一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法
阅读：463发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法。本发明提供31对豌豆SSR引物组成的标记组合，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑62所示，利用PCR扩增技术、非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳 或 荧光 PCR毛细管电泳检测技术对豌豆品系或豌豆野生近缘种进行鉴定，可在短时间内完成豌豆品系或其野生近缘种鉴定与遗传多样性评价工作，具有高效、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境影响等优点。本发明的方法可以对豌豆 种子 真伪进行有效监控，从DNA 水 平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为豌豆品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，具有良好的应用前景。，下面是一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法专利的具体信息内容。
1.一种用于鉴别豌豆品系或其野生近缘种的分子标记组合，其特征在于，含有19个基因组SSR分子标记和12个EST-SSR分子标记，分别为SSR4825、SSR4696、SSR28304、SSR24036、B83、EST671、SSR27844、SSR25888、SSR24882、SSR23759、SSR21491、EST619、SSR24112、EST599、SSR22754、P14、SSR24731、SSR25334、EST876、SSR28967、SSR21399、SSR21405、P282、EST643、SSR25799、SSR25965、P291、P292、SSR22052、P344、EST617；
所述分子标记分别通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30、SEQ ID NO.31-32、SEQ ID NO.33-34、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.41-42、SEQ ID NO.43-
44、SEQ ID NO.45-46、SEQ ID NO.47-48、SEQ ID NO.49-50、SEQ ID NO.51-52、SEQ ID NO.53-54、SEQ ID NO.55-56、SEQ ID NO.57-58、SEQ ID NO.59-60、SEQ ID NO.61-62所示的引物。
2.一种引物组合，其特征在于，含有以下31对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-62所示。
3.含有权利要求2所述引物组合的试剂盒。
4.权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在鉴定豌豆品种中的应用。
5.权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在豌豆辅助育种中的应用。
6.一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于，以权利要求2所述的引物组合对不同豌豆品系或其野生近缘种的DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测或对PCR产物进行荧光毛细管电泳检测：
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；
杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；
无效等位变异的大小记录为0/0；
上述“/”前为小片段，“/”后为大片段；
通过对不同位点的数据整合，形成不同豌豆的SSR指纹图谱。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，PCR扩增方法为：
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35个循环；
72℃延伸5min，10℃保温5min；
10μL扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix 5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板
1.5μL，ddH2O 2.5μL。
8.权利要求6或7所述的构建方法构建得到的豌豆指纹图谱在鉴别豌豆品中或豌豆辅助育种中的应用，所述的豌豆指纹图谱为81种豌豆品系或其野生近缘种的指纹图谱，分别如下：
和
和
和
和
和
和
和
和
和
和
和
和
和
和
和
上述W1-W81分别指代81种豌豆品系或其野生近缘种，分别为：Garfield，DDR-14，保加利亚豌豆，邓恩豌豆，MG101831，俄罗斯豌豆，秦选1，辽选1号，海门白花豌豆，小白花豌豆，麻豌豆，白菜豌，菜豌，食荚大菜豌1号，无须豆尖1号，定豌1号，定豌2号，定豌3号，定豌4号，定豌5号，定豌6号，定豌7号，定豌8号，草原23，草原24号，草原224号，草原276，青荷一号，甜脆761，阿极克斯，陇豌1号，科碗2号，科碗5号，科碗6号，科碗7号，科碗8号，科碗1号，科碗3号，云碗1号，云碗4号，云碗8号，云碗10号，成碗7号，成碗8号，成碗9号，成碗10号，成碗11号，食荚甜脆碗3号，食荚大菜碗6号，中秦1号，中秦2号，无须豌171，成驹39，草原22号，草原
25号，中豌4号，红花豌豆，荷兰豆，毛口壳豌，元宝山豌豆，豌豆，豌豆，麻豌豆，豌豆，白豌豆，绿皮豌豆，小青豌豆，利民白豌豆，麻菜豌豆，大白豌，黑豌豆，哈密豌豆，菜豌豆，AGG1706，AGG116，AGG105，AGG2380，AGG4023，AGG533，AGG866，G5671。
9.一种鉴定豌豆品系或其野生近缘种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待检豌豆的DNA，以权利要求2所述的引物组合中的31对引物对分别对待检豌豆的DNA进行PCR扩增；
(2)扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染显色，根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置；或
对扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，根据扩增产物的相对位置：
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；
杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；
无效等位变异的大小记录为0/0；上述“/”前为小片段，“/”后为大片段；
(3)结果对照权利要求6或7所述的构建方法构建得到的权利要求8述及的豌豆指纹图谱，材料间差异位点数≥3，则为不同豌豆品系或不同豌豆野生近缘种；材料间差异位点数<
3，则为近似豌豆品系或其野生近缘种。
一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法
技术领域
背景技术
[0002] 豌豆(Pisum sativum L.)属豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papilionoideae)野豌豆族(Vicieae)豌豆属(Pisum)中的一个栽培中，属一年生(春播)或越年生(秋播)攀岩性草本自花授粉植物。豌豆是世界上第四大食用豆类作物，全球有60多个国家生产干豌豆；我国是世界豌豆主产国，总面积、总产均为世界第一。豌豆适用冷凉气候、多种土地和干旱环境，具有高蛋白质含量、维生素丰富、易消化吸收，粮、菜、饲、肥兼用以及深加工增值的诸多特点，是种植业结构调整中重要的间、套、轮作和养地作物，在我国的可持续农业发展和我国人民食物结构中产生着重要影响。因此开展豌豆品种的有效甄别显得尤为重要。
[0003] 目前我国对豌豆品种进行鉴定主要方法是按照NY/T 2436-2013《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南豌豆》进行田间测定来鉴定的。该方法简便、经济，但受限于许多形态学性状鉴定周期长、易受环境影响等因素，因此不能精确、快捷地为新品种侵权案件提供鉴定依据，同时也常出现不同测试人员对某些性状的认识存在偏差，导致判定结果不一致的问题。当前，随着育种骨干亲本的利用集中化，传统的形态学测试已经不能适应品种鉴定和纯度分析的要求。
[0004] 随着生物技术的飞速发展，基于分子标记技术而建立起来的DNA指纹图谱(fingerprint)在品种、品系鉴别方面发挥着重要作用。品种DNA指纹数据库的构建在豌豆品种纯度及真实性鉴定、种子质量标准化、品种审定及产权登记保护、真假种辨别、品种纠纷等方面具有重要应用价值，在探究我国豌豆种质资源的亲缘关系、杂种优势群划分、种质资源创新利用及新品种选育等方面发挥着显著作用。当前用于构建作物DNA指纹图谱的标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、EST、ISSR、SSR等。简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)，是第二代基于PCR技术的分子标记技术，具有多态性丰富、遗传信息多、操作便利、共显性、高度可重复性等优点，已被广泛应用于植物资源遗传研究和分子辅助育种实践中。
[0005] DNA指纹图谱能够从DNA水平上鉴定出品种间的差异或遗传相似性。微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性较高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。为了有效保护我国豌豆的品种知识产权，有必要在我国开展豌豆开发微卫星标记开发，并应用于豌豆优良品种“分子身份证”构建的研究。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法，本发明的另一目的在于提供一种高效、准确、低成本的利用豌豆SSR指纹图谱鉴别豌豆品系或其野生近缘种的方法。本发明的目的还在于提供该方法的应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明以49份代表性豌豆品种和32份豌豆种质资源基因组DNA为模板，通过分析豌豆基因组序列和EST序列，合成核心基因组SSR和EST-SSR引物。经过筛选，分别有19对基因组SSR和12对EST-SSR引物组成的分子标记组合可完全鉴别49份豌豆品种和32份豌豆种质资源的差异。所述的81份代表性参试豌豆材料见表1。表1中，有49份豌豆育成品种(W7-W55，6份国外豌豆资源(W1-W6)，18份豌豆核心种质资源(W56-W73)，共计73份豌豆材料，统称“豌豆品系”，表1中另外8份野生豌豆资源(W74-W81)为豌豆野生近缘种。
[0008] 表1 81份豌豆品系或其野生近缘种
[0009]
[0010]
[0011]
[0012]
[0013] 经过多次筛选，选择在连锁群上的均匀分布、多态性较高、PCR扩增较稳定，同时满足常规非变性凝胶电泳检测和毛细管荧光电泳检测两种技术平台，最终筛选出在豌豆品系或其野生近缘种间多态性信息含量值最高、等位位点数最多、重复性好、扩增带型清晰度高、连锁群分布均匀的SSR引物作为豌豆SSR指纹图谱库构建的核心引物。
[0014] 基于上述筛选方法，本发明提供用于鉴别豌豆品系或其野生近缘种的分子标记组合，其特征在于，含有19个基因组SSR分子标记和12个EST-SSR分子标记，分别为SSR4825、SSR4696、SSR28304、SSR24036、B83、EST671、SSR27844、SSR25888、SSR24882、SSR23759、SSR21491、EST619、SSR24112、EST599、SSR22754、P14、SSR24731、SSR25334、EST876、SSR28967、SSR21399、SSR21405、P282、EST643、SSR25799、SSR25965、P291、P292、SSR22052、P344、EST617；
[0015] 所述分子标记分别通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30、SEQ ID NO.31-32、SEQ ID NO.33-34、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.41-42、SEQ ID NO.43-44、SEQ ID NO.45-46、SEQ ID NO.47-48、SEQ ID NO.49-50、SEQ ID NO.51-52、SEQ ID NO.53-54、SEQ ID NO.55-56、SEQ ID NO.57-58、SEQ ID NO.59-60、SEQ ID NO.61-
62所示的引物。
62所示的引物。
[0016] 本发明提供一种引物组合，含有以下31对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-62所示。
[0018] 本发明提供了上述分子标记组合或引物组合在鉴定豌豆品系或其野生近缘种中的应用。
[0019] 本发明提供了上述分子标记组合或引物组合在豌豆种质资源改良中的应用。
[0020] 本发明提供了上述分子标记组合或引物组合在构建豌豆SSR植物图谱中的应用。
[0021] 本发明还提供一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法，以本发明所述的含有上述31对引物的引物组合对不同豌豆品种和种质资源的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测或对PCR产物进行荧光毛细管电泳检测：
[0022] 纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；
[0023] 杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；
[0024] 无效等位变异的大小记录为0/0；
[0025] 上述“/”前为小片段，“/”后为大片段；
[0026] 通过对不同位点的数据整合，形成不同豌豆材料的SSR指纹图谱。
[0027] 其中，PCR扩增方法为：
[0028] 反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，10℃保温5min；
[0029] 10μL扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix 5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 2.5μL。
[0031] 当采用荧光毛细管电泳检测时，为引物加入荧光标记，详细情况见表2。
[0032] 本发明提供了利用上述构建方法构建得到的豌豆指纹图谱。
[0033] 本发明构建得到的豌豆指纹图谱，如表5-表20所示。
[0034] 本发明进而提供一种鉴定豌豆品系或其野生近缘种的方法，包括如下步骤：
[0035] (1)提取待检豌豆的DNA，以本发明所述的引物组合中的31对引物对分别对待检豌豆的DNA进行PCR扩增；
[0037] 对扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，根据扩增产物的相对位置：
[0038] 纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；
[0039] 杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；
[0040] 无效等位变异的大小记录为0/0；上述“/”前为小片段，“/”后为大片段；
[0041] (3)结果对照表5-表20的豌豆品系或其野生近缘种指纹图谱，材料间差异位点数≥3，则为不同豌豆品系或不同豌豆野生近缘种；材料间差异位点数<3，则为近似豌豆品系或其野生近缘种。
[0042] 本发明提供了上述方法在豌豆种质资源改良中的应用。
[0043] 本发明豌豆DNA指纹图谱的构建方法，利用了SSR引物组合对某一豌豆品系或其野生近缘种DNA进行扩增，得到一组特有的DNA指纹，于是本发明方法采用引物组合鉴别的方法对豌豆品系或其野生近缘种进行分析和筛选，使每一个豌豆品系或其野生近缘种都找到了它特有的DNA指纹。本发明的基因组SSR和EST-SSR引物的扩增产物带型间大小差异明显，能够很好的区分不同的豌豆品种或豌豆材料。对同一品种内的个体间的扩增产物，其带型一致。本发明的检测方法在短时间内即可完成豌豆品系或其野生近缘种鉴定与遗传多样性评价工作，具有高效、准确、低成本、操作简便等优势。同时本发明的检测方法可以有效的对豌豆种子真伪进行监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为豌豆品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术参考。附图说明
[0044] 图1为81份豌豆品系或其野生近缘种聚类分析结果图。
具体实施方式
[0046] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
[0047] 本发明品种判定原则遵照以下国家标准进行，NY/T 2594-2014植物品种鉴定DNA指纹方法总则；NY/T 2436-2013《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南豌豆》；GB/T 19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则。
[0048] 实施例1用于鉴定豌豆豌豆品系或其野生近缘种的基因组SSR和EST-EST引物的筛选
[0049] 本实施例以我国豌豆主产区代表性推广的49个豌豆品种和32份豌豆种质资源(见表1)基因组DNA为模板，通过分析豌豆基因组序列和EST序列，合成核心基因组SSR和EST-SSR引物。经过筛选，分别有19对基因组SSR和12对EST-SSR引物组成的分子标记组合可完全鉴别49份豌豆品种和32份豌豆种质资源的差异。
[0050] 最终筛选得到19对基因组SSR分子标记和12对EST-SSR分子标记。
[0051] 表2 31对SSR核心引物
[0052]
[0053]
[0055] 实施例2豌豆特征指纹图谱的构建与豌豆品系或其野生近缘种鉴定方法的建立[0056] 1、豌豆总DNA提取
[0057] 采用改良CTAB法提取供试样品DNA：取2g左右的新鲜幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末状装入2.0ml离心管中，放入-80℃冰箱保存待用；将预热到65℃的2×CTAB提取液，按占溶液容量的1％的比例加入β-巯基乙醇，充分混匀；取出研磨好的叶片组织，每份样品中加入800μL预热后的CTAB提取液，涡旋1-2min，65℃水浴1h(每15min上下颠倒轻翻一次，充分混匀)；水浴加热结束后，加入800μL氯仿/异戊醇(24：1)溶液于离心管中，混合15-20min，之后10000rpm离心15min；吸取600μL左右上清液移至新离心管(量可适当减少，但切不可接触蛋白质层)，后加入95％等体积乙醇，摇匀后于-20℃冰箱放置2h或者4℃冰箱过夜，保证充分沉淀；12000rpm离心10min，倒掉上清，保留沉淀；用90％乙醇500μL清洗白色沉淀，10000rpm离心5min，小心倒掉上清；室温风干，加入100μL ddH2O充分溶解沉淀。利用Nanodrop2000/2000C仪器检测样品DNA浓度，将DNA浓度稀释到50ng/μL，4℃保存备用。
[0058] 2、以实施例1所述81份豌豆参试材料，利用实施例1筛选得到的用于扩增31个分子标记的引物分别对实施例1所述的49个豌豆品种和32份豌豆种质资源基因组DNA进行PCR扩增，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，10℃保温5min；10μL扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix 5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 2.5μL。
[0059] 3、PCR扩增产物凝胶电泳及银染显色：扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2-2.5h，至加样缓冲液移到凝胶底部时电泳结束。银染显色，照相记录。
[0060] (1)玻璃板清洗 用清水和洗涤剂将平、凹玻璃板充分清洗干净，然后用蒸馏水冲洗，置于玻璃板架晾干；为防止灌胶时有气泡产生，灌胶前用酒精擦洗玻璃板，晾干备用；将组装好的玻璃板水平放齐，用夹子固定。
[0061] (2)灌胶 在45ml 8％PAGE胶中加入TEMED 45μL和10％过硫酸铵450μL TEMED(注：TEMED和过硫酸铵的使用量应依据环境温度做出相应调整)，迅速混匀后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层时，在上部轻轻插入梳子，使其聚合25min左右(注：具体聚合时间应随不同环境温度做出相应调整)。在灌胶过程中，应防止气泡的产生。
[0062] (3)PCR扩增产物预处理 在10μL PCR扩增产物中加入2.5μL 6×Loading buffer，混匀30s待用。
[0063] (4)电泳 用移液器吹吸加样槽，清除杂质和气泡。每加样孔点入1.5μL产物进行检测，电泳1-1.5小时(电压300V，电流280mA，功率260W)，电泳时间长短可根据目标片段大小和实际功率适度调节。待上部的指示带(二甲苯青)到达胶板底部，电泳结束，小心剥离聚丙烯酰胺凝胶，待染色。
[0064] (5)银染 漂洗：使用蒸馏水快速漂洗聚丙烯酰胺凝胶1次，时间不超过10s。银染：按以下银染液配比对凝胶进行染色，然后平行震荡染色10min。
[0065] 表3
[0066]
[0067] 清洗：染色10min后，将染色液倒入废液桶，继续用蒸馏水漂洗2次，每次不超过15s。
[0068] 显色：按以下显色液配比，加入适当的显色液于塑料盒中，轻轻混匀后置于平行震荡仪，使凝胶与显色液充分作用，直至条带清晰。
[0069] 表4
[0070]
[0071] 洗涤：将显影液倒掉并用蒸馏水清洗2-3次，每次不超过15s。
[0072] 保存：清洗干净后，将凝胶平铺在玻璃板上，用保鲜膜将其密封，读出条带结果并统计记录，然后照相留存。
[0073] 结果记录：纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异(小片段在前，大片段在后)；无效等位变异的大小记录为0/0。构建的81份豌豆材料的指纹图谱见表5-表20。
[0074] 表5
[0075]
[0076]
[0077] 表6
[0078] SSR24112 B83 P291 SSR24036 SSR28304 SSR22754 SSR25799 SSR21405W1 195/199 162/162 220/220 206/220 133/133 173/173 104/104 130/144W2 195/195 158/162 220/220 194/194 127/127 161/161 102/102 130/157
W3 187/187 159/162 210/219 212/212 125/134 173/173 102/102 130/130
W4 199/199 160/160 201/201 192/192 125/125 173/173 102/102 144/144
W5 205/205 158/158 219/219 194/194 127/127 173/173 102/102 143/143
W6 223/225 161/161 219/219 218/218 128/128 173/173 102/102 157/157
W7 195/195 163/163 201/201 206/206 127/127 161/173 144/144 130/130
W8 195/195 163/163 219/219 206/206 127/127 170/170 134/134 130/130
W9 189/189 156/156 208/208 192/192 134/134 173/173 108/108 159/159
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W37 142/145 157/157 154/189 187/190 159/159 112/112 158/158
W38 132/132 145/145 154/163 187/190 146/146 112/112 178/178
W39 157/157 138/138 154/163 181/187 146/146 113/113 172/172
W40 157/157 157/157 154/163 187/190 165/165 112/112 172/172
[0094] 表13
[0095]
[0096]
[0097] 表14
[0098] SSR24112 B83 P291 SSR24036 SSR28304 SSR22754 SSR25799 SSR21405W41 220/220 161/161 201/201 202/202 133/133 173/173 102/102 143/143W42 224/224 159/159 219/219 194/194 128/128 161/161 134/134 143/143W43 227/227 159/159 201/201 204/204 127/127 161/161 151/151 144/144W44 227/227 159/159 201/201 204/204 127/127 161/161 151/151 144/144W45 225/225 156/156 201/201 218/218 134/134 183/183 102/102 159/159W46 199/199 162/162 208/208 194/194 127/127 158/158 134/134 144/161W47 199/199 162/162 208/208 194/194 127/127 158/158 134/134 161/161W48 195/195 160/160 219/219 197/197 128/128 173/173 151/151 144/144W49 225/225 159/159 201/201 194/204 127/127 161/161 151/151 144/144W50 195/195 161/161 219/219 194/194 133/133 161/161 102/102 144/144W51 186/186 161/161 219/219 193/193 127/127 161/161 134/134 144/144W52 199/201 157/161 207/219 218/218 127/127 161/161 102/102 129/145W53 199/199 157/159 210/210 197/201 133/133 161/161 102/102 130/143W54 195/195 163/163 219/219 193/193 127/127 173/173 151/151 130/130W55 188/199 161/163 201/219 192/220 127/133 158/182 102/102 130/130W56 186/186 161/161 219/219 194/194 127/127 161/161 102/134 130/144W57 199/199 142/155 201/219 194/194 134/134 170/170 102/108 130/159W58 197/197 159/159 202/202 194/194 125/125 170/170 103/103 144/144W59 199/199 156/156 219/219 194/194 134/134 158/170 102/108 144/159W60 199/199 155/155 201/208 194/194 127/134 173/173 102/102 130/159[0099] 表15
[0100]
[0101]
[0102] 表16
[0103] EST643 P344 EST876 P14 SSR25965 SSR27844 SSR21491W41 153/153 157/157 154/176 187/190 146/146 112/112 172/172
W42 157/157 138/138 154/176 187/196 146/146 113/113 172/172
W43 157/157 138/138 154/176 187/196 147/147 115/115 160/160
W44 157/157 138/138 154/176 196/196 146/146 115/115 160/160
W45 139/139 138/138 154/190 181/187 147/147 115/115 178/178
W46 157/157 138/138 154/154 187/191 147/147 113/113 175/175
W47 157/157 138/138 154/193 187/190 146/146 113/113 175/175
W48 157/157 139/139 154/177 187/197 146/146 113/113 178/178
W49 157/157 145/145 154/177 187/190 146/146 115/115 172/172
W50 157/157 157/157 154/176 187/197 167/167 113/113 172/172
W51 157/157 157/157 154/176 187/196 146/146 113/113 172/172
W52 144/144 138/138 154/154 181/187 161/161 113/113 172/172
W53 138/138 145/157 154/163 187/190 149/149 112/112 172/172
W54 157/157 157/157 154/163 181/187 146/146 112/112 169/169
W55 138/138 138/157 154/163 187/196 161/167 113/115 160/172
W56 157/157 157/157 154/176 196/196 146/146 113/113 169/169
W57 141/141 145/145 154/163 190/190 155/155 113/114 178/178
W58 142/142 139/145 154/177 182/184 166/166 107/107 178/178
W59 141/145 138/144 154/154 187/197 161/161 113/113 172/180
W60 142/144 138/145 154/154 187/190 161/161 113/115 172/172
W42 157/157 138/138 154/176 187/196 146/146 113/113 172/172
W43 157/157 138/138 154/176 187/196 147/147 115/115 160/160
W44 157/157 138/138 154/176 196/196 146/146 115/115 160/160
W45 139/139 138/138 154/190 181/187 147/147 115/115 178/178
W46 157/157 138/138 154/154 187/191 147/147 113/113 175/175
W47 157/157 138/138 154/193 187/190 146/146 113/113 175/175
W48 157/157 139/139 154/177 187/197 146/146 113/113 178/178
W49 157/157 145/145 154/177 187/190 146/146 115/115 172/172
W50 157/157 157/157 154/176 187/197 167/167 113/113 172/172
W51 157/157 157/157 154/176 187/196 146/146 113/113 172/172
W52 144/144 138/138 154/154 181/187 161/161 113/113 172/172
W53 138/138 145/157 154/163 187/190 149/149 112/112 172/172
W54 157/157 157/157 154/163 181/187 146/146 112/112 169/169
W55 138/138 138/157 154/163 187/196 161/167 113/115 160/172
W56 157/157 157/157 154/176 196/196 146/146 113/113 169/169
W57 141/141 145/145 154/163 190/190 155/155 113/114 178/178
W58 142/142 139/145 154/177 182/184 166/166 107/107 178/178
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W60 142/144 138/145 154/154 187/190 161/161 113/115 172/172
[0104] 表17
[0105]
[0106]
[0107] 表18
[0108] SSR24112 B83 P291 SSR24036 SSR28304 SSR22754 SSR25799 SSR21405W61 188/188 157/157 201/201 192/192 134/134 158/158 108/108 134/134W62 186/186 161/161 219/219 194/194 127/127 173/173 102/102 130/144W63 189/199 155/155 207/219 193/193 134/134 170/170 102/108 134/134W64 198/198 158/158 219/219 191/191 134/134 158/158 102/102 143/143W65 191/191 155/155 201/201 191/191 134/134 158/161 102/102 158/158W66 184/184 142/142 201/201 192/192 127/127 158/158 108/108 134/134W67 189/189 142/159 201/219 192/193 128/134 158/176 108/108 130/144W68 195/195 159/159 219/219 197/197 128/128 173/173 155/155 130/130W69 195/195 155/155 207/219 192/192 134/134 170/170 102/108 143/143W70 195/195 156/156 201/201 194/194 134/134 171/171 102/102 144/144W71 191/191 167/167 208/208 192/192 134/134 158/158 108/108 134/134W72 195/199 164/179 220/220 206/218 134/134 170/170 105/105 130/130W73 195/195 159/159 220/220 194/194 125/125 177/177 108/108 144/144W74 225/225 159/159 220/220 194/194 128/128 161/161 149/149 130/130W75 201/201 140/140 207/207 210/210 127/127 173/173 104/104 156/156W76 186/186 161/161 219/219 194/194 125/125 173/173 103/103 144/144W77 232/232 155/155 204/204 192/192 133/133 158/158 102/102 144/144W78 188/188 159/159 201/201 212/212 134/134 173/173 102/102 144/144W79 199/199 161/161 213/213 198/198 125/125 173/173 104/104 144/144W80 187/187 160/160 201/201 206/206 133/133 158/158 103/110 144/144W81 199/199 147/147 208/208 187/187 127/127 167/167 108/108 134/134[0109] 表19
[0110] EST599 SSR24882 SSR24731 EST619 EST671 SSR25888 SSR22052 SSR25334W61 167/167 152/152 212/212 112/115 131/148 163/163 138/138 141/141W62 158/170 150/150 193/193 123/127 130/147 163/163 141/141 137/137W63 146/146 152/171 187/187 115/124 130/143 166/166 141/141 137/137W64 170/170 171/171 202/202 123/123 143/147 162/162 141/141 136/136W65 146/146 152/152 193/193 124/124 130/130 166/166 137/137 137/137W66 146/146 152/152 214/214 124/124 129/147 178/178 137/137 137/137W67 146/146 152/152 193/218 115/124 139/146 163/166 137/137 135/137W68 148/148 152/156 198/198 126/126 129/129 173/173 137/137 136/136W69 167/175 150/150 187/187 126/126 143/147 166/166 137/141 136/136W70 169/169 152/152 208/208 115/115 131/148 166/166 138/138 136/136W71 165/165 168/168 193/193 124/124 143/148 166/166 138/138 128/128W72 159/159 152/152 193/198 115/115 131/148 166/166 144/144 136/136W73 175/175 150/150 202/202 126/126 143/148 166/166 144/144 139/139W74 173/173 150/150 200/202 126/126 141/141 166/166 137/137 136/136W75 124/124 150/150 190/190 115/115 143/143 166/166 144/144 127/127W76 146/146 154/154 192/192 115/115 131/147 166/166 144/144 136/136W77 124/124 152/152 193/193 115/115 130/147 176/176 144/144 130/130W78 156/156 151/151 193/193 124/124 130/147 163/163 139/139 128/128W79 156/156 150/150 193/193 126/126 130/147 165/165 144/144 137/137W80 158/158 154/154 200/200 126/126 140/147 177/177 139/139 132/132W81 135/135 152/152 190/190 132/132 145/145 168/168 128/128 165/165[0111] 表20
[0112]
[0113]
[0114] 4、与上述步骤3平行的检测方法，还可采用对PCR扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，具体如下：
[0115] PCR产物样品准备及电泳分析结果
[0116] 将FAM(蓝色)和HEX(绿色)荧光标记的PCR产物用超纯水稀释25倍，分别取等体积的上述2种稀释后溶液混合形成混合液，吸取1μL混合液、0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺分别加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出后立即置于碎冰上，冷却15min左右；瞬时离心10s，进行毛细管电泳检测，用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集。以DNA MarkerI为DNA分子量标准，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；无效等位变异的大小记录为0/0(注：小片段在前，大片段在后)。通过对多个位点的数据整合，最终形成不同豌豆品系或其野生近缘种的SSR指纹图谱(表5-表20)。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3～5个参照材料的扩增产物。
[0117] 不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过预试验确定。
[0118] 检测结果判定：材料间差异位点数≥3，则为不同豌豆品系或不同豌豆野生近缘种；材料间差异位点数<3，则为近似豌豆品系或其野生近缘种。比较81份豌豆材料的指纹数据，发现任意两个材料间的差异位点数都大于3，说明这31对核心引物可以有效的把这些豌豆品系或其野生近缘种鉴别开；利用Power Marker和MEGA软件进行聚类，分析参试材料间的遗传关系，从图中可以发现在遗传相似系数为0.075左右时可以把81份豌豆材料区分开(图1)。
[0119] 实施例3本发明鉴定豌豆品系或其野生近缘种方法的应用
[0120] 提取已知品种名称的6个豌豆样品的叶片DNA，以本发明实施例1筛选得到的分子标记组合中的31对引物分别对待检豌豆品种的DNA进行PCR扩增；参照本发明实施例2的PCR反应体系，PCR反应程序，聚丙烯酰胺凝胶电泳和变异位点记录方法(方法1)，同时重复实验采用荧光毛细管电泳法和变异位点记录方法(方法2)，将得到的指纹代码与本发明得到的豌豆品系或其野生近缘种的特征指纹图谱(表5-表20)进行比对，以验证本发明实施例2建立的鉴定方法准确度。
[0121] 表21
[0122] SSR4825 SSR21399 SSR23759 P292 SSR4696 P282 SSR28967 EST617F1 191/191 141/141 156/156 210/210 212/212 184/184 172/172 125/125F2 225/225 141/141 156/156 225/225 195/195 184/184 173/173 125/125
F3 205/205 158/158 163/163 225/225 216/216 201/203 172/172 134/134
F4 195/205 141/141 156/156 200/200 216/216 184/184 182/182 128/128
F5 195/224 154/154 163/163 216/216 195/195 186/186 172/172 127/127
F6 191/195 154/154 163/163 216/216 212/212 186/186 172/172 128/128
F3 205/205 158/158 163/163 225/225 216/216 201/203 172/172 134/134
F4 195/205 141/141 156/156 200/200 216/216 184/184 182/182 128/128
F5 195/224 154/154 163/163 216/216 195/195 186/186 172/172 127/127
F6 191/195 154/154 163/163 216/216 212/212 186/186 172/172 128/128
[0123] 表22
[0124] SSR24112 B83 P291 SSR24036 SSR28304 SSR22754 SSR25799 SSR21405F1 189/189 156/156 208/208 192/192 134/134 173/173 108/108 159/159F2 195/195 155/155 219/219 194/194 134/134 161/161 102/102 158/158
F3 189/189 161/161 219/219 194/194 128/128 161/161 151/151 144/144
F4 225/225 161/161 201/201 220/220 133/133 173/173 144/144 130/130
F5 227/227 159/159 201/201 204/204 127/127 161/161 151/151 144/144
F6 225/225 159/159 201/201 194/204 127/127 161/161 151/151 144/144
F3 189/189 161/161 219/219 194/194 128/128 161/161 151/151 144/144
F4 225/225 161/161 201/201 220/220 133/133 173/173 144/144 130/130
F5 227/227 159/159 201/201 204/204 127/127 161/161 151/151 144/144
F6 225/225 159/159 201/201 194/204 127/127 161/161 151/151 144/144
[0125] 表23
[0126] EST599 SSR24882 SSR24731 EST619 EST671 SSR25888 SSR22052 SSR25334F1 146/146 152/152 187/187 115/115 131/147 163/166 137/137 137/137F2 146/177 150/150 202/202 124/124 141/141 166/166 137/137 137/137
F3 158/158 153/153 187/187 126/126 140/187 163/163 141/141 137/137
F4 154/154 150/150 216/216 123/123 140/140 177/177 141/141 136/136
F5 158/158 150/150 202/202 126/126 141/141 177/177 144/144 152/152
F6 158/158 150/150 202/202 126/126 139/139 177/177 144/144 150/150
F3 158/158 153/153 187/187 126/126 140/187 163/163 141/141 137/137
F4 154/154 150/150 216/216 123/123 140/140 177/177 141/141 136/136
F5 158/158 150/150 202/202 126/126 141/141 177/177 144/144 152/152
F6 158/158 150/150 202/202 126/126 139/139 177/177 144/144 150/150
[0127] 表24
[0128] EST643 P344 EST876 P14 SSR25965 SSR27844 SSR21491F1 141/141 138/145 154/154 187/190 159/161 113/113 169/169
F2 144/144 138/138 154/191 187/196 161/161 113/113 169/169
F3 157/157 138/138 154/176 187/190 146/146 112/112 172/172
F4 139/139 158/158 154/163 190/190 146/146 115/115 172/172
F5 157/157 138/138 154/176 196/196 146/146 115/115 160/160
F6 157/157 145/145 154/177 187/190 146/146 115/115 172/172
F2 144/144 138/138 154/191 187/196 161/161 113/113 169/169
F3 157/157 138/138 154/176 187/190 146/146 112/112 172/172
F4 139/139 158/158 154/163 190/190 146/146 115/115 172/172
F5 157/157 138/138 154/176 196/196 146/146 115/115 160/160
F6 157/157 145/145 154/177 187/190 146/146 115/115 172/172
[0129] 结果发现：用本发明实施例1的31对引物组合对6个豌豆品种进行PCR扩增，上述两种方法测得的6个豌豆样品变异位点均一致，结果见表21-表24，且与本发明建立的豌豆指纹图谱目标品种的差异位点数＜3，F1-F6为待测6个豌豆品种，经过对比鉴定得到F1-F6分别对应海门白花豌豆(W9)，无须豆尖1号(W15)，草原276(W27)，科碗2号(W32)，成碗8号(W44)，食荚大菜碗6号(W49)，与已知品种名称一致，准确度100％。表明本发明实施例1筛选得到的31对引物组合可以较好的可以区分不同豌豆品种。应用本发明实施例2提供的鉴别豌豆品种的方法准确性较高，适合推广使用。
[0130] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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