牙周疾病是人类最常见、最多发的疾病之一，其中最常见的就是牙周炎。牙周疾病显著的病理变化是牙周支持组织的破坏：牙槽骨吸收、附着在骨质上的结缔组织破坏并伴有不同程度的牙骨质吸收，如果得不到有效的治疗就会导致牙齿松动脱落。在口腔的微生物环境中，细菌的主要构成部分，革兰氏阴性菌来源的脂多糖能够引发类似牙周病的刺激性的骨丧失。LPS通过激活固有免疫反应来刺激白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和RNAKL的表达[1-3]。炎症因子的产生过程是由酶诱导的信号通路和转化因子活化的结果。脂多糖通过联合CD14以及Toll样受体引发这一过程，起主要作用的是Toll-2和Toll-4[4-6]。不管是哪种Toll样受体起作用，LPS都可以增加RANKL，IL-1，PGE2和TNF-α[7]。各种因子都可以促进破骨细胞活性、增殖和分化。此外，活化的单核细胞、巨噬细胞和成纤维细胞可以产生破坏牙周组织IL-1，PGE2、TNF-α等细胞因子，相对于健康的牙周组织，这些细胞因子的量在牙周破坏处有显著地增加[8-14]。这些细胞因子反应出现在牙周组织的破坏过程中，其产物包括参与炎症反应的酶和介导因子的基质金属蛋白酶和前列腺素。此外，消炎因子直接或者间接地通过RNAKL-依赖性和非依赖行通路活化破骨细胞，从而导致了不可逆的骨组织破坏[15，16]。具有高度特异性识别系统固有免疫是防御病原体入侵的第一道防线[17]。固有的免疫细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞可以表达一系列的Toll-样受体，它们能够相互联合形成高度特异性表达相关联的分子系统。重要的是，从革兰氏阴性菌提取的脂多糖通过CD14和Toll样受体(主要是TLR-2和TLR-4受体)的结合引发严重的炎症反应。脂多糖识别TLR-4后，固有免疫细胞介导细胞因子的产生，引发一系列精细的信号传导通路后，宿主即产生的适应性的免疫反应[5，6]。牙周组织发生急性炎症的时候，TLR-2和TLR-4的表达会增加，表明了这些受体的增加会影响细胞因子的表达能力[18]。TLR-4通路活化MyD88-依赖性通路后IRAK、TRAF6通路随即活化，最终具有细胞因子诱导功能的核因子(NF-κB)被激活。而且，TRAF6通路在不同蛋白受体的补充和/或需要细胞因子mRNA转录和mRNA的稳定的各种通路的流通过程中，例如ERK1/2，JNK和p38是必需的[19，20]。
通常来说，临床上获得牙周组织再生的关键在于屏障膜的使用，这种屏障膜的作用是组织牙龈和上皮细胞在根面的定植，并且给牙周膜组织的再生留有一定的空间[21]。这种引导性组织再生的理论有利于组织结合上皮的重建，但是它并不能引导能促进牙槽骨再生细胞的增殖[22]。想获得牙周组织再生必须把一些关键的因素联合起来。骨髓基质干细胞和牙周成纤维细胞是能使丧失的牙周组织再生的两种细胞。此外，需要有血供和一定机械强度的支架来为组织形成提供营养源和模板[23，24]。我们已经使用了一些牙周组织再生和牙周组织工程的方法来克服常规方法的缺陷。细胞来源、支架制造方法以及生长因子和基因的方法得到了改善。牙周膜和其他牙支持组织的再生可以通过一些以支架材料为基础方法来实现。结合了自体牙蕾细胞的凝胶-软骨素-透明质酸酶支架在猪体内诱导了牙的形成，而且产生有规则的牙周组织有33％的成功率。在另外一个研究中，人牙周膜细胞植在多孔的纳米微晶的羟磷灰石/壳聚糖支架上产生了相互连接向内生长的微管组织。壳聚糖/胶原支架与TGF-1基因和人牙周膜细胞结合获得了理想的牙周膜组织的再生。这种支架和TGF-1L联合的方法与单纯的支架相比人牙周膜细胞获得了显著地增殖[25]。最近一些研究转向了对生物活性生长因子释放来增加牙周组织的形成的研究，这种基质可以精细的控制因子的释放来为牙周组织损伤的恢复提供方法。例如，磷酸三钙中释放的PDGF可以促进有牙周局部损坏患者VEGF的生成[26]。在体外右旋糖苷-凝胶微球中IGF-1的释放导致了新骨组织、牙骨质和牙周膜的新生。生长因子在牙周修复再生过程中的作用已经引起了广泛的关注，由于天然生长因子来源有限，因此有大量的实验在研究外源性生长因子的作用和功能。研究表明多种生长因子可以调节牙周相关细胞的增殖、趋化、分化和细胞外基质的生物合成，能明显促进牙周组织的再生和修复。然而，外源性生长因子半衰期短，局部使用很快被稀释和代谢或因为体内酶的作用而失活，只有借助合适的载体才能使生长因子持续高效发挥作用，更好地促进组织再生。
综上所述，现有文献的报导中，尚未有关于本发明中所述的结合生物可降解纳米结构膜片，并以生长因子控释的方式对牙周组织炎症和再生，分段进行抑制和诱导，以实现促牙周组织再生的相关研究报道。
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本发明的目的在于提供一种生物可降解促牙周组织再生膜片的制备方法。
本发明提出的生物可降解促牙周组织再生膜片的制备方法，将聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、胶原(collagen)或改性壳聚糖(chitosan)中的一至几种，溶于极性、易挥发有机溶剂中，控制溶液的浓度为8-25wt％，通过静电纺丝方法，制得具有纳米结构的生物可降解材料薄膜；将所得生物可降解材料薄膜通过超分子静电自组装吸附，将对ERK/P38细胞通路具有抑制作用和促进牙周骨组织再生的生长因子分别负载至高分子材料薄膜上，经真空干燥，灭菌包装后，即得所需产品；其中：静电纺丝方法所施加直流高压范围为：0.5-50KV；喷丝头距离收集装置的距离为：5-100cm。
本发明中，用于静电纺丝的聚合物溶液，随所加入的聚合物、聚合物混合物的不同，及其分子量的不同，溶液体系的粘稠度也有所不同。具体以可通过静电场引力成丝为宜。
本发明中，所述极性、易挥发溶剂采用氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇、六氟丙醇、乙酸乙酯或丙酮中的一种或几种的混合物。
本发明中，所述超分子负载技术，是指静电层层自组装方法，该方法基于大分子间的弱相互作用力(静电吸引力、范德化力、氢键等)，实现对生物大分子和聚电解质的有序组装，除可保持生物大分子的生物活性和空间结构外，还可在各种具有复杂空间构型的材料表面上实现。
本发明中，所述一类生长因子为对细胞ERK/P38细胞通路具有抑制作用的小分子化合物或抑制剂。采用：SB203580(p38细胞通路抑制剂)，PD98059(ERK细胞通路抑制剂)，但并不仅仅限于此两例。
本发明中，所述另一类生长因子为对牙周骨组织再生具有诱导作用的小分子化合物或多肽序列，包括如：骨形成蛋白(BMP)、血小板衍生性生长因子(PDGF)，但并不仅仅限于此两例。
本发明的优点：该生物可降解促牙周组织再生膜片具有良好的生物相容性和体内降解性，更重要的是通过对所负载生长因子的分时、分型控释，可实现分段抑制P38、ERK通路(抑制炎症)和诱导激活牙周组织再生。
附图说明
图1为实施例1中PCL静电纺丝后制得的生物可降解膜片的扫描电镜(SEM)照片。
图2为实施例2中PLGA静电纺丝后制得的生物可降解膜片的扫描电镜(SEM)照片。
图3为实施例3中PLGA∶COLLAGEN＝2∶1静电纺丝后制得的生物可降解膜片的扫描电镜(SEM)照片。

下面通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
采用PCL为原料，溶解于氯仿中，制成浓度为15％(wt)的溶液。将此混合物溶液加入到通过注射泵控制的静电纺丝注射器中，设定高压发生器的电压为10KV，收集距离为15cm，可以获得由纳米尺度直径的超细纤维无规组成的薄膜，然后将此薄膜用去离子水洗涤多次后真空干燥后待用。先将此薄膜浸入聚乙烯亚胺(PEI，1-3mg/ml)溶液中，浸泡5-10分钟，然后用pH＝7.0的去离子水洗涤。再将BMP-2和PDGF制成0.1-10μg/ml浓度的溶液，把薄膜置于此溶液中浸泡10-30分钟进行吸附，然后用pH＝7.0的去离子水洗涤。然后依次浸入聚烯丙基胺(PAH，3mg/ml)和聚丙烯酸(PAA，3mg/ml)溶液中，循环3-4次，每次沉积后均用去离子水洗脱。接下来，将P38抑制剂(SB203580)和ERK抑制剂(PD98059)溶解于二甲亚砜(DMSO)中形成0.1-15μg/ml浓度的溶液。将前面经过处理的膜片置于该溶液中浸泡15-20分钟。然后用乙醇洗脱随后用氮气气流干燥。即得到可降解促牙周组织再生膜片。
从图1中可以看出，PCL通过静电纺丝工艺形成了纳米纤维结构，PCL纤维直径从几个微米到几百纳米。且纤维组成的薄膜结构具有多孔特性，可以为生长因子负载提供有效空间。
实施例2
采用PLGA为原料，溶解于氯仿中，制成浓度为20％(wt)的溶液。将此混合物溶液加入到通过注射泵控制的静电纺丝注射器中，设定高压发生器的电压为20KV，收集距离为20cm，可以获得由纳米尺度直径的超细纤维无规组成的薄膜，然后将此薄膜用去离子水洗涤多次后真空干燥后待用。先将此薄膜浸入聚乙烯亚胺(PEI，1-3mg/ml)溶液中，浸泡5-10分钟，然后用pH＝7.0的去离子水洗涤。再将BMP-2和PDGF制成0.1-10μg/ml浓度的溶液，把薄膜置于此溶液中浸泡10-30分钟进行吸附，然后用pH＝7.0的去离子水洗涤。然后依次浸入聚烯丙基胺(PAH，3mg/ml)和聚丙烯酸(PAA，3mg/ml)溶液中，循环3-4次，每次沉积后均用去离子水洗脱。接下来，将P38抑制剂(SB203580)和ERK抑制剂(PD98059)溶解于二甲亚砜(DMSO)中形成0.1-15μg/ml浓度的溶液。将前面经过处理的膜片置于该溶液中浸泡15-20分钟。然后用乙醇洗脱随后用氮气气流干燥。即得到可降解促牙周组织再生膜片。
从图2中可以看出，PLGA通过静电纺丝工艺形成了超细纤维结构，PLGA纤维直径主要分布在微米级别。PLGA超细纤维组成多孔、无规的薄膜结构。
实施例3
采用PLGA和胶原蛋白(collagen)为原料(2∶1)，溶解于六氟丙醇中，制成浓度为10％(wt)的溶液。将此混合物溶液加入到通过注射泵控制的静电纺丝注射器中，设定高压发生器的电压为15KV，收集距离为15cm，可以获得由纳米尺度直径的超细纤维无规组成的薄膜，然后将此薄膜用去离子水洗涤多次后真空干燥后待用。将BMP-2和PDGF制成0.1-10μg/ml浓度的溶液，把薄膜置于此溶液中浸泡10-30分钟进行吸附，然后用pH＝7.0的去离子水洗涤。然后依次浸入聚烯丙基胺(PAH，3mg/ml)和聚丙烯酸(PAA，3mg/ml)溶液中，循环3-4次，每次沉积后均用去离子水洗脱。接下来，将P38抑制剂(SB203580)和ERK抑制剂(PD98059)溶解于二甲亚砜(DMSO)中形成0.1-15μg/ml浓度的溶液。将前面经过处理的膜片置于该溶液中浸泡15-20分钟。然后用乙醇洗脱随后用氮气气流干燥。即得到可降解促牙周组织再生膜片。
从图3中可以看出，PLGA/胶原蛋白共混液通过静电纺丝工艺形成了微米级的超细纤维，且具有多孔、无规的薄膜结构，可为生长因子负载和细胞黏附提供有利条件。
实施例4
采用PCL和改性壳聚糖(chitosan)为原料(1∶1)，溶解于六氟丙醇中，制成浓度为15％(wt)的溶液。将此混合物溶液加入到通过注射泵控制的静电纺丝注射器中，设定高压发生器的电压为15KV，收集距离为10cm，可以获得由纳米尺度直径的超细纤维无规组成的薄膜，然后将此薄膜用去离子水洗涤多次后真空干燥后待用。将BMP-2和PDGF制成0.1-10μg/ml浓度的溶液，把薄膜置于此溶液中浸泡10-30分钟进行吸附，然后用pH＝7.0的去离子水洗涤。然后依次浸入聚烯丙基胺(PAH，3mg/ml)和聚丙烯酸(PAA，3mg/ml)溶液中，循环3-4次，每次沉积后均用去离子水洗脱。接下来，将P38抑制剂(SB203580)和ERK抑制剂(PD98059)溶解于二甲亚砜(DMSO)中形成0.1-15μg/ml浓度的溶液。将前面经过处理的膜片置于该溶液中浸泡15-20分钟。然后用乙醇洗脱随后用氮气气流干燥。即得到可降解促牙周组织再生膜片。