技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，具体是一种小鼠体细胞核移植方法。
背景技术
[0002] 体细胞核移植是指将体细胞核注入到去核的卵母
细胞质中获得重构胚，由重构胚最终发育为后代的技术，细胞的重编程能够通过核移植、细胞融合、特定转录因子以及培养条件诱导等方法来实现；但是目前唯一能够诱导细胞重新发育成个体的重编程方法只有体细胞核移植，其他方法只能够在细胞、分子或者生化的
水平上产生诱导，并且都存在一些不足之处；但是，自从体细胞核移植技术建立以来，克隆效率一直处于较低的水平，只有很少的重构胚胎能够发育到足月出生，在小鼠中通常只有1～2％的出生率，而且大多数克隆小鼠在出生后不久就会死亡，成功出生的克隆小鼠也会出现胎盘巨大、
胎儿过度生长等异常症状，即所谓的“胎儿巨大症”，造成这一现象的主要原因是供体细胞核不能够被完全的重编程所致；重编程主要指的是表观遗传修饰的擦除与重建，主要包括DNA的甲基化、组蛋白的乙酰化、基因组印记的重建、X
染色体的复活与失活以及端粒长度的再延伸等修饰的动态变化。
[0003] 小鼠体细胞核移植主要为以下几个步骤：(1)核供体细胞的准备；(2)受体卵母细胞的准备；(3)受体卵母细胞的去核；(4)供体细胞核的注入；(5)重构胚胎的激活；(6)重构胚
胎体外培养；(7)重构胚胎移植代孕母鼠；自从核移植技术介导的体细胞重编程成功以来，有关核移植技术的研究，始终围绕着如何提高重编程效率这一核心问题展开；核移植介导的重编程通常从以下几个方面来评价：(1)重构胚的囊胚发育率；(2)克隆动物的出生率；(3)克隆动物的成活率；(4)从重构囊胚中获得胚胎干细胞的成功率。
[0004] 重构胚的体外培养是克隆胚胎发育的关键因素之一，好的重构胚体外培养体系，对于提高重构胚卵裂率、囊胚发育率、妊娠及克隆动物出生等非常重要；CZB、KSOM-AA和M16是目前最为常用的培养液，均可将受精卵培养至囊胚阶段，但适于重构胚体外培养条件还不统一，因而选取一套重构胚培养体系，对于进一步探寻重构胚的发育机理有着很大的研究价值和意义。
[0005] 小鼠胚胎移植技术是核移植动物生产过程中必不可少的关键技术之一，输卵管伞口移植和子宫
角移植是目前普遍采用的两种技术；根据研究的目的不同，所采用的移植方法也不同，一般说来，原核注射制备转基因小鼠使用输卵管伞口移植；制作卵裂球杂交融合、嵌合体动物时使用子宫角移植技术；但核移植重构胚的移植方法，现在还没有统一的认识，不同文献中不仅采用的方法不同，而且同一移植方法的出生效率也并不一致，因此摸索一套最佳的移植方案，对于进一步研究核移植动物的发育机理也有着重大的研究价值和意义。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种小鼠体细胞核移植方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 一种小鼠体细胞核移植方法，包括以下步骤：
[0009] 1)选择实验动物：选用B6D2F1雌雄小鼠提供稳定的卵母细胞，用于体细胞核移植试验，购自内蒙古大学实验动物研究中心，供体鼠饲养在SPF级动物房22～24℃，
相对湿度50～60％，动物房光照时间为每天早8点至晚8点；
[0010] 2)配制细胞培养液：
[0011] 2.1)饲养层细胞培养液：500mL，组成成分为：DMEM培养液445mL、胎
牛血清50mL、L-谷
氨酰胺5mL；
[0012] 2.2)胚胎干细胞培养液：100mL，组成成分为：DMEM培养液80mL、血清替代物15mL、青
链霉素混合液1ml、L-谷氨酰胺1ml、非必须氨基酸1ml、胚胎干细胞核苷酸1ml、β巯基
乙醇100μl、白血病抑制因子10μl；
[0013] 2.3)冻存液：500mL，组成成分为：DMEM培养液350mL、血清50mL、L-谷氨酰胺100mL；配完后10mL分装，-20℃保存，有效期12个月，用于细胞的冻存；
[0014] 2.4)丝裂霉素C
[0015] 100X丝裂霉素C的配置与储存均在生物安全柜中进行，用2mL
注射器吸取2mL的PBS注入2mg丝裂霉素C棕色药瓶中，充分颠倒混匀后配置成1mg/mL浓储液，开瓶盖，将溶解后的丝裂霉素C分装，存于-20℃中，丝裂霉素C的工作浓度为10μg/mL；
[0016] 3)配制胚胎培养液：
[0017] 3.1)浓缩液：
[0018] 3.1.1)HCZB浓储液：500mL；组成成分为：超纯水495ml、
氯化钠2380mg、氯化
钾180mg、7水
硫酸镁145mg、
乙二胺四乙酸二钠20mg、乳酸钠2.65mL、
葡萄糖500mg、
磷酸二氢钾
80mg；
[0019] 3.1.2)10ml氯化
钙100X浓储液：由0.2g二水
氯化钙和10ml超纯水配制而成；
[0020] 3.1.3)10ml氯化锶100X浓储液：由2.666g六水氯化锶和10ml超纯水配制而成；
[0021] 3.1.4)20ml谷氨酰胺100X浓储液：由0.294g谷氨酰胺和20ml无钙CZB溶液配制而成；
[0022] 3.1.5)细胞松弛素B溶液：由细胞松弛素B以1mg/ml的配比溶于二甲基亚砜溶液中制备而成；
[0024]
质量分数为10％的PVP溶液：由1g PVP和10ml HCZB配制而成；
[0025] 质量分数为3％的PVP溶液：由0.3g PVP和10ml HCZB配制而成；
[0026] 3.1.7)透明质酸酶10X浓储液：由20ml M2培养液和100mg透明质酸酶配制而成；
[0027] 3.2)HCZB胚胎操作液：100ml，pH＝7.4；
[0028] 组成：步骤3.1.1)中制备的HCZB浓储液99ml；
碳酸氢钠211mg、步骤3.1.2)中制备的二水氯化钙100X浓储液1ml、丙
酮酸钠3mg、谷氨酰胺1ml、牛血清
白蛋白500mg；
[0029] 3.3)无钙CZB溶液：
[0030] 组成：步骤3.1.1)中制备的HCZB浓储液100ml、
碳酸氢钠211mg、
丙酮酸钠3mg、谷氨酰胺1ml、牛血清白蛋白500mg；
[0031] 3.4)M2胚胎操作液
[0032] 3.4.1)M2、M16浓储液
[0033] 浓储液A(10×)200mL；组成：氯化钠11.068g、
氯化钾0.712g、磷酸二氢钾0.324g、7水
硫酸镁0.586g、乳酸钠8.698g、葡萄糖2g、青霉素0.12g、链霉素0.1g；
[0034] 浓储液B(10×)20mL；组成：碳酸氢钠0.4202g、酚红0.002g；
[0035] 浓储液C(100×)10mL；组成：丙酮酸钠0.036g；
[0036] 浓储液D(100×)50mL；组成：二水氯化钙1.26g；
[0037] 浓储液E(100×)250ml；组成：4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸14.895g、酚红0.025g。
[0038] 3.4.2)从浓储液配制M2培养液
[0039] M2培养液体积10mL：浓储液A(10×)1.00mL、浓储液B(10×)0.16mL、浓储液C(100×)0.10mL、浓储液D(100×)0.10mL、浓储液E(100×)0.84mL、无酶水7.80mL、牛血清白蛋白40mg；
[0040] M2培养液体积50mL：浓储液A(10×)5.00mL、浓储液B(10×)0.80mL、浓储液C(100×)0.50mL、浓储液D(100×)0.50mL、浓储液E(100×)4.20mL、无酶水39.0mL、牛血清白蛋白200mg；
[0041] M2培养液体积100mL：浓储液A(10×)10.0mL、浓储液B(10×)1.60mL、浓储液C(100×)1.00mL、浓储液D(100×)1.00mL、浓储液E(100×)8.40mL、无酶水78.0mL、牛血清白蛋白400mg；
[0042] M2培养液体积200mL：浓储液A(10×)20.0mL、浓储液B(10×)3.20mL、浓储液C(100×)2.00mL、浓储液D(100×)2.00mL、浓储液E(100×)16.80mL、无酶水156.0mL、牛血清白蛋白800mg；
[0043] 3.4.3)从浓储液配制M16培养液
[0044] M6培养液体积10mL：浓储液A(10×)1.00mL、浓储液B(10×)1.00mL、浓储液C(100×)0.10mL、浓储液D(100×)0.10mL、无酶水7.80mL、牛血清白蛋白40mg；
[0045] M6培养液体积50mL：浓储液A(10×)5.00mL、浓储液B(10×)5.00mL、浓储液C(100×)0.50mL、浓储液D(100×)0.50mL、无酶水39.0mL、牛血清白蛋白200mg；
[0046] M6培养液体积100mL：浓储液A(10×)10.00mL、浓储液B(10×)10.00mL、浓储液C(100×)1.0mL、浓储液D(100×)1.0mL、无酶水78.0mL、牛血清白蛋白400mg；
[0047] M6培养液体积200mL：浓储液A(10×)20.00mL、浓储液B(10×)20.00mL、浓储液C(100×)2.0mL、浓储液D(100×)2.0mL、无酶水156.0mL、牛血清白蛋白800mg；
[0048] 3.5)配制KSOM-AA胚胎培养液
[0049] 每100mLKSOM-AA胚胎培养液中含乙二胺四乙酸二钠盐0.38mg、氯化钠559.5mg、氯化钾18.5mg、磷酸二氢钾4.75mg、7水硫酸镁4.95mg、乳酸钠盐溶液0.174ml、葡萄糖3.60mg、碳酸氢钠210.0mg、谷氨酰胺14.5mg、丙酮酸钠2.2mg、青霉素6.3mg、链霉素5.0mg；必需氨基酸1.0ml、非必需氨基酸0.5ml；其中乙二胺四乙酸二钠盐优先滴加，将100mg牛血清白蛋白添加到100mLKSOM-AA胚胎培养液中，轻轻混匀使牛血清白蛋白缓慢溶解，不要剧烈摇动液体以避免产生
泡沫而导致
蛋白质变性；用0.22μm的针头式滤器过滤培养液到无菌的塑料管内，溶液保存在4℃，保存时间1～2周；
[0050] 4)实验器材：
[0051] 4.1)核移植实验器材：Corning塑料培养皿、充油型注射仪、带有Nomarski或Hoffman光学系统的倒置
显微镜、锻针仪、压电陶瓷系统、拉针仪、显微操作用针、水
银；
[0052] 4.2)细胞培养实验器材：1.5ml、0.6ml和0.2ml离心管；细胞培养皿、离心管、冻存管；细胞培养用移液管；离心机；体式镜；
培养箱；生物安全柜；
[0053] 5)实验方法：
[0054] 5.1)准备供体细胞：
[0055] 5.1.1)制备小鼠饲养细胞；
[0056] 5.1.2)制备胚胎干细胞；
[0058] 5.2)体细胞核移植：
[0059] 5.2.1)收集MⅡ期卵母细胞；
[0060] 5.2.2)准备供体细胞：包括胚胎干细胞收集、MEF细胞收集、卵丘细胞的收集；
[0061] 5.3)进行核移植操作：包括：准备显微操作用的操作滴、MII卵母细胞的去核、供体核注射、重构胚的激活、重构胚体外培养；
[0062] 5.4)胚胎移植：
[0063] 5.4.1)准备结扎雄鼠与假孕雌鼠；
[0064] 5.4.2)进行输卵管伞口移植；
[0065] 5.4.3)进行子宫角移植；
[0066] 6)进行数据统计和分析：采用SPSS10.0统计学
软件分析处理，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著；
[0067] 6.1)选取最佳激活液：将卵丘细胞重构胚、胎儿成纤维细胞重构胚和胚胎干细胞重构胚分别用无钙CZB、无钙KSOM激活6h后统计假原核形成率；得到无钙KSOM激活液为最佳激活液；于体式镜下统计重构胚的状况，卵丘细胞重构胚经无钙KSOM激活后，成功率为93.5％，成功率极显著，优于无钙CZB激活液，P<0.01；对于胎儿成纤维细胞重构胚和ES重构胚，两种激活液的激活效果差异不显著，P>0.05，但这两种重构胚经无钙KSOM激活后死亡率显著低于无钙CZB激活液，P<0.05，表明，无钙KSOM激活液是最好的小鼠重构胚激活液；
[0068] 6.2)选取重构胚培养液：采用步骤6.1)确定的无钙KSOM激活液，将激活后的卵丘细胞重构胚、胎儿成纤维细胞重构胚和胚胎干细胞重构胚分别用CZB、αMEM、M16和KSOM-AA培养液培养，4.5d后比较重构胚的囊胚发育率；得到KSOM-AA液作为重构胚培养液；在这4种培养液中，卵丘细胞重构胚均有较高的卵裂率，囊胚发育率也很高；卵丘细胞重构胚的卵裂率在4种胚胎培养液中无差异，但在KSOM-AA培养液中囊胚率最高，为78.4％；在αMEM中，胎儿成纤维细胞重构胚的卵裂率显著高于其它培养液，在KSOM-AA培养液中胎儿成纤维细胞重构胚的囊胚率显著高于αMEM培养液，αMEM和KSOM-AA培养液相比较为37.1vs.30.2％，P<0.05；胚胎干细胞重构胚在KSOM-AA培养液中卵裂率和囊胚率均显著高于其它3种培养液，在所用的4种培养液中，KSOM-AA对三类克隆胚胎的培养效果最好，因此在克隆操作中，均选用KSOM-AA培养液作为重构胚培养液；
[0069] 6.3)选取最佳胚胎移植方法
[0070] 采用步骤6.1)确定的无钙KSOM激活液和步骤6.2)确定的KSOM-AA培养液，将卵丘细胞重构胚通过输卵管移植法和子宫移植法进行胚胎移植，统计核移植小鼠的出生率；卵丘细胞重构胚经无钙KSOM激活液激活6h后，将形态良好并且形成假原核的重构胚，于KSOM-AA培养液中培养，培养12h后，将卵裂胚采用输卵管移植；培养3.5d后发育至囊胚的重构胚进行子宫角移植；统计小鼠出生情况采用输卵管移植时，每侧移植2-细胞时期重构胚15枚；子宫角移植时，每侧子宫角移植7枚囊胚；子宫角移植组无一发育到期，而输卵管移植组有1只孕鼠发育到期，并生下1仔，出生率1.67％，得出，重构胚体外发育至MⅡ期细胞时期，经输卵管双侧移植，每侧移植15枚胚胎获得核移植动物效率高。
[0071] 作为本发明进一步的方案：所述步骤5.3)中，核移植操作包括以下步骤：
[0072] A)准备显微操作用的操作滴：用含5mg/mL细胞松弛素B的胚胎操作液作为去核、注核操作滴，质量分数为3％的PVP溶液以及质量分数为10％的PVP溶液滴作为洗针液滴，用矿物油
覆盖，于37℃预热；
[0073] B)MII卵母细胞的去核：选择胞质饱满、透明带界面清晰、无分裂碎片的卵母细胞用于去核，30～40枚/组，先用持卵针固定卵母细胞，将纺锤体置于时钟3点的
位置，去核针将纺锤体吸出。去核后的卵母细胞移回培养液滴中待用
[0074] C)供体核注射：对于ES或MEF细胞核移植，用口吸管将备好的ES或MEF细胞移入质量分数为3％的PVP液滴中，将已经去核的卵母细胞20～30个/组移入注核操作滴中；选取形态良好的细胞，用注核针尖吸入并利用压电陶瓷系统将细胞膜打破，同时将细胞反复吸吐，使供体细胞膜破裂；对于卵丘细胞核移植，用口吸管将备好的卵丘放入质量分数为3％的PVP液滴中，用注核针将细胞吸吐，反复几次后使供体细胞核暴露，将供体细胞核注入去过核的卵母细胞中，重构胚移回培养液滴进行培养；
[0075] D)重构胚的激活：取1mL无钙KSOM或无钙CZB溶液于培养皿中，先加入谷氨酰胺10μl和细胞松弛素B 5μl，然后加入氯化锶浓储液10μl，混勾后立刻做滴；用矿物油覆盖后放入培养箱中平衡60min以上待用，将在胚胎培养液滴中恢复30min以上的重构胚移入激活液中，放回培养箱内激活6h，同时将胚胎培养液滴平衡待用；
[0076] E)重构胚体外培养：将激活后的胚胎移入胚胎培养液中，CZB溶液、αMEM溶液、M16溶液和KSOM-AA溶液四种培养液中进行对比，放入培养箱内进行培养。
[0077] 作为本发明再进一步的方案：所述步骤5.4.2)中，输卵管伞口移植包括以下步骤；
[0078] A)挑选成功见栓0.5d假孕鼠母鼠，
腹腔注射麻醉剂，70％酒精消毒小鼠背部偏下方表皮；
[0079] B)在小鼠背部偏下处纵向剪开
皮肤，开口约为70mm。用
剪刀剥开皮肤层和肌肉层，在强光下可透过肌层看见白色脂肪垫于脊柱两侧1cm处
[0080] C)从脂肪垫处剪开肌肉层，开口约0.5cm，用钝头
镊子夹住脂肪组织，缓缓将一侧的卵巢、输卵管和部分子宫脱出，于体式镜镜下进行后续操作
[0081] D)准备移植针：首先吸入一段2mm的石
蜡油，接着依次吸入1mm长的空气、一小段培养液，再吸入一段空气，最后吸入胚胎及少量培养液；
[0082] E)用钟表镊子撕开小口在伞口处的透明囊膜，调整角度充分暴露输卵管的伞部，准确并且缓慢的从输卵管伞口处插入移胚针，轻轻地将胚胎吹入；
[0083] F)将胚胎成功吹入输卵管后，拔出移胚针，将脂肪垫、卵巢、输卵管和子宫送回腹腔复位，另一侧的输卵管重复相同操作；
[0084] G)缝合伤口，皮肤与肌肉层分开缝合；
[0085] H)移植完成后，小鼠放置于热垫上保温，麻醉状态下的小鼠看护直到完全苏醒过来；
[0086] I)移植后的19.5d，处死孕鼠，经剖腹取出克隆小鼠，取出的仔鼠擦干口鼻部粘液，剪断脐带，置于37℃的保温盒中观察；
[0087] J)仔鼠寄养给同天生育小鼠的雌鼠。
[0088] 作为本发明再进一步的方案：所述步骤5.4.3)中，子宫角移植包括以下步骤：
[0089] A)使用见栓后2.5d的假孕鼠，麻醉与开口同输卵管移植；
[0090] B)体式镜下用钝头镊子夹住子宫上部，选择子宫上端血较少处，4号针头刺破子宫的体壁；
[0091] C)移胚针吸取囊胚，装针的方法如同输卵管移植，移胚针沿针刺孔再次插入子宫中，将胚胎缓缓吹入子宫中；
[0092] D)移植后17.5d进行剖腹产，其他操作如同输卵管移植。
[0093] 与
现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明建立了一套小鼠克隆技术方案，利用卵丘细胞、胎儿的成纤维细胞和胚胎干细胞等3种细胞构建了重构胚，并比较了这3种重构胚在不同激活液中的激活效率、不同培养液中的发育效率和不同胚胎移植方法的妊娠效率；结果表明，1)无钙KSOM激活液是通用的高效激活液，激活效率在93.5％左右；2)KSOM-AA培养液适合于卵丘和胚胎干细胞重构胚的体外培养，而胎儿成纤维重构胚的最佳培养液为αMEM培养液；3)当重构胚体外发育至2-细胞时期，经输卵管双侧移植，每侧移植15枚胚胎可高效获得核移植动物；本发明的小鼠体细胞核移植方法能提高重构胚卵裂率、重构胚的囊胚发育率、克隆动物的出生率和成活率，继而提高从重构囊胚中获得胚胎干细胞的成功率，对于进一步探寻重构胚的发育机理有着积极的研究价值和意义。
具体实施方式
[0094] 下面结合具体实施方式对本
专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0095] 一种小鼠体细胞核移植方法，包括以下步骤：
[0096] 1)选择实验动物：选用B6D2F1雌雄小鼠提供稳定的卵母细胞，用于体细胞核移植试验，购自内蒙古大学实验动物研究中心，供体鼠饲养在SPF级动物房22～24℃，相对湿度50～60％，动物房光照时间为每天早8点至晚8点；
[0097] 2)配制细胞培养液：
[0098] 2.1)饲养层细胞培养液：500mL，组成成分为：DMEM培养液445mL、胎牛血清50mL、L-谷氨酰胺5mL；
[0099] 2.2)胚胎干细胞培养液：100mL，组成成分为：DMEM培养液80mL、血清替代物15mL、青链霉素混合液1ml、L-谷氨酰胺1ml、非必须氨基酸1ml、胚胎干细胞核苷酸1ml、β巯基乙醇100μl、白血病抑制因子10μl；
[0100] 2.3)冻存液：500mL，组成成分为：DMEM培养液350mL、血清50mL、L-谷氨酰胺100mL；配完后10mL分装，-20℃保存，有效期12个月，用于细胞的冻存；
[0101] 2.4)丝裂霉素C
[0102] 100X丝裂霉素C的配置与储存均在生物安全柜中进行，用2mL注射器吸取2mL的PBS注入2mg丝裂霉素C棕色药瓶中，充分颠倒混匀后配置成1mg/mL浓储液，开瓶盖，将溶解后的丝裂霉素C分装，存于-20℃中撕裂霉素C的工作浓度为10μg/mL；
[0103] 3)配制胚胎培养液：
[0104] 3.1)浓缩液：
[0105] 3.1.1)HCZB浓储液：500mL；组成成分如表1所示：
[0106] 表1 HCZB浓储液组成成分
[0107]
[0108] 3.1.2)10ml氯化钙100X浓储液：
[0109] 由0.2g二水氯化钙和10ml超纯水配制而成；
[0110] 3.1.3)10ml氯化锶100X浓储液：
[0111] 由2.666g六水氯化锶和10ml超纯水配制而成；
[0112] 3.1.4)20ml谷氨酰胺100X浓储液：
[0113] 由0.294g谷氨酰胺和20ml无钙CZB溶液配制而成；
[0114] 3.1.5)细胞松弛素B溶液：由细胞松弛素B以1mg/ml的配比溶于二甲基亚砜溶液中制备而成；
[0115] 3.1.6)聚乙烯吡咯烷酮溶液：
[0116] 质量分数为10％的PVP溶液：由1g PVP和10ml HCZB配制而成；
[0117] 质量分数为3％的PVP溶液：由0.3g PVP和10ml HCZB配制而成；
[0118] 3.1.7)透明质酸酶10×浓储液：由20ml M2培养液和100mg透明质酸酶配制而成；
[0119] 3.2)HCZB胚胎操作液：100ml，pH＝7.4，组成成分如表2所示：
[0120] 表2 HCZB胚胎操作液组成成分
[0121]
[0122] 3.3)无钙CZB溶液：组成成分如表3所示：
[0123] 表3 无钙CZB溶液组成成分
[0124]
[0125]
[0126] 3.4)M2胚胎操作液
[0127] 3.4.1)M2、M16浓储液，按表4分别配置浓储液A、浓储液B、浓储液C、浓储液D、浓储液E：
[0128] 表4 浓储液A-E的配制方法
[0129]
[0130] 3.4.2)从浓储液配制M2培养液，方法如表5所示：
[0131] 表5 从浓储液配制M2培养液的配制方法
[0132]
[0133]
[0134] 3.4.3)从浓储液配制M16培养液，方法如表6所示：
[0135] 表6 从浓储液配制M16培养液的配制方法
[0136]
[0137] 3.5)配制KSOM-AA胚胎培养液，方法如表7所示：
[0138] 表7 KSOM-AA胚胎培养液的配制方法
[0139]
[0140]
[0141] 其中，乙二胺四乙酸二钠盐优先滴加，将100mg牛血清白蛋白添加到100mLKSOM-AA胚胎培养液中，轻轻混匀使牛血清白蛋白缓慢溶解，不要剧烈摇动液体以避免产生泡沫而导致蛋白质变性；用0.22μm的针头式滤器过滤培养液到无菌的塑料管内，溶液保存在4℃，保存时间1～2周；
[0142] 4)实验器材：
[0143] 4.1)核移植实验器材：Corning塑料培养皿、充油型注射仪、带有Nomarski或Hoffman光学系统的倒置显微镜、锻针仪、Piezo系统、拉针仪、显微操作用针、水银；
[0144] 4.2)细胞培养实验器材：1.5ml、0.6ml和0.2ml离心管；细胞培养皿、离心管、冻存管；细胞培养用移液管；离心机；体式镜；培养箱；生物安全柜；
[0145] 5)实验方法：
[0146] 5.1)准备供体细胞：
[0147] 5.1.1)制备小鼠饲养细胞；
[0148] 5.1.2)制备胚胎干细胞；
[0149] 5.1.3)制备胎儿成纤维细胞；
[0150] 5.2)体细胞核移植：
[0151] 5.2.1)收集MⅡ期卵母细胞；
[0152] 5.2.2)准备供体细胞：包括胚胎干细胞收集、MEF细胞收集、卵丘细胞的收集；
[0153] 5.3)进行核移植操作：包括：准备显微操作用的操作滴、MII卵母细胞的去核、供体核注射、重构胚的激活、重构胚体外培养；
[0154] 核移植具体操作包括以下步骤：
[0155] A)准备显微操作用的操作滴：用含5mg/mL细胞松弛素B的胚胎操作液作为去核、注核操作滴，质量分数为3％的PVP溶液以及质量分数为10％的PVP溶液滴作为洗针液滴，用矿物油覆盖，于37℃预热；
[0156] B)MII卵母细胞的去核：选择胞质饱满、透明带界面清晰、无分裂碎片的卵母细胞用于去核，30～40枚/组，先用持卵针固定卵母细胞，将纺锤体置于时钟3点的位置，去核针将纺锤体吸出。去核后的卵母细胞移回培养液滴中待用
[0157] C)供体核注射：对于ES或MEF细胞核移植，用口吸管将备好的ES或MEF细胞移入质量分数为3％的PVP液滴中，将已经去核的卵母细胞20～30个/组移入注核操作滴中；选取形态良好的细胞，用注核针尖吸入并利用
电压力将细胞膜打破，同时将细胞反复吸吐，使供体细胞膜破裂；对于卵丘细胞核移植，用口吸管将备好的卵丘放入质量分数为3％的PVP液滴中，用注核针将细胞吸吐，反复几次后使供体细胞核暴露，将供体细胞核注入去过核的卵母细胞中，重构胚移回培养液滴进行培养；
[0158] D)重构胚的激活：取1mL无钙KSOM或无钙CZB溶液于培养皿中，先加入谷氨酰胺10μl和细胞松弛素B 5μl，然后加入氯化锶浓储液10μl，混勾后立刻做滴；用矿物油覆盖后放入培养箱中平衡60min以上待用，将在胚胎培养液滴中恢复30min以上的重构胚移入激活液中，放回培养箱内激活6h，同时将胚胎培养液滴平衡待用；
[0159] E)重构胚体外培养：将激活后的胚胎移入胚胎培养液中，CZB溶液、αMEM溶液、M16溶液和KSOM-AA溶液四种培养液中进行对比，放入培养箱内进行培养；
[0160] 5.4)胚胎移植：
[0161] 5.4.1)准备结扎雄鼠与假孕雌鼠；
[0162] 5.4.2)进行输卵管伞口移植，具体方法包括以下步骤：
[0163] A)挑选成功见栓0.5d假孕鼠母鼠，腹腔注射麻醉剂，70％酒精消毒小鼠背部偏下方表皮；
[0164] B)在小鼠背部偏下处纵向剪开皮肤，开口约为70mm。用剪刀剥开皮肤层和肌肉层，在强光下可透过肌层看见白色脂肪垫于脊柱两侧1cm处
[0165] C)从脂肪垫处剪开肌肉层，开口约0.5cm，用钝头镊子夹住脂肪组织，缓缓将一侧的卵巢、输卵管和部分子宫脱出，于体式镜镜下进行后续操作
[0166] D)准备移植针：首先吸入一段2mm的
石蜡油，接着依次吸入1mm长的空气、一小段培养液，再吸入一段空气，最后吸入胚胎及少量培养液；
[0167] E)用钟表镊子撕开小口在伞口处的透明囊膜，调整角度充分暴露输卵管的伞部，准确并且缓慢的从输卵管伞口处插入移胚针，轻轻地将胚胎吹入；
[0168] F)将胚胎成功吹入输卵管后，拔出移胚针，将脂肪垫、卵巢、输卵管和子宫送回腹腔复位，另一侧的输卵管重复相同操作；
[0169] G)缝合伤口，皮肤与肌肉层分开缝合；
[0170] H)移植完成后，小鼠放置于热垫上保温，麻醉状态下的小鼠看护直到完全苏醒过来；
[0171] I)移植后的19.5d，处死孕鼠，经剖腹取出克隆小鼠，取出的仔鼠擦干口鼻部粘液，剪断脐带，置于37℃的保温盒中观察；
[0172] J)仔鼠寄养给同天生育小鼠的雌鼠；
[0173] 5.4.3)进行子宫角移植，具体包括以下步骤：
[0174] A)使用见栓后2.5d的假孕鼠，麻醉与开口同输卵管移植；
[0175] B)体式镜下用钝头镊子夹住子宫上部，选择子宫上端血较少处，4号针头刺破子宫的体壁；
[0176] C)移胚针吸取囊胚，装针的方法如同输卵管移植，移胚针沿针刺孔再次插入子宫中，将胚胎缓缓吹入子宫中；
[0177] D)移植后17.5d进行剖腹产，其他操作如同输卵管移植。
[0178] 实验结果
[0179] 进行数据统计和分析：采用SPSS10.0统计学软件分析处理，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
[0180] 1)最佳激活液的选取
[0181] 将卵丘细胞重构胚、胎儿成纤维细胞重构胚和胚胎干细胞重构胚分别用无钙CZB、无钙KSOM激活6h后统计假原核形成率；于体式镜下统计重构胚的状况，结果如表8所示：
[0182] 表8 不同激活液对重构胚的激活情况
[0183]
[0184]
[0185] 由表8数据得出，卵丘细胞重构胚经无钙KSOM激活后，成功率为93.5％，成功率极显著，优于无钙CZB激活液，P<0.01；对于胎儿成纤维细胞重构胚和ES重构胚，两种激活液的激活效果差异不显著，P>0.05，但这两种重构胚经无钙KSOM激活后死亡率显著低于无钙CZB激活液，P<0.05，表明，无钙KSOM激活液是最好的小鼠重构胚激活液。
[0186] 2)重构胚培养液的选取：采用步骤1)确定的无钙KSOM激活液，将激活后的卵丘细胞重构胚、胎儿成纤维细胞重构胚和胚胎干细胞重构胚分别用CZB、αMEM、M16和KSOM-AA培养液培养，4.5d后比较重构胚的囊胚发育率；结果如表9所示：
[0187] 表9 重构胚在不同培养液中的发育情况
[0188]
[0189]
[0190] *相同的一列标注不同的上标表示显著的不同(P<0.05)。
[0191] 由表9数据得出，在这4种培养液中，卵丘细胞重构胚均有较高的卵裂率，囊胚发育率也很高；卵丘细胞重构胚的卵裂率在4种胚胎培养液中无差异，但在KSOM-AA培养液中囊胚率最高，为78.4％；在αMEM中，胎儿成纤维细胞重构胚的卵裂率显著高于其它培养液，在KSOM-AA培养液中胎儿成纤维细胞重构胚的囊胚率显著高于αMEM培养液，37.1vs.30.2％，P<0.05；胚胎干细胞重构胚在KSOM-AA培养液中卵裂率和囊胚率均显著高于其它3种培养液，在所用的4种培养液中，KSOM-AA对三类克隆胚胎的培养效果最好，因此在克隆操作中，均选用KSOM-AA培养液作为重构胚培养液。
[0192] 3)最佳胚胎移植方法的选取
[0193] 采用步骤1)确定的无钙KSOM激活液和步骤2)确定的KSOM-AA培养液，将卵丘细胞重构胚通过输卵管移植法和子宫移植法进行胚胎移植，统计核移植小鼠的出生率；卵丘细胞重构胚经无钙KSOM激活液激活6h后，将形态良好并且形成假原核的重构胚，于KSOM-AA培养液中培养，培养12h后，将卵裂胚采用输卵管移植；培养3.5d后发育至囊胚的重构胚进行子宫角移植；统计小鼠出生情况，采用输卵管移植时，每侧移植2-细胞时期重构胚15枚；子宫角移植时，每侧子宫角移植7枚囊胚；子宫角移植组无一发育到期，而输卵管移植组有1只孕鼠发育到期，并生下1仔，出生率1.67％，得出，重构胚体外发育至MⅡ期细胞时期，经输卵管双侧移植，每侧移植15枚胚胎获得核移植动物效率高，结果见表10所示：
[0194] 表10 重构胚移植结果
[0195]
[0196] *相同的一列标注不同的上标表示显著的不同(P<0.05)。
[0197] 本发明的设计思路是：重构胚的激活是核移殖技术的关键环节之一，激活的效果直接影响核移植重构胚的发育率；对于小鼠核移植重构胚，可以通过
温度、锶离子、酒精、
电刺激、渗透压、酶及钙离子载体A23187等多种物理、化学因素进行激活；锶离子激活法由于浓度可以精确固定、重复性好等许多优点而被广泛采用；Sr2+引起重构胚激活的主要原理是：Sr2+的进入重构中，诱导内质网Ca2+释放，导致重构胚内游离Ca2+水平升高，继而引起细胞内Cyclin B的减少，致使MPF水平下降，MPF的降解引起重构胚的激活；在以往的核移植流程中，通常选用无钙CZB激活液，但在我们的试验过程中注意到无钙KSOM对于孤雌胚胎的激活效果明显好于核移植重构胚；经无钙CZB激活的重构胚，假原核形成率偏低，并且重构胚的发育具有阻滞现象；通过将能够克服发育阻滞的KSOM-AA培养液改良成无钙KSOM激活液，对三种不同供体细胞的重构胚进行激活效率的比较，结果表明，无钙KSOM激活液对于卵丘细胞重构胚、胎儿成纤维细胞重构胚和胚胎干细胞重构胚的激活效率优于无钙CZB激活液，可能原因是KSOM培养液中的K+离子是经过优化，更适于激活时Ca2+离子波地形成。
[0198] 选取适于核移植重构胚早期发育的体外培养液一直受到关注，国内外学者做了大量的工作。核移植重构胚的早期发育中存在典型的2-细胞阻滞现象。迄今为止，仍然没有统一的适于重构胚发育的培养液。因此，有必要研究简单的、成分明了的可支持重构胚发育到囊胚的培养液。本发明的研究表明，KSOM-AA培养液可以高效支持卵丘细胞重构胚和胚胎干细胞重构胚发育至囊胚，但胎儿成纤维细胞重构胚的最佳培养液是αMEM。卵丘细胞重构胚在KSOM-AA培养液中的囊胚率已经显著高于以往文献中的报道(78.4％vs.20.2％，P<0.01)。由于在体外培养系统中，各种因子与重构胚之间的相互作用和影响非常复杂；另外，供体细胞核在早期阶段重编程不够彻底，重构胚会表现出对体细胞培养液的依赖。今后的研究中，可根据重构胚的复杂性和不断变化的因素，设计一种不连续培养的方法，即早期发育阶段采用体细胞培养，在体外培养后期采用胚胎培养液，或者一种按特定比例的混合培养液。
[0199] 胚胎移植是核移植动物制作过程中的重要技术之一，影响胚胎移植成功的因素有很多。要提高核移植动物的出生率除了加强专
门技术训练外，还要对原技术本身进行改进。从两种移植方法的产仔数来看，输卵管伞口移植明显优于子宫角移植。由于输卵管移植时，重构胚在体外培养时间短并且对于代孕母鼠的创伤较小，这可能的原因是输卵管移植好于子宫角移植的主要原因。目前，核移植小鼠的出生率在所有核移植动物中是最低的，仅为
1％～2％。此次试验的出生率为1.67％，处于以往报道的中上水平。
[0200] 本发明中，无钙KSOM激活液是适于卵丘细胞、胎儿成纤维细胞重构胚和胚胎干细胞核移植重构胚激活的通用激活液；KSOM-AA培养液适合于卵丘细胞、胚胎干细胞重构胚的体外培养，胎儿成纤维细胞重构胚的最佳培养液为αMEM培养液；当重构胚体外发育至2-细胞时期，采用输卵管双侧移植，每侧移植15枚胚胎可高效获得核移植动物。
[0201] 上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。
