生物饲料活性度的评价方法
阅读：1006发布：2021-08-13
专利汇可以提供生物饲料活性度的评价方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 生物 饲料 活性度的评价方法。具体而言，本发明涉及以肠道菌群为靶标的一种生物饲料活性度的评价方法，其利用无菌动物通过16S rDNA测序来检测动物肠道菌群正向或负向 波动 ，以评价生物饲料的活性度。本发明的方法可以用于各种生物饲料活性度的评估，通过体内外实验检测测试物对肠道菌群的作用，以菌群的波动变化反映样品的优劣性。，下面是生物饲料活性度的评价方法专利的具体信息内容。
1.一种饲料活性度评价的方法，其通过检测饲料对动物肠道菌群的正向或负向调控作用来评价饲料活性度，其中饲料优选为生物饲料，优选地，利用16S rDNA或宏基因组测序方法检测饲料对动物肠道菌群的正向或负向调控作用。
2.如权利要求1所述的方法，其在检测饲料对动物肠道菌群的正向或负向调控作用的步骤之前包括以单胃动物来源的菌群建立动物模型并用所述饲料饲喂所述动物模型的步骤，其中菌群定植于动物模型的肠道，优选地，该步骤如下进行：将所述饲料饲喂所述动物模型一定时间，如连续8天，然后利用16S rDNA或宏基因组测序技术，测定所述饲料原料或因子对动物模型中的菌群的正向或负向作用；或者在检测饲料对动物肠道菌群的正向或负向调控作用的步骤之前包括将单胃动物来源的菌群在肠道菌群离体培养装置中培养并与饲料原料或因子作用的步骤，优选地，所述肠道菌群离体培养装置为离体恒化器，优选地，该步骤如下进行：利用肠道菌群离体培养装置培养肠道菌群，通过添加饲料原料或因子并作用一定时间，如连续作用8天，然后利用16S rDNA或宏基因组测序技术，测定所述饲料原料或因子对离体培养菌群的正向或负向作用。
3.如权利要求2所述的方法，其中单胃动物为猪，和/或所述动物模型为小鼠、大鼠或地鼠，优选地，动物模型为小鼠，优选地，动物模型为无菌C57BL/6J小鼠，优选地，其饲养于无菌隔离器中。
4.如权利要求1到3任一项所述的方法，其还包括检测饲料中微生物数量的步骤，优选地，利用平板计数法或16S rDNA测序方法进行该步骤。
5.如权利要求1到4任一项的方法，其中16S rDNA测序方法是指检测细菌16S rDNA基因所含的九个“高度可变区”，和/或宏基因组测序是指测定整个环境中所有微生物的基因组DNA。
6.如权利要求1到5任一项所述的方法，其中饲料包括选自益生菌(元)、合生元、植物提取物、酶制剂和酸化剂中的一种或多种。
7.如权利要求1到6任一项所述的方法，其中对肠道菌群的正向作用表现在有益共生菌群的丰度上调，和/或条件性致病菌的丰度下调，和/或外源致病菌群数量减少或消失，反之则为负向作用，优选地，有益共生菌群选自双歧杆菌如婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌，乳酸杆菌如植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌，芽孢杆菌如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌，梭菌如丁酸梭菌的一种或多种，优选地，条件性致病菌选自肠球菌如粪肠球菌、屎肠球菌，和/或埃希氏菌如大肠杆菌，优选地，外源致病菌群选自沙门氏菌如猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌，和/或埃希氏菌如致病大肠杆菌，梭菌如产气荚膜梭菌。
8.如权利要求1到7任一项所述的方法，其中根据所述方法可建立饲料的检测标准，其中饲料活性度越高，肠道菌群越呈正向作用，饲料活性度越低，肠道菌群越呈负向作用。
9.如权利要求1到8任一项所述的方法，其可用于评价含有生物脱霉剂，不同种类、功能的益生菌如双歧杆菌、乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌，益生元如异麦芽低聚糖、低聚果糖、低聚乳糖、低聚壳聚糖、木寡聚糖，酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、植酸酶、果胶酶，植物提取物如茶多酚、白藜芦醇、血根碱、地黄、黄芩、淫羊藿、车前草、植物精油，抗生素如土霉素钙、吉他霉素、金霉素、那西肽、恩拉霉素、阿美拉霉素、黄霉素、喹乙醇，重金属如高铜、高锌，农药残留的饲料。
10.如权利要求1到9任一项所述的方法，其中16S rDNA测序采取下述步骤进行：1)基因组DNA的制备；2)高可变区引物设计和PCR扩增；3)Illumina测序文库构建(加入接头)；4)PCR产物用Axy PrepTM Mag PCR Normalizer做归一化处理；5)上机测序：构建好的文库上样到cBot或簇生成系统，用于簇生成及Miseq测序；6)分析测序结果。
生物饲料活性度的评价方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物饲料的活性度评价方法，具体涉及以肠道菌群为靶标的一种生物饲料活性度的评价方法。
背景技术
[0002] 1、饲料禁抗形势日趋严峻
[0003] 抗生素滥用破坏肠道菌群，严重危害动物和人类的健康，同时抗生素残留还危害食品安全。从化学养殖到生物养殖将是发展趋势，活性饲料理论符合生物养殖内涵。在当前食品安全关注度越来越高，抗生素禁用呼声越来越高的背景下，当前的化学养殖模式越来越难以为继。以微生态制剂、植物提取物等天然活性成分为主要饲料添加剂原料的生物养殖模式将会是发展趋势。
[0004] 2、活性饲料评价体系缺乏
[0005] 生物饲料、无抗饲料的内涵、标准缺乏，且与常规饲料界定不清楚。益生菌(元)、合生元、植物提取物等活性生物饲料缺乏共通的评价标准、评价技术，如何与含抗生素、高铜、高锌等化学因子的饲料从标准、技术、应用等形成本质区分也不清楚。活性饲料需要相应的评价方法来支撑其理论、技术、应用等完整体系。
[0006] 3、活性因子调控肠道菌群将是发展趋势
[0007] 肠道菌群是生存在人和动物肠道里的大量细菌构成的集体，它号称人类第二套基因组、人体健康状况的晴雨表。全面研发与应用调整肠道菌群的富含活性因子的普通食品、临床营养食品、药品以及动物健康产品，已经成为人类及动物健康产业重点及热点。肠道菌群体系必将深刻影响动物饲料营养学。肠道健康即肠道菌群健康，养猪即是养肠道菌群。
[0008] 4.无菌动物与宏基因组测序技术
[0009] 猪源菌群小鼠中移植的菌群可保持猪肠道菌群的特性，适于研究猪肠道菌群的相互作用和代谢以及对外源菌的屏障作用。此模型易控制，可确定代谢和生态学方面的相互作用，为研究肠道菌群耐药性产生、肠道菌群微生态对外源病原菌的屏障作用等提供了一种合适的模型。
[0010] 宏基因组学从技术上看包括16S rDNA高变区测序和全基因组的宏基因组测序两个层次。16S rDNA高变区测序可获得微生物多样性、种群结构、进化关系等相关信息；而对微生物菌群全基因组进行测序，可进一步对微生物基因功能、各微生物菌群相互协作关系、菌群与环境之间的关系等方面进行深入研究。
[0011] 截至目前，尚未有关于利用宏基因组技术检测移植猪源菌群的无菌动物的肠道菌群正向或负向波动来评价活性饲料的活性度的方法，且饲料活性度的概念也是首次提出和定义。
发明内容
[0012] 本发明的第一方面涉及一种饲料活性度评价的方法，其通过检测饲料对动物肠道菌群的正向或负向调控作用来评价饲料活性度，其中饲料为所有饲料或原料，包括生物饲料，在一些实施方案中，利用16S rDNA或宏基因组测序方法检测饲料对动物肠道菌群的正向或负向调控作用。如果饲料对动物肠道菌群有正向调控作用，说明这个饲料具有活性，比如生物饲料；如果某些饲料对肠道菌群无影响或有抑制作用，比如含抗生素的饲料对肠道菌群是负向调控，则含抗生素饲料的活性度是负的，即没有活性。
[0013] 在一些实施方案中，在检测饲料对动物肠道菌群的正向或负向调控作用的步骤之前包括以单胃动物来源的菌群建立动物模型并用所述饲料饲喂所述动物模型的步骤，其中菌群定植于动物模型的肠道，优选地，该步骤如下进行：将所述饲料饲喂所述动物模型一定时间，如连续8天，如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、30天、35天、40天、45天、50天、60天、70天、80天、90天或更长时间，然后利用16S rDNA或宏基因组测序技术，测定所述饲料原料或因子对动物模型中的菌群的正向或负向作用；或者在检测饲料对动物肠道菌群的正向或负向调控作用的步骤之前包括将单胃动物来源的菌群在肠道菌群离体培养装置中培养并与饲料原料或因子作用的步骤，优选地，所述肠道菌群离体培养装置为离体恒化器，优选地，该步骤如下进行：利用肠道菌群离体培养装置培养肠道菌群，通过添加饲料原料或因子并作用一定时间，如连续作用8天，如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、30天、35天、40天、45天、50天、60天、70天、80天、90天或更长时间，然后利用16S rDNA或宏基因组测序技术，测定所述饲料原料或因子对离体培养菌群的正向或负向作用。
[0014] 在一些实施方案中，所述单胃动物为猪，和/或所述动物模型为小鼠、大鼠或地鼠。
[0015] 在一些实施方案中，所述动物模型为小鼠，优选地，动物模型为无菌C57BL/6J小鼠，优选地，其饲养于无菌隔离器中。
[0016] 在一些实施方案中，本发明的方法包括检测饲料微生物数量的步骤，其可以采用常规的平板计数的方法进行或采用16S rDNA测序的方法进行。
[0017] 在一些实施方案中，16S rDNA测序方法是指检测细菌16S rDNA基因所含的九个“高度可变区”，和/或宏基因组测序是指测定整个环境中所有微生物的基因组DNA。
[0019] 在一些实施方案中，对肠道菌群的正向作用表现在有益共生菌群的丰度上调，和/或条件性致病菌的丰度下调，和/或外源致病菌群数量减少或消失，反之则为负向作用，优选地，有益共生菌群选自双歧杆菌如婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌，乳酸杆菌如植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌，芽孢杆菌如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌，梭菌如丁酸梭菌的一种或多种，优选地，条件性致病菌选自肠球菌如粪肠球菌、屎肠球菌，和/或埃希氏菌如大肠杆菌，优选地，外源致病菌群选自沙门氏菌如猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌，和/或埃希氏菌如致病大肠杆菌，梭菌如产气荚膜梭菌。
[0020] 在一些实施方案中，根据所述方法可建立饲料的检测标准，其中饲料活性度越高，肠道菌群越呈正向作用，饲料活性度越低，肠道菌群越呈负向作用。因此，在本发明的一些方面，本发明涉及利用本发明的方法建立的饲料的检测标准。
[0021] 在一些实施方案中，所述方法用于评价含有生物脱霉剂，不同种类、功能的益生菌如双歧杆菌、乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌，益生元如异麦芽低聚糖、低聚果糖、低聚乳糖、低聚壳聚糖、木寡聚糖，酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、植酸酶、果胶酶，植物提取物如茶多酚、白藜芦醇、血根碱、地黄、黄芩、淫羊藿、车前草、植物精油，抗生素如土霉素钙、吉他霉素、金霉素、那西肽、恩拉霉素、阿美拉霉素、黄霉素、喹乙醇，重金属如高铜、高锌，农药残留的饲料。本领域技术人员知晓，可以用本发明的方法评价活性度的饲料及其所含有的成分是没有限制的，只要有优化饲料的活性度的需求，或担心即将加入或已经加入饲料中的成分会影响饲料的活性度，就可以应用本发明的方法。
[0022] 在一些实施方案中，16S rDNA测序采取下述步骤进行：1)基因组DNA的制备；2)高可变区引物设计和PCR扩增；3)Illumina测序文库构建(加入接头)；4)PCR产物用Axy PrepTM Mag PCR Normalizer做归一化处理；5)上机测序：构建好的文库上样到cBot或簇生成系统，用于簇生成及Miseq测序；6)分析测序结果。在其它实施方案中，16S rDNA测序可以采取本领域已知的任何16S rDNA测序方法进行。
[0023] 在一些实施方案中，本发明涉及利用本发明的方法所鉴定获得的饲料，其具有较高的活性度，具有增加的正向生物饲料原料或因子，和/或具有降低的负向饲料原料或因子。所述正向生物饲料原料或因子和/或负向饲料原料或因子利用如上所述的方法鉴定筛选获得，并建立不同饲料原料数据库，建立活性饲料方程，用于饲料活性度的计算，从而优化饲料的配方，经中试、动物试验等步骤即可获得成熟产品。
[0024] 换言之，本发明公开了一种以肠道菌群为靶标的生物饲料评价方法，通过无菌动物、16S rDNA测序的方法检测动物肠道菌群正向或负向波动来评价生物饲料的活性度。正向生物饲料原料或因子包括不同种类、功能的益生菌、益生元、酶、植物提取物等，负向饲料原料包括抗生素、部分化学因子等。
[0025] 本发明的目的在于利用单胃动物如猪源菌群动物模型如小鼠模型，以16S rDNA测序的方法评价比较不同因子对肠道菌群的影响，优化饲料配方，例如评价比较生物脱霉剂与化学吸附性脱霉剂对肠道菌群的影响，以阐明生物脱霉剂优势，优化配方。
[0026] 以脱霉剂试验为例，综合体内外检测结果，建立不同饲料原料数据库，建立活性饲料方程，用于饲料活性度的计算。
[0027] 为实现上述目的，本发明在一个实施方案中提供的解决方案是：利用移植猪源菌群的小鼠模型，以16S rDNA测序的方法评价比较生物脱霉剂与化学吸附性脱霉剂在体内、体外对肠道菌群的影响，阐明生物脱霉剂的优势，优化配方。具体包括移植猪源菌群的小鼠模型的建立、离体恒化器模型的运行、16S rDNA测序、生物脱霉剂与化学吸附性脱霉剂对肠道菌群的影响的比较。
[0028] 本发明的有益效果包括：
[0032] 图1显示了本发明的整体技术路线图。
具体实施方式
[0033] 定义
[0035] 相对于生物饲料，含抗生素、高铜、高锌、农药等化学因子的饲料对肠道菌群不发挥正向调控作用，即无活性饲料。
[0036] 本文中活性饲料与生物饲料、生物活性饲料的含义基本一致，可交换使用，均是围绕微生物发酵而言。活性饲料强调对动物肠道菌群有正向调控作用。活性度是指活性饲料对动物肠道菌群发挥正向调控的一个量化指标。具体而言，基于肠道菌群靶标下的饲料活性度评价方法，对不同饲料或原料进行活性度评价实验，筛选合适的参照物，形成数据库及活性饲料方程，用于饲料活性度的计算。
[0037] 动物肠道菌群是指在动物肠道内寄居的种类繁多的微生物，按一定的比例组合，各菌间互相制约，互相依存，在质和量上形成一种生态平衡。这些数目庞大的细菌大致可以分为三个大类：有益菌、有害菌和中性菌。
[0039] 本发明所利用的动物肠道菌群的表型和/或症状在动物上的表型一般是指仔动物是否腹泻、母动物是否便秘、生长育肥动物的生长性能等，例如在猪上的表型一般指仔猪是否腹泻、母猪是否便秘、生长育肥猪的生长性能等。宏基因组测序是指对样品的整个环境中所有微生物的基因组DNA进行高通量测序，分析微生物群体的多样性与丰度，探求微生物与环境，微生物与宿主之间的关系，发掘和研究新的、具有特定功能的基因。
[0040] 动物模型是指用来研究理解某种特定生物现象所使用的非人物种，以使得在该模型动物中获得的发现能提供其它生物体中相关生物活动的理解。在本发明中，动物模型用于移植单胃动物如猪来源的菌群。本发明所用的动物模型可以是本领域已知的任何动物模型，例如小鼠、大鼠、地鼠等，所述动物模型优选是无菌的，并饲养于无菌环境中。
[0041] 16S rDNA即16S ribosomal DNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分，相对分子质量约为0.6MDa，长度约为1540nt，16S rDNA是细菌分类学研究中最常用的一段序列，包含可变区和保守区。在本发明中，16S rDNA基因中的可变区，尤其是高度可变区，例如9个“高度可变区”，被用来进行PCR扩增测序。16S rDNA的9个“高度可变区”是本领域公知的。
[0042] 16S rDNA测序是针对细菌核糖体小亚基16SrDNA基因的特定高可变区进行PCR扩增测序，并将得到的测序数据与已有的16S rDNA数据库进行比对分析，从而反映出群落的物种组成、物种间进化关系及群落多样性。
[0043] 益生元(菌)是指能促进益生菌生长繁殖的一类食品成分，作为益生菌增殖的底物不能被动物机体消化吸收，在大肠中发酵。益生元主要包括各种寡糖类物质，例如异麦芽低聚糖、低聚果糖、低聚乳糖、低聚壳聚糖、木寡聚糖等。
[0044] 益生菌是指经动物及人体摄食足够数量的、并证实对宿主健康有利的、活的微生物。主要包括乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌等几大类。例如双歧杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌以及嗜酸乳杆菌等。
[0045] 合生元是指益生菌与益生元结合使用的生物制剂，合生元中的益生元必须促进内含的益生菌，即两者结合需要发挥协同作用。
[0047] 本发明可以使用的酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、植酸酶、果胶酶等。
[0049] 肠道中的有益菌主要是各种双歧杆菌、乳酸杆菌等，是人体健康不可缺少的要素，可以合成各种维生素，参与食物的消化，促进肠道蠕动，抑制致病菌群的生长，分解有害、有毒物质等。
[0050] 肠道中的条件性致病菌即具有双重作用的细菌，如大肠杆菌、肠球菌等，在正常情况下对健康有益，一旦增殖失控，或从肠道转移到身体其他部位，就可能引发许多问题。
[0051] 肠道中的外源致病菌包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、致病大肠杆菌等。它们属于外源菌群种，一旦误食进入肠道，则会导致腹泻、食物中毒等症状。
[0052] 饲料配方的效价是指某一物质引起生物反应的功效单位,可用理化方法检测，也可用生物检测方法测定；或生物制品活性(数量)高低的标志，通常采用生物学方法测定。主要包括能量消化率、氨基酸回肠消化率、蛋白消化率、脂肪消化率、纤维消化率、灰分、钙、磷等指标。
[0053] 脱霉剂是指能将霉菌毒素(如呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素等)吸附或降解的一种饲料添加剂。
[0054] 离体恒化器模型是指一种能模拟肠道的、连续流动的肠道菌群离体培养装置。它包括发酵罐的控温系统、自动输送新鲜培养基及输出废液系统和肠道菌群生长所需环境保障系统。
[0055] 肠道菌群培养用的培养基根据需求进行合适的选择。例如乳酸菌用MRS培养基，大肠杆菌用LB培养基。
[0056] 操作分类单位即运算分类单元(OTU)，用于物种分类及物种相对丰度分析的基本单元。一般情况下，如果序列之间，比如不同的16S r RNA序列的相似性低于98％就可以把它定义为一个OTU，每个OTU对应于一个不同的16SrDNA序列，也就是每个OTU对应于一个不同的细菌(微生物)种。
[0057] 正向调节作用是指不同种类、功能的益生菌；益生元；酶；植物提取物等对肠道菌群的正向调控，可使双歧杆菌、乳酸杆菌等有益共生菌群的丰度上调，肠球菌、肠杆菌等条件性致病菌的丰度下调，沙门氏菌和致病大肠杆菌等外源致病菌群消失。
[0058] 负向调节作用是指抗生素、部分化学因子等对肠道菌群的影响，导致双歧杆菌、乳酸杆菌等有益共生菌群的丰度下调，肠球菌、肠杆菌等条件性致病菌的丰度上调，沙门氏菌和致病大肠杆菌等外源致病菌群丰度上调。
[0060] 下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
[0061] 实施例
[0062] 方法实施例1移植猪源菌群的小鼠模型的建立
[0063] 无菌C57BL/6J小鼠(由第三军医大学实验动物中心提供)饲养于第三军医大学基础部实验动物学教研室无菌隔离器中，饲养环境：20～24℃，湿度40％～70％，严格12h光照12h黑暗。饲料来自北京科奥协力饲料有限公司销售的co60辐照大小鼠生长繁育料，垫料经Co-60γ50kGy射线辐照消毒，鼠笼、饮水和饮水瓶等均采用高温高压灭菌(121℃，60min)。
将30只4周龄无菌C57BL/6J小鼠灌喂0.1mL猪粪便悬液(来自健康青年猪，无胃肠道疾病，饮食和生活习惯正常，且在本实验开始前2个月未饲喂过任何抗生素和益生菌的猪的清晨第1次的新鲜粪便)，待菌群定植3周，即获得移植猪源菌群的小鼠。
将30只4周龄无菌C57BL/6J小鼠灌喂0.1mL猪粪便悬液(来自健康青年猪，无胃肠道疾病，饮食和生活习惯正常，且在本实验开始前2个月未饲喂过任何抗生素和益生菌的猪的清晨第1次的新鲜粪便)，待菌群定植3周，即获得移植猪源菌群的小鼠。
[0064] 方法实施例2离体恒化器模型运行
[0065] 向离体恒化器模型(按照申请(专利)号为200710028346.2的说明组装模型)的发酵罐中注入灭菌的肠道菌群培养基500ml，蜡封，使整个系统处于无菌、密闭的环境。开启连接新鲜培养基的蠕动泵以35ml.h-1流速运行，输送新鲜培养基不断补充营养物质，废液以同等流速移出，保证培养液恒定。准确称取猪粪便样品(采集于健康青年猪，无胃肠道疾病，饮食和生活习惯正常，且在本实验开始前2个月未饲喂过任何抗生素和益生菌的猪的清晨第1次的新鲜粪便)5g，用灭菌的0.85％生理盐水5倍稀释，充分匀浆后过滤，取等量3份样品混匀，接种于已平衡了24h的发酵罐中。其中肠道菌群培养用的培养基配方(g/L)为：蛋白胨3.0g，牛奶乳酪蛋白3.0g，脂蛋白0.6g，果胶0.6g，木聚糖0.6g，淀粉5.0g，L-半胱氨酸0.4g，胆固醇0.25g，鹅脱氧胆酸0.25g，胆酸0.25g，阿拉伯半乳糖0.6g，KH2PO4 2.0g，N aHCO30.1g，CaCl2.2H2O 0.45g，MgSO4.7H2O 0.5g，氯化高铁血红素0.01g。
[0066] 方法实施例3 16S rDNA测序
[0067] 提取样本总DNA，釆用16S rDNA基因V3-V4可变区作为靶标进行扩增，通用引物序列：341F-806R正向引物(5'-3')：ACTCCTACGGGRSGCAGCAG(341 F)(SEQ ID NO：1)，反向引物(5'-3')：GGACTACVVGGGTATCTAATC(806 R)(SEQ ID NO：2)(参照Sun,W.et al.Mechanism and Effect of Temperature on Variations in Antibiotic Resistance Genes during Anaerobic Digestion of Dairy Manure.Sci.Rep.6,30237；doi:10.1038/srep30237(2016).)，扩增完成的PCR产物纯化之后进行上机测序。整个测序流程是由上海锐翌生物科技有限公司完成，包括DNA提取及引物设计等，使用Illumina HiSeq PE250进行上机测序。通过对测序结果进行OUT(操作分类单位)聚类分析，反映出群落的物种组成、物种间进化关系及群落多样性。
[0068] 实施例1活性因子评价
[0069] 1.1实验动物与处理：
[0070] 猪源菌群小鼠模型(如上所建立)分别饲喂生物脱霉剂(添加量2g/kg)、化学脱霉剂(添加量2g/kg)、基础饲料。
[0071] 其中所述的生物脱霉剂是指采用生物方式高效降解饲料中的各类霉菌毒素，降解产物无毒无害。(具体成分为枯草芽孢杆菌≥1×109CFU/g、水分≤10.0％、乳酸菌≥2.5×108CFU/g、维生素A≥100000IU/kg、维生素E≥800IU/kg)。
[0073] 基础饲料的配方在表1中给出。
[0074] 表1 SPF小鼠基础饲料
[0075]
[0076] 1.2主要试剂与仪器:
[0077] DNA提取试剂盒(Qiagen，货号：51504)、培养基(普通厌氧培养基(GAM)，购于青岛高科园海博生物技术有限公司)、离体恒化器(按照申请(专利)号为200710028346.2的说明组装模型)、PCR扩增仪(Invitrogen、型号：12346-086)、超低温冰箱(-80℃)、超净工作台、显微镜等
[0078] 1.3.检测饲料原料或产品微生物数量
[0079] 按常规微生物平板菌落计数法或16S rDNA测序，对饲料原料或产品中微生物含量进行测定。
[0080] 生物脱霉剂成分：
[0081] 枯草芽孢杆菌≥1×109CFU/g，水分≤10.0％，乳酸菌≥2.5×108CFU/g维生素A≥100000IU/kg、维生素E≥800IU/kg(深圳市百澳飞生物技术有限公司，脱霉宝)。
[0082] 1.4.体内活性因子评价
[0083] 以上述猪源菌群小鼠模型为实验动物，通过上述16S rDNA检测方法，检测上述生物脱霉剂与上述化学脱霉剂对肠道菌群的正向或负向调控作用。
[0084] 1.4.1实验动物与处理
[0085] 将30只小鼠(无菌C57BL/6J小鼠7周龄，雌雄各半)分为3组，每组10只。对照组饲喂基础饲料，生物脱霉剂组饲喂基础饲料+生物脱霉剂(添加量2g/kg)，化学脱霉剂组饲喂基础饲料+化学脱霉剂(添加量2g/kg)。实验周期为8周。1.4.2样本采集
[0086] 灌喂脱霉剂后第8周取其新鲜粪便样品(3份)并拍照，装于2mL无菌EP管中，冻藏于-80℃待用。
[0087] 1.4.3DNA提取
[0088] 取小鼠粪便1mg，于2mL离心管中，加入1mL裂解液；具体参照天根的粪便基因组DNA提取试剂盒的说明进行。
[0089] 1.4.4 16S rDNA测序
[0090] 按上述方法，每组随机选择3个重复，共9个样品测序。
[0091] 1.5体外活性因子评价
[0092] 以接种猪肠道菌群的离体恒化器为模型，通过16S rDNA测序，检测生物脱霉剂与化学脱霉剂对肠道菌群的正向或负向调控作用。
[0093] 1.5.1离体恒化器分组和处理
[0094] 使用3套离体恒化器模型，分为空白对照组、化学脱霉剂组、生物脱霉剂组，离体模型接种猪肠道菌群14d后，化学脱霉剂组添加化学脱霉剂(添加量2g/L)、生物脱霉剂组添加生物脱霉剂(添加量2g/L)，连续作用8天。
[0095] 1.5.2样本采集
[0096] 粪便接种发酵罐后，在加脱霉剂连续作用8天后采集培养液，装于2mL无菌EP管中，冻藏于-80℃待用，用于细菌数量检测和菌群结构分析。
[0097] 1.5.3DNA提取和16S rDNA测序
[0098] 取培养液0.5mL，于2mL离心管中，加入1mL裂解液；具体参照天根的粪便基因组DNA提取试剂盒的说明进行。
[0099] 1.5.4 16S rDNA测序
[0100] 按上述方法，每组随机选择3个重复，共9个样品测序。
[0101] 1.6技术路线，参见附图1。
[0102] 1.7体内外实验结果
[0103] 通过16S rDNA测序，反映出群落的物种组成、物种间进化关系及群落多样性。测定两款脱霉剂对肠道菌群的正向激活作用或抑制作用：
[0104] (1)与其他两组相比，生物脱霉剂组中拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌等有益共生菌群的丰度上调，使共生菌占压倒性优势；
[0105] (2)与其他两组相比，生物脱霉剂组中肠球菌、埃希氏菌等条件性致病菌的丰度下调。
[0106] (3)沙门氏菌和致病大肠杆菌等外源致病菌群在三组中均未检测到，如有致病性菌，加入活性饲料后可将致病菌丰度降低或消除。
[0107] 结果见表2。
[0108] 表2 实验相关微生物类群的相对丰度
[0109]
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