一种纳米纤维固定化β-D-半乳糖苷酶的制备方法
专利汇可以提供一种纳米纤维固定化β-D-半乳糖苷酶的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种 纳米 纤维 固定化β-D-半乳糖苷酶的制备方法，属于酶的固定化及其应用技术领域。该方法过程为：以苯乙烯- 马 来酸酐共聚物通过 静电纺丝 法制备纳米纤维， 乙醇 水 溶液预处理后再利用纤维表面的酸酐基团共价偶联β-D-半乳糖苷酶分子，得到固定化β-D-半乳糖苷酶。酶负载量可达20～30mg酶/g纳米纤维，酶活 力 回收率为45～60％，固定化酶重复使用21次后仍维持85％的催化活力。该方法简便易行，所得固定化酶易于回收和重复利用，可用于烷基半乳糖苷和功能性低聚半乳糖的合成，低乳糖奶的生产等领域。，下面是一种纳米纤维固定化β-D-半乳糖苷酶的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种纳米纤维固定化β-D-半乳糖苷酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)静电纺丝法制备苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)纳米纤维：将一定量的PSMA溶解于有机溶剂中，在室温磁力搅拌的条件下充分溶解制得浓度为20～40％(w/v)的电纺液；将电纺液吸入注射器内进行静电纺丝，控制注射器针头至接收板的距离为10～30cm，电纺液流速为250～1000μL/h，电压在15～50kV之间调节，制得PSMA纳米纤维，室温放置直至溶剂完全挥发；
(2)PSMA纳米纤维的预处理：取PSMA纳米纤维在25％(V/V)的乙醇水溶液中浸泡15min以增加其亲水性，再分别用水和缓冲溶液冲洗；
(3)β-D-半乳糖苷酶的固定化：用pH值介于2.5～8.0的缓冲溶液配制0.1～5.0mg/mL的β-D-半乳糖苷酶溶液；将乙醇处理后的PSMA纳米纤维浸入β-D-半乳糖苷酶溶液中，在4～25℃条件下于摇床振荡固定化0.5～15h；取出固定化酶用缓冲溶液充分洗去纤维表面未固定化的酶，最后浸泡在0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中(pH4.5)，于4℃保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂是N，N-二甲基乙酰胺、N，N二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜中的一种、或其中任意两种的混合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纳米纤维可以是纳米纤维膜、纳米纤维丝、纳米纤维球或表面偶联纳米纤维丝的纤维球，优选的是纳米纤维膜和纳米纤维丝。
技术领域
本发明涉及一种纳米纤维固定化β-D-半乳糖苷酶的制备方法，属于酶的固定化及其应用技术领域。
背景技术
目前的实际生产中，无论是水解乳糖的反应还是转糖苷反应多在游离β-gal的催化下进行，游离酶难以自反应液中回收，不仅增加反应成本，而且使得产物分离步骤更加繁琐。通过β-gal的固定化有望解决上述问题，同时酶稳定性也将得到提高。
国内外研究人员就β-gal的固定化已开展大量工作。日本专利JP8256769以silica颗粒为载体，采用先吸附再用戊二醛交联的方式固定化β-gal，有效提高酶的活力和稳定性。CN1587404以粒径为200-600μm的黄原胶、瓜尔豆胶等多糖微球为载体，也通过戊二醛交联固定化β-gal，酶活力回收率达62％。以上酶固定化方式虽有助于提高酶稳定性，但粒径为纳米或微米尺度的固定化酶仍无法以便捷方式回收利用。CN101191782先将β-gal交联在醛基化环糊精微球表面，再将载酶微球分别涂抹至两张聚碳酸酯微孔膜上，向膜上滴加海藻酸钠溶液，再将两张膜共同浸泡于氯化钙溶液中固化，即得三明治结构的β-gal酶膜，固定化酶膜半衰期15-20天，稳定性良好，且块状膜易于回收，但此法的缺点是存在严重的扩散限制。
由静电纺丝法制备的纳米纤维是新兴的酶固定化载体，自2002年被首次用于酶固定化后纳米纤维由于比表面积大而能大量负载酶分子，由于孔隙率高仅有极小扩散阻力，由于宏观上以无纺布形式存在而易于回收利用等诸多优势便被广泛认可。在已有的文献报道中，α-胰凝乳蛋白酶和脂肪酶等均曾被高效固定化在高分子纳米纤维上。
发明内容
本发明的技术方案：一种纳米纤维固定化β-gal的制备方法，是以PSMA纳米纤维为载体，利用载体上的酸酐基团直接固定化β-gal，所述固定化酶的步骤为：
(1)静电纺丝制备PSMA纳米纤维：将一定量的PSMA溶解于有机溶剂中，在室温磁力搅拌的条件下充分溶解制得浓度为20～40％(W/V)的电纺液。将电纺液吸入注射器内进行静电纺丝，控制注射器针头至接收板的距离为10～30cm，电纺液流速为250～1000μL/h，电压在15～50kV之间调节，制得PSMA纳米纤维，室温放置直至溶剂完全挥发。
(2)PSMA纳米纤维的预处理：取步骤(1)制备的PSMA纳米纤维在25％(V/V)的乙醇水溶液中浸泡15min以增加其亲水性，再分别用水和缓冲溶液冲洗两次。
(3)β-gal的固定化：用pH值介于2.5～8.0的缓冲溶液配制0.1～5.0mg/mL的β-gal溶液。经步骤(2)处理后的PSMA纳米纤维浸入β-gal溶液中，在4～25℃条件下于摇床震荡固定化0.5～15h。取出固定化酶用缓冲溶液充分洗去纤维表面未固定化的酶，最后浸泡在0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液中(pH4.5)，于4℃保存。
本发明的有益效果：目前未见有利用纳米纤维作为载体固定化β-gal的报道。利用PSMA纳米纤维固定化β-gal，固定化条件温和，所得固定化酶活力维持率高，酶负载量高且易于回收重复利用。该固定化酶可应用于乳糖水解、烷基半乳糖苷合成和酶传感器等多个领域。
附图说明
图1为实施例二制备PSMA纳米纤维的扫描电镜照片
图2为实施例三制备固定化β-gal的重复使用稳定性
具体实施方式
准确称取3.5g PSMA溶解于10mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温磁力搅拌使其充分溶解，制得浓度为35％(W/V)的电纺液。将5mL电纺液吸入配有8号针头的注射器内静电纺丝，注射器针头至接收板的距离为25cm，电纺液流速为250μL/h，电压21kV，静电纺丝30min后获得PSMA纳米纤维，室温放至溶剂完全挥发。
取1mg PSMA纳米纤维在1mL 25％(V/V)的乙醇水溶液中浸泡15min，分别用去离子水和0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH4.0)冲洗两次。用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2mol/L)配制浓度为1.0mg/mL的β-gal溶液，在15℃条件下于摇床振荡固定化4h，再用上述pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗去纤维表面未固定化的酶，直至利用微量考马斯亮蓝法无法检测出洗液中的蛋白质含量，所得固定化β-gal的酶负载量是23mg酶/g纳米纤维。
实施例二
准确称取3.5g PSMA溶解于10mL N，N-二甲基乙酰胺中，室温磁力搅拌使其充分溶解，制得浓度为35％(W/V)的电纺液。将5mL电纺液吸入配有8号针头的注射器内静电纺丝，注射器针头至接收板的距离为25cm，电纺液流速为250μL/h，电压21kV，静电纺丝30min后获得PSMA纳米纤维，室温放至溶剂完全挥发后，用扫描电子显微镜(SEM)表征纳米纤维的微观形貌，由SEM照片可知纤维直径在300nm左右。
取1mg PSMA纳米纤维在1mL 25％(V/V)的乙醇水溶液中浸泡15min，分别用去离子水和0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH5.0)冲洗两次。用pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2mol/L)配制浓度为1.0mg/mL的β-gal溶液，在4℃条件下于摇床振荡固定化6h，再用上述pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗去纤维表面未固定化的酶，直至利用微量考马斯亮蓝法无法检测出洗液中的蛋白质含量，所得固定化β-gal的酶负载量是21mg酶/g纳米纤维。
实施例三
以实施例二制备的固定化β-gal催化2-硝基苯酚β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)的水解反应，将1mg固定化β-gal加入到5mL预热至37℃的ONPG溶液中(0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液，pH4.5)，将反应液置于70rpm摇床中反应20min，取出100μL反应液并加入1mol/LNa2CO3 100μL终止反应。在405nm下测定溶液的吸光度值以计算酶活。反应完毕用5mL0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH4.5)洗涤固定化酶，再投入下一次反应，固定化β-gal重复使用21次后仍能维持85％的催化活力。
实施例四
用实施例一制备的固定化β-gal催化己醇/水两相体系中己基半乳糖苷的合成反应。用0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH4.5)配制100mmol/L乳糖溶液，取1mL乳糖溶液加至1mL己醇中，预热至50℃，再向上述两相体系中投入1mg固定化β-gal，于90rpm摇床中反应1h，取出反应液用HPLC检测产物量并计算酶活。酶活力单位定义为在50℃下1h催化产生1mmol己基半乳糖苷所需的酶量，测得固定化β-gal的活力为18U/mg纳米纤维。
实施例五
按实施例一所述方法制备PSMA纳米纤维膜，通过高速搅拌或冷冻切片的方式将其制备成纳米纤维丝，再按照实施例一所述方法固定化β-gal，然后按照实施例四所述方法利用PSMA纤维丝上的固定化β-gal催化己醇/水两相体系中己基半乳糖苷的合成反应，测得固定化β-gal的活力为26U/mg纳米纤维。
实施例六
按实施例一所述方法制备纳米纤维膜，或按实施例五所述方法制备纳米纤维丝，固定化β-gal后，通过球形模具将载酶纤维制备成纳米纤维球，应用于ONPG的水解反应，或己基半乳糖苷的合成反应。
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