技术领域
[0001] 本
发明属于
微生物培养、生物催化及生物医药制备领域，具体涉及催化柚皮苷酯合成反应的细菌细胞催化剂的制备方法。
背景技术
[0002] 黄
酮类化合物是两个苯环通过三个
碳原子相互连接而形成的一系列重要的多酚类化合物，广泛存在于几乎所有的
植物,尤其是蔬菜和
水果；在医药、食品和
化妆品上有很大的应用价值。黄酮有多种生物活性包括抗
氧化活性,抗炎,抗癌的,抗菌,抗过敏,和抗病毒等，然而,由于其多羟基结构的特点，大部分黄酮生物活性受限于其低脂溶性或
水溶性。位于苯环或配糖体骨架上的羟基对黄酮的生物和化学活性有重要的影响。黄酮的酯化被认为一种很有前景的方法用于提高黄酮的
溶解度,从而使黄酮展示出更多的生理活性。已有研究表明,有选择地修饰黄酮类化合物结构不仅可以提高物理化学属性,例如,热
稳定性和光阻系数;而且增强其生物活性,如抗氧化活性;抗菌活性;细胞渗透能
力;减肥和降血脂功能等。柚皮苷又名柚苷、异橙皮苷、柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一种双氢黄酮类化合物，主要存在于芸香科植物葡萄柚、橘、橙的
果皮和果肉中，也是骨碎补、枳实、枳壳、化橘红等中药的主要有效成分之一。 柚皮苷具有促进骨骼生长、抗氧化、降胆固醇与降血脂、抗
肿瘤、提高其他药物的生物利用度等作用。
[0003] 目前黄酮酯类衍生物的合成均采用化学催化剂或者离体酶催化剂。由于黄酮的苯环或糖环上羟基众多，且反应活性相似，采用化学催化剂时存在的主要问题是反应区域选择性很低，易产生大量的副产物及含
碱废液，对环境造成严重污染。酶催化剂较之化学催化剂更为绿色，且区域选择性高，反应条件温和，但是由于酶的分离纯化过程复杂且在此过程中酶活性有部分损失，在立体环境中不稳定，易失活等缺点，且酶的价格昂贵，造成酶法反应成本较高，这些方面均严重制约了其在工业化的应用。因此，研究开发新型绿色催化剂用于黄酮酯的制备具有重大的现实意义。
发明内容
[0004] 本发明针对现有用于柚皮苷酯合成的催化剂的不足，提供一种催化柚皮苷酯合成反应的细菌细胞催化剂的制备方法。其制备方法简单易操作，原材料价廉易购买，不涉及酶的分离纯化。用本法制备的可催化柚皮苷酯合成反应的细胞催化剂，可选择性催化合成柚皮苷6’’-单酯，其区域选择性达到97%以上，克服了传统化学方法的选择性低导致底物利用率低，产物纯度低，易生成副产物等缺点。同为绿色，反应条件温和的生物催化剂，细胞催化剂较之离体酶催化剂具有稳定性高，价廉、易获取的优点。
[0005] 本发明目的通过以下技术方案来实现：一种催化柚皮苷酯合成反应的细菌细胞催化剂的制备方法，包括以下步骤：
1）将细菌
种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，接种量为0.5%~20%（v/v），培养条件为30℃~50℃，培养时间为12~144h；
2）离心后收集菌体，蒸馏水洗涤两次，经
真空冷冻干燥12h-36h，
收获菌体干粉，即为细菌细胞催化剂。
[0006] 上述方法中，所述细菌包括施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri 或
铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 。
[0007] 上述方法中，所述液体培养基成分为：0. 5~100 g/L产酶诱导剂，0.5~50 g/L有机氮源，0.5 ~10 g/L MgSO4•7H2O， 5 g/L (NH4)2SO4，1 g/L K2HPO4。
[0008] 上述方法中，所述产酶诱导剂包括糖类化合物、饱和
植物油脂、不饱和植物油脂、
脂肪酸、Tween系列或Span系列中的一种或两种。
[0009] 上述方法中，所述有机氮源包括
牛肉膏、
酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨、干酪素、酸
水解酪蛋白胨或无
氨基酵母膏中的一种或两种。
[0010] 本发明所用细菌公众可以从菌种中心购买或自己筛选得到。
[0011] 本发明与现有的技术相比具有如下的优点：1.细菌细胞催化剂为生物催化剂，较之化学催化剂反应条件温和、环境友好，区域选择性高，选择性合成柚皮苷的6’’-单酯，其区域选择性在90%以上，从而克服了传统化学方法产物纯度低，易生成副产物等缺点。
[0012] 2. 细菌细胞催化剂营养要求很低，容易培养，培养基配方简单，制备易操作，制备成本低。
具体实施方式
[0013] 为更好理解本发明，下面结合
实施例对本发明做进一步地详细说明，需要说明的是，这些实施例并不构成对本发明保护范围的限制。
[0014] 实施例1将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：0.5 g/L
大豆油， 0.5 g/L 酵母膏，0.5 g/L MgSO4•7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为7.0。培养60h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于柚皮苷与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-柚皮苷丙酯区域选择性为98.7%。
[0015] 本发明方法得到的催化剂的区域选择性以柚皮苷与丙酸乙烯酯区域选择性酰化反应进行测定，反应条件为在2mL的柚皮苷酯化反应体系中添加80mg的菌体干粉作为催化剂，以65.8μl丙酸乙烯酯作为酰基供体，柚皮苷用量为17.4mg，反应体系为90% ( v/v）乙腈-叔戊醇，反应
温度为40℃，振荡速度180rpm，常压下反应。反应区域选择性表征为：6’-柚皮苷丙酯的产量/黄酮酯的总产量。
[0016] 实施例2将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为50℃，液体培养基成分为：0.5 g/L Tween 80，
0.5 g/L 酵母膏，0.5 g/L MgSO4•7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为7.0。培养
60h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于柚皮苷与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-柚皮苷丙酯区域选择性为97.7%。
[0017] 实施例3将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为20%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：50 g/L Tween 80， 10 g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4•7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养48h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于柚皮苷与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-柚皮苷丙酯区域选择性为98.2%。
[0018] 实施例4将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：0.5 g/L Tween 80，
0.5 g/L 酵母膏，0.5 g/L MgSO4•7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养
12h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于柚皮苷与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-柚皮苷丙酯区域选择性为98.4%。
[0019] 实施例5将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：0.5 g/L Tween 80，0.5 g/L 酵母膏，0.5 g/L MgSO4•7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养144h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于柚皮苷与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-柚皮苷丙酯区域选择性为99.1%。
[0020] 实施例6将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：0.5 g/L
葡萄糖，0.5 g/L 酵母膏，0.5 g/L MgSO4•7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养48h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于柚皮苷与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-柚皮苷丙酯区域选择性为99.2%。
[0021] 实施例7将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：0.5 g/L 大豆油，0.5 g/L 酵母膏，0.5 g/L MgSO4•7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养48h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于柚皮苷与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-柚皮苷丙酯区域选择性为98.9%。
[0022] 实施例8将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：0.5 g/L span60，0.5 g/L 酵母膏，0.5 g/L MgSO4•7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养48h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于柚皮苷与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-柚皮苷丙酯区域选择性为98.3%。
[0023] 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的
基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明
权利要求的保护
