多的径流并降低功效。

[0384] 表面活性剂按其电离或分裂成称为离子的带电荷的原子或分子的方式分类。带负电荷的表面活性剂是阴离子的。带正电荷的表面活性剂是阳离子的，而不带电荷的表面活性剂是非离子的。在非离子表面活性剂存在下的配制品活性可以与在阳离子或阴离子表面活性剂存在下的活性完全不同。选择错误的表面活性剂会降低杀有害生物剂产品的功效并损害靶植物。当与接触杀有害生物剂(通过直接接触而不是系统吸收来控制有害生物的杀有害生物剂)一起使用时，阴离子表面活性剂是最有效的。阳离子表面活性剂绝不能用作独立的表面活性剂，因为它们通常具有植物毒性。

[0385] 通常与系统杀有害生物剂一起使用的非离子表面活性剂有助于杀有害生物剂喷雾渗透植物角质层。非离子表面活性剂与大多数杀有害生物剂相容，并且大多数需要表面活性剂的EPA注册的杀有害生物剂推荐使用非离子型。佐剂包括但不限于黏着剂、增量剂、植物渗透剂、相容剂、缓冲液或pH改性剂、漂移控制添加剂、消泡剂、和增稠剂。

[0386] 本文所述的组合物中包括的表面活性剂的非限制性实例包括烷基硫酸酯盐、烷基磺酸酯、烷基芳基磺酸酯、烷基芳基醚及其聚氧乙烯化产物、聚乙二醇醚、多元醇酯和糖醇衍生物。

[0387] xi.组合

[0388] 在配制品和由这些配制品制备的使用形式中，调节剂可以处于含有其他活性化合物(例如杀有害生物剂(例如杀昆虫剂、杀菌剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或杀真菌剂；参见例如，列于表12中的杀有害生物剂)、引诱剂、生长调节物质或除草剂)的混合物中。如本文所用的，术语“杀有害生物剂”是指旨在用于预防、破坏、抵制或减轻任何有害生物的任何物质或物质的混合物。杀有害生物剂可以是用于对抗有害生物(包括与人竞争食物、破坏财产、传播疾病或是令人讨厌的昆虫、病原体、杂草和微生物)的化学物质或生物制剂。术语“杀有害生物剂”可以进一步涵盖其他生物活性分子，如抗生素、抗病毒杀有害生物剂、抗真菌剂、抗蠕虫剂、营养物、花粉、蔗糖和/或使昆虫运动减弱或减缓的药剂。

[0389] 在将调节剂施用于植物的情况下，也可以使用含有其他已知化合物(例如除草剂、肥料、生长调节剂、安全剂、化学信息素)或用于改善植物特性的药剂的混合物。

[0390] V.递送

[0391] 本文所述的宿主能以允许将组合物递送或给予至昆虫的任何合适方式而暴露于本文所述的任何组合物。调节剂可以单独递送或与其他活性或非活性物质组合递送，并且可以通过例如喷雾、显微注射、通过植物、倾倒、浸渍，以配制以递送有效浓度的调节剂的浓缩液体、凝胶、溶液、悬浮液、喷雾、粉剂、丸剂、块剂、砖剂等形式施用。施用本文所述的组合物的量和位置通常取决于宿主的习性、宿主微生物可被调节剂靶向的生命周期阶段、将施用的位置、以及调节剂的物理和功能特征。本文所述的调节剂可通过经口摄取给予至昆虫，但也可通过允许穿透角质层或穿透昆虫呼吸系统的方式给予。

[0392] 在一些情况下，可以用包括调节剂的溶液简单地“浸泡”或“喷雾”昆虫。可替代地，调节剂可以与昆虫的食物组分(例如，可食用组分)连接以便于递送和/或为了增加昆虫对调节剂的摄取。用于经口引入的方法包括，例如将调节剂与昆虫的食物直接混合，将调节剂喷雾在昆虫的生境或田地中，以及工程化方法，其中将用作食物的物种工程化以表达调节剂，然后向有待被影响的昆虫饲喂该物种。在一些情况下，例如，该调节剂组合物可以掺入昆虫的饮食中或覆盖在昆虫的饮食的顶部。例如，可以将该调节剂组合物喷雾到昆虫栖息的作物田地上。

[0393] 在一些情况下，通过例如背包喷雾、空中喷雾、作物喷雾/尘剂等将组合物直接喷雾到植物(例如作物)上。在将调节剂递送至植物的情况下，接受调节剂的植物可以处于植物生长的任何阶段。例如，配制的调节剂可以在植物生长的早期阶段作为种子涂层或根处理施用，或者在作物周期的后期作为总植物处理施用。在一些情况下，该调节剂可以作为局部制剂施用于植物，使得宿主昆虫在摄取或以其他方式与植物接触时与植物相互作用。

[0394] 此外，可以将调节剂(例如，在植物生长的土壤中，或在用于浇灌植物的水中)作为通过植物的组织(例如茎或叶)或动物宿主而吸收和分布的内吸剂(systemic agent)施用，使得其上进食的昆虫将获得有效剂量的调节剂。在一些情况下，可以对植物或食物生物进行遗传转化以表达调节剂，使得以植物或饵料生物为食的宿主摄取调节剂。

[0395] 延迟或持续释放也可以通过将调节剂或含有一种或多种调节剂的组合物涂覆有可溶解或生物可侵蚀涂层(例如明胶)(该涂层在使用环境中溶解或侵蚀，以使得该调节剂可用)或通过将药剂分散在可溶解或可侵蚀的基质中来实现。此类持续释放和/或分配方式装置可有利地用于在特异性宿主生境中始终维持本文所述的一种或多种调节剂的有效浓度。

[0396] 调节剂也可以掺入昆虫生长、生活、繁殖、进食或侵染的培养基中。例如，调节剂可以掺入食物容器、进食站、保护性包装或蜂巢中。对于一些施用，该调节剂可以与固体支持物结合，用于以粉剂形式或于“捕获器”或“进食站”中施用。例如，对于其中组合物用于捕获器或作为特定宿主昆虫的诱饵的施用，组合物也可以与固体支持物结合或包封在定时释放材料中。例如，可以通过向该昆虫生长、生活、繁殖或进食的至少一个生境中递送该组合物，给予本文所述的组合物。

[0397] VI.筛选

[0398] 本文包括了用于鉴定该调节剂的筛选测定，其中该调节剂有效改变宿主的微生物区系并且从而提高了宿主适合度(例如，昆虫适合度)。例如，筛选测定可以用于鉴定一种或多种调节剂，该一种或多种调节剂靶向具体的微生物和/或具体的宿主。此外，筛选测定可以用于鉴定具有增强的功能性的一种或多种微生物。例如，筛选测定可以有效分离具有增强的能力的一种或多种微生物，该能力是代谢(例如降解)杀有害生物剂(例如，杀昆虫剂，例如，新烟碱)或植物化感物质(例如，咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂N、单萜类、二萜酸、或酚类化合物)。分离的微生物在宿主中的递送和定殖可以增加该宿主对杀有害生物剂或植物化感物质的抗性，由此增加宿主适合度。对于分离具有在本文所述的宿主中的任一种中增强的定殖能力的微生物，这些方法也是有用的。

[0399] 例如，为了筛选提高宿主对杀有害生物剂抗性的微生物，可以使用包括微生物(例如，细菌)和高浓度的杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂或本领域已知的杀有害生物剂，例如新烟碱)的初始培养物。在一些情况下，能以富集杀有害生物剂的环境样品(例如，土壤样品)形式提供杀有害生物剂。可替代地，能以纯的形式或与其他载体组合提供杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)。此外，一种或多种微生物分离物可直接接种在培养基(例如，从实验室菌株中)或可以是包括一种或多种微生物物种的环境样品。该生长培养基可以是液体或固体的。在一些情况下，感兴趣的杀有害生物剂是培养基中微生物的唯一碳源或氮源。该培养物可以进行任何次数的传代培养(例如，和高水平的杀有害生物剂一起接种到新鲜的培养基中)以富集和/或分离能够代谢杀有害生物剂的微生物菌株(例如，细菌菌株)。可以使用本领域已知的任何方法来评估初始培养物或传代培养物，以测试(例如，使用HPLC)样品中杀有害生物剂水平的改变(例如，降低)。可以分离降低杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂或本领域已知的杀有害生物剂，例如新烟碱)的浓度的分离物在本文所述的任何方法或组合物中用作调节剂。

[0400] 该方法可用于进一步选择具有增强的在宿主(例如，昆虫)中定殖和存活的能力的本文所述的微生物，包括从筛选测定中分离的那些。例如，宿主可以接种细菌分离物(例如，具有降解杀有害生物剂的能力的细菌分离物)。然后可以定期测试该宿主中细菌分离物的存在(例如，通过培养或从该宿主中分离的肠中的16s RNA)。可以分离在宿主(例如，昆虫的中肠)中存活的细菌分离物用作本文所述的任何方法或组合物中的调节剂。

[0401] 表12.杀有害生物剂

[0402]

[0403]

[0404]

[0405] 实例

[0406] 以下是本发明的方法的实例。应理解，鉴于以上提供的一般性描述，可以实践各种其他的实施例。

[0407] 实例1：产生天然微生物的文库

[0408] 此实例证明了从土壤中分离天然产生氨基酸(甲硫氨酸)的细菌。

[0409] 用于分离微生物的培养基是淀粉‑酪蛋白‑硝酸盐琼脂(淀粉，10.0g；酪蛋白，0.003g；KNO3，0.02g；NaCl，0.02g；MgSO4，0.5mg；CaCO3，0.2mg；FeSO4，0.1mg；琼脂，12.0g；
H2O，1L；pH 7.0)(Kuster和Williams，1964)。将每个环境土壤样品(1.0g)悬浮在9ml无菌水‑5
中，并且将1ml悬浮液在无菌蒸馏水中连续稀释十倍。将一毫升10 稀释液接种在琼脂培养基上并且在30℃孵育7天。在这一阶段结束时，观察板上的生长。挑选白色的离散和革质的集落并在新的淀粉‑酪蛋白‑硝酸盐琼脂板上生长以产生分离物文库。在30℃生长7天后，将板保持在4℃。

[0410] 实例2：筛选产生甲硫氨酸的分离物

[0411] 此实例证明了来自天然产生氨基酸(甲硫氨酸)的实例1的分离物的筛选测定。

[0412] 筛选甲硫氨酸产量：

[0413] 含有蔗糖(20.0g)和NH4Cl(10.0g)的改良的基础培养基(K2HPO4，0.3g；KH2PO4，0.7g；Na2CO3，1.0g；CaCl2，5.0mg；MgSO4，0.3g；FeSO4，1.0mg；H2O，1L)用于发酵(Chay，B.P.，Galvez，F.C.F.和Padolina，W.G.P.U.L.B.P.(1992).Methionine production by batch fermentation from various carbohydrates.[通过从各种碳水化合物分批发酵生产甲硫氨酸]ASEAN Food Journal(Malaysia)[东盟食品杂志(马来西亚)])。该培养基的pH是7.2。

[0414] 培养条件：将实例1的7天分离物培养物的两个环接种到含有30ml发酵培养基的250ml锥形瓶中。将烧瓶在旋转式摇床(160rpm)上在30℃孵育5天后，测定甲硫氨酸产量。准备双份的烧瓶并且在所有实验中将未接种的烧瓶用作对照。

[0415] 通过纸层析法随后按照Khanna和Nag(Khanna等人，“Production of amino acids in  vitro tissue culture[体外组织培养生产氨基酸]”，Indian Journal of Experimental Biology[印度实验生物学](1973))的改良的方法检查分离物的培养物肉汤中甲硫氨酸的存在。将肉汤培养物以5000x g离心20分钟并且将2μL的上清液施用于尺寸为
18em x 22cm的沃特曼(Whatman)1号滤纸一边正上方1.5cm。将1μL体积的标准甲硫氨酸溶液(0.1mg/mL)沿着上清液施用，并且将色谱图在正丁醇、乙酸和水(4∶1∶1)的溶剂混合物中显色18小时。将色谱图在室温风干，用在丁醇中的0.15％茚三酮溶液喷雾并且再次干燥，然后在60℃在烘箱中加热5分钟。与标准甲硫氨酸溶液的值相对应的上清液的茚三酮‑阳性斑点(蓝紫色)的值指示肉汤培养物中甲硫氨酸的存在。如下评估分离物的肉汤培养物中产生的甲硫氨酸的浓度。将色谱图上的分离物的上清液的茚三酮‑阳性斑点稀释在10％乙醇中并且记录在520nm处的洗脱液的光谱光度测量读数。从标准曲线确定上清液中的甲硫氨酸浓度。将光密度值对甲硫氨酸溶液的改变的浓度(0.1至0.9mg/ml)的图作为标准甲硫氨酸曲线。

[0416] 将产生甲硫氨酸的分离物保持在新鲜琼脂板上并且通过将两环的微生物悬浮在一等分试样的50％甘油溶液中产生储备溶液。

[0417] 实例3：给予产甲硫氨酸分离物以提高蟋蟀的氨基酸含量

[0418] 此实例证明了用产甲硫氨酸细菌处理蟋蟀以提高它们的营养含量的能力。

[0419] 全世界对肉类的需求正在增长，并且动物饲料的生产对土地和水的压力也越来越大。昆虫能以更低的环境成本提供大部分蛋白动物；许多昆虫物种可以粪肥为食(如格兰特蛆虫(Grant’s maggot))，或以其他类型的有机废物(如隔夜菜、内脏和啤酒厂丢弃的谷物)为食。昆虫以惊人的速率产生体质量，部分是因为作为冷血动物，它们不会消耗能量用来调节它们的体温。蟋蟀(例如，家蟋蟀(Acheta domesticus))仅仅需要1.7千克饲料来获得一千克的体重；典型的美国鸡消耗2.5千克，猪消耗5千克，和牛消耗10千克。另一个优势：大多数昆虫可以被完整地食用。鸡或猪只有一半是可食用的；对于牛来说，这个分数甚至更小。因此，饲养一公斤昆虫蛋白产生的CO2比饲养猪或牛少，而且只占土地的十分之一。

[0420] 昆虫粉可取代动物饲料中在25％与100％之间的豆粕或鱼粉而没有不良影响，但是大多数昆虫粉缺乏氨基酸‑甲硫氨酸和赖氨酸。甲硫氨酸的合成产生需要危险化学品并且其使用在有机农场中是被禁止的。通过将产甲硫氨酸细菌引入蟋蟀的微生物组，预期蟋蟀天然地提高它们的营养含量。

[0421] 治疗性设计：针对蟋蟀，将在实例2中鉴定为产甲硫氨酸的分离的细菌和混合有饲7
养底物(例如，家禽幼雏饲料和米糠(家禽饲料‑PF))的10细胞/mL溶液一起配制。

[0422] 实验设计：

[0423] 蟋蟀繁殖的实验单位是改良的盖洛德(gaylord)运输箱，其具有标准国际运输托台的面积(1.2m(L)x1.0m(W)x0.61m(H))。每个围隔的内部衬有4mm透明塑料衬里，并覆盖122cm x 137cm的尼龙蚊帐用作入口或出口的物理屏障。为防止同类相食和应激相关死亡率，将96个尺寸为30em x 30em的蛋品包装纸盒放在每个盒子周边的边缘。这提供了大约
2
172800cm 的可爬行表面积。由2夸脱大小的家禽饮水机来提供水，其中棉花和碎石插入分配池以防止新孵化的蛹淹死。对饮水机的侧面进行打磨，以便为蟋蟀垂直爬行提供支点。将带有止回阀以防止滴水的雾化尖端固定在每个围隔的内部的顶部。为了维持可接受的湿度并为大量蟋蟀提供分散的替代水源，这些尖端以自动间隔提供瞄准围隔中心的水脉冲。在实验过程中，将温室内的温度(T)和相对湿度(RH)分别维持在29.0±2.1标准偏差(SD)℃和
67.2±14.7SD％。以24小时/天提供光。

[0424] 将来自林线渔业(Timberline Fisheries http：//timberlinefresh.com)的由大约50，000个家蟋蟀卵(孵化率为70％)组成的卵底物放入每个围隔中。将卵底物维持在80％‑90％的湿度直至它们孵化。一旦观察到孵化，每天将底物雾化两次，直到蛹完全出现。
通过对来自每个实验单元的70个个体的随机样品进行计数和称重，每3天至4天监测群体生长。

[0425] 从孵化后14天直到它们收获或经历完全死亡，对家蟋蟀群体给予如下：2个自由采食处理：1)5∶1比率的非药物家禽幼雏饲料和米糠(家禽饲料‑PF)作为对照；2)5∶1比率的非药物家禽幼雏饲料和米糠(家禽饲料‑PF)，其喷洒了稀释在本文所述的生长培养基中的实9
例2中描述的100mL的10细胞/ml的分离的细菌的溶液。

[0426] 每周进行一次培养，持续五周，收获昆虫。将昆虫在‑50℃的冰箱中储存半小时。接下来，将冷冻的昆虫浸没在液氮中，并且随后使用搅拌器(博朗(Braun)Multiquick5，600W，德国克龙贝格)研磨15分钟。根据Yi，L.等人(2013)的技术，按照国际标准ISO 13903：2005，使用离子交换层析法分析冷冻干燥的昆虫粉剂的氨基酸组成。

[0427] 实例2中鉴定的以产甲硫氨酸微生物饲喂的蟋蟀预期含有比用对照饲料饲喂的蟋蟀更多的甲硫氨酸含量。

[0428] 实例4：将细菌的产甲硫氨酸菌株给予至用缺乏甲硫氨酸的食物饲养的黑腹果蝇以提高它们的体质量、发育率、和存活

[0429] 此实例证明了用产甲硫氨酸细菌处理用缺乏甲硫氨酸的饲料饲养的黑腹果蝇以提高体质量、发育率和存活的能力。此实验设计还适用于提高其他昆虫(如蟋蟀)的营养含量，这些昆虫如蟋蟀可用于产生富含甲硫氨酸的动物饲料。

[0430] 实验设计：

[0431] 实例2中产生甲硫氨酸的分离的细菌菌株、以及不产生甲硫氨酸的菌株在营养物肉汤中在30℃生长。

[0432] 如Nature[自然]，第11卷，第1期，100‑105，2014中所述制备化学定义的(CD)蝇食物。制备缺乏甲硫氨酸的CD食物，并将其称为CD‑M。将蝇食物配制品用于本实例中所述的所有实验。

[0433] 发育率和体质量测定

[0434] 在第1天，将如实例1中所述的109的产甲硫氨酸细菌、或不产生甲硫氨酸(对照)的细菌重新悬浮在100μl的磷酸盐缓冲盐水中并且添加至CD‑M蝇食物中。让这两个组群在25℃干燥24小时。

[0435] 在第2天，将从蝇中收集的受精的胚用2％次氯酸盐溶液处理5分钟并且然后用无菌水洗涤以从胚中去除任何细胞外微生物。将10μl的在水中的胚悬浮液(1∶3胚：水悬浮液)添加至细菌接种的样品和对照样品中。在该实验的其余部分，将含有胚的蝇食物组群维持在25℃，伴随12小时光照和12小时黑暗的循环。

[0436] 测量每个组群的蛹壳形成时间和形成的蛹的数量。测量每个样品中的成虫出现时间和出现率。从第一只成虫从蛹中出现时，每12小时计数出现的成年蝇的数量，并计算出现率。

[0437] 对于体质量测定，从两个组群中收集十只幼虫并且测量它们的质量、区域和总蛋白含量。

[0438] 实例2中鉴定的用产甲硫氨酸细菌接种的CD‑M蝇食物中的胚预期比用非产甲硫氨酸细菌接种的CD‑M蝇食物上的胚发育更快并且具有更高的蛋白含量。

[0439] 存活测定

[0440] 在第一天前12天，如前所述产生无菌胚并且用无菌CD蝇食物饲养。当在25℃伴随12小时光照和12小时黑暗的循环中饲养时，从收集了胚之后11天，无菌成虫开始从它们的蛹中出现。

[0441] 在第1天，将109的产甲硫氨酸细菌、或不产生甲硫氨酸(对照)的细菌重新悬浮在100μl磷酸盐缓冲盐水中并且添加至CD‑M蝇食物中。让这两个组群在25℃干燥24小时。

[0442] 在实验的第二天，将10只新出现的无菌雄性和雌性成虫引入具有产甲硫氨酸细菌的CD‑M蝇食物或对照中。在该实验的其余部分，将含有蝇的蝇食物维持在25℃，伴随12小时光照和12小时黑暗的循环。每天计算存活的雄性和雌性蝇的数量，直到所有蝇都死亡。进行存活分析以评估产甲硫氨酸细菌对蝇存活的适合度益处。

[0443] 用接种了实例2中鉴定的产甲硫氨酸微生物的CD‑M蝇食物饲养的蝇预期比对照存活更久。

[0444] 实例5：降解杀螟松(有机磷杀昆虫剂)的微生物的分离

[0445] 此实例证明了获得能够降解杀螟松(有机磷杀昆虫剂)的微生物文库。

[0446] 实验设计

[0447] 从先前使用杀螟松用于昆虫控制的不同区域获得土壤样品。将从如(Microbes Environ.[微生物和环境]第21卷，第1期，58‑64，2006)中所述的土壤样品中分离降解杀螟松的细菌。简言之，将1g的土壤样品与9ml的无菌蒸馏水充分混合。然后将土壤颗粒在1000rcf离心5分钟，并且然后将100μl的上清液铺板在具有矿物质盐介质的杀螟松中
(0.4g/l酵母提取物，0.4g/l杀螟松，15g/l细菌学琼脂)。在制备时，该板是浑浊的，因为杀螟松是乳状液。

[0448] 在周围出现透明区的集落可以降解或代谢杀螟松，并且这些集落在LB琼脂、营养物琼脂、酵母葡萄糖琼脂、TSA琼脂、BHI琼脂、或MRS琼脂上分离和重新生长。一旦鉴定出独特的细菌集落，就使用基因组DNA提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，DNeasy血液和组织试剂盒)根据制造商的方案，提取它们的基因组。

[0449] 使用通用细菌引物27F‑(5’‑AGAGTTTGATCMTGGCTCAG‑3’；SEQ ID NO：227)和1492R(5’‑TACCTTGTTACGACTT‑3’；SEQ ID NO：228)，并且使用PCR条件：94℃持续2分钟；94℃持续1分钟、56℃持续1分钟和72℃持续2分钟的30个循环；和72℃持续5分钟的最终延伸，扩增
16S rRNA基因。凝胶电泳用于确认扩增子具有正确尺寸(约1500bp)，并且将产物从凝胶上切除并使用凝胶提取试剂盒(凯杰公司，QIAquick)按照制造商的方案进行纯化。正确尺寸的扩增子是桑格测序的并且BLAST用于使序列与16s rRNA基因序列的各种储存库匹配以鉴定细菌。

[0450] 为了确定分离的细菌是否降解杀螟松，将约107的细菌细胞在含有1mM杀螟松的1ml的20mM磷酸钠‑钾缓冲液(pH 7)中孵育，如在PNAS[美国国家科学院院刊]，第109卷，第
22期，8618‑8622，2012中所述。在30℃孵育30分钟后，通过添加等体积的甲醇停止该反应。
然后通过HPLC分析杀螟松和其代谢物(3‑甲基‑4‑硝基酚)。将HPLC曲线的保留时间和峰面积与已知标准相比。

[0451] 然后将具有降解杀螟松能力的独特细菌分离物作为冷冻的甘油在‑80℃储存。

[0452] 实例6：通过给予降解杀螟松的细菌提高黑腹果蝇对杀螟松的抗性

[0453] 此实例证明产生如下的昆虫模型的能力：对它们的饲料中的杀昆虫剂(更具体地是杀螟松)的一种或多种负面作用具有抗性的黑腹果蝇，从而产生了更强壮的昆虫。以下方法是对于其他昆虫(如蟋蟀或本文所披露的其他昆虫，例如有用于产生富含蛋白质的动物饲料的昆虫来源)的替代方法。包括杀螟松的许多杀昆虫剂已示出对蟋蟀的毒性。

[0454] 实验设计：

[0455] 治疗性设计：在含有和不含杀螟松的100μl蝇食物培养基中以109的生物配制实例5中选择的细菌分离物。

[0456] 用于饲养蝇的培养基是玉米粉、糖蜜和酵母培养基(11g/l酵母、54g/l黄色玉米粉、5g/l琼脂、66ml/l糖蜜、和4.8ml/l丙酸)。对于实验程序，将0、10和100p.p.m.的杀螟松或作为阴性对照的磷酸盐缓冲盐水灌注到无菌蝇食物培养基中。

[0457] 发育率测定

[0458] 在第1天，将实例5中所述的109的降解杀螟松的细菌悬浮在100μl的磷酸盐缓冲盐水中或者将等体积的盐水(阴性对照)添加至含有或不含杀螟松的无菌蝇食物培养基中。将全部在25℃干燥一天，如在Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]第82卷，第20期，6204‑6213，2016中所述。

[0459] 在第2天，将从蝇中收集的受精的胚用2％次氯酸盐溶液处理5分钟并且然后用无菌水洗涤以从胚中去除任何细胞外微生物。将10μl的在水中的胚悬浮液(1∶3胚：水悬浮液)添加至含有或不含杀螟松的细菌接种的蝇食物或阴性对照蝇食物中。在该实验的其余部分，将含有胚的蝇食物组群维持在25℃，伴随12小时光照和12小时黑暗的循环。

[0460] 测量每个组群的蛹壳形成时间和形成的蛹的数量。测量每个样品中的成虫出现时间和出现率。从第一只成虫从蛹中出现时，每12小时计数出现的成蝇的数量，并计算出现率。

[0461] 在接种了降解杀螟松的细菌的杀螟松灌注的蝇食物中的胚预期比不含降解杀螟松的细菌的杀螟松灌注的食物上的胚发育更快。

[0462] 存活测定

[0463] 在第一天前约12天，如前所述产生无菌胚并且用无菌蝇食物饲养。当在不含杀螟松的无菌蝇食物中在25℃伴随12小时光照和12小时黑暗的循环中饲养时，在胚收集后11天成虫开始从它们的蛹中出现。

[0464] 在第1天，将在磷酸盐缓冲盐水中的109的降解杀螟松的细菌添加至无菌蝇食物培养基中，如在先前实例中所述。

[0465] 在第2天，将10只新出现的无菌雄性和雌性成虫引入含有或不含杀螟松的细菌接种的蝇食物或阴性对照蝇食物中。在该实验的其余部分，将含有蝇的蝇食物维持在25℃，伴随12小时光照和12小时黑暗的循环。每天计算存活的雄性和雌性蝇的数量，直到所有蝇都死亡。进行存活分析以评估降解杀螟松的细菌对蝇存活的适合度益处。

[0466] 在接种了降解杀螟松的细菌的杀螟松灌注的蝇食物上饲养的蝇预期比在不含降解杀螟松的细菌的杀螟松灌注的食物上饲养的蝇存活更久。

[0467] 实例7：使用天然存在的噬菌体从黑腹果蝇中消除昆虫病原细菌

[0468] 此实例证明了使用天然存在的噬菌体从黑腹果蝇中消除昆虫细菌病原体(如黏质沙雷氏菌、软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora)、和喜昆虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila))的能力。该程序可用作消除在其他昆虫物种中(如在蜜蜂中)的细菌的替代测定。

[0469] 实验设计：

[0470] 治疗性设计：使用了具有如下噬菌体科的噬菌体文库集合：肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、Ampullaviridae、Bicaudaviridae、Clavaviridae、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌科(Cystoviridae)、纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、Gluboloviridae、滴状病毒科(Guttaviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、光滑噬菌体科(Leviviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、复层病毒科(Tectiviridae)。

[0471] 经2周在无菌1L烧瓶中收集多个环境样品(土壤、池塘沉积物、和污水)，并在收集后立即进行处理，然后在4℃储存。将固体样品在无菌双倍强度difco公司卢里亚肉汤(Luria Broth，LB)中或补充有2mM CaCl2至最终体积100mL的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中进行匀浆。使用磷酸盐测试条测量pH和磷酸盐水平。为了纯化，将所有样品在4℃以3000‑
6000g离心10‑15分钟，并通过0.2‑μm低蛋白质过滤器过滤以去除所有剩余的细菌细胞。然后将含有噬菌体文库的上清液在氯仿存在下在4℃储存于玻璃瓶中。

[0472] 将20‑30ml的噬菌体文库用LB‑肉汤稀释至30‑40ml的体积。添加靶细菌菌株(例如，黏质沙雷氏菌、软腐欧氏杆菌和喜昆虫假单胞菌)(50‑200μl在LB‑肉汤中生长的过夜培养物)以富集靶向培养物中的该特异性细菌菌株的噬菌体。将该培养物在37℃孵育过夜，以230rpm振荡。通过离心(3000‑6000g，15‑20分钟，4℃)去除来自该富集培养物的细菌，并过滤(0.2μm或0.45μm过滤器)。将2.5ml无菌培养物添加至2.5ml的LB‑肉汤中并且将50‑100μl靶细菌添加回该培养物中以进一步富集噬菌体。将富集培养物如上生长过夜。将来自该富集培养物的样品在室温下以13，000g离心15分钟，并将10μl上清液以及100‑300μl靶细菌和
3ml熔化的0.7％软琼脂铺板在LB‑琼脂的培养皿上。将板在37℃过夜孵育。

[0473] 挑选在细菌菌苔上观察到的每个噬斑并将其转移到500μl的LB肉汤中。将来自该噬斑原液的样品进一步铺板在靶细菌上。对所有发现的噬菌体进行三次噬斑纯化，以从异质噬菌体混合物中分离单个同质噬菌体。

[0474] 通过收获表现出融合裂解的宿主细菌菌株的覆盖板制备来自具有高滴度噬菌体(>1x 10^10PFU/ml)的平板的裂解物。在用5ml缓冲液充满后，将软琼脂覆盖物浸软，通过离心澄清，并过滤灭菌。将得到的裂解物储存在4℃。通过等密度CsCl离心进一步纯化高滴度噬菌体裂解物，如在(Summer等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]192：179‑190，2010)中所述的。

[0475] 如在Summer，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]502：27‑46，2009中所述的，从CsCl纯化的噬菌体悬浮液中分离DNA。通过使用454焦磷酸测序方法将个体分离的噬菌体测序为两个噬菌体基因组库的一部分。简言之，将噬菌体基因组DNA以等摩尔量混合至最终浓度为约100ng/L。将合并的DNA剪切，与对每个合并具有特异性的多重标识符(MID)标签连接，并根据制造商的方案，使用在测序仪(罗氏公司(Roche))上的全板反应通过焦磷酸测序法进行测序。将合并的噬菌体DNA存在于两个测序反应中。通过使用软件(454生命科学公司(Life Sciences))，通过调整设置以仅包括每个组件具有单个MID的读数，将对应于每个合并的输出单独组装。使用针对重叠群序列产生的引物和作为模板的个体噬菌体基因组DNA制备物，通过PCR确定个体重叠群的同一性。使用测序软件(基因编码公司(Gene Codes Corporation))进行序列组装和编辑。

[0476] 通过实验确定噬菌体染色体端结构。通过对噬菌体基因组端进行测序以及对通过扩增(通过环化基因组DNA的连接的接点)衍生的PCR产物进行测序来确定噬菌体的粘性(cos)端，如在Summer，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]502：27‑46，2009中所述的。蛋白质编码区最初使用基因预测软件来预测(Lukashin等人，NucleicAcids Res.[核酸研究]
26：1107‑1115，1998)，通过Artemis中的人工分析进行精化(Rutherford等人，
Bioinformatics[生物信息学]16：944‑945，2000.)，并通过使用BLAST(E值截止值为0.005)进行分析(Camacho等，BMC Bioinformatics[BMC生物信息学]10：421，2009)。通过序列检索软件另外分析了特别感兴趣的蛋白质(Hunter等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]40：
D306‑D312，2012)。

[0477] 通过用胰蛋白酶大豆肉汤缓冲液稀释噬菌体原液，进行裂解果蝇属的致病细菌物种的CsCl纯化的噬菌体(>1x10^11PFU/ml)的电子显微镜检查。将噬菌体施用到薄的400目碳涂覆的网格上，用2％(wt/vol)乙酸铀酰染色，并风干。在以100kV的加速电压操作的透射电子显微镜上观察试样。测量每个噬菌体的五个病毒粒子以在适当时计算衣壳和尾的尺寸的平均值和标准偏差。

[0478] 将噬菌体掺入粉中

[0479] 用于饲养蝇的培养基是玉米粉、糖蜜和酵母培养基(11g/l酵母、54g/l黄色玉米粉、5g/l琼脂、66ml/l糖蜜、和4.8ml/l丙酸)。将噬菌体溶液灌注到蝇食物中以获得最终浓8
度在0与10pfu/ml之间的噬菌体。

[0480] 将黏质沙雷氏菌、软腐欧氏杆菌和喜昆虫假单胞菌细菌在30℃在营养物肉汤中或LB肉汤中生长。

[0481] 通过将从蝇中收集的受精的胚用2％次氯酸盐溶液处理5分钟，并且然后用无菌水9
洗涤以去除任何细胞外微生物，产生无菌蝇胚。通过将10 CFU的细菌接种在无菌蝇食物中并且将无菌蝇胚添加到该食物中，产生具有靶细胞的蝇幼虫。2天后，将用十只黏质沙雷氏
8
菌感染的第一龄蝇幼虫添加到具有范围为(0‑10 pfu/ml)的噬菌体浓度的蝇食物中。让幼虫在含有噬菌体的食物中生长3天，直到它们达到第三龄。然后收集幼虫并且在营养物肉汤或LB肉汤中单独匀浆，并且铺板在营养物琼脂板或LB琼脂板上，并且在30℃孵育。记录了从具有不同噬菌体浓度的蝇食物中的幼虫中获得的黏质沙雷氏菌的CFU的数量。这显示在蝇中存在的活细菌的数量。

[0482] 在含有针对该细菌的噬菌体的蝇食物上生长的幼虫中，预期活细菌的数量减少。

[0483] 实例8：通过饲料将细菌的产氨基酸菌株给予至黑腹果蝇以提高它们的发育率

[0484] 此实例证明了用产氨基酸的细菌处理该昆虫黑腹果蝇以改善它们的营养含量的能力。此实验设计可以延长以减少生长时间并产生更多生物量的可以用于产生富含蛋白质的动物饲料的其他昆虫，例如蟋蟀。

[0485] 全世界对肉类的需求正在增长，并且动物饲料的生产对土地和水的压力也越来越大。昆虫能以更低的环境成本提供人和动物需要的大部分蛋白；许多昆虫物种可以粪肥为食(如格兰特蛆虫(Grant’s maggot))，或以其他类型的有机废物(如隔夜菜、内脏和啤酒厂丢弃的谷物)为食。昆虫以惊人的速率产生体质量，部分是因为作为冷血动物，它们不会消耗能量用来调节它们的体温。蟋蟀(例如，家蟋蟀)仅仅需要1.7千克饲料来获得一千克的体重；典型的美国鸡消耗2.5千克，猪消耗5千克，和牛消耗10千克。另一个优势：大多数昆虫可以被完整地食用。鸡或猪只有一半是可食用的；对于牛来说，这个分数甚至更小。因此，饲养一公斤昆虫蛋白产生的CO2此饲养猪或牛少，而且只占土地的十分之一。

[0486] 昆虫粉可取代动物饲料中在25％与100％之间的豆粕或鱼粉，而没有不良影响。然而，大部分昆虫粉中缺乏氨基酸‑甲硫氨酸和赖氨酸。甲硫氨酸的合成产生需要危险化学品并且其使用在有机农场中是被禁止的。在此实例中，将产甲硫氨酸细菌引入昆虫的微生物组中天然地提高了它们的营养含量。

[0487] 治疗性设计：

[0488] 将产谷氨酸或甲硫氨酸的分离的细菌谷氨酸棒状杆菌与和果蝇属蝇的饲喂底物9
混合的10个菌落形成单位(CFU)的溶液一起配制。

[0489] 实验设计：

[0490] 将产生谷氨酸盐或甲硫氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株在营养物肉汤中在30℃生长。

[0491] 用于饲养蝇的培养基是玉米粉、糖蜜和酵母培养基(11g/l酵母、54g/l黄色玉米粉、5g/l琼脂、66ml/l糖蜜、和4.8ml/l丙酸)。将除丙酸外的所有饲料组分在去离子水中一起加热至80℃(伴随30分钟恒定混合)，然后冷却至60℃。然后混合进丙酸，并将50ml饲料等分到各个瓶中，并允许其冷却并固化。将蝇在26℃、16∶8小时光照：黑暗循环、在约60％湿度下饲养。

[0492] 对于测量幼虫生长速率的实验装置，使用了确定的饲料(Piper等人，2014，Nature Methods[自然方法])。确定的饲料消除了用于基于玉米粉的饲料的成分中批次间变化的影响。此外，确定的饲料允许排除单个组分以测试它们对蝇发育的作用。

[0493] 发育率测定

[0494] 在第1天，将由109的菌落形成单位(CFU)组成的100ul的在营养物肉汤中的谷氨酸棒状杆菌悬浮液添加至蝇食物的五个重复中。作为对照，将不含细菌的营养物肉汤添加至蝇食物的另外五个瓶中。将从果蝇中收集的受精的胚用2％次氯酸盐溶液处理五分钟并且然后用无菌水处理以从胚中去除任何细胞外微生物。将10ul在水中的胚悬浮液(1∶3胚：水悬浮液)添加至所有细菌接种的蝇食物瓶和对照蝇食物瓶中。在该实验的其余部分，将含有胚的蝇食物维持在26℃、16∶8小时光照：黑暗循环、约60％湿度中。测量每个重复中的成虫出现时间和出现率。从第一只成虫从蛹中出现时，每12小时计数出现的成蝇数量，并计算出现率。

[0495] 幼虫质量测定

[0496] 为了测试产细菌的氨基酸的存在是否可提高在确定的饲料上饲养的发育幼虫的体质量，我们生产了无外来菌并且与单个细菌菌株单一相关的幼虫。对于这些测定，使用了三种不同的细菌，即谷氨酸棒状杆菌(一种产生谷氨酸盐的菌株)、谷氨酸棒状杆菌(一种产生甲硫氨酸的菌株)和大肠杆菌。

[0497] 首先，产生了无外来菌的胚。在6小时的时间段里，在含有酵母的葡萄汁琼脂板上收集来自果蝇的受精的胚。为了消除任何细菌污染，将胚用2％次氯酸盐溶液处理五分钟并且然后用无菌水洗涤三次。然后将一体积的胚悬浮在3体积的水中。

[0498] 将确定的饲料等分到小瓶中，并且对于每种测试条件使用9个重复。这些条件为：

[0499] 1.不向食物中添加细菌

[0500] 2.含有谷氨酸棒状杆菌(产谷氨酸盐(谷氨酸棒状杆菌谷氨酸盐(C.glu‑Glu))的菌株)的食物

[0501] 3.含有谷氨酸棒状杆菌(产甲硫氨酸(谷氨酸棒状杆菌甲硫氨酸(C.glu‑Met))的菌株)的食物

[0502] 4.含有大肠杆菌的食物

[0503] 向在条件2、3和4中的每瓶食物中添加100ul过夜固定相培养物。

[0504] 向在每个条件中的九个重复中的每一个中添加10ul无菌胚+水悬浮液。然后将这些小瓶在26℃、60％湿度、16∶8光照：黑暗循环中孵育。

[0505] 13天后，对每个重复的10‑15个随机选择的幼虫进行取样，并测量它们的区域，作为其生物量和重量的替代指示。用无菌刮刀将幼虫从食物中挖出，用水冲洗以将食物从它们的身体上清理掉，并单独获得在每种条件下的每个重复的取样的每只幼虫的图像。将图像J脚本(Image J script)用于鉴定，描绘和测量每张图像中幼虫的区域。

[0506] 产氨基酸细菌处理提高了昆虫发育率。

[0507] 在接种了产氨基酸的细菌菌株的饲料上发育的胚到达成虫期比在无菌饲料中饲养的那些显著更快(图1)。此外，在雌性蝇中的这种作用略强于雄性蝇(图2A和2B)。

[0508] 产氨基酸细菌处理提高了幼虫体质量。

[0509] 补充了谷氨酸棒状杆菌甲硫氨酸的饲料中的幼虫平均体重最大，其次是具有谷氨酸棒状杆菌谷氨酸盐、大肠杆菌和没有细菌的饲料的那些(图3)。这显示昆虫的饲料中增加产生氨基酸的细菌比未补充的饲料更快地产生昆虫生物量。

[0510] 总之，这些数据证明，在昆虫的饲料中增加能够产生氨基酸的细菌比未补充的饲料更快地产生昆虫生物量。将其扩展到其他昆虫(如蟋蟀)，用能够产生甲硫氨酸的细菌补充它们的饲料可以提高它们的生物量和蛋白含量。

[0511] 实例9：用纯化的噬菌体溶液处理昆虫

[0512] 此实例证明了从靶向特异性昆虫细菌的环境样品中分离和纯化噬菌体。此实例还通过噬斑测定，通过测量其氧消耗率和细胞外酸化率，证明了分离的噬菌体在体外针对靶细菌的功效。最后，此实例通过测量噬菌体对来自蝇的靶细菌的能力(通过用针对细菌分离的噬菌体来处理靶细菌)证明了噬菌体在体内的功效。此实例证明了可以使用噬菌体靶向细菌来清除降低昆虫适合度的致病细菌。具体而言，可以使用从花园堆肥中分离的噬菌体清除作为蝇中的致病细菌的黏质沙雷氏菌。

[0513] 存在若干种有益的和商业上有用的昆虫，它们受到天然存在的细菌病原体的影响。

[0514] 实验设计

[0515] 从天然样品中分离特异性细菌噬菌体：

[0516] 从环境来源材料中分离出针对靶细菌的细菌噬菌体。简言之，将黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的饱和培养物稀释进新鲜的双倍强度胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中，并在24℃‑26℃生长约120分钟至早期对数期，或者稀释进双倍强度的卢里亚‑贝尔塔尼(Luria‑Bertani，LB)中并在37℃生长约90分钟。通过在PBS中均质化来制备花园堆肥，并将其通过0.2μm过滤来进行灭菌。通过0.2μm过滤对未处理的污水进行灭菌。将一体积过滤的源材料添加至对数期细菌培养物中并继续孵育24小时。通过沉淀培养物并通过0.45μm膜对上清液进行过滤来制备富集的源材料。

[0517] 通过将样品铺板到双琼脂细菌菌苔上来分离噬菌体。将固定的细菌培养物与熔融的0.6％琼脂LB或TSB组合并倾倒入1.5％琼脂LB或TSB板上。凝固后，将2.5μL噬菌体样品稀释液点样在双琼脂板上并允许其吸收。然后将板包裹并在25℃(TSA)或37℃(LB)孵育过夜，然后对可见噬斑的形成进行评估。将新分离的噬斑通过在靶菌株上连续传代单个噬斑(通过将噬斑挑取到SM缓冲液(50mM Tris‑HCl[pH 7.4]、10mM MgSO4、100mM NaCl)中并在55℃孵育15分钟)进行纯化，然后使用噬斑悬浮液重复上文的双琼脂点样方法。

[0518] 如上详述，成功地从污水和堆肥中分离出细菌噬菌体。在将样品点样到用于富集的黏质沙雷氏菌细菌的菌苔上之后，噬斑形成是非常明显的。

[0519] 细菌噬菌体的传代、定量、和繁殖：

[0520] 使用如上分离和纯化的细菌噬菌体进行用于后续实验的噬菌体裂解物的繁殖和产生。简言之，将饱和细菌培养物稀释100倍至新鲜培养基中并生长60‑120分钟以实现用于有效噬菌体感染的早期对数生长状态。将噬菌体悬浮液或裂解物添加至早期对数期培养物中并继续孵育直至观察到肉汤清除(指示噬菌体繁殖和细菌裂解)，或直至感染后24小时。通过以7，197x g沉淀细胞20分钟，然后通过0.45或0.2μm膜过滤上清液来收获裂解物。将过滤的裂解物储存在4℃。

[0521] 使用双琼脂点样法进行感染性噬菌体颗粒的计数。简言之，在PBS中进行样品的1∶10稀释系列，并将稀释液点样在用如上的宿主细菌制备的固化双琼脂板上。在孵育过夜后计数噬斑形成单位(PFU)以确定样品的近似滴度。

[0522] 测量细菌呼吸的分离噬菌体的体外分析：

[0523] 通过监测感染期间的氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)，使用海马(Seahorse)XFe96分析仪(安捷伦公司(Agilent))测量噬菌体对细菌的作用。在实验前一天，将XFe96板通过每孔15μL的1mg/mL聚‑L‑赖氨酸原液涂覆并在28℃干燥过夜，并且将XFe96探针通过放置在含有200μL的校准液(XF Calibrant)的孔中平衡并在黑暗中在室温孵育。第二天将用聚‑L‑赖氨酸涂覆的板用ddH2O洗涤两次。将大肠杆菌BL21(LB，37℃)或黏质沙雷氏菌(TSB，25℃)的过夜饱和培养物以1∶100继代培养到相同的培养基并在30℃通风培养约2.5小时。然后使用相同的培养基将培养物稀释至O.D.600nm～0.02。通过以10x最终浓度将原液稀释到SM缓冲液中并将20μL的10x溶液加载到探针板的适当注射口中来制备处理物。当探针在XFe96Flux分析仪中平衡时，通过添加90μL细菌悬浮液或培养基对照来制备细菌板并以3，000rpm旋转10分钟。离心后，将另外的90μL适当的培养基轻轻地添加至孔中，以便不干扰细菌粘附，使每孔的总体积达到180μL。

[0524] XFe96 Flux分析仪在约30℃运行，按照1∶00、0∶30、3∶00的混合、等待、读数循环。完成四个循环以允许细菌的平衡/标准化，然后注射20μL处理物并如上继续循环，持续总共大约6小时。使用海马(Seahorse)XFe96 Wave软件包分析数据。

[0525] 用海马(Seahorse)XFe96分析仪，通过测量细菌的氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)测定分离的细菌噬菌体的作用。当用噬菌体T7感染大肠杆菌并用新分离的ΦSmVL‑C1感染黏质沙雷氏菌时，在该速率短暂爆发后观察到OCR显著降低(图4)。对于具有这两种宿主生物的这两种噬菌体，海马(Seahorse)测定允许检测成功的噬菌体感染而无需噬斑测定。因此，此方法适用于检测不适合传统噬菌体检测方法的宿主生物的噬菌体感染。

[0526] 用于感染鉴定的SYBR Gold转导测定：

[0527] 通过用核酸酶预处理来除去可以干扰荧光信号说明的额外病毒核酸(extraviral nucleic acid)，来制备细菌噬菌体制剂用于染色。简言之，将MgCl2添加至10mL的噬菌体裂解物(10mM最终浓度)，并且添加RNA酶A(凯杰公司)和DNA酶I(西格玛公司)两者至10μg/mL的最终浓度。将样品在室温孵育1小时。核酸酶处理后，将5mL的裂解物与1μL的SYBR Gold(赛默公司(Thermo)，10，000x)合并，并且在室温孵育约1.5小时。随后使用米康(Amicon)超滤柱从样品中去除过量的染料。简言之，通过添加10mL的SM缓冲液并在5,000x g、4℃旋转5分钟来洗涤米康(Amicon)柱(15mL，10k MWCO)。然后将标记的噬菌体样品以5,000x g、4℃旋转通过柱，直至体积减少大约10倍(15‑30分钟)。为了洗涤样品，将5mL SM缓冲液添加至每个贮存器并重复旋转，然后再洗涤两次。在第三次洗涤后，将保留的样品从米康(Amicon)贮存器中用移液管移出，并使用SM缓冲液使其达到大约1mL。为了除去较大的污染物，将洗涤过的和标记的噬菌体样品以10,000x g离心2分钟，随后将上清液通过0.2μm膜过滤到黑色微管中并在4℃储存。

[0528] 通过减速旋转1mL等分试样并用1mL PBS洗涤一次，然后使用1mL PBS最终重悬来制备饱和细菌培养物(在37℃在LB中生长的大肠杆菌MG1655，在26℃在TSB中生长的黏质沙雷氏菌和共生沙雷氏菌(S.symbiotica))。通过将500μL洗涤过的细菌与1μL的SYBR Gold组合并在室温在黑暗中孵育1小时来染色阳性对照标记的细菌。将细菌通过以8.000x g旋转5分钟沉淀，并用等体积的PBS洗涤两次，然后重悬于最终体积为500μL的PBS中。将体积为25μL的染色的细菌与黑色微管中的25μL的SM缓冲液合并，向其中添加50μL的10％福尔马林(5％最终体积，约2％甲醛)并通过轻弹混合。将样品在室温固定约3小时，然后使用米康(Amicon)超滤柱洗涤。简言之，将500μL的picopure水添加至米康(Amicon)柱(0.5mL，100k MWCO)上，并以14,000xg旋转5分钟以洗涤膜。将固定的样品通过添加400μL的PBS进行稀释，然后转移至预洗涤的旋转柱并以14,000x g旋转10分钟。将柱转移到新鲜的收集管中，然后添加500μL的PBS以稀释保留在渗余物中的固定剂。随后，进行另外两次PBS稀释，总共洗涤三次。将最终的渗余物稀释至约100μL，然后将柱倒入新鲜的收集管中并以1,000x g旋转2分钟以收集样品。将洗涤过的样品转移到黑色微管中并储存在4℃。

[0529] 对于转导实验和对照，将25μL的细菌(或PBS)和25μL的SYBR Gold标记的噬菌体(或SM缓冲液)在黑色微管中合并，并在室温静置孵育15‑20分钟以允许噬菌体吸附和注射到受体细菌中。孵育后立即向样品中添加50μL的10％福尔马林，并在室温下固定约4小时。如上，使用米康(Amicon)柱用PBS洗涤样品。

[0530] 细菌噬菌体核酸的注射需要噬菌体成功地感染宿主细菌细胞。用SYBR Gold标记的并与黏质沙雷氏菌共孵育的大肠杆菌噬菌体Plkc通过显微镜检查显示荧光细菌的存在，这验证了在噬菌体分离管道中该测定的用途。与海马(Seahorse)测定一样，这种方法提供了传统噬菌体方法的替代方案，以允许扩增到不适合噬斑测定的生物中。另外地，SYBR Gold转导测定不需要细菌生长，因此适用于分析靶向困难或甚至不可培养的生物(包括内共生体，如布赫纳氏菌)的噬菌体。。

[0531] 测试针对黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)蝇中黏质沙雷氏菌的噬菌体的体内功效

[0532] 黏质沙雷氏菌培养物在30℃在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中生长，伴随200rpm恒定振荡。

[0533] 用于饲养蝇原种的培养基是玉米粉、糖蜜和酵母培养基(11g/l酵母、54g/l黄玉米粉、5g/l琼脂、66ml/l糖蜜、和4.8ml/l丙酸)。将除丙酸外的所有饲料组分在去离子水中一起加热至80℃(伴随30分钟恒定混合)，然后冷却至60℃。然后混合进丙酸，并将50ml饲料等分到各个瓶中，并允许其冷却并固化。将蝇在26℃、16∶8小时光照：黑暗循环、在约60％湿度下饲养。

[0534] 为了用黏质沙雷氏菌感染蝇，将细针(约10um宽的尖端)浸入密集的过夜静止期培养物中并刺破蝇的胸腔。对于此实验，使用针穿刺法，用黏质沙雷氏菌感染10只雄性和10只雌性的四个重复，作为蝇死亡率的阳性对照。对于处理组，将四个重复(每个重复中10只雄性和10只雌性)用黏质沙雷氏菌和含有约108个噬菌体颗粒/ml的噬菌体溶液针刺。最后，将没有针刺或没有任何处理的两个重复(每个重复中10只雄性和10只雌性)用作死亡率的阴性对照。

[0535] 将所有条件下的蝇置于食品瓶中并在26℃、16∶8光照：黑暗循环、60％湿度下孵育。在针刺后每天计数活蝇和死蝇的数量，持续四天。所有用单独的黏质沙雷氏菌针刺的蝇都在治疗后24小时内死亡。相比之下，噬菌体处理组中超过60％的蝇和未经处理的对照组中的所有蝇在该时间点都存活(图5)。此外，当实验终止时，噬菌体处理组和阴性对照组中的大多数蝇继续存活四天。

[0536] 为了确定蝇死亡的原因，将来自黏质沙雷氏菌和黏质沙雷氏菌+噬菌体两者针刺的蝇中的死蝇进行匀浆并铺板。将来自黏质沙雷氏菌和黏质沙雷氏菌+噬菌体处理的四个重复中的每一个的四只死蝇在100ul的TSB中匀浆。还通过在TSB中稀释匀浆产生1∶100稀释液。将10ul浓缩的匀浆以及1∶100稀释液铺板在TSA板上，并在30℃孵育过夜。在检查用于细菌生长的板时，来自黏质沙雷氏菌针刺的死蝇的所有板都有在其上生长的细菌的菌苔，而来自黏质沙雷氏菌+噬菌体针刺的死蝇的板上没有细菌。这显示在不存在噬菌体时，黏质沙雷氏菌可以在蝇中诱导感染性休克，导致其死亡。然而，在噬菌体的存在下，死亡率可以是由于用针刺引起的损伤。

[0537] 其他实施例

[0538] 尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实例详细地描述了前述发明，但是描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的披露都明确地通过引用以其全文并入。