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Toll样受体5激动剂stFla抗肺 纤维化的用途

阅读：843发布：2023-01-28

专利汇可以提供Toll样受体5激动剂stFla抗肺纤维化的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了抗Toll样受体5激动剂在制备治疗肺纤维化药物中的应用，优选的Toll样受体5激动剂选自stFla。纤维化是许多慢性疾病致残和致死的主要病理基础，严重威胁着人们的健康和生命。肺纤维化发病率和致死率呈不断上升趋势。本发明公开了Toll样受体(TLR)5激动剂，优选的Toll样受体5激动剂选自stFla，能显著降低博莱霉素诱导肺纤维化小鼠的死亡率；激活TLR5 信号通路，能够显著降低博莱霉素导致的肺部炎症反应，减轻博莱霉素导致的肺组织纤维化程度，包括降低肺部胶原沉积、羟脯氨酸含量及-SMA的表达。，下面是Toll样受体5激动剂stFla抗肺纤维化的用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.抗Toll样受体5激动剂在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的抗Toll样受体5激动剂选自stFla。

说明书全文

Toll样受体5激动剂stFla抗肺 纤维化的用途

技术领域

[0001] 本发明设计Toll样受体5激动剂stFla在治疗肺纤维化中的新用途，属于医药技术领域。

背景技术

[0002] 组织异常重构是导致器官功能衰竭的主要原因，而纤维化作为组织重构的重要病理表现之一，是当今临床许多疾病致残、致死的主要原因，严重威胁人们的健康和生命。肺纤维化(Pulmonary fibrosis)是多种肺间质性炎症疾病的主要病理改变，包括哮喘、慢性支气管炎、支气管扩张、肺结核、肺癌、间质性肺病等，其典型特征为过度纤维化组织替代功能性肺组织，导致肺功能受损。近年来肺纤维化发病率和致死率呈不断上升趋势。例如特发性肺纤维化临床诊断明确后平均生存时间仅为3到5年。肺纤维化的确切发病机制至今尚未完全阐明。但已有的研究结果表明，肺泡持续性损伤、细胞外基质反复破坏-修复、持续的炎症反应都是该疾病的重要影响因素。遗憾的是，对于肺纤维化这类预后差、致残率及死亡率高的慢性复杂疾病，至今还没有真正有效的药物问世。除2008年吡非尼酮在日本获准用于治疗特发性肺间质纤维化(对该药的效果美国FDA仍有质疑)外，还没有其它有效的药物和治疗方法。因此，深入研究肺纤维化的发生机制，并在此基础上发现新药靶、开发新药物迫在眉睫。

[0003] 博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型是迄今为止应用最广泛，与人类肺纤维化发生发展最为相似的动物模型。小鼠肺纤维化的诱导因素包括高浓度氧、石棉、二氧化硅、放射线等，但只有博莱霉素导致的肺部病变具有典型的间质性肺纤维化病理特征：早期为弥漫性肺泡炎，肺泡上皮损伤，肺泡单位结构紊乱，随后大量间质细胞增生，细胞外基质进行性聚集以致取代正常的肺组织结构，严重影响肺部功能。因此，使用博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型具备广泛的代表意义。

[0004] 模式识别受体家族成员Toll样受体(Toll-Like Receptors，TLRs)是先天免疫系统的重要组成部分，并且TLRs的活化信号影响着获得性免疫应答的方向。虽然目前未见TLRs与肺纤维化发生、发展的直接证据，但大量的研究报道TLRs与多种纤维化疾病有密切联系，例如本实验室前期研究发现，无论是敲除TLR2还是治疗性给予中和性TLR2抗体均可显著抑制肺脏抑制性免疫微环境的形成，降低博来霉素所致肺损伤、纤维化和动物死亡；治疗性给予TLR4激动剂可改善博来霉素或二氧化硅所致小鼠肺纤维化；预防性或治疗性给予TLR9激动剂能够显著改善单侧输尿管结扎导致的小鼠肾纤维化病变。

[0005] TLR5是Toll样受体家族的一员，表达于细胞表面，鞭毛蛋白是目前鉴定到的唯一的TLR5特异性配基。TLR5能够迅速识别鼠伤寒沙门菌、李斯特菌、铜绿假单胞菌等细菌表面的鞭毛蛋白而激活先天免疫应答。Gewirtz等首先发现预先给予鞭毛蛋白能够明显提高小鼠对口服化学制剂、细菌、轮状病毒以及辐射的抵抗力。stFla是来源于S.thyphimurium(鼠伤寒沙门菌)细胞壁鞭毛蛋白单体。与TLR4激动剂LPS不同，TLR5特异性配基stFla能够激发温和的先天免疫反应，在小鼠肿瘤模型上证实具有较强的肿瘤抑制活性。

发明内容

[0006] 针对肺纤维化危害严重及缺少临床有效药物和治疗方法的现状，本发明提供了一种新的技术方案，即利用Toll样受体5激动剂用于治疗肺纤维化。优选Toll样受体5激动剂选自stFla。

[0007] 本发明通过系统的研究发现对于C57BL/6小鼠经气管内注射博莱霉素(5U/Kg)造成肺纤维化模型，在造模后14天开始，腹腔注射stFla(5ug/kg/3day)至第35天。通过病理组织学及生化检测等方法分别分析和评价博莱霉素灌注小鼠肺部炎症、损伤和纤维化的改变，发现激活TLR5信号通路能显著降低博莱霉素灌注小鼠的死亡率；激活TLR5信号通路显著降低博莱霉素诱导的肺部炎症和损伤，减小博莱霉素所致肺纤维化，包括降低肺部胶原沉积、羟脯氨酸含量和α-SMA的表达。

[0008] 实验结果表明，TLR5激动剂stFla能抑制博莱霉素所致肺纤维化，改善肺纤维化小鼠的肺部炎症，大大降低其死亡率。

[0009] 术语及简称

[0010] BLM博莱霉素

[0011] TLR5Toll样受体5

[0012] α-SMAα平滑肌肌动蛋白附图说明

[0013] Sham：假手术组

[0014] BLM：模型组

[0015] stFla：TLR5激动剂stFla治疗组

[0016] 图1.治疗性给予TLR5激动剂stFla显著改善BLM诱导肺纤维化小鼠生存率。

[0017] 图2.stFla显著减轻BLM所致肺部炎症。

[0018] A，肺HE染色；B，肺部炎症评分。

[0019] 图3.stFla显著改善BLM诱导肺纤维化小鼠肺脏脏器指数

[0020] 图4.治疗性给予TLR5激动剂stFla显著降低BLM诱导肺纤维化小鼠肺部胶原沉积。

[0021] A，肺Masson染色；B，胶原沉积统计结果。

[0022] 图5.治疗性给予TLR5激动剂stFla显著降低BLM诱导肺纤维化小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量。

[0023] 图6.治疗性给予TLR5激动剂stFla显著降低BLM诱导肺纤维化小鼠肺部α-SMA蛋白的表达。

具体实施方式

[0024] 以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。

[0025] 实施例1

[0026] 【材料和方法】

[0027] 实验动物及主要试剂

[0028] SPF级C57BL/6小鼠(雄性，6～8周，16-18g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK(京)2008-0003。所有动物饲养于中国医学科学院药物研究所实验动物中心，恒温恒湿，自由饮食。所有动物实验经过中国医学科学院药物研究所动物管理协会批准进行。

[0029] 博莱霉素(Bleomycin，BLM)购自日本化药株式会社；stFla购自Invivogen公司；羟脯氨酸测定试剂盒购自江苏南京建成生物有限公司；α-SMA抗体购自Boster公司；Western Blot实验中所使用的ECL pluswestern blotting detection reagents购自Amersham BiosciencesInc.(Piscataway，NJ)。苏木素染色液，伊红试剂以及Masson三色染色试剂盒均购自福州迈新生物科技开发有限公司。

[0030] 肺纤维化动物模型(BLM致肺纤维化动物模型)

[0031] 雄性C57BL/6J(6-8周龄，18g)小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)麻醉。气管内注射BLM(5U/kg)，具体方案如下：以尽量小的创伤切开颈部皮肤，在弯头眼科镊的协助下，暴露气管，使用微量进样器穿刺气管，向气管内注入约50ul适量BLM，迅速地旋转并直立5分钟，以便使BLM均匀地进入左右肺叶。假手术组气管内注射等体积的生理盐水。造模后每日记录体重及动物的死亡情况，至第35天结束实验。

[0032] 肺纤维化动物实验分组设计

[0033] 实验共分为3组，每组20只小鼠，即假手术组(Sham)、模型组(BLM)及stFla治疗组(stFla)。BLM造模后第14天开始腹腔注射stFla(5ug/kg/3day)至BLM造模后第35天。假手术组和模型组给予等量的生理盐水。

[0034] 肺脏脏器系数测定

[0035] 肺指数能够反映肺部炎症及纤维化程度。于气管注射BLM造模35天后，隔夜禁食，称重，麻醉处死小鼠，称取肺脏重量并计算脏器系数(mg/g)。公式：肺指数(mg/g)＝肺重(mg)/体重(g)。

[0036] 病理切片和结果分析

[0037] 取动物右侧下叶肺组织，4％多聚甲醛固定后石蜡包埋，并在最大横截面积切片。分别通过苏木素-伊红(HE)和Masson染色观察炎症和纤维化状况。应用Spot Advanced
3.0获得高清晰的病理图片(200倍)，HE染色观察病理基本改变，并进行炎症评分。使用Image-Pro Plus 5.1分析Masson染色后胶原的着色面积和肺组织面积。使用Image-Pro Plus5.1测量出每个视野Masson染色后的胶原着色面积、视野下肺组织面积，以着色面积与视野肺组织面积比表示该组织胶原的相对含量。实验中每组分析10个标本，每个标本随机取10个视野，取均值代表一个动物胶原组织在肺组织内的相对含量和表达强度。通过非参数方差分析比较各组胶原面积。

[0038] 羟脯氨酸测定

[0039] 羟脯氨酸是胶原蛋白的特异性组成部分，在正常组织中含量极低。BLM所致肺纤维化实验中，检测动物左肺最大肺叶羟脯氨酸的含量，评价肺纤维化的情况。方法参照南京建成生物工程技术有限公司碱水解法测定组织羟脯氨酸含量试剂盒说明书。

[0040] Western Blot检测α-SMA的表达

[0041] 取冻存的小鼠肺脏组织，加入蛋白裂解缓冲液(含25mmol/L三羟甲基氨基甲烷pH＝7.6，5％(v/v)甘油，150mmol/L 氯化钠，2.5mmol/L氯化镁，1mmol/L乙二胺四乙酸，0.5％NP-40，5mmol/L β-巯基乙醇，50mmol/L氟化钠，1mmol/L钒酸钠，1mmol/L二硫苏糖醇，1mmol/L苯甲基磺酰氟化物，1μg/mL蛋白酶抑制剂亮肽素，抑胃肽以及抑肽酶)。匀浆后，冰上放置15分钟；4℃，12000g离心5分钟，得到的上清为胞浆蛋白。Bradford法定蛋白，调蛋白浓度一致后，加上样缓冲液煮沸，经12％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后将蛋白条带转到硝酸纤维素膜上。5％脱脂奶粉封闭后，依次加入抗小鼠α-SMA抗体，辣根酶标记马抗小鼠二抗，使用Amersham Biosciences ECL显色系统显色，经Gel-pro3.1 软件测出各条带的光密度值，用于统计分析。

[0042] 统计分析

[0043] 实验结果用X±SE，经参数或者非参数方差检验，经比较P＜0.05有统计学差异，P＜0.01有明显的统计学差异。病理学分级资料的统计使用卡方检验，经比较P＜0.05认为有统计学差异，P＜0.01认为有明显的统计学差异。

[0044] 【结果】

[0045] 治疗性给予TLR5激动剂stFla显著减少BLM所致动物死亡

[0046] 在所有肺纤维化动物模型中，BLM所致肺纤维化的发病机制与人类间质性肺纤维化最为接近。因此，我们选择BLM诱导的小鼠肺纤维化模型。气管注射BLM可造成动物急性肺损伤甚至引起死亡，随着急性炎症的消退逐渐形成明显的肺纤维化。实验结果显示，比较气管注射BLM后35天内各组小鼠的生存率，造模35天后，sham组动物全部存活，BLM可引起35％动物死亡，TLR5激动剂stFla治疗组只有5％动物死亡，显著减少BLM所致肺纤维化小鼠死亡率(图1)。

[0047] 治疗性给予TLR5激动剂stFla显著减轻BLM致肺部炎症

[0048] 研究发现，引起肺间质性疾病的原因高达150种以上，包括感染、毒物、药物、自身免疫性疾病、严重创伤和辐射等，但是不同原因引起的肺间质性疾病都以肺组织炎症和组织纤维增生为共同病理特征。HE染色结果显示，BLM能够导致小鼠肺泡纵隔增厚、正常肺组织结构破坏、大量炎性细胞在肺组织内浸润。而TLR5激动剂stFla能够维持肺组织正常结构形态，显著降低其炎症程度(图2)。由于在肺间质性病变过程中.早期是肺泡炎.大量炎性细胞浸润。后期是肺纤维化.大量间质细胞增生及胶原蛋白的沉积等.使模型动物的肺脏重量增加。于气管注射BLM造模35天后，相比于sham组，BLM显著升高小鼠肺指数，而给予TLR5激动剂stFla则显著抑制肺指数的增长(图3)。

[0049] 治疗性给予TLR5激动剂stFla显著降低BLM致肺部胶原沉积

[0050] 临床上多发的各种器官纤维化的主要病理特征在于胶原纤维的过度增生和降解严重不足，从而导致细胞外基质过度沉积，影响甚至代替正常器官的功能。BLM所致小鼠肺纤维化的典型病理改变便是肺组织内出现大面积胶原沉积，对胶原沉积的影响是评价药效的重要指标。Masson染色结果显示，正常肺组织中仅表达少量的胶原，而BLM诱导的肺纤维化小鼠肺部胶原大量沉积，给予TLR5激动剂stFla则能够显著抑制这一趋势(图3)。

[0051] 治疗性给予TLR5激动剂stFla显著降低BLM所致肺纤维化组织中羟脯氨酸的含量

[0052] 羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4％，在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，是胶原蛋白的特异性组成部分。因此，羟脯氨酸的含量能反映结缔组织疾病中胶原的表达情况。实验结果显示，BLM诱导的肺纤维化小鼠肺部羟脯氨酸表达明显增加，而TLR5激动剂stFla显著降低BLM所致的肺组织羟脯氨酸含量升高(图4)。

[0053] 治疗性给予TLR5激动剂stFla显著降低BLM致肺部α-SMA的蛋白表达[0054] 正常肺组织中α-SMA仅在较大血管、支气管壁的平滑肌细胞胞浆中表达。纤维化病变时，肺上皮细胞向肌成纤维细胞分化，同时表达α-SMA，因此α-SMA成为成纤维细胞分化的标志。实验结果显示，BLM所致肺纤维化小鼠肺部α-SMA蛋白的表达明显增加，治疗性给予TLR5激动剂stFla显著抑制α-SMA的表达(图5)。

[0055] 【结论】

[0056] 本发明采用TLR5激动剂stFla激活TLR5信号传导通路，可显著抑制博莱霉素所致小鼠肺纤维化，改善肺部炎症，显著降低肺纤维化小鼠死亡率。

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