一种多肽及其皮肤修复功能的应用
阅读：37发布：2023-03-09
专利汇可以提供一种多肽及其皮肤修复功能的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于多肽应用领域，特别是 皮肤 修复多肽应用领域，具体涉及一种多肽及其皮肤修复功能的应用。本研究发现一种新型多肽，将其命名为：ZKSA-P-1001。进一步研究发现ZKSA-P-1001 稳定性 良好，具有较好的促皮肤 伤口愈合 能 力 。ZKSA-P-1001可用于具有修复皮肤功能的药品、术后医疗器械、保健品、 化妆品 等的生产原料或辅料。，下面是一种多肽及其皮肤修复功能的应用专利的具体信息内容。
1.一种分离的多肽，其包括：(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸组成的多肽；(b)或在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码如权利要求1所述的多肽。
3.一种重组表达载体，包含如权利要求2所述的分离的多核苷酸。
4.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求3所述重组表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求2所述分离的多核苷酸。
5.如权利要求1所述的多肽的制备方法，选自以下之任一：
(1)利用化学合成方法合成所述多肽；(2)在合适的条件下培养如权利要求4所述宿主细胞并使其表达所述多肽，而后分离及纯化获得所述多肽。
6.如权利要求1所述多肽的用途，所述用途选自以下之任一：(1)所述多肽在制备皮肤成纤维细胞增殖促进剂中的用途；(2)所述多肽在制备血管内皮细胞增殖促进剂中的用途；
(3)所述多肽在制备血管内皮细胞迁移促进剂中的用途；(4)所述多肽在制备皮肤浅皮层或皮肤真皮层损伤修复促进剂中的用途；(5)所述多肽在制备皮肤伤口愈合促进药物中的用途；(6)所述多肽在制备皮肤缺损和难愈性皮肤溃疡治疗药物中的用途；(7)所述多肽在制备外伤皮肤受损治疗药物中的用途。
7.如权利要求1所述多肽在制备皮肤修复药物、皮肤修复术后医疗器械、皮肤修复保健品或皮肤修复化妆品中的用途。
8.一种药物组合物，包括有效成分以及药学上可接受的载体，所述有效成分含有如权利要求1所述多肽。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述多肽作为有效成分起到以下之任一的作用：(1)促进皮肤成纤维细胞增殖；(2)促进血管内皮细胞增殖；(3)促进血管内皮细胞迁移；(4)促进皮肤浅皮层或皮肤真皮层损伤的修复；(5)促进皮肤伤口愈合；(6)治疗外伤皮肤受损；(7)修复皮肤损伤。
10.一种皮肤修复产品，其有效成分含有如权利要求1所述多肽，所述产品为术后医疗器械、保健品或化妆品。
一种多肽及其皮肤修复功能的应用
技术领域
[0001] 本发明属于多肽应用领域，特别是皮肤修复多肽应用领域，具体涉及一种多肽及其皮肤修复功能的应用。
背景技术
[0002] 皮肤是机体与外界接触的第一道屏障，是机体免于脱水、损伤、感染的第一道防线，是维持内环境稳定和阻止微生物、化学物质等侵入的屏障。炎症、溃疡、严重烧伤、创伤、肿瘤术后以及先天性畸形等多种急慢性损伤引起的大面积皮肤缺损和难愈性皮肤溃疡，引发许多局部与全身各系统的变化，细菌极易入侵繁殖，可引起水电解质紊乱、败血症休克、高代谢反应、多脏器功能衰竭等，从而使机体不能维持正常的自稳状态，甚至导致死亡。具报道，约有15％的老年人遭受慢性皮肤创伤的困扰。就美国而言，每年用于老年患者创伤修复方面的费用就高达250亿美元。所有溃疡中约15-27％最终需外科手术截骨，但各国的比例略有不同。慢性皮肤溃疡的预后很差，由于该病慢性迁延、难以治愈且消耗甚大，给患者造成了很大的心理压力，严重影响患者的身体状况及生活质量，慢性皮肤溃疡的治疗已引起了国内外学者的广泛关注。因此，开发出安全、低毒、低成本低、高效的促皮肤愈合药物，降低其发病率和致残率，提高患者生活质量，已成为当前医药企业和科研工作者亟待解决的问题。
[0003] 在人体各组织器官的修复愈合中，皮肤创伤修复是最基本的模型。此外，皮肤创伤愈合是一个非常复杂的生物学过程，是皮肤中多种类型细胞、细胞因子和细胞外基质之间复杂相互作用的动态过程，是一种复杂而连续的分子、细胞、组织和整体之间的多层次反应过程。涉及到血液凝固、炎症的发生与发展、基质的合成、血管再生，纤维组织增生、再上皮化，创口收缩、组织重构等。可以把皮肤创伤愈合大致可分为以下几个过程：血凝期、炎症期、增殖期、组织重构四个相互重叠的时期，包括细胞的增殖、分化、上皮化、迁移及基质的合成与沉积。
[0004] 已有许多研究表明，两栖动物含有促进皮肤修复的多肽，这些多肽能促进动物皮肤的快速愈合，从而达到伤口修复愈合的目的。
发明内容
[0005] 鉴于现有技术中的情况，本发明的目的在于提供一种多肽及其皮肤修复功能的应用。
[0006] 为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，其包括：
[0008] (a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸组成的多肽；
[0009] (b)或在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的多肽。
[0010] 优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：RWRFKWKK，亦即：Arg-Trp-Arg-Phe-Lys-Trp-Lys-Lys。
[0011] 本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码前述多肽。
[0012] 本发明的编码前述多肽的多核苷酸，可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
[0013] 本发明的编码所述多肽的多核苷酸，可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法。
[0014] 本发明的第三方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含前述分离的多核苷酸。
[0015] 本领域技术人员熟知的方法能用于构建所述重组表达载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。将编码所述多肽的多核苷酸有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达多肽，或者用于同源重组。
[0016] 本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有前述重组表达载体或基因组中整合有外源的前述分离的多核苷酸。
[0017] 本发明的第五方面，提供前述多肽的制备方法，选择以下之任一：
[0018] (1)利用化学合成方法合成所述多肽；
[0019] (2)在合适的条件下培养前述宿主细胞并使其表达所述多肽，而后分离及纯化获得所述多肽。
[0020] 本发明的第六方面，提供前述多肽在制备皮肤成纤维细胞增殖促进剂中的用途。
[0021] 优选地，所述多肽为该促进剂的唯一有效成分或有效成分之一。
[0022] 本发明的第七方面，提供前述多肽在制备血管内皮细胞增殖促进剂中的用途。
[0023] 优选地，所述多肽为该促进剂的唯一有效成分或有效成分之一。
[0024] 本发明的第八方面，提供前述多肽在制备血管内皮细胞迁移促进剂中的用途。
[0025] 优选地，所述多肽为该促进剂的唯一有效成分或有效成分之一。
[0026] 本发明的第九方面，提供前述多肽在制备皮肤浅皮层或皮肤真皮层损伤修复促进剂中的用途。
[0027] 优选地，所述多肽为该促进剂的唯一有效成分或有效成分之一。
[0028] 本发明的第十方面，提供前述多肽在制备皮肤伤口愈合促进药物中的用途。
[0029] 优选地，所述多肽为该药物的唯一有效成分或有效成分之一。
[0030] 进一步地，所述皮肤伤口可以是皮肤创伤，进一步可以是浅皮层创伤或真皮层创伤。
[0031] 本发明的第十一方面，提供前述多肽在制备皮肤缺损和难愈性皮肤溃疡治疗药物中的用途。
[0032] 优选地，所述多肽为该药物组合物的唯一有效成分或有效成分之一。
[0033] 进一步地，所述皮肤缺损和难愈性皮肤溃疡可以是炎症、溃疡、严重烧伤、创伤、肿瘤术后以及先天性畸形等多种急慢性损伤引起的大面积的皮肤缺损和难愈性皮肤溃疡。
[0034] 本发明的第十二方面，提供前述多肽在制备外伤皮肤受损治疗药物中的用途。
[0035] 优选地，所述多肽为该药物的唯一有效成分或有效成分之一。
[0036] 本发明的第十三方面，提供前述多肽在制备皮肤修复药物、皮肤修复术后医疗器械、皮肤修复术后用品、皮肤修复保健品或皮肤修复化妆品中的用途。
[0037] 优选地，所述多肽为该药物、术后医疗器械、保健品或化妆品的唯一有效成分或有效成分之一。
[0038] 本发明的第十四方面，提供一种药物组合物，包括有效成分及药学上可接受的载体，所述有效成分含有前述多肽。
[0039] 优选地，所述多肽为该药物组合物的唯一有效成分或有效成分之一。
[0040] 所述多肽作为有效成分起到以下之任一的作用：
[0041] (1)促进皮肤成纤维细胞增殖；(2)促进血管内皮细胞增殖；(3)促进血管内皮细胞迁移；(4)促进皮肤浅皮层或皮肤真皮层损伤的修复；(5)促进皮肤伤口愈合；(6)治疗外伤皮肤受损；(7)修复皮肤损伤。
[0042] 药学上可接受的载体为各种药学上常用的辅料和/或赋形剂，包括(但不限于)糖类(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)，淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉)，纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素)，黄蓍胶粉末，麦芽，明胶，滑石，固体润滑剂(如硬脂酸和硬脂酸镁)，硫酸钙，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油，多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)，海藻酸，乳化剂(如Tween、聚氧乙烯蓖麻油)，润湿剂(如月桂基硫酸钠)，着色剂，调味剂，压片剂、稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，无热原水，等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等；该载体可根据需要提高配方的稳定性、活性及生物有效性等。
[0043] 本发明药物组合物使用时，所述多肽作为唯一有效成分，或者所述多肽作为有效成分之一，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型。
[0044] 优选地，所述药物组合物的制剂形式为片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末，或者栓剂。上述制剂类型可以按照药剂学(第六版，人民卫生出版社，崔福德)中的相关定义理解，上述制剂的制备可以按照药剂学(第六版，人民卫生出版社，崔福德)中的相关制剂的方法配制。
[0045] 所述多肽作为活性成分的有效剂量可随给药模式和疾病的严重程度而变化。具体的给药剂量均在本领域医师技能范围内。
[0046] 本发明的第十五方面，提供一种皮肤修复产品，其有效成分含有前述多肽。
[0047] 进一步地，所述产品可以是术后医疗器械、保健品，也可以是化妆品。
[0048] 例如，所述术后医疗器械可以是缝合针，使用时，可将前述多肽作为有效成分涂抹于缝合针上。
[0049] 优选地，所述多肽为该产品的唯一有效成分或有效成分之一。
[0050] 本发明的第十六方面，提供一种治疗皮肤疾病的方法，包括步骤：将本发明第一方面的多肽作为有效成分施用于皮肤。
[0051] 所述多肽作为有效成分起到以下之任一的作用：
[0052] (1)促进皮肤成纤维细胞增殖；(2)促进血管内皮细胞增殖；(3)促进血管内皮细胞迁移；(4)促进皮肤浅皮层或皮肤真皮层损伤的修复；(5)促进皮肤伤口愈合；(6)治疗外伤皮肤受损；(7)修复皮肤损伤。
[0053] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0054] 本研究发现一种新型多肽，将其命名为：ZKSA-P-1001。进一步研究发现ZKSA-P-1001稳定性良好，具有较好的促皮肤伤口愈合能力。ZKSA-P-1001可用于具有修复皮肤功能的药品、术后医疗器械、保健品、化妆品等的生产原料或辅料。
附图说明
附图说明
[0055] 图1为：ZKSA-P-1001样品促HSF和Huvec细胞增殖作用的柱状图。
[0056] 图2为：ZKSA-P-1001对Huvec细胞迁移活性的柱状图。
[0057] 图3为：ZKSA-P-1001对Huvec细胞迁移活性的细胞划痕图。
[0058] 图4为：ZKSA-P-1001和EGF对小鼠创伤动物模型的促创伤愈合效果的柱状图。
[0059] 图5为：ZKSA-P-1001和EGF对小鼠创伤动物模型的创面愈合图。
具体实施方式
[0060] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0061] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0062] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0063] 实施例1 ZKSA-P-1001样品促皮肤成纤维HSF细胞增殖作用的影响
[0064] 首先采用现有技术体外合成一种多肽，其氨基酸序列为：RWRFKWKK(SEQ ID NO.1)，Arg-Trp-Arg-Phe-Lys-Trp-Lys-Lys(SEQ ID NO.1)，将其命名为：ZKSA-P-1001，纯度为：97.96％。所以，本发明所提到的ZKSA-P-1001均是指氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。
[0065] 接下来采用细胞增殖活性检验试验-MTS法考察ZKSA-P-1001对皮肤成纤维HSF细胞增殖作用的影响。
[0066] Day0：胰酶消化皮肤成纤维HSF细胞并计数，稀释细胞悬液至1×105个/mL左右，细胞接种于96孔板中，每孔100μL细胞悬液，培养箱过夜培养细胞贴壁；
[0067] Day1：ZKSA-P-1001样品称量粉末后用PBS溶解配成10mg/mL母液待用；对96孔板中贴壁细胞加ZKSA-P-1001处理，继续放培养箱培养24h；
[0068] Day2：培养24h，每孔加20μL MTS试剂，避光37℃孵育1h左右，酶标仪490nm读数，处理数据。
[0069] 设置4个重复，使用MTS方法检测细胞生长情况，结果数据使用T-test分析差异显著性，每次重复结果均一致。ZKSA-P-1001用DNEM完全培养液溶解，再提高浓度进行验证是否有高浓度抑制现象存在。此次试验排除了PBS作为溶剂对培养液造成的稀释。但24h的MTS结果显示ZKSA-P-1001样品浓度高于2mg/mL时对细胞增殖表现出一定的抑制效应。如图1所示，ZKSA-P-1001对皮肤成纤维HSF细胞增殖实验结果表明，ZKSA-P-1001在500-2000ug/mL浓度时作用于皮肤成纤维HSF细胞24h能显著促进细胞增殖。
[0070] 实施例2 ZKSA-P-1001样品促人脐静脉Huvec细胞增殖作用的影响
[0071] 采用细胞增殖活性检验试验-MTS法考察ZKSA-P-1001对人脐静脉Huvec细胞增殖作用的影响。
[0072] Day0：胰酶消化人脐静脉Huvec细胞并计数，稀释细胞悬液至1×105个/mL左右，细胞接种于96孔板中，每孔100μL细胞悬液，培养箱过夜培养细胞贴壁；
[0073] Day1：ZKSA-P-1001样品称量粉末后用PBS溶解配成10mg/mL母液待用；对96孔板中贴壁细胞加ZKSA-P-1001处理，继续放培养箱培养24h；
[0074] Day2：培养24h，每孔加20μLMTS试剂，避光37℃孵育1h左右，酶标仪490nm读数，处理数据。
[0075] 设置4个重复，使用MTS方法检测细胞生长情况，结果数据使用T-test分析差异显著性，每次重复结果均一致。ZKSA-P-1001用M200完全培养液溶解，再提高浓度进行验证是否有高浓度抑制现象存在。设置4个重复，使用MTS方法检测细胞生长情况，结果数据使用T-test分析差异显著性，每次重复结果均一致。此次试验排除了PBS作为溶剂对培养液造成的稀释，MTS结果显示(如图1)ZKSA-P-1001在500-2000μg/mL浓度时作用于人脐静脉Huvec细胞24h能显著促进细胞增殖。
[0076] 实施例3 ZKSA-P-1001对人脐静脉Huvec细胞迁移活性的影响
[0077] 本实施例考察ZKSA-P-1001对人脐静脉Huvec细胞迁移活性的影响：
[0078] Day0：胰酶消化人脐静脉Huvec细胞并计数，稀释细胞悬液至1×105个/mL左右，将细胞接种于12孔板中，培养箱过夜培养细胞贴壁，培养至细胞完全铺满板底；
[0079] Day2-3：显微镜下观察细胞基本铺板底时，用200μL黄色无菌枪头在每个试验孔中中央处置与培养孔自上而下画线；弃培养液，用PBS吹洗两次以出去划痕产生的细胞团；称量ZKSA-P-1001样品，用PBS溶解成母液10mg/mL待用。对照组加入新鲜培养液，实验组加入不同浓度的ZKSA-P-1001；16h观察拍照。
[0080] 划痕修复率(％)＝(0小时划痕面积-16h划痕面积)/0小时划痕面积×100[0081] 设置4个重复，结果数据使用T-test分析差异显著性，每次重复结果均一致。ZKSA-P-1001对人脐静脉Huvec细胞划线实验结果表明(如图2和图3所示)，划线后的细胞在完全培养液或无血清培养液条件下，跟对照组相比，ZKSA-P-1001浓度为500和1000ug/mL时，人脐静脉16h Huvec细胞发生较明显迁移。
[0082] 实施例4 ZKSA-P-1001对小鼠全皮层创伤愈合的影响
[0083] 制备皮肤创伤模型：
[0084] 用1％戊巴比妥钠(1mg/100mL)腹腔麻醉小鼠；剔除背部毛，用碘伏消毒在小鼠背部近臀侧左右两侧各开等大等圆创口(去除全层皮肤)，单只分笼饲养；损伤模型建立后，用无菌纱布清理创口；将小鼠分为两组，ZKSA-P-1001和上表皮生长因子EGF组(阳性对照组)；ZKSA-P-1001和PBS组；每只小鼠左侧创口滴加ZKSA-P-1001样品(浓度500μg/mL，用量20μL)；EGF组小鼠右侧创口滴加EGF(浓度100μg/mL，用量20μL)，PBS组小鼠右侧创口滴加PBS(用量20μL)，自然暴露创口，每天上午、下午各用药1次，并观察记录创口愈合情况。分别在创伤后第0～8天，拍照记录创面变化情况，如图5所示；创面的面积大小用Image J软件进行分析计算。将术后记录的创面面积与0天进行比较后得到百分比值绘制成柱状图，结果如图
4所示。伤口愈合的比率用以下公式计算：
4所示。伤口愈合的比率用以下公式计算：
[0085] The Residual wond area(％)＝[R(2～8)/R(0)]x100
[0086] R(0)代表术后0天的创伤面积；R(2～8)代表术后2～8天的创伤面积
[0087] 结果显示，在小鼠的整个创伤愈合实验过程中未观察到有任何生理或行为的异常。从全皮层缺损小鼠创伤愈合实验中我们发现，创口局部涂抹ZKSA-P-1001的创面较PBS组的创面愈合速度明显加快，伤口收缩显著，从图4和图5中我们可以看到，跟对照PBS处理的创口相比，ZKSA-P-1001和EGF给药的创面在术后第三天就表现出较为明显的收缩，差异有显著性，且局部应用ZKSA-P-1001的创面在术后四天较涂抹阳性对照EGF的创面有明显收缩。通过连续三次小鼠的创伤修复过程观察，我们认为，ZKSA-P-1001能够显著促进小鼠全皮层缺损创伤的修复，且和阳性对照EGF相比，表现出更为良好的促愈合能力。
[0088] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
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