背景技术

利什曼病(leishmaniasis)是一种原生动物寄生虫病，该病流行于88个国 家中，导致严重的发病率和死亡率。至少20种利什曼病能通过白蛉叮咬人、 狗和各种野生脊椎动物宿主进行传播，起源于皮肤利什曼病，再扩散到皮肤 粘膜型利什曼病，更甚至成为内脏利什曼病。估计，每年皮肤利什曼病发病 例为100万至150万，内脏利什曼病为500,000例。患病人数估计为3.5亿人， 流行人数为1200万。日益增加的风险因素促使利什曼病在全世界很多国家成 为受关注的公众健康问题。

治疗利什曼病的最常用药物是葡萄糖酸锑钠(Pentostam)和甲葡胺锑酸盐 (Glucantime)。含锑的化疗药物需要胃肠外高剂量给药，且疗程长。对锑治疗 无效病例所使用的二线药物包括两性霉素B(AMB)、巴龙霉素(aminosidine) 和喷他脒(pentamidine)。但是，所有这些药物由于在有效剂量时具有无法接 受的副作用而远不能达到满意程度。最近开发的两性霉素B的脂质体剂型 (AmBisomeTM)对于那些对锑治疗无效的粘膜皮肤型利什曼病表现出很好的治 疗效率。但是，其给药技术难度大，治疗成本昂贵。

寄生虫对含锑药物替代品的普遍耐受性、在使用药物的高毒性以及利什 曼病/HIV联合感染的新发疾病促使人们不断寻找其它可选择的治疗物质。由 婴儿利什曼原虫(L.infantum)引起的内脏利什曼病是一种与AIDS相关的机 会感染，尤其是在欧洲南部地区。

近几年，烷基溶解性磷脂类似物(ALPs)由于其具有抗肿瘤活性和免疫 调节性质而引起人们极大的兴趣。对各种ALPs的构效关系的研究表明，长 链烷基和磷酸胆碱部分是醚型脂类似物的抗肿瘤活性的必不可少的最小结 构。这一发现促使对烷基磷酸胆碱(APCs)的合成。在烷基链同族体中，十六 烷基磷酸胆碱(HePC)具有抗肿瘤活性，于1992年在德国被批准成药，用于 局部治疗转移性乳腺癌。

体外和体内的几项研究表明包括HePC的烷基磷酸胆碱，以及诸如依地 福新(edelfosine)、伊莫福新(ilmofosine)和SRI-62,834的烷基甘油磷酸胆 碱都具有抗利什曼病的作用。据报道，十六烷基磷酸胆碱对治疗感染了内脏 利什曼病的小鼠具有很好疗效，口服米替福新(miltefosine)比皮下给予葡萄 糖酸锑钠的疗效高600倍。在这些有前景的考察结果下，已完成了HePC(米 替福新)口服治疗印度人内脏利什曼病的I期和II期临床试验，III期临床试 验正在进行中。用100-150mg/日的剂量，治疗28天，治愈率达88％-100％。 这样的结果鼓舞了对米替福新在新世界治疗皮肤利什曼病的疗效研究，目前 正处于II期临床试验中。在I期临床试验中，米替福新以100-150mg的剂 量，治疗3周，其治愈率达94％。各个阶段的临床试验，米替福新表现的主 要副作用是胃肠系统副作用，最常见为适度的呕吐和腹泻。在一些患者中还 出现短暂的转氨酶升高或脲/血肌氨酸酐升高的现象，随着继续治疗，上述指 标都得以降低。尽管米替福新的毒性看起来比一些肠胃外给药药物小一些， 但在严重患者身上，诸如营养不良或脱水患者身上，仍可能产生严重的胃肠 道症状。另外，禁忌对孕妇进行治疗，这是因为米替福新有致畸作用。此外， 米替福新的半衰期长，治疗有效率低，一个疗程的治疗会使血液几周内都为 亚治疗水平。这些药物的特性可能会引起耐药性。在欧洲，米替福新对HIV 联合感染患者仅表现出暂时有效性。因此，需要寻找治疗原生动物性疾病尤 其是利什曼病的新型磷脂类药物，而且这种药物不会引起严重副作用。

美国专利文献US 5,436,234公开了以下通式的化合物：

R-X-A-PO3-(CH2)2-N+R1R2R3

其中，R为瓢儿菜基(erucyl)、巴西烯基(brassidyl)或二十四烯基 (nervonyl)；R1，R2和R3独自为包含至多4个碳原子的直链、支链或环状饱 和或不饱和烷基，其可含一个羟基，其中，两个基团可以相连形成一个环； A为化合键或下式之一的基团：

——CH2-CH2—CH2—O——(IV)

当A优选为化合键时，X为氧原子。通式为R-X-A-PO3-(CH2)2-N+R1R2R3的化合物及包含这些化合物的药物组合物可被用于治疗原生动物性疾病、真 菌性疾病、自身免疫性疾病和骨髓损伤。

美国专利文献US 6,254,879是申请号为08/469,779、目前美国专利号为 5,980,915的部分继续申请，其公开了口服或局部给药用于治疗原生动物性疾 病尤其是利什曼病的一种新型药剂，该药剂含有的活性物质是具下列通式结 构的一个或多个化合物：

R1-PO4-CH2CH2-N+R2R3R4

其中，R1为含有12-20个碳原子的饱和烃基或具一个不饱和键或多个不 饱和键的烃基。

美国专利文献US 6,344,576涉及一种通式(I)的磷脂类化合物：

其对水不溶或水难溶活性物质具有助溶作用，并用于将活性物质输送至 细胞内来治疗疾病，如癌症和原生动物性疾病。

其中，A为

其中，R1和R2独自为氢、饱和的或不饱和的酰基或烷基，其任选为支 链的或/和被取代的，酰基和烷基的碳原子总数为16至44个碳原子。

发明概述

本发明的一个方案在于提供一种新型的含有磷脂物质的环，及其用于治 疗原生动物性疾病，诸如利什曼病、锥虫病、疟疾、弓形体病、babeosis、阿 米巴痢疾和兰伯氏鞭毛虫病(lambliasis)的应用。本发明的化合物包括通式 A-X-PO3-W的磷脂类物质。

本发明的另一个方案涉及一种上述化合物的制备方法。

本发明的进一步方案涉及一种治疗原生动物感染的方法，其包括以治疗 方式施用有效量的能抑制感染的本发明化合物。

通过以下详细描述、详细特征、特性、特点以及相关要素、制备步骤、 在说明书和实施例中阐述的与其他各要素相关的内容来进一步理解本发明。

附图说明

图1显示了在不同浓度的本发明化合物存在下，所存活的THP1细胞的 百分数。

图2为本发明的一些化合物。

图3所选实施例的溶血活性与米替福新的比较。

发明详述

本发明涉及一种新型的通式为A-X-PO3-W的含有环的磷脂物质，及其旋 光异构体和几何异构体以及其生理可接受盐，和包含上述物质的药物组合物。

通式为A-X-PO3-W的本发明磷脂化合物在残基A中磷脂结构处含有各 种大小和形状的环，这是现有技术中没有公开过的。现有技术的化合物的残 基A中仅含有直链或支链烷基取代基，除美国专利文献5,436,234外，其残 基A中具有四氢呋喃取代基。本发明的化合物并没有包含现有技术的化合物。

本发明的新型环取代的磷脂类物质通过通式A-X-PO3-W表示。

A包括选自下式之一的基团：Y、YR1、R1Y、R1YR4、R1OY、YOR1、 R1YOR2或R1OYOR2。A优选为YR1、R1YOR2或R1OYOR2。

W包括选自下式之一的基团：R3Q或含有一个氮原子的C4-C7非芳香性 杂环，其中所述的杂环包括至少一个杂原子，该杂原子独自地选自氮、氧、 硫及其混合，所述杂环可以被一个或多个取代基所取代。优选地，取代基独 立地选自羟基、卤素、烷基、环烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基或 氨基。

Y包括碳环、含至少一个取代基的碳环、稠合双环、含至少一个取代基 的稠合双环、桥双环、含至少一个取代基的桥双环、桥三环、含至少一个取 代基的桥三环、杂环、含至少一个取代基的杂环、芳环体系或含至少一个取 代基的芳环体系、杂芳环体系或含至少一个取代基的杂芳环体系。

X包括化合键、亚甲基(-CH2-)或选自氮、氧、硫的一个杂原子。优选的 杂原子为氧原子。

R1包括选自含有约3至约7个环原子的碳环、含有约4至约7个环原子 的杂环、含有约5至约7个环原子的芳环、含有约5至约7个环原子的杂芳 环或至少一个环原子上具有一个取代基的上述任意基团、含有约3至约20 个碳原子的饱和的或不饱和的直链或支链脂肪烃、含有约3至约20个碳原子 的饱和的或不饱和的直链或支链脂肪烃，其含有一个或多个独立选择的杂原 子、含有约3至约20个碳原子的饱和的或不饱和的直链或支链脂肪烃，其含 有至少一个独自选立于约4至约7个环原子的碳环、约4至约7个环原子的 杂环、约5至约7个环原子的芳环、约5至约7个环原子的杂芳环、或在至 少一个环原子上具有一个取代基的上述任意环、或上述任意约3至约20个碳 原子的烃链，其含至少一个独立选择的取代基。优选地，约3至约20个碳原 子烃链的取代基独立选自羟基、卤素、烷基、环烷基、芳基、烷氧基、烷氧 羰基、烷硫基或氨基。

R2包括任意一种环，其选自含约3至约7个环原子的碳环、含约4至约 7个环原子的杂环、含约5至约7个环原子的芳环、含约5至约7个环原子 的杂芳环、至少一个环原子上具有一个取代基的上述任意基团、含约2至约 5个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链脂肪烃链、含约2至约5个碳原子 的饱和或不饱和的直链或支链脂肪烃链，其具有一个或多个独立选择的杂原 子、含约2至约5个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链脂肪烃链，其包含 至少一个独立选自于含约4至约7个环原子的碳环、约4至约7个环原子的 杂环、约5至约7个环原子的芳环、约5至约7个环原子的杂芳环；在至少 一个环原子上具有一个取代基的上述任意基团、或上述任意含约2至约5个 碳原子的烃链，其含有至少一个独立选择的取代基。

优选地，R2包括C2饱和或不饱和烷基或烯基、可被一个或多个选自羟 基、卤素、烷基、环烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基和氨基的取代 基所取代的C2饱和或不饱和烷基或烯基。

R3包括任意选自含约3至约9个环原子的碳环、含约4至约9个环原子 的杂环、含约5至约9个环原子的芳环、含约5至约9个环原子的杂芳环、 在至少一个环原子上有取代基的上述任意基团、约C2至约C5的饱和或不饱 和的直链或支链的脂肪烃链、约C2至约C5的饱和或不饱和的直链或支链的 脂肪烃链，其包含一个或多个分别选择的杂原子、约C2至约C5的饱和或不 饱和的直链或支链的脂肪烃链，其至少包含一个分别选自于含约4至约7个 环原子的碳环、约4至约7个环原子的杂环、约5至约7个环原子的芳环、 约5至约7个环原子的杂芳环；或在至少一个环原子上有取代基的上述任意 环、或上述任意约C2至约C5烃链，其含有至少一个独立选择的取代基。

优选地，R3包括C2饱和或不饱和烷基或烯基、可被一个或多个选自羟 基、卤素、烷基、环烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基和氨基的取代 基所取代的C2饱和或不饱和烷基或烯基，或C1位与氧相连、C2位与Q相 连的C3-C8的环烷基。

R4包括独立选自R1或R2的任意基团。

Q包括铵基，该铵基可一次或多次被C1-C6烷基取代、或包括C3-C7杂环， 其含有一个与R3相连的氮原子，其中所述杂环可以含有一个或多个分别选自 氮、氧、硫及其组合的杂原子，该杂环还可被一个或多个取代基所取代、杂 双环，其含有与R3相连的一个氮原子，其中所述杂双环可以含有一个或多个 分别选自氮、氧、硫及其组合的杂原子，该杂双环可被一个或多个取代基所 取代、杂三环，其含有与R3相连的一个氮原子，其中所述杂三环可以含有一 个或多个分别选自氮、氧、硫及其组合的杂原子，该杂三环可被一个或多个 取代基所取代。优选地，取代基独自选自羟基、卤素、烷基、环烷基、芳基、 烷氧基、烷氧羰基、烷硫基和氨基。

优选的R1残基的实例包括C5-C18亚烷基或C5-C18烷基，最优选的是亚 戊基、亚十一烷基、亚十二烷基、亚十四烷基、亚十六烷基、或戊基、十一 烷基、十二烷基、十四烷基和十六烷基。

优选的Y残基的实例包括C3-C6碳环、取代的碳环、桥三环体系或取代 的桥三环体系、芳环，最优选的是环己基、金刚烷基或苯基。

R2和R3最优选的是C2饱和烷基。X最优选的是氧。Q最优选的是三甲 基铵或N-甲基吗啉代(morpholinio)或N-甲基哌啶子基(piperidinio)。

本发明的化合物包括任何所有异构体和旋光体，以及其加成盐，尤其是 药学可接受加成盐。通常，本发明的组合物可以选择性的制成包括本发明公 开的适宜化合物，或由本发明的化合物所组成，或基本上由本发明的化合物 组成的制剂。本发明的组合物还可以或可选择性地制成不含有或基本上不含 有现有技术组合物中使用的组分、材料、组成、赋形剂等物质，或者对于实 现本发明功能和/或目的没有必要的物质。

除非特别定义，“酰基”的通式为-C(O)烷基。

除非特别定义，“酰氧基”的通式为-O-酰基。

除非特别定义，“醇”的通式为烷基-OH，包括一级、二级和三级醇形式。

除非特别定义，“烷基”或“低级烷基”是指含1至约16个碳原子的直链、 支链、或环状的烷基，其包括如甲基、乙基、丙基、丁基、己基、辛基、异 丙基、异丁基、叔丁基、环丙基、环己基、环辛基、乙烯基和烯丙基。烷基 可以是饱和的或不饱和的。除非另有特别限定，烷基可以是未被取代的、在 任意位置上的单取代或可能情况下的多取代。除非另有特定限定，环烷基包 括单环、双环、三环和多环，如降冰片基、金刚烷基和相关的萜类。

除非另有特别限定，“烷氧基”的通式为-O-烷基。

除非另有特别限定，“烷基巯基”的通式为-S-烷基。

除非另有特别限定，“烷基氨基”的通式为-NH-烷基。

除非另有特别限定，“二烷基氨基”的通式为-N-(烷基)2。除非另有特 别限定，二烷基氨基包括环胺化合物，如哌啶和吗啉。

除非另有特别限定，芳环是含有约5个至约7个环原子的不饱和环结构， 其中的环原子仅为碳原子。芳环结构可以是未被取代的、在任意位置上的单 取代或可能情况下的多取代。

除非另有特别限定，“芳基”是指环原子仅为碳原子的芳环体系，如苯基、 联苯基或萘基。芳基可以是未被取代的、在任意位置上的单取代或可能情况 下的多取代。

除非另有特别限定，“芳酰基”的通式为-C(＝O)-芳基。

除非另有特别限定，双环结构包括两个稠合环或桥环，其环原子仅为碳 原子。双环结构可以是饱和的或不饱和的。双环结构可以是未被取代的、在 任意位置上的单取代或可能情况下的多取代。各单环可以相同也可不同。双 环结构的实例包括二甲基-双环[3，1，1]庚烷、双环[2，2，1]庚二烯、十氢萘和二 环辛烷。

除非另有特别限定，碳环是指具有约3至约8个仅为碳的环原子的饱和 的或不饱和的非芳环结构，如，环己二烯或环己烷。该碳环可以是未被取代 的、在任意位置上的单取代或可能情况下的多取代。

除非另有特别限定，“卤素”是指选自于氟、氯、溴和碘的原子。

除非另有特别限定，杂芳环是指具有约5至约8个环原子的不饱和环结 构，所述环原子包含碳原子和一个或多个包括氧、氮和/或硫的杂原子，如吡 啶、呋喃、喹啉及它们的衍生物。杂芳环可以是未被取代的、在任意位置上 的单取代或可能情况下的多取代。

除非另有特别限定，杂双环结构包括两个稠合环或桥环，其环原子包括 碳原子和一个或多个包括氧、氮和/或硫的杂原子。杂双环结构可以是饱和的 或不饱和的。杂双环结构可以是未被取代的、在任意位置上的单取代或可能 情况下的多取代。各单环可以相同也可不同。杂双环结构的实例包括莨菪烷、 奎宁环和四氢苯并呋喃。

除非另有特别限定，杂环是指具有约3至约8个环原子的饱和或不饱和 环结构，所述环原子包含碳原子和一个或多个包括氧、氮和/或硫的杂原子， 如哌啶、吗啉、哌嗪、吡咯烷、硫代吗啉、四氢吡啶及它们的衍生物。所述 杂环可以是未被取代的、在任意位置上的单取代或可能情况下的多取代。

除非另有特别限定，杂三环结构包括三个环，其可以是稠合环、桥环或 既包括稠合环又包括桥环的三环，其环原子包括碳原子和一个或多个包括氧、 氮和/或硫的杂原子。杂三环结构可以是饱和的或不饱和的。杂三环结构可以 是未被取代的、在任意位置上的单取代或可能情况下的多取代。各单环可以 相同也可不同。杂三环结构的实例包括2，4，10-三氧杂金刚烷、四十氢邻二氮 杂菲。

除非另有特别限定，杂多环结构包括三个以上的环，其可以是稠合环、 桥环或既包括稠合环又包括桥环的杂多环，其环原子包括碳原子和一个或多 个包括氧、氮和/或硫的杂原子。杂多环结构可以是饱和的或不饱和的。杂多 环结构可以是未被取代的、在任意位置上的单取代或可能情况下的多取代。 各单环可以相同也可不同。杂多环结构的实例包括氮杂金刚石、5-降冰片烯 -2，3-二羧甲酰亚胺。

除非另有特别限定，术语“苯酰基”的通式为-苯基-酰基。

除非另有特别限定，多环结构包括三个以上的环，其可以是稠合环、桥 环或既包括稠合环又包括桥环的杂多环，其环原子仅为碳原子。多环结构可 以是饱和的或不饱和的。多环结构可以是未被取代的、在任意位置上的单取 代或可能情况下的多取代。各单环可以相同也可不同。多环结构的实例包括 金刚石、二环辛烷、降莰烷和双环壬烷。

除非另有特别限定，螺环是指两个环仅有一个共用环原子的环体系。螺 环可以包括具有约3个至约8个环原子的饱和碳环、具有约3个至约8个环 原子的杂环，其中约3个环原子可以是N、S或O或其组合。

除非另有特别限定，三环结构包括仅为碳环原子三个环，其可以是稠合 环、桥环或既包括稠合环又包括桥环的三环。三环结构可以是饱和的或不饱 和的。三环结构可以是未被取代的、在任意位置上的单取代或可能情况下的 多取代。各单环可以相同也可不同。三环结构的实例包括芴和蒽。

除非另有特别限定，术语“取代”是指被如下取代基在任意位置上的取代。 上述所述的本发明所采用的取代基是不明显降低本发明化合物生物活性的基 团。不明显降低本发明化合物生物活性的取代基包括，如H、卤素、N3、NCS、 CN、NO2、NX1X2、OX3、OAc、O-酰基、0-芳酰基、O烷基OH、O烷基NX1X2、 NH-酰基、NH-芳酰基、NHCO烷基、CHO、CF3、COOX3、SO3H、PO3X1X2、 OPO3X1X2、SO2NX1X2、CONX1X2、烷基、醇、烷氧基、烷基巯基、烷基氨 基、二烷基氨基、磺酰氨基、硫代烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取 代的杂芳基、或当被取代结构有两个相邻碳原子时，取代基可以为亚甲基二 氧基，其中X1和X2独立地包括H或烷基，或X1和X2共同包括含有约4至 约7个环原子的杂环的一部分，且任选还含有选自O、N或S的一个杂原子， 或X1和X2共同包括含有约5至约6个环原子的酰亚胺环的一部分，X3包括 H、烷基、羟基低级烷基、或烷基-NX1X2。除非另有特别限定，取代基团可 以在任意位置取代。

本发明还涉及原生动物性疾病如利什曼病、锥虫病、疟疾、弓形体病、 babeosis、阿米巴痢疾和兰伯氏鞭毛虫病(lambliasis)的治疗方法。该方法包 括以治疗方式给予抑制感染有效量的一种本发明化合物。在一个实施方式中， 有效剂量包括足量的一种旋光体或旋光体的混合物，其所述化合物的所有旋 光体都具有抗原生动物的性质。在另一个实施方式中，化合物只有一种旋光 体具有显著的抗原生动物性质，其有效剂量包括足量的纯的抗原生动物的旋 光体。

本发明的化合物可以局部给药、肠道给药、肠胃外给药，药物可以是液 体或固体形式。

本发明进一步涉及一种制备所述化合物的方法。通式为A-X-PO3-W的本 发明的化合物通过下述方法进行合成：

i)在有机溶剂如四氢呋喃中用三氯氧化磷处理适宜的醇A-OH，其中A 的定义如上。溶剂中含有有机碱，如三乙胺，其能够在水解后提供相应的磷 酸衍生物。

ii)在诸如吡啶的有机碱中，用1-(1，3，5-三甲基苯(mesitylen)-2-磺酰 基)-3-硝基-1H 1，2，4-三唑或2，4，6-三异丙基苯磺酰氯处理上述磷酸，随后加 入适宜醇W-OH，其中W的定义如上，然后加热混合物，水解后得到磷脂 A-X-PO3-W。

通过以下非限定性实施例对本发明作进一步举例说明。

实施例

合成方法

总方法

所有反应在严格干燥条件下进行。所有新化合物的NMR图谱由Bruker AC 300光谱仪记录，在300MHz下测定1H，在75.43MHz下测定13C，在 121.44MHz下测定31P。在7.24ppm下的CHCl3共振以单位δ表示1H NMR 光谱，作为化学位移共振。13C NMR的位移采用77.00ppm下相对于CDCl3 的单位来表示，31PNMR光谱采用相对于85％H3PO4的单位δ表示，作为外 标。薄层色谱使用的硅胶板为MerckF254。用硅胶(200-400目)进行色谱纯化。

制备醚型磷脂的总方法

在含有三氯氧化磷(0.09mL，1mmol)和三乙胺(0.25mL，1.8mmol)的干 燥THF(5mL)中，0℃下，逐滴加入干燥THF(7mL)中的相应醇(1mmol)。室 温搅拌混合物2个小时，然后加水(3mL)进行水解。室温搅拌1小时后，用 水稀释反应混合物，然后用乙酸乙酯和二氯甲烷提取水相。用盐水洗涤混合 有机提取物，然后用无水Na2SO4干燥，真空下蒸除溶剂，得到相应的磷酸衍 生物，加入7mL无水吡啶并在40℃下搅拌2个小时，使磷酸衍生物转化为 吡啶盐。冷却后，真空下蒸除溶剂，在残余物中加入吡啶(5mL)。边冷却所 得溶液边逐滴加入干燥吡啶(2mL)中的1-(1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝 基-1H-1，2，4-三唑(MSNT)(0.593g，2mmol)或2，4，6-三异丙基苯磺酰氯 (TIPS-C1)(0.606g，2mmol)溶液，之后加入胆碱盐酸盐(0.210g，1.5mmol)或 N(2-羟乙基)-N-甲基哌啶溴化物(0.448g，1.5mmol)或N-(2-羟乙基)-N-甲 基吗啉溴化物(0.452g，1.5mmol)。在40℃下搅拌反应混合物达48-56个小时。 冷却后，加入水(2mL)和2-丙醇(7mL)，室温搅拌1个小时，使反应混合物 水解。真空下蒸除溶剂，用色谱柱纯化所得粗产物，先用CH2Cl2/MeOH/25％ NH4OH(60/50/5)洗脱，然后用MeOH/25％NH4OH(95/5)洗脱，真空下蒸除溶 剂。用CHCl3稀释残余物，孔膜(0.5M，FH Millipore)过滤。蒸除溶剂，得到 目标产物。

实施例1

1-{2-{[(4-亚十二烷基环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲 铵内盐

通过上述总方法，采用2-(4-亚十二烷基环己氧基)乙醇、TIPS-C1和盐酸 胆碱，得到上述命名的化合物(0.327g，69％)。1H NMR：δ5.06(t，J＝6.7Hz，1H， C＝CH)，4.24(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.89(broad s，2H)，3.76(broad s，2H)， 3.57(broad s，2H)，3.40-3.35(m，1H，CHO)，3.30(s，9H，N+(CH3)3)，2.40-1.72(m， 8H)，1.42-1.33(m，2H)，1.24(broad s，18H，(CH2)9)，0.84(t，J＝7.0Hz，3H， CH3)；31P NMR：δ-2.16。

实施例2

1-{2-{[(4-亚十二烷基环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基}乙基}-1-甲基哌啶 鎓内盐

通过上述总方法，利用2-(4-亚十二烷基环己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2- 羟基乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.350g，68％)。1H NMRδ：5.16(t，J＝6.70Hz，1H，C＝CH)，4.24(bs，2H，POCH2CH2N)，3.82-3.55 (m，10H)，3.30(broad s，1H，CHO)，3.25(s，3H，N+CH3)，1.92-1.43(m，14H)， 1.41-1.32(m，2H，CH2CH＝)，1.19(broad s，18H，(CH2)9)，0.83(t，J＝7.0Hz， 3H，CH3)；31PNMRδ：-2.1。

实施例3

1-{2-{[(4-亚十二烷基环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基}乙基}-1-甲基吗啉 鎓内盐

通过上述总方法，利用2-(4-亚十二烷基环己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2- 羟基乙基)-N-甲基吗啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.330g，64％)。1H NMR：δ5.11(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.13(s，2H，POCH2CH2N)，3.82-3.32(m， 15H)，3.16(s，3H，N+CH3)，1.92-1.47(m，8H)，1.42-1.34(m，2H，CH2CH＝)，1.27 (broad s，18H，(CH2)9)，0.83(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMRδ：-2.04。

实施例4

1-{2-{[(4-亚十四烷基环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲 铵内盐

通过上述总方法，采用2-(4-亚十四烷基环己氧基)乙醇、TIPS-C1和盐酸 胆碱，得到上述命名的化合物(0.166g，33％)。1H NMR：δ5.05(t，J＝6.7Hz，1H， CH＝C)，4.23(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.88(broad s，2H)，3.75(broad s，2H)， 3.55(broad s，2H，CH2N)，3.40-3.35(m，1H，CHO)，3.32(s，9H，N+(CH3)3)， 2.41-2.37(m，1H)，2.17-2.13(m，1H)，1.89-1.74(m，8H)，1.21(broad s，22H， (CH2)11)，0.89(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMR：δ-2.26；13C NMR：δ136.9， 122.7，74.3，67.7，64.7，54.2，33.4，32.5，31.9，30.1，29.6，29.3，27.4，24.9，22.6， 14.0。

实施例5

1-{2-{[(4-亚十四烷基环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基}乙基}-1-甲基哌啶 鎓内盐

通过上述总方法，利用2-(4-亚十四烷基环己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2- 羟基乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.201g，37％)。1H NMR：δ5.21(t，J＝6.7Hz，1H，CH＝C)，4.31(bs，2H，POCH2CH2N)，3.93-3.80 (m，4H)，3.60-3.43(m，6H，CH2N(CH2)2)，3.30(broad s，4H，NCH3，CHO)，2.40- 1.40(m，16H)，1.23(broad s，22H，(CH2)11)，0.88(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMR：δ-2.4。

实施例6

1-{2-{[(4-亚十四烷基环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基}乙基}-1-甲基吗啉 鎓内盐

通过上述总方法，利用2-(4-亚十四烷基环己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2- 羟基乙基)-N-甲基吗啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.218g，40％)。1H NMR：δ5.06(t，J＝6.7Hz，1H，CH＝C)，4.07(broad s，2H，POCH2CH2N)， 3.49-3.17(m，5H)，3.11(s，3H，N+CH3)，1.99-1.34(m，10H)，1.08(broad s，22H， (CH2)11)，0.78(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMR：δ-1.9。

实施例7

1-{2-{[(4-亚十六烷基环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲 铵内盐

通过上述总方法，采用2-(4-亚十六烷基环己氧基)乙醇、TIPS-C1和盐酸 胆碱，得到上述命名的化合物(0.196g，37％)。1H NMR：δ5.08(t，J＝6.7Hz， 1H，CH＝C)，4.09(broad s，2H，OP(O)CH2CH2N)，3.82(broad s，2H， OCH2CH2OP)，3.71(broad s，2H，OCH2CH2OP)，3.51-3.43(m，2H，CH2N)，3.04 (s，10H，CHO，N+(CH3)3)，2.45-2.40(m，1H)，2.25-2.20(m，1H)，2.02-1.85(m， 6H)，1.51-1.42(m，2H，CH2CH＝)，1.09(broad s，26H，(CH2)13)，0.71(t，J＝7.0 Hz，3H，CH3)；31P NMR：δ-2.04。

实施例8

1-{2-{[(4-亚十六烷基环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基}乙基}-1-甲基哌啶 鎓内盐

通过上述总方法，利用2-(4-亚十六烷基环己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2- 羟基乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.211g，37％)。1H NMR：δ5.13(t，J＝6.7Hz，1H，CH＝C)，4.35(broad s，2H，POCH2)，3.87(broad s，2H)，3.78(broad s，2H)，3.62-3.45(m，6H)，3.26(broad s，4H)，2.27-1.63(m， 8H)，1.52-1.41(m，2H，CH2CH＝)，1.24(broad s，26H，(CH2)13)，0.89(t，J＝7.0 Hz，3H，CH3)；31P NMR：δ-2.0；13C NMR：δ138.0，117.4，75.1，67.8，67.7，64.8， 63.3，61.8，58.7，48.8，37.2，31.8，30.1，29.7，29.6，29.4，29.3，28.4，27.7，27.2， 22.5，20.9，20.1，14.0。

实施例9

1-{2-{[(4-亚十六烷基环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基}乙基}-1-甲基吗啉 鎓内盐

通过上述总方法，利用2-(4-亚十六烷基环己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2- 羟基乙基)-N-甲基吗啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.206g，36％)。1H NMR：δ5.06(t，J＝6.70Hz，1H，CH＝C)，4.41(bs，2H，POCH2)，3.99-3.39(m， 15H)，3.35(s，3H，N+CH3)，2.45-2.40(m，1H，CHCHOCH2)，2.25-2.20(m，1H， CH2CHOCH)，2.13-1.85(m，6H)，1.22(broad s，28H，(CH2)14)，0.89(t，J＝7.0Hz， 3H，CH3)；31P NMR：δ-2.17；13C NMR：δ136.8，122.8，65.3，60.7，33.4，33.3， 32.4，31.8，30.1，29.6，29.4，29.3，27.4，24.9，22.6，14.0。

实施例10

1-{2-{[(5-亚环己基戊氧基)羟基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐

通过上述总方法，采用5-亚环己基戊醇、MSNT和盐酸胆碱，得到上述 命名的化合物(0.219g，66％)；1H NMR：δ4.99(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.21 (broad s，2H，POCH2CH2N)，3.74(broad s，4H，CH2OPOCH2CH2N)，3.34(s，9H， N+(CH3)3)，2.09-1.84(m，6H)，1.55-1.28(m，10H)；31P NMR：δ-2.16；13C NMR：δ139.8，120.8，66.1，65.4，59.1，54.2，37.1，30.6，28.6，27.8，26.9，26.4， 25.6；ESI-MS m/z：3 56.2(M++Na+)，334.2(M+)。

实施例11

1-{2-{[(5-亚环己基戊氧基)羟基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓内盐

通过上述总方法，采用5-亚环己基戊醇、MSNT和N-(2-羟乙基)-N- 甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.153g，41％)；1H NMR：δ5.02 (t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.28(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.82-3.42(m，8H， CH2OPOCH2CH2N(CH2)2)，3.31(s，3H，N+CH3)，2.08-1.48(m，16H)，1.23(broad s，6H，(CH2)3)；31P NMR：δ-2.04；ESI-MS m/z：374.2(M+)。

实施例12

1-{2-{[(5-亚环己基戊氧基)羟基膦氧基]乙基}-1-甲基吗啉鎓内盐

通过上述总方法，采用5-亚环己基戊醇、MSNT和N-(2-羟乙基)-N- 甲基吗啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.153g，41％)。1H NMR：δ5.01(t， J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.29(broad s，2H，POCH2CH2N)，4.11-3.68(m，12H)， 3.42(s，3H，N+CH3)，2.09-1.95(m，4H)，1.58-1.49(m，6H)，1.31(broad s，6H， (CH2)3)；31P NMR：δ-2.23；ESI-MS m/z：376.2(M+)。

实施例13

1-{2-{[(11-亚环己基十一烷氧基)羟基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵内 盐

通过上述总方法，采用11-亚环己基十一烷醇、MSNT和盐酸胆碱，得 到上述命名的化合物(0.220g，52％)。1H NMRδ：5.05(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)， 4.20(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.75-3.68(m，4H，CH2OPOCH2CH2N)，3.26(s， 9H，N+(CH3)3)，2.11-1.92(m，4H)，1.65-1.48(m，6H)，1.23(broad s，18H， (CH2)9)；31P NMR：δ-2.45；13C NMR：δ131.0，124.8，66.1，66.0，59.1，54.1， 31.0，30.2，29.9，29.7，29.6，29.5，29.3，28.6，28.0，27.8，27.0，26.9，25.9，25.7； ESI-MS m/z：440.2(M++Na+)，418.2(M+)。

实施例14

1-{2-{[(11-亚环己基十一烷氧基)羟基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓内 盐

通过上述总方法，采用11-亚环己基十一烷醇、MSNT和N-(2-羟乙基) -N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.315g，69％)。1H NMR：δ4.99 (t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.23(bs，2H，POCH2CH2N)，3.78-3.48(m，8H， CH2OPOCH2CH2N(CH2)2)，3.27(s，3H，N+CH3)，2.04-1.45(m，16H)，1.18(broad s，18H，(CH2)9)；31P NMRδ：-2.04；13C NMR：δ130.9，124.7，65.3，63.2，58.4， 48.5，37.0，31.0，30.9，30.1，29.8，29.6，29.5，29.4，29.2，28.6，27.9，27.7，26.8， 25.8，25.6；ESI-MS m/z：480.3(M++Na+)，458.3(M+)。

实施例15

1-{2-{[(11-亚环己基十一烷氧基)羟基膦氧基]乙基}-1-甲基吗啉鎓内 盐

通过上述总方法，采用11-亚环己基十一烷醇、MSNT和N-(2-羟乙基) -N-甲基吗啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.117g，25％)。1H NMR：δ 5.05(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.29(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.99-3.70(m， 12H)，3.48(s，3H，N+CH3)，2.08-1.92(m，4H)，1.65-1.48(m，6H)，1.23(s，18H， (CH2)9)；31P NMR：δ-2.13；13C NMR：δ131.0，124.8，65.8，64.3，60.7，58.5，48.3， 37.1，31.0，30.9，29.9，29.7，29.6，29.5，29.4，29.3，28.6，28.2，28.0，27.8，27.0， 25.8，25.7，17.6。

实施例16

1-{2-[(5-亚金刚烷基戊氧基)羟基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 通过上述总方法，采用5-亚金刚烷基戊醇、MSNT和盐酸胆碱，得到上述命 名的化合物(0.223g，58％)。1H NMR：δ4.96(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.22 (broad s，2H，POCH2CH2N)，3.77-3.71(m，4H，CH2OPOCH2CH2N)，3.29(s，9H， N+(CH3)3)，2.75(s，1H，CHC＝)，2.27(s，1H，CHC＝)，1.95-1.53(m，16H)， 1.34-1.29(m，2H)；31P NMR：δ-2.42；13C NMR：δ147.7，115.9，66.3，65.5，59.1， 54.3，40.5，39.8，38.9，37.2，32.0，30.6，28.6，26.6，26.2；ESI-MS m/z：408.1 (M++Na+)，386.1(M+)。

实施例17

1-{2-[(5-亚金刚烷基戊氧基)羟基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓内盐 通过上述总方法，采用5-亚金刚烷基戊醇、MSNT和N-(2-羟乙基)-N-甲 基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.272g，64％)。1H NMRδ：4.93(t，J＝ 6.7Hz，1H，C＝CH)，4.25(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.79-3.60(m，8H， CH2OPOCH2CH2N(CH2)2)，3.32(s，3H，N+(CH3)3)，2.72(s，1H，CHC＝)，2.24(s， 1H，CHC＝)，1.92-1.50(m，22H)，1.31-1.26(m，2H)；31P NMR：δ-1.9；13C NMR： δ：147.6，115.9，65.4，65.3，63.5，58.6，58.5，48.6，40.5，39.8，38.9，37.2，32.0，30.7， 30.6，28.6，26.6，26.2，20.9，20.2；ESI-MS m/z：448.2(M++Na+)，426.2(M+)。

实施例18

1-{2-[(5-亚金刚烷基戊氧基)羟基膦氧基]乙基}-1-甲基吗啉鎓内盐

通过上述总方法，采用5-亚金刚烷基戊醇、MSNT和N-(2-羟乙基)-N- 甲基吗啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.239g，56％)。1H NMRδ：4.94(t，J ＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.27(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.99-3.69(m，12H)， 3.43(s，3H，N+CH3)，2.73(s，1H，CHC＝)，2.25(s，1H，CHC＝)，1.96-1.32(m， 16H)，1.29-1.18(m，2H)；31P NMR：δ-2.16；13C NMR：δ147.8，115.8，65.6，65.5， 64.3，60.7，58.5，48.3，40.5，39.8，38.9，37.2，32.0，30.6，30.5，28.6，26.6，26.5； ESI-MS m/z：450.2(M++Na+)，428.2(M+)。

实施例19

1-{2-[(11-亚金刚烷基十一烷氧基)羟基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐

通过上述总方法，采用11-亚金刚烷基十一烷醇、MSNT和盐酸胆碱， 得到上述命名的化合物(0.248g，53％)。1H NMR：δ4.98(t，J＝6.7Hz，1H， C＝CH)，4.21(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.75(broad s，4H，CH2OPOCH2CH2N)， 3.32(s，9H，N+(CH3)3)，2.77(s，1H，CHC＝)，2.28(s，1H，CHC＝)，1.91-1.53(m， 16H)，1.23(broad s，14H)；31P NMR：δ-2.16；13C NMR：δ：147.2，116.3，66.1， 65.5，59.2，54.2，40.5，39.8，38.9，37.3，32.0，31.0，30.9，29.7，29.6，29.5，29.2， 28.7，26.5，25.9；ESI-MS m/z：492.2(M++Na+)，470.2(M+)。

实施例20

1-{2-[(11-亚金刚烷基十一烷氧基)羟基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓内盐 通过上述总方法，采用11-亚金刚烷基十一烷醇、MSNT和N-(2-羟乙基) -N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.168g，33％)。1H NMRδ：4.98(t， J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.27(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.84-3.52(m，8H， CH2OPOCH2CH2N(CH2)2)，3.32(s，3H，NCH3)，2.76(s，1H，CHC＝)，2.27(s，1H， CHC＝)，1.92-1.53(m，22H)，1.23(broad s，14H)；31P NMR：δ-2.04；13C NMR：δ 147.2，116.3，65.1，62.1，57.3，47.4，40.5，39.9，38.9，37.5，32.0，30.3，29.6，29.5， 29.4，29.2，28.7，26.4，25.8，20.9，20.2；ESI-MS m/z：532.3(M++Na+)，510.3 (M+)。

实施例21

1-{2-[(11-亚金刚烷基十一烷氧基)羟基膦氧基]乙基}-1-甲基吗啉鎓内盐

通过上述总方法，采用11-亚金刚烷基十一烷醇、MSNT和N-(2-羟乙 基)-N-甲基吗啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.235mg，46％)。1H NMR： δ4.99(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.29(broad s，2H，POCH2CH2N)，4.00-3.67 (m，12H)，3.42(s，3H，N+CH3)，2.77(s，1H，CHC＝)，2.28(s，1H，CHC＝)， 1.91-1.54(m，14H)，1.23(s，16H)；31P NMR：δ-2.29；13C NMR：δ147.2，116.3， 65.7，64.9，60.7，58.5，48.3，40.5，39.8，38.9，37.3，32.0，30.9，30.4，29.7，29.6， 29.5，29.3，28.6，26.5，25.8；ESI-MS m/z：534.2(M++Na+)，512.2(M+)。

实施例22

1-{2-{[(4-(十二烷氧基)环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基]乙基}-1-甲基哌 啶鎓内盐

通过上述总方法，采用2-[4-(十二烷氧基)环己氧基]乙醇、TIPS-Cl和 N-(2-羟乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.241g，45％)。 1H NMR：δ4.26(bs，2H)，3.88-3.79(m，4H)，3.58-3.38(m，6H)，3.36-3.27(m， 7H)，1.95-1.40(m，34H)，0.83(t，J＝7.0Hz，3H)；31P NMR：δ-2.26。

实施例23

1-{2-{[(4-(十二烷氧基)环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基]乙基}-1-甲基吗 啉鎓内盐

通过上述总方法，采用2-[4-(十二烷氧基)环己氧基]乙醇、TIPS-Cl和 N-(2-羟乙基)-N-甲基吗啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.213g，40％)。 1H NMR：δ4.32(broad s，2H)，4.04-3.19(m，21H)，1.99-1.50(m，28H)，0.86(t，J ＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMR：δ-2.5。

实施例24

1-{2-{[(4-(十四烷氧基)环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基]乙基}-1-甲基哌 啶鎓内盐

通过上述总方法，采用2-[4-(十四烷氧基)环己氧基]乙醇、TIPS-Cl和 盐酸胆碱，得到上述命名的化合物(0.214g，38％)。1H NMR：δ4.31(bs，2H)， 3.93-3.84(m，4H)，3.62-3.54(m，6H)，3.36-3.27(m，7H)，1.87-1.20(m，38H)， 0.83(t，J＝7.0Hz，3H)；31P NMR：δ-2.32。

实施例25

1-{2-{[(4-(十四烷氧基)环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基]乙基}-1-甲基吗 啉鎓内盐

通过上述总方法，采用2-[4-(十四烷氧基)环己氧基]乙醇、TIPS-Cl和 N-(2-羟乙基)-N-甲基吗啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.236g，42％)。 1H NMR：δ4.32(broad s，2H)，3.96-3.19(m，21H)，1.99-1.50(m，32H)，0.86(t，J ＝7.0Hz，3H)；31P NMR：δ-2.11。

不饱和醚型磷脂氢化的总方法

在甲醇(10mL)中的所需醚型磷脂(1mmol)的溶液中加入10％的Pd/C(10％w/w)，使所得混合物在1个大气压下，氢化反应10个小时。通过硅藻 土过滤，真空浓缩滤液，得到纯产物。

实施例26

1-{2-{[(4-(十二烷基环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵 内盐

通过上述总方法，使实施例1的化合物氢化得到上述命名的化合物(收 率定量)。1H NMR：δ：4.31(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.93(broad s，2H， CH2OPOCH2CH2N)，3.82(broad s，2H)，3.59(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.37 (broad s，10H，CHO，N+(CH3)3)，2.05-1.95(m，1H)，1.76-1.72(m，2H)，1.46-1.10 (m，28H)，0.86(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)。

实施例27

1-{2-{[(4-(十四烷基环己氧基)乙氧基]羟基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵 内盐

通过上述总方法，使实施例4的化合物氢化得到上述命名的化合物(收 率定量)。1H NMR：δ4.31(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.93-3.82(m，4H)， 3.59-3.15(m，12H)，1.96(broad s，1H)，1.76(broad s，2H)，1.42-1.09(m，32H)， 0.87(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)。

实施例28

1-{2-[(11-环己基十一烷氧基)羟基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐

通过上述总方法，使实施例13的化合物氢化得到上述命名的化合物(收 率定量)。1H NMR：δ4.20(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.75-3.68(m，4H， CH2OPOCH2CH2N)，3.26(s，9H，N+(CH3)3)，2.09-1.12(m，13H)，1.23(s，18H， (CH2)9)。

实施例29

1-{2-[(5-金刚烷基戊氧基)羟基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 通过上述总方法，使实施例16的化合物氢化得到上述命名的化合物(收率定 量)。1H NMR：δ4.27(bs，2H，POCH2CH2N)，3.79-3.09(m，13H)，2.02-1.25(m， 23H)。

实施例30

1-{2-[(11-金刚烷基十一烷氧基)羟基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 通过上述总方法，使实施例19的化合物氢化得到上述命名的化合物(收率定 量)。1H NMR：δ4.27(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.79-3.09(m，13H)，2.02-1.25 (m，35H)。

在前鞭毛体培养物中测试体外抗利什曼的活性

利用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)酶标分析法 为细胞存活标记，来评价本发明的磷脂类对朵氏利什曼原虫(Leishmania Donovani)和婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)的前鞭毛体的抑制作用， 并与醚型磷脂十六碳烷基磷酸胆碱(米替福新)的作用相比较。因而，将婴儿 利什曼原虫MHOM/TN/80/IPT1/LEM 235和朵氏利什曼原虫 MHOM/IN/80/DD8/LEM703的前鞭毛体培养于26℃的RPMI1640中，其中 还加有10％FCS、L谷氨酸和抗生素。将所有新型化合物溶解于DMSO中， 所得最终浓度为9.625mM，在培养基中以线性稀释方式进行3倍稀释。将 25μl的前鞭毛体培养液以5×105个细胞/mL置于96孔平底板中(Costar3696)， 然后于26℃下，与25μl各种浓度的药物共同培养。72小时后，加入10μl PBS 液中的5mg/mL MTT(SIGMA M2128)，然后继续培养3个小时。加入50μl 的50％异丙醇、10％SDS，轻微震荡30分钟使反应停止。利用TRITURUS微 板读数仪在550nm下测定吸收度，以620nm处为对照。

表1本发明的磷脂类抑制朵氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫的前鞭毛 体的体外抗利什曼活性* 化合物 IC50(μM) 婴儿利什曼原虫 MON235  IC50(μM)  朵氏利什曼原虫  MON703 米替福新 22.56±3.6  23.71±4.07 1-{2-{[(4-亚十二烷基环己氧基)乙氧基] 羟基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 3.25±0.65  7.08±1.2 1-{2-{[(4-亚十二烷基环己氧基)乙氧基] 羟基膦氧基}乙基}-1-甲基哌啶鎓内盐 23.07±3.6  22±3.25 1-{2-{[(4-亚十二烷基环己氧基)乙氧基] 羟基膦氧基}乙基}-1-甲基吗啉鎓内盐 16.46±1.8  50.67±3.6 1-{2-{[(4-亚十四烷基环己氧基)乙氧基] 羟基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 5.25±0.45  3.91±0.21 1-{2-{[(4-亚十四烷基环己氧基)乙氧基] 羟基膦氧基}乙基}-1-甲基哌啶鎓内盐 11.4±2.4  29.7±3.6 1-{2-{[(4-亚十四烷基环己氧基)乙氧基] 羟基膦氧基}乙基}-1-甲基吗啉鎓内盐 15.5±1.8  38.6±3.2 1-{2-{[(4-亚十六烷基环己氧基)乙氧基] 羟基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 21.19±2.6  45.1±7.2 1-{2-{[(4-亚十六烷基环己氧基)乙氧基] 羟基膦氧基}乙基}-1-甲基哌啶鎓内盐 6.5±1.7  21.96±1.99 1-{2-{[(4-亚十六烷基环己氧基)乙氧基] 羟基膦氧基}乙基}-1-甲基吗啉鎓内盐 3.7±0.71  16.22±2.29 1-{2-[(5-亚环己基戊氧基)羟基膦氧基]乙 基}-N，N，N-三甲铵内盐 ＞100  ＞100 1-{2-[(5-亚环己基戊氧基)羟基膦氧基]乙 基}-1-甲基哌啶鎓内盐 ＞100  ＞100 1-{2-[(5-亚环己基戊氧基)羟基膦氧基]乙 基}-1-甲基吗啉鎓内盐 ＞100  ＞100 1-{2-[(11-亚环己基十一烷氧基)羟基膦 氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 5.2±1.5  2.4±0.6 1-{2-[(11-亚环己基十一烷氧基)羟基膦 氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓内盐 47.6±7.33  8.7±1 1-{2-[(11-亚环己基十一烷氧基)羟基膦 氧基]乙基}-1-甲基吗啉鎓内盐 22.8±1.7  8.25±0.25 1-{2-[(5-亚金刚烷基戊氧基)羟基膦氧基] 乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 ＞100  4.99±1.50 1-{2-[(5-亚金刚烷基戊氧基)羟基膦氧基] 乙基}-1-甲基哌啶鎓内盐 ＞100  ＞100 1-{2-[(5-亚金刚烷基戊氧基)羟基膦氧基] 乙基}-1-甲基吗啉鎓内盐 ＞100  46.85±8.7 1-{2-[(11-亚金刚烷基十一烷氧基)羟基膦 氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 6.75±2.4  3.16±0.63 1-{2-[(11-亚金刚烷基十一烷氧基)羟基膦 氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓内盐 22.58±3.4  5.41±1.14 1-{2-[(11-亚金刚烷基十一烷氧基)羟基膦 氧基]乙基}-1-甲基吗啉鎓内盐 6.64±1.2  5.09±1.86 1-{2-{[(4-(十二烷基环己氧基)乙氧基] 羟基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 5.65±1.93  9.49±1.4 1-{2-{[(4-(十四烷基环己氧基)乙氧基] 羟基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 23.3±3.5  23.65±4.4 1-{2-[(11-(烷己基十一烷氧基)羟基膦氧 基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 8.4±0.8  10.3±1.3 1-{2-[(5-金刚烷基戊氧基)羟基膦氧基]乙 基}-N，N，N-三甲铵内盐 ＞100  4.02±2.3 1-{2-[(11-金刚烷基十一烷氧基)羟基膦氧 基]乙基}-N，N，N-三甲铵内盐 5.97±1.06  2.88±0.72

*结果是以平均值±SEM表示的，n＝3-4(每个实验重复两次)

值得注意的是本发明活性化合物的烷基链长度，对于烷基磷酸胆碱类， 其烷基可含5-11个碳原子，对于烷氧乙基磷酸胆碱类，其烷基可含12-14个 碳原子。这将有利于这些新化合物的溶解性和/或毒性，并有利于其代谢清除。 因此，我们进一步在人体单核细胞系THP1中评价4个本发明化合物以及米 替福新的细胞毒性。

在THP1单核细胞中评价细胞毒性

用SYBR-14和PI(Molecular Probes，The Netherlands)双染色，流式细胞 计数后，定量测定经各种浓度药物培养后的细胞受损数。

用SYBR-14和PI进行染色

1×106个细胞/ml的THP1细胞与浓度范围为50-1.56μM的各种浓度化合 物孵育。培养72小时后，将约4×106个细胞悬浮于标注的缓冲液中(10mM HEPES，150mM NaCI，10％BSA，pH7.4)，并加入10μg/ml PI和0.1mg/ml的 SYBR-14。流式细胞分析之前将培养液于37℃下放置30分钟。

流式细胞分析

用Epics Elite型流式细胞仪(Coulter，Miami，Florida)分析细胞样本。在 488nm激发SYBR-14的绿色荧光和PI的红色荧光。每个样本至少分析10,000 个细胞，每个染色试验重复两次。依据荧光强度进行数据分析，不包括细胞 的自身荧光和细胞碎片。

用合适种类的利什曼原虫感染THP1单核细胞，通过对细胞内寄生虫无 鞭毛体时期的抑制来评价化合物抑制利什曼原虫的活性。如图1所示，对感 染朵氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫的THP1单核细胞进行细胞毒性评价， 米替福新在50μM的低浓度下显示了对THP1极强的细胞毒作用，而这样的 细胞毒作用并没有在本发明活性最好的两个类似物(化合物13和19)中看 到。