一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法
专利汇可以提供一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种双标记报告 荧光 多重病原体核酸检测方法，本发明在 现有技术 的 基础 上设计出包括两种荧光基团，以及一种或两种淬灭荧光基团标记的探针，并使用该探针检测核酸，所述被检测核酸选自病原体，本发明所述探针包括两种荧光基团，称为双标记的报告荧光，所述报告荧光选自FAM、HEX/VIC/HEX/、TAMRA、Cy3、Cy5、CY5.5、Texax、ROX，本发明所述探针包括淬灭荧光，选自BHQ1、BHQ2与BHQ3。，下面是一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法专利的具体信息内容。
1.一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法，其特征在于，包括使用两种荧光基团，以及一种或两种淬灭荧光基团标记的探针，并使用该探针检测核酸。
2.根据权利要求1所述的检测方法，所述病原体，选自：呼吸道病原体、发热伴出疹病原体、感染性腹泻、食源重要病原体、虫媒传染病、人畜共患病原体、肝炎病毒、烈性传染病病原体。
3.根据权利要求2所述的检测方法，所述呼吸道病原体，选自：甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、流行性脑膜炎双球菌、军团菌、百日咳、副百日咳、结核分枝杆菌等病毒细菌及其亚型；发热伴出疹病原体选自：肠道病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、伤寒副伤寒、细小病毒、巨细胞病毒、立克次体等病毒细菌及亚型；感染性腹泻及食源重要病原体选自：诺如病毒、札如病毒、轮状病毒、星状病毒、霍乱弧菌、致泻性大肠埃希菌、副溶血弧菌、弯曲曲、志贺氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、假单胞菌等病毒细菌及其亚型；虫媒传染病选自：布尼亚病毒、登革热病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒、基孔肯雅热病毒、疟原虫等病毒细菌及其亚型；人畜共患病原体、肝炎病毒选自：甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒；动物传染病原体选自：口蹄疫、猪瘟、伪狂犬、乙脑、猪细小、布鲁菌病、链球菌病、附红体病、猪肺疫、猪副伤寒、猪大肠杆菌病、狂犬病、蓝耳病、猪流感、猪痢疾、猪丹毒、猪喘气病、猪痘。
4.根据权利要求2所述的检测方法，所述病原体选自：甲型流感病毒(FLUA)，H1N1亚型流感病毒，H3N2亚型流感病毒，乙型流感病毒(FLUB)，BV亚型流感病毒，BY亚型流感病毒。
5.根据权利要求2所述的检测方法，所述探针，其中包括两种荧光基团，称为双标记的报告荧光，所述报告荧光选自FAM、HEX/VIC/HEX/、TAMRA、Cy3、Cy5、CY5.5、Texax、ROX，所述淬灭荧光，选自BHQ1、BHQ2与BHQ3；每个报告荧光可以是FAM、HEX/VIC/Joe、Cy3、Cy5、CY5.5、Texax、ROX任意两个标记的组合。
6.根据权利要求2所述的检测方法，所述的方法包括以下步骤：
步骤1，样本提取
病原样本类型包括拭子类、病毒培养物、细菌、真菌、组织、血浆、血清、全血、干血斑、粪便、环境样本，提取试剂可以用商品化试剂盒进行核酸提取，其方法可以是硅胶膜或磁珠法；
步骤2，PCR；
步骤3，荧光检测；
步骤4，定性计算。
7.根据权利要求2所述的检测方法，所述的方法，其中步骤1的方法步骤如下：
1)取30μl拭子类临床样本，加入50μl核酸提取液中，混匀，90℃裂解4min；
2)干血斑样本，打6mm斑，加1ml去红细胞裂解液，室温放置3min，8000rpm离心3min，加入50μl核酸提取液，混匀，90℃裂解4min；
6
3)全血样本，建议取1－5*10白细胞，加入50μl核酸提取液，混匀，90℃裂解4min；
4)尿液样本建议取100μl尿液样本，8000rpm离心，去上清，沉淀加入50μl核酸提取液，混匀，90℃裂解4min；
5)粪便样本建议水样便采取200μl，成形便采取黄豆大小的粪量，加入900μlPBS，100μl氯仿，漩涡震荡5-10分钟，12000rpm离心2min，转移上清至另一干净、无核酸酶的EP管中；取
30μl上清入50μl核酸提取液，90℃裂解4min；
6)污染严重的水源样本，建议5000rpm离心1-2min，转移上清30μl至50μl核酸提取液中，混匀，90℃裂解4min；
7)细菌真菌培养液10μl，或用牙签挑一菌斑至50μl核酸提取液中，混匀，90℃裂解
4min；
8)取出加样管，瞬时离心，上清即是提取的核酸；
其中，步骤2的PCR方法，步骤如下：
1)根据病原的保守与特异区设计引物与探针，探针可以是同一条序列两种报告集团标记也可以是不同序列两种标报告集团标记；并交专业的公司合成；
2)根据合成公司的报告单，将引物与探针稀释成10-100mM；
3)进行PCR反应的调配：调配PCR缓冲液、酶、Mg2+、dNTPs与引物探针的量；
PCR缓冲液终浓度：1×
Taq聚合酶终浓度:0.1-1U/μl
RT逆转录酶终浓度：1-10U/μl
Mg2+终浓度：1-5mM
dNTPs终浓度：0.1-0.8mM
引物与探针终浓度：50-500nM
4)PCR总体系可以是20μl-100μl
其中，步骤3，荧光检测方法步骤如下：
扩增条件，针对RNA病原可以使用以下程序
程序1
程序2
针对DNA病原扩增程序如下：
其中，步骤4，定性计算方法，步骤如下：
定性判断值如下
DNA病原阳性判断值
CT值 结果判断
无CT值或CT＝0 阴性
0
8.一种试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1-7任何一项权利要求中的所述的探针及其相关的试剂。
9.根据权利要求8的试剂盒，还包括以下成分：
1)反应液
2)酶混合液
3)阳性对照
4)阴性对照
其中，反应液：包括PCR缓冲液终浓度、dNTPs、Mg2+、检测病原的引物与探针和无核酸酶水；
其中，酶混合液：包括Taq聚合酶或/与RT逆转录酶及酶稀释液，按一定比例混匀；
其中，阳性对照：有无核酸酶水稀释的人工假病毒，分装成200ul/支；
其中，阴性对照：无核酸酶水，质检后分装。
10.权利要求9所述试剂盒的使用方法，步骤如下：
针对DNA病原检测
1)反应体系的配制：
取出试剂盒，在室温下融化并漩涡震荡60秒后(酶不需要震荡)，6000rpm离心10秒；计算需准备反应试剂人份数n(n＝样本数+2管对照)；每人份反应体系配制如下：
配制体系
试剂名称 加样量(μl)/每人份
ADV反应液 19
Taq聚合酶 1
总体积 20
计算上述试剂的各使用量，充分混匀后，离心6000rpm 10秒，按20μl的量分装到n个PCR反应管中；
2)加样：
取5μl(待测样本DNA、阴性对照、阳性对照)分别加入PCR扩增管，反应总体系为25μl；
3)扩增检测：
将加样后的PCR扩增管分别转移到全自动荧光定量PCR检测仪上进行扩增检测，全自动荧光定量PCR检测仪(RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000、STRATAGENE Mx3000p型)扩增程序：
对于ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自动荧光定量PCR检测仪，荧光信号设置为：Reporter Dye1：FAM、Quencher Dye1：NONE，Passive Reference：NONE；荧光PCR扩增程序如下；
4)反应程序：
对于RNA病原检测：
1)反应体系的配制：
取出试剂盒，在室温下融化并漩涡震荡60秒后(酶不需要震荡)，6000rpm离心10秒；计算需准备反应试剂人份数n(n＝样本数+2管对照)；每人份反应体系配制如下：
反应体系配制
试剂名称 加样量(μl)/每人份
反应液 18
酶混合液 2
总体积 20
计算上述试剂的各使用量，充分混匀后，离心6000rpm 10秒，按20μl的量分装到n个PCR反应管中；
2)加样：
取5μL(待测样本RNA、阴性对照、阳性对照)分别加入PCR扩增管；
3)扩增检测：
将加样后的PCR扩增管分别转移到全自动荧光定量PCR检测仪上进行扩增检测，全自动荧光定量PCR检测仪(RG3000、ABI Prism7500、ABI Prism 7000、STRATAGENE Mx3000p型)扩增程序，
程序1
程序2
一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法
技术领域：
发明内容
ADV反应液 19
Taq聚合酶 1
总体积 20
酶混合液 2
总体积 20
具体实施方式
反应液 18 32
Taq聚合酶 2 8
总体积 20
酶混合液 2
总体积 20
NONE；Passive Reference：NONE。荧光PCR扩增程序的设置见表1-2。反应总体积为25μl。
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