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调节对检查点抑制剂疗法的应答

阅读：672发布：2020-05-26

专利汇可以提供调节对检查点抑制剂疗法的应答专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种用于与全身递送检查点抑制剂的组合瘤内递送免疫刺激细胞因子的给药时间表。具体地说，本发明提供了使用电穿孔来瘤内递送编码免疫刺激细胞因子例如IL-12的质粒以及全身递送PD-1拮抗剂。，下面是调节对检查点抑制剂疗法的应答专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种治疗癌症的方法，其包括：将治疗有效量的检查点抑制剂与免疫刺激细胞因子组合施用于患者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者是哺乳动物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述哺乳动物选自由人类、犬科动物、猫科动物和马科动物组成的群组。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤是黑色素瘤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述PD-1拮抗剂选自由以下组成的群组：纳武单抗(nivolumab)(ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、OPDIVO)、派姆单抗(pembrolizumab)(MK-
3475、KEYTRUDA)、皮立珠单抗(pidilizumab)(CT-011)和阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫刺激细胞因子选自表2。
8.根据权利要求7所述的方法，其中免疫调节细胞因子是IL-12。
9.根据权利要求1所述的方法，其中全身递送所述PD-1拮抗剂，并且在质粒上编码并通过电穿孔瘤内递送所述免疫刺激细胞因子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中：
a)在第1天一起施用所述PD-1拮抗剂和所述免疫刺激细胞因子；
b)在第5天和第8天再次施用所述免疫刺激细胞因子；
c)每三周施用所述PD-1拮抗剂；并且
d)每6周施用所述免疫刺激细胞因子。
11.根据权利要求9所述的方法，其中：
a)所述PD-1拮抗剂选自由以下组成的群组：纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、 )、派姆单抗(MK-3475、 )、皮立珠单抗(CT-011)和阿
特珠单抗(MPDL3280A)；并且
b)所述免疫刺激细胞因子是IL-12。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述电穿孔的场强度为约200v/cm到约1500v/cm并且时长为约100微秒到约20毫秒。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述电穿孔合并了电化学阻抗谱法(EIS)。
14.一种使用给药时间表通过施用质粒编码的免疫刺激细胞因子以及检查点抑制剂来治疗患者体内的肿瘤的方法，其中所述给药时间表包括：
a)在第1周的第一治疗周期，其中：
i)在第1天、第5天和第8天通过电穿孔向肿瘤递送所述质粒编码的免疫刺激细胞因子；
并且
ii)在第1天向所述患者全身递送检查点抑制剂；
b)第二治疗周期，其中在所述第一周期之后三周向所述患者全身递送所述检查点抑制剂；以及
c)持续后续治疗周期，其中每三周可替代地重复所述第一周期和所述第二周期。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述质粒编码的免疫刺激细胞因子选自表2。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述免疫刺激细胞因子是IL-12。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述PD-1拮抗剂选自由以下组成的群组：纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、 )、派姆单抗(MK-3475、 )、
皮立珠单抗(CT-011)和阿特珠单抗(MPDL3280A)。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述电穿孔的场强度为约200v/cm到约1500v/cm并且时长为约100微秒到约20毫秒。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述电穿孔合并了电化学阻抗谱法(EIS)。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述患者是哺乳动物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述哺乳动物选自由人类、犬科动物、猫科动物和马科动物组成的群组。

说明书全文

调节对检查点抑制剂疗法的应答

技术领域

[0001] 本发明提供了一种通过改善对检查点抑制剂的免疫应答来治疗癌症的方法。具体地说，瘤内递送免疫刺激细胞因子以增加肿瘤微环境中的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。

背景技术

[0002] 实体瘤由各种组分构成，包含恶性细胞以及内皮、结构和免疫细胞。癌细胞能够经由“癌症编辑”使微环境成形以逃避身体的免疫监视。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)频繁发现于肿瘤中，从而表明肿瘤触发了宿主的免疫应答。这一所谓的肿瘤免疫原性是通过肿瘤抗原介导的。这些抗原区分肿瘤与健康细胞，从而提供免疫学刺激(Boon等人(1997)《今日免疫学(Immunol Today)》18:267-268)。

[0003] ‘癌症免疫编辑’的概念描述了免疫系统和肿瘤细胞在癌症发育过程中是如何相互作用的。其由三个不同的阶段组成，被称为‘三E(the three E's)’(Kim等人(2007)《免疫学(Immunology)》121:1-14)。消除需要通过T淋巴细胞完全除去肿瘤细胞。在平衡状态下，免疫抗性肿瘤细胞群出现。同时，非抗性肿瘤细胞上存在不间断的免疫压力。这个阶段可以持续数年(Kim等人)。最后，在逃逸期间，肿瘤开发出用于逃避免疫检测或破坏的策略。这些策略可以是丢失肿瘤抗原、分泌抑制性细胞因子或下调主要组织相容性复合物分子(Stewart和Abrams(2008)《癌基因(Oncogene)》27:5894-5903)。另外，抗原可能无效地呈递给免疫系统，即，无适当共刺激，从而产生免疫耐受性(Stewart和Abrams(2008))。

[0004] 许多研究报告了与TIL的存在相关联的存活益处(Zhang等人(2003)《新英格兰医学杂志(N Engl JMed)》348:203-213；Sato等人(2005)《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》102:18538-18543；Galon等人(2006)《科学(Science)》313:1960-1964；以及Leffers等人(2009)《癌症免疫学与免疫疗法(Cancer Immunol Immunother)》58:449-459)。这表明TIL虽然被上述机制拮抗但在延缓肿瘤进展方面是有效的。

[0005] 由于存在最终导致癌症消退的成功T细胞应答，因此有三个步骤必须发生：(1)APC必须呈递肿瘤抗原并且激活效应T细胞应答；(2)引发的T细胞必须成功归巢并且在与其在肿瘤上的靶标结合之前浸润间质组织；以及(3)浸润的T细胞的T细胞受体(TCR)必须与MHCI-肽复合物结合以激活细胞毒性T细胞应答(Kelderman等人(2014)《分子肿瘤学
(Mol.Oncol.)》8:1132-1139)。

[0006] 免疫检查点抑制剂尤其是靶向PD-1或PD-L1的那些免疫检查点抑制剂已经移动到内科肿瘤学的治疗性发展最前线。T细胞上的PD-1可以与肿瘤细胞上的PD-L1结合，从而发送信号以关闭T细胞的功能。在短暂时间段内，大量学术和药物资源已经重新聚焦于针对多种癌症类型开发靶向PD-1/PD-L1轴的药剂。这些努力的结果已经产生了令人印象深刻的临床数据，但仅在少数患者中。未选中群体中的应答率常常小于20％(Mahoney等人(2014)《癌基因》28增刊3:39-48)。

[0007] 有证据证明，T细胞归巢很可能是通过表达某些趋化因子驱动的，所述趋化因子是由基质成分和肿瘤自己分泌的(Gajewski等人(2010)《癌症杂志(Cancer J.)》16:399-403)。白介素-12(IL-12)是可以增加实体瘤中的免疫细胞浸润的一种此类免疫调节细胞因子。

[0008] IL-12的抗肿瘤效应中的一些包含：增加通过NK和T细胞产生IFN-γ，IFN-γ是IL-12作用的最有效力的介体；刺激活化的NK细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞的生长和细胞毒性，从而转变CD4+Th 0细胞到Thl表型的分化；增强针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性
(ADCC)；以及诱导IgG并抑制由B细胞产生的IgE。然而，几种其它机制也强有力地促进了IL-
12的抗肿瘤活性。这些是经由以下产生的有效力的抗血管生成效应：诱导抗血管生成细胞因子和趋化因子产生、重构瘤周胞外基质和肿瘤间质、重编程髓源性抑制细胞以及改变对MHC I类分子的表达的处理和增加(参见例如Lasek等人(2014)《癌症免疫学与免疫疗法》
63:419-435)。

[0009] 然而，类似于其它免疫刺激细胞因子，IL-12已经证明对全身施用毒性太大。本发明提供了用于避免IL-12的全身毒性并增加对检查点抑制剂具体地说PD-1抑制剂的患者应答的解决方案。附图说明

[0010] 图1示出了被称为tavokinogene teslaplasmid(塔沃科诺基因特斯拉质粒)(tavo(塔沃))的pUMVC3-hIL-12的示意图，pUMVC3-hIL-12在CMV启动子的控制下由白介素12(IL-12)的p35和p40亚单元组成，亚单元之间有用于由单个mRNA来表达这两个亚单元的内部核糖体进入位点(Aldeveron公司人类IL-12#4024；小鼠IL-12#4033)。小鼠IL-12质粒构建体具有置换人类IL-12亚单元的小鼠IL-12亚单元。

发明内容

[0011] 本发明至少部分地基于一种与检查点抑制剂的全身递送组合通过电穿孔瘤内递送的质粒编码免疫刺激细胞因子的给药时间表。

[0012] 本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括：将治疗有效量的检查点抑制剂与免疫刺激细胞因子组合施用于患者。在一些实施例中，所述患者是包含人类、犬科动物、猫科动物和马科动物的哺乳动物。在进一步实施例中，所述癌症是黑色素瘤。所述检查点抑制剂可以是包含以下的PD-1拮抗剂：纳武单抗(nivolumab)(ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、OPDIVO)、派姆单抗(pembrolizumab)(MK-3475、KEYTRUDA)、皮立珠单抗(pidilizumab)(CT-011)和阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)。在某些实施例中，所述免疫刺激细胞因子选自表2，并且在进一步实施例中，免疫调节细胞因子是IL-12。全身递送所述PD-1拮抗剂，并且在质粒上编码并通过电穿孔瘤内递送所述免疫刺激细胞因子。考虑所述PD-1拮抗剂和所述免疫刺激细胞因子是：a)在第1天一起施用；b)在第5天和第8天再次施用所述免疫刺激细胞因子；c)每三周施用所述PD-1拮抗剂；并且d)每6周施用所述免疫刺激细胞因子。在某些实施例中，所述PD-1拮抗剂选自由以下组成的群组：纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、 )、派姆单抗(MK-3475、 )、皮立珠单抗(CT-011)和阿
特珠单抗(MPDL3280A)；并且所述免疫刺激细胞因子是IL-12。在进一步实施例中，所述电穿孔的场强度为约200v/cm到约1500v/cm并且时长为约100微秒到约20毫秒。在又进一步实施例中，所述电穿孔合并了电化学阻抗谱法(EIS)。

[0013] 本发明提供了一种使用给药时间表通过施用质粒编码的免疫刺激细胞因子以及检查点抑制剂来治疗患者体内的肿瘤的方法，其中所述给药时间表包括：a)在第1周的第一治疗周期，其中：i)在第1天、第5天和第8天通过电穿孔向肿瘤递送所述质粒编码的免疫刺激细胞因子；并且ii)在第1天向所述患者全身递送检查点抑制剂；b)第二治疗周期，其中在所述第一周期之后三周向所述患者全身递送所述检查点抑制剂；以及c)持续后续治疗周期，其中每三周可替代地重复所述第一周期和所述第二周期。在某些实施例中，所述质粒编码的免疫刺激细胞因子选自表2并且可以是IL-12。在进一步实施例中，所述检查点抑制剂是包含以下的PD-1拮抗剂：纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、 )、派姆单抗(MK-3475、 )、皮立珠单抗(CT-011)和阿特珠单抗(MPDL3280A)。在实
施例中，所述电穿孔的场强度为约200v/cm到约1500v/cm并且时长为约100微秒到约20毫秒。所述电穿孔可以合并电化学阻抗谱法(EIS)。在一些实施例中，所述患者是包含人类、犬科动物、猫科动物和马科动物的哺乳动物。

具体实施方式

[0014] 如本文所使用的，包含所附权利要求书在内，单词的单数形式如“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含其复数指代物，除非上下文中清楚地另有指明。

[0015] 本文所引用的所有参考文献均通过引用结合，其程度如同每个单独的出版物、专利申请或申请被确切并单独地指明通过引用结合那样。

[0016] I.定义.

[0017] 分子的“活性”可以描述或指代分子与配体或受体的结合、催化活性、刺激基因表达的能力、抗原活性、对其它分子的活性的调节等等。分子的“活性”还可以指代在调制或保持细胞间相互作用例如粘附方面的活性或在保持细胞的结构例如细胞膜或细胞骨架方面的活性。“活性”还可以意指比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白质]或[免疫活性]/[mg蛋白质]等等。

[0018] “核酸”意指RNA和DNA两者，包含：cDNA、基因组DNA、质粒DNA或凝聚核酸、用阳离子脂质配制的核酸、用肽配制的核酸、阳离子聚合体、RNA或mRNA。在优选实施例中，施用的核酸是构成“载体”的质粒DNA。核酸可以是但不限于具有真核启动子的质粒DNA载体，如例如：IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-12等等，所述真核启动子表达具有潜在治疗作用的蛋白质。

[0019] 如本文所使用的，“免疫检查点”分子指代诱导T细胞功能障碍或细胞凋亡的免疫细胞表面受体/配体群组。这些免疫抑制靶标减弱了过量免疫反应并且确保了自体耐受性。肿瘤细胞利用这些检查点分子的抑制效应。免疫检查点靶标分子包含但不限于表1中描述的检查点靶标。

[0020] 表1：检查点靶标登录号

[0021]

[0022]

[0023] 短语“免疫检查点抑制剂”包含通过阻断免疫检查点分子的效应来防止免疫抑制的分子。检查点抑制剂可以包含抗体和抗体片段、纳米抗体、双抗体、检查点分子的可溶结合配偶体、小分子治疗剂、肽拮抗剂等。抑制剂包含但不限于表1中描述的检查点抑制剂。

[0024] 短语“免疫刺激细胞因子”包含介导或增强对外源抗原的免疫应答的细胞因子，所述外源抗原包含病毒抗原、细菌抗原或肿瘤抗原。先天性免疫刺激细胞因子可以包含例如TNF-α、IL-1、IL-10、IL-12、IL-15、I型干扰素(IFN-α和IFN-β)、IFN-γ和趋化因子。适应性免疫刺激细胞因子包含例如IL-2、IL-4、IL-5、TGF-β、IL-10和IFN-γ。

[0025] 下表2中提供了免疫刺激细胞因子的实例。

[0026] 表2：免疫刺激细胞因子登录号

[0027]

[0028]

[0029] 术语“癌症”包含通常表征为不适当的细胞增生、异常细胞增生或过量细胞增生的种种疾病。癌症的实例包含但不限于乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、肾癌、脑癌或肉瘤。此类癌症可能是由以下引起的：环境因素、染色体异常、退行性生长和发育障碍、促有丝分裂剂、紫外线辐射(UV)、病毒感染、对基因不适当的组织表达、基因表达的改变或致癌剂。

[0030] 术语“治疗”包含但不限于抑制或减少癌细胞增生、破坏癌细胞、防止癌细胞增生、或防止恶性细胞发动或者转化的恶化前细胞的进展停滞或逆转为恶性疾病、或减轻疾病。

[0031] 术语“受试者”指代任何动物，优选哺乳动物，如人类。兽用也旨在包含在本发明中，包括犬科动物和猫科动物。

[0032] 如本文中可互换地使用的，术语“电穿孔”、“电透化”或“电动态增强”(“EP”)指代使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导显微途径(孔)；显微途径的存在允许如质粒、寡核苷酸、siRNA、药品、离子和水等生物分子从细胞膜的一侧穿到另一侧。

[0033] 如本文所使用的，术语“生物分子”包含质粒编码的抗体、抗体片段、全长免疫调节蛋白、膜锚定分子的可溶结构域、融合蛋白等等。

[0034] 如本文所使用的，术语“pUMVC3-hIL-12”包含质粒编码的人类IL-12，更具体地说，tavokinogene teslaplasmid，下文中被称为“tavo”。

[0035] 短语“通过电穿孔瘤内递送质粒IL-12”或“IT-pIL-12-EP”包含在或内。

[0036] II.总述

[0037] 本发明包含一种治疗癌症具体地说黑色素瘤的方法以及给药治疗时间表的惊人结果，所述惊人结果增加了肿瘤微环境中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的数量并且提高了患者对检查点抑制剂疗法例如用PD-1拮抗剂进行的治疗的应答。

[0038] III.抗体

[0039] 本发明提供了一种用于减小肿瘤的尺寸或抑制癌细胞在个体体内生长或者减少或抑制转移癌在罹患癌症的个体体内发育的免疫治疗方法。疗法通过全身递送蛋白质治疗剂或使用电穿孔瘤内递送编码各种可溶形式的检查点抑制剂的质粒来实现。检查点抑制剂疗法可以在通过电穿孔瘤内递送免疫刺激细胞因子例如IL-12之前、期间或之后进行。具体地说，

[0040] 检查点抑制剂可以采取抗体或抗体片段的形式，抗体和抗体片段均可以编码在质粒中或通过电穿孔递送到肿瘤或作为蛋白质/肽被全身递送。如上所述，检查点抑制剂疗法的递送可以在通过电穿孔瘤内递送免疫刺激细胞因子例如IL-12之前、期间或之后进行。

[0041] 如本文所使用的，术语“抗体”包含免疫球蛋白，免疫球蛋白是B细胞及其变体的产物。免疫球蛋白是包括一个或多个多肽的蛋白质，所述一个或多个多肽基本上由免疫球蛋白κ和λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因编码。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，γ、μ、α、δ或ε进而分别定义免疫球蛋白种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链的亚类也是已知的。例如，人类中的IgG重链可以是IgG 1、IgG2、IgG3和IgG4亚类中的任何一种。

[0042] 已知典型的免疫球蛋白结构单位包括四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50kD到70kD)。每条链的N末端定义了主要负责抗原识别的具有约100个到110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指代这些轻链和重链。

[0043] 抗体以全长完整的抗体存在或以通过用肽酶或化学品消化产生的各种充分表征片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下的抗体从而产生Fab二聚体F(a)'2，其本身是通过二硫键与VH-CHi连接的轻链。可以在温和条件下减少F(ab')2以打破铰链区中的二硫键，从而将F(ab')2二聚体转变为Fab'单体。Fab'单体本质上是具有铰链区的Fab片段(关于其它抗体片段的更详细描述，参见《基础免疫学(Fundamental Immunology)》W.E.Paul编,Raven出版社,纽约(1993))。Fab片段和Fc片段通过用木瓜蛋白酶消化IgG来生成。木瓜蛋白酶在铰链区中在链间S-S键合所涉及的残基正上方进行分裂，从而产生单价Fab片段和Fc片段，所述Fc片段包含两个恒定区片段，每个恒定区片段含有铰链的下部部分即CH2和CH3结构域。Fc的恒定区片段通过铰链区的下部残基的链间S-S键合稳定化为二聚体。

[0044] 免疫球蛋白“Fc”通常指代恒定区的通过用木瓜蛋白酶消化生成的部分。包含具有链间S-S键的下铰链。如本文所使用的，术语“Fc”指代包括一对免疫球蛋白恒定区多肽的二聚体蛋白，每个免疫球蛋白恒定区多肽含有铰链的下部部分即CH2和CH3结构域。此类“Fc”片段可以含有或可能不含有铰链区中的S-S链间桥接。应理解，Fc可以来自任何Ig种类并且如此可以包含CH4结构域，如在IgM的情况下。Fc的突变序列是已知的，如Wines等人《免疫学杂志(J.Immunol.)》2000年5月15日,164(10):5313-8所描述的，并且可以用于本文中。

[0045] 尽管根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但是熟练的技术人员应了解，可以用化学方法或通过利用重组DNA法从头合成各种抗体片段中的任何一种。因此，如本文所使用的，术语抗体还包含通过修饰整个抗体产生的或从头合成的抗体片段或者通过使用重组DNA法获得的抗体和片段。

[0046] 重组抗体可以是常规全长抗体、从蛋白酶解消化已知的抗体片段、独特抗体片段如Fv或单链Fv(scFv)、结构域缺失抗体等等。片段可以包含结构域或多肽，其中少至一个或几个氨基酸发生缺失或突变，但是更广泛的缺失也是可能的，如缺失一个或多个结构域。

[0047] Fv抗体具有约50kD的尺寸并且包括轻链和重链的可变区。单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH:VL异源二聚体，所述共价连接的VH:VL异源二聚体可以由包含直接连接或通过肽编码接头连接的VH和VL编码序列的核酸表达。参见例如Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊》85:5879-5883)。用于将自然聚集但化学分离的轻和重多肽链从抗体V区转变为scFv分子的多种结构将会折叠成与抗原结合位点的结构基本上类似的三维结构。

[0048] 已经在通过骆驼、美洲鸵和鲨鱼的免疫系统产生的独特抗体集中找到了上述传统抗体片段的替代性方案。不同于其它抗体，这些亲和性试剂由仅两个重链构成；更好的是，单个结构域形成这些重链抗体的抗原结合位点。结构域甚至可以被基因工程化以产生极小的非常稳定的单结构域重组抗体片段，被称为“纳米抗体”。考虑将仅编码重链(VHH)的质粒、单结构域抗体以及纳米抗体用于通过电穿孔进行瘤内递送。

[0049] IV.可溶拮抗剂

[0050] 检查点分子的拮抗剂/抑制剂也可以是检查点抑制剂的可溶结合配偶体，如可溶PD-L1，所述可溶PD-L1至少包括PD-L1的胞外结构域(ECD)。其它可溶检查点抑制剂将会类似地缺少跨膜和胞内结构域，但是能够与其结合配偶体结合并引起生物效应。关于通过电穿孔进行的瘤内递送，ECD将被编码在表达载体中并且将在递送到肿瘤时被表达。

[0051] 检查点抑制剂的可溶编码形式在表达载体中可以与编码另一种蛋白质或多肽的DNA连接。此类其它多肽可以是免疫球蛋白的Fc部分、白蛋白或保持了检查点抑制剂分子的可溶性的任何其它类型的血清蛋白或其片段。检查点抑制剂分子的可溶形式可以经由重链和/或轻链与免疫球蛋白连接，所述重链和/或轻链可以是片段或者全称重链或轻链。免疫球蛋白可以是可以靶向域癌细胞或肿瘤缔合的抗原的抗体。

[0052] 可溶检查点抑制剂作为蛋白质被全身递送或作为核酸经由电穿孔被瘤内递送。核酸指代多核苷酸化合物，所述多核苷酸化合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包括具有通过标准磷酸二酯键或其它键共价连接的含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷或核苷类似物。核酸可以包含RNA、DNA、嵌合DNA-RNA聚合物或其类似物。DNA可以是表达关注的特定可溶检查点抑制剂分子的质粒。

[0053] V.表达质粒

[0054] 如本文所使用的，术语“质粒”指代由基因材料(即核酸)构成的构建体。DNA质粒是包含重组多肽的编码序列的质粒，所述重组多肽能够在所述DNA质粒在电穿孔之后进入时表达在哺乳动物细胞中。优选地，编码序列是在靶哺乳动物具体地说肿瘤中引起免疫应答的免疫刺激细胞因子。在一些实施例中，编码序列是在优化用于哺乳动物表达的构建体中，所述编码序列可以包含以下中的一种或多种：包含添加Kozak序列、密码子优化、RNA优化以及整合翻译修饰剂，如IRES或P2A序列。

[0055] 编码序列包含被布置成使得插入的编码序列可以转录在真核细胞中的遗传成分。而且，尽管质粒可以包含来自病毒核酸的序列，但是此类病毒序列优选地并未使质粒合并到病毒颗粒中，并且质粒因此是非病毒载体。优选地，质粒是闭合环状DNA分子。表达质粒的增强子/启动子区将会确定表达水平。被设计用于高表达水平的大多数基因表达系统含有完整的人类巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子序列。然而，已经报告了在组织中随时间推移下调CMV启动子。对于游离型质粒，在体内尚未观察到如合并到逆转录病毒载体中时观察到的对CMV启动子的过度甲基化。但是，CMV启动子沉默可以与其对转录因子NF-κB的降低的水平的敏感性联系起来。还示出了，CMV启动子的活性被包含干扰素(α和β)在内的各种细胞因子以及肿瘤坏死因子(TNF-α)减弱。为了延长体内表达并确保表达在期望组织中的特异性，已将组织特异性增强子/启动子合并到表达质粒中。示出了，鸡骨α肌动蛋白启动子在非鸟类横纹肌中提供了几周的高表达水平(与用CMV驱动型构建体实现的表达水平相当)。

[0056] 可以添加表达质粒中另外的遗传序列以影响信使RNA(mRNA)的稳定性和翻译效率。已知5'非翻译区(5'UTR)引起翻译并且其位于加帽位点与起始密码子之间。理想地，5'UTR应相对较短，缺乏强劲二级结构和上游起始密码子并且在最佳局部上下文中应具有起始密码子AUG。5'UTR还会影响RNA稳定性、RNA加工和转录。为了通过确保有效且准确的RNA剪接来使基因表达最大化，一个或多个内含子可以包含在表达质粒中在特定位置处。可以通过使用合成的内含子来使低效和/或不准确剪接的可能性最小化，所述合成的内含子具有理想化剪接点和匹配共有序列的分支点序列。基因表达系统内的另一个重要序列是3'非翻译区(3'UTR)即mRNA中从终止密码子扩展到poly(A)添加位点的序列。3'UTR可以影响mRNA稳定性、翻译和胞内定位。示出了，骨骼肌α-肌动蛋白3'UTR使肌肉组织中的mRNA稳定，由此产生了与其它3'UTR相比更高的表达水平。3'UTR似乎诱导了所产生蛋白质的不同胞内区室化，从而防止将蛋白质有效运输到分泌途径并且有利于其核周定位。

[0057] 在一些实施例中，使用增强用于高产率和/或cGMP制造的过程，可以优选地大量制造DNA质粒。优选地，可以将制造用于递送到哺乳动物的DNA质粒配制成高DNA浓度。可以通过转染如大肠杆菌细胞等微生物细胞来执行DNA质粒制造过程。考虑用于制造本文所述DNA质粒的过程包含美国专利号7,238,522中公开的过程，所述美国专利以其全文结合在此。优选将DNA质粒配制成在注入哺乳动物受试者中时安全有效。优选地，将DNA质粒配制成足以通过转化细胞表达的浓度。

[0058] VI.病症

[0059] 考虑将本发明用于治疗受癌症或其它非癌性(良性)生长折磨的患者。这些生长本身可以显现为以下中的任何一种：损伤、息肉、瘤(乳头状尿路上皮瘤)、乳头状瘤、恶性肿瘤、肿瘤(例如，Klatskin肿瘤、肝门区肿瘤、非浸润性乳头状尿路上皮瘤、生殖细胞瘤、尤文氏瘤、Askin瘤、原始神经外胚层肿瘤、莱迪希细胞瘤、维尔姆斯瘤、Sertoli细胞瘤)、肉瘤、癌(例如，鳞状细胞癌、穴肛原癌、腺癌、腺鳞癌、胆管癌、肝细胞癌、浸润性乳头状尿路上皮癌、扁平尿路上皮癌)、肿块或任何其它类型的癌性或非癌性生长。用本实施例的方法治疗的肿瘤可以属于以下中的任何一种：非浸润性、浸润性、表皮的、乳头状、扁平的、转移性、局部性、单中心的、多中心的、低等级和高等级。

[0060] 本发明旨在用于治疗各种类型的恶性肿瘤(即癌症)和良性肿瘤。例如，肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌(例如，肝门周癌、远端胆管癌、肝内胆管癌)、膀胱癌、良性和癌性骨癌(例如，骨瘤、骨样骨瘤、成骨细胞瘤、骨软骨瘤、血管瘤、软骨黏液样纤维瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、脑和中枢神经系统癌(例如，脑膜瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、神经节神经胶质瘤、神经鞘瘤、生殖细胞瘤、颅咽管瘤)、乳腺癌(例如，原位管癌、浸润性管癌、浸润性小叶癌、小叶原位癌、男性乳房发育症)、卡斯特曼病(例如，巨淋巴结增生、血管滤泡性淋巴结增生)、宫颈癌、大肠癌、子宫内膜癌(例如，子宫内膜样腺癌、腺癌、乳头状浆液性腺癌、透明细胞癌)食道癌、胆囊癌(黏液腺癌、小细胞癌)、胃肠道类癌肿瘤(例如，绒毛膜癌、破坏性卵巢绒毛膜腺瘤)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、卡波西肉瘤、肾癌(例如，肾细胞癌)、喉癌和下咽癌、肝癌(例如，血管瘤、肝腺瘤、局灶性结节性增生、肝细胞癌)、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、间皮瘤、浆细胞瘤、鼻腔和鼻窦癌(例如，鼻腔神经胶质瘤、中线肉芽肿瘤)、鼻咽癌、头颈部鳞状细胞癌、成神经细胞瘤、口腔和口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体肿瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤(例如，胚胎性横纹肌肉瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、多形性横纹肌肉瘤)、唾腺癌、皮肤癌、黑色素瘤尤其是转移性黑色素瘤以及非黑色素瘤皮肤癌两者(包含梅克尔细胞癌)、胃癌、睾丸癌(例如，精原细胞瘤、非精原细胞瘤、生殖细胞癌)、胸腺癌、甲状腺癌(例如，滤泡癌、未分化癌、低分化癌、甲状腺髓样癌、甲状腺淋巴瘤)、阴道癌、外阴癌、以及子宫癌(例如，子宫平滑肌肉瘤)。

[0061] VII.电穿孔装置

[0062] 本发明可用于瘤内基因电转移。具体地说，当前的质粒构建体可以用于生成足够浓度的几种重组表达免疫调节分子，如多聚体细胞因子或多聚体细胞因子的组合、天然或工程化形式的共刺激分子、含有共享的肿瘤抗原的基因佐剂等。为了实现本发明质粒构建体到组织例如肿瘤的转移，采用电穿孔装置。

[0063] 本实施例的装置和方法用于通过向肿瘤不断地和/或以脉冲方式递送电疗法一定时间段来治疗癌性肿瘤，所述时间段的范围为几分之一秒到几天、几周和/或几个月。在优选实施例中，电疗法是直流电疗法。

[0064] 如本文所使用的，“电穿孔”(即，使细胞膜可渗透)可能由在足以打开细胞膜中的孔洞(例如，以允许分子如药物、溶液、基因和其它药剂扩散到活细胞中)的任何时间段内向患者递送的任何数量的库伦、电压和/或电流造成。

[0065] 向组织递送电疗法产生了一系列生物和电化学反应。在足够高的电压下，电疗法的施加严重扰乱了细胞结构和细胞代谢。虽然癌性细胞和非癌性细胞均在一定水平的电疗法下造成破坏，但是与非癌性细胞相比，肿瘤细胞对其微环境的改变更为敏感。由于电疗法，常量元素和微量元素的分布发生改变。电穿孔附近的细胞破坏被称为不可逆电穿孔。

[0066] 还考虑了使用可逆电穿孔。可逆电穿孔在用电极施加的电力低于靶组织的电场阈值时发生。因为施加的电力低于细胞的阈值，因此细胞能够修复其磷脂双层并且继续其正常细胞功能。可逆电穿孔通常通过涉及使药品或基因(或对于细胞膜不可正常渗透的其它分子)进入细胞的治疗来完成。(Garcia等人(2010)“用于深颅内病症的非热力不可逆电穿孔(Non-thermal irreversible electroporation for deep intracranial disorders)”《2010年IEEE医学与生物工程年度国际会议(2010Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology)》2743-6)

[0067] 在单个电极配置下，可以将电压施加在铅电极与发生器壳体之间几分之一秒到几小时，以开始破坏癌性组织。给定电压的施加可以采取一系列脉冲的方式，每个脉冲持续几分之一秒到几分钟。在某些实施例中，脉冲时长或宽度可以为。也可以施加低电压几分之一秒到几分钟的时长，这样可以将白细胞吸引到肿瘤位点。以此方式，细胞介导的免疫系统可以移除死亡的肿瘤细胞并且可以发展抵抗肿瘤细胞的抗体。此外，刺激的免疫系统可以攻击边缘肿瘤细胞和转移。

[0068] 依赖于宿主物种，可以使用多种佐剂来增加任何免疫应答，包含但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、如氢氧化铝或磷酸铝等矿物盐、各种细胞因子、如溶血卵磷脂等表面活性物质、普朗尼克多元醇、多聚阴离子、肽、油乳剂、以及如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌等可能有用的人类佐剂。可替代地，免疫应答可以通过与分子如钥孔虫戚血蓝蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、卵白蛋白、霍乱毒素或其片段组合和/或偶联来增强。

[0069] Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963描述了模块化电极系统及其用于促进生物分子引入身体或植物的所选组织的细胞中的用途。模块化电极系统包括：多个针电极；皮下注射针；电连接器，所述电连接器提供了从可编程恒流脉冲控制器到所述多个针电极的导电连接；以及电源。操作者可以抓握安装到支撑结构上的所述多个针电极并且将所述多个针电极牢牢插入身体或植物中的所选组织中。然后，经由皮下注射针将生物分子递送到所选组织中。激活可编程恒流脉冲控制器并且向所述多个针电极施加恒流电脉冲。施加的恒流电脉冲促进生物分子在所述多个电极之间引入细胞中。美国专利号7,245,963的全部内容通过引用结合在此。

[0070] 美国专利公开2005/0052630描述了可以用于有效地促进生物分子引入身体或植物中的所选组织的细胞中的电穿孔装置。电穿孔装置包括电动态装置(“EKD装置”)，通过软件或固件来指定所述电动态装置的操作。EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输出以阵列的方式在电极之间产生一系列可编程恒流脉冲图案并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包括具有针电极阵列、注射针的中心注射通道以及可移除引导盘的可置换电极盘(参见例如通过引用结合在此的美国专利公开2005/0052630)。

[0071] 美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/0052630所描述的电极阵列适于深入穿透到如肌肉等组织以及其它组织或器官中。由于电极阵列的配置，注射针(用于递送选中的生物分子)还完全插入到靶器官中，并且插入是在电极预先界定的区域中垂直于靶组织施加的。

[0072] 使用电穿孔摄取的效率取决于各种相互关联的因素，包含但不限于组织的性质、电信号的波形、电场的性质、脉冲长度。包含对任何已知细胞进行电穿孔所需的电场强度在内的各种参数通常描述在科学文献中。

[0073] 待生成的电场的性质通过组织的性质、所选组织的尺寸和其位置来确定。期望场尽可能是同源的并且具有正确振幅。过度的场强度导致细胞裂解，而低场强度导致功效降低。通常，体内细胞电穿孔所需的电场在幅值上总体上类似于体外细胞所需的场。在一个实施例中，电场的幅值范围大致为10V/cm到约1500V/cm，优选约700V/cm到1500V/cm并且优选约1000V/cm到1500V/cm。当采用较低场强度(约10V/cm到100V/cm并且更优选约25V/cm到75V/cm)时，脉冲长度较长。例如，当标称电场为约25V/cm到约75V/cm时，优选脉冲长度为约
10msec。

[0074] 脉冲发生器提供的电信号的波形可以是指数式衰减脉冲、正方形脉冲、单极振荡脉冲串、双极振荡脉冲串或这些形式中的任何形式的组合。方波电穿孔脉冲对细胞有较温和的影响，这样产生了较高的细胞活力。方波电穿孔系统递送受控电脉冲，所述受控电脉冲快速升至设定电压、在那个水平停留设定时间长度(脉冲长度)并且然后快速降至零。关于对植物原生质体和哺乳动物细胞系进行电穿孔这一类型的系统产生了比指数式衰减系统更好的转化效率。

[0075] 脉冲长度可以为约10μs到约100ms。可以存在任何期望数量的脉冲，通常为每秒一个到100个脉冲。设定的脉冲之间的间隔可以为任何期望的时间，如一秒。波形、电场强度和脉冲时长还可以取决于细胞的类型和待经由电穿孔进入细胞中的分子的类型。

[0076] 还设想了其它替代性电穿孔技术。还可以使用冷等离子体来执行体内质粒递送。等离子体是物质的四种基本状态中的一种，其它基本状态为固体、液体和气体。等离子体是具有未结合的正负颗粒的电中性介质(即，等离子体的总电荷大致为零)。等离子体可以通过加热气体或使气体经受用激光或微波发生器施加的强劲电磁场来产生。这减少或增加了电子的数量从而产生了被称为离子的带正电荷颗粒或带负电荷颗粒(Luo等人(1998)《等离子体物理学(Phys.Plasma)》5:2868-2870)并且伴随有分子键的解离，如果有的话。

[0077] 为了使EP的功效最大化，期望可实时测量的可量化度量的膜完整性。电化学阻抗谱法(EIS)是用于表征生理和化学系统的方法并且可以用标准EP电极执行。此技术测量了频率范围内系统的电响应以显示出能量储存和耗散特性。在生物系统中，胞外和胞内基质抵抗电流流动并且因此可以用电表示为电阻器。完整细胞膜和细胞器的脂质储存能量并且表示为电容器。电阻抗是这些电阻和电容元件在频率范围内的和。为了量化这些参数中的每个参数，可以将组织阻抗数据拟合到等效电路模型。实时监测组织的电特性将会实现对EP参数的反馈控制并且会在异质性肿瘤中产生最佳转染。使用EIS反馈将会允许：(1)实时调整递送参数；(2)仅递送生成治疗性应答所需的脉冲；以及(3)降低EP介导的整体组织损伤，因此，EP在细胞膜破裂时成功，从而导致电容改变。因此，通过监测和测量EP脉冲之前、期间和/或之后的电特性例如阻抗(包含电容)，可以收集相关的经验数据并将其用于产生初始训练阶段期间的模型。EIS EP的完整描述可以在PCT/US16/25416中找到，其通过引用结合并且以附录A附上。

[0078] 还设想了其它替代性电穿孔技术。还可以使用冷等离子体来执行体内质粒递送。等离子体是物质的四种基本状态中的一种，其它基本状态为固体、液体和气体。等离子体是具有未结合的正负颗粒的电中性介质(即，等离子体的总电荷大致为零)。等离子体可以通过加热气体或使气体经受用激光或微波发生器施加的强劲电磁场来产生。这减少或增加了电子的数量从而产生了被称为离子的带正电荷颗粒或带负电荷颗粒(Luo等人(1998)《等离子体物理学》5:2868-2870)并且伴随有分子键的解离，如果有的话。

[0079] 冷等离子体(即，非热等离子体)通过将脉冲高压信号递送到适合的电极产生。冷等离子体装置可以采取气体喷射装置或介电阻挡放电(DBD)装置的形式。低温等离子体借助于其在相对较低气体温度下提供等离子体已经吸引了大量热忱和关注。在此类温度下提供等离子体是各种应用所关注的，包含伤口愈合、抗菌过程、各种其它医学疗法以及杀菌。如早前指出的，冷等离子体(即，非热等离子体)是通过将脉冲高压信号递送到适合的电极而产生的。冷等离子体装置可以采取气体喷射装置、介电阻挡放电(DBD)装置或多频富含谐波电源的形式。

[0080] 介电阻挡放电装置依靠不同的过程来生成冷等离子体。介电阻挡放电(DBD)装置含有被介电层覆盖的至少一个导电电极。电返回路径由可以由经历冷等离子体处理的目标衬底提供的地面形成或通过为电极提供内置地面形成。介电阻挡放电装置的能量可以由高压电源如上文所提及的那个电源提供。更普遍地，能量以脉冲DC电压的形式输入到介电阻挡放电装置以形成等离子体排出物。借助于介电层，排出物与导电电极分离并且电极蚀刻和气体加热减少。可以在振幅和频率上改变脉冲DC电压以实现不同的操作方案。合并了冷等离子体生成的此类原理的任何装置(例如，DBD电极装置)落入本发明的各个实施例的范围内。

[0081] 已经采用冷等离子体来转染具有外源核酸的细胞。具体地说，转染肿瘤细胞(参见例如Connolly等人(2012)《人类疫苗与免疫疗法(Human Vaccines&Immunotherapeutics)》8:1729-1733；和Connolly等人(2015)《生物电化学(Bioelectrochemistry)》103:15-21)。

[0082] VIII.给药时间表

[0083] 本发明描述了一种给药时间表，所述给药时间表包含与检查点抑制剂组合通过电穿孔施用质粒编码的免疫刺激细胞因子多个周期。可以期望同时地、顺序地或单独地施用这两种疗法。在一些实施例中，以每周期或交替周期的方式施用质粒编码的免疫刺激细胞因子。在进一步实施例中，可以在每个周期的第1天同时递送质粒编码的免疫刺激细胞因子以及检查点抑制剂。在优选实施例中，在奇数周期同时施用这两种治疗剂，并且在偶数周期单独施用检查点抑制剂。

[0084] 在每个周期或交替周期的至少一天、两天或三天通过电穿孔递送质粒编码的免疫刺激细胞因子。在某些实施例中，在每个周期的第1天、第5天和第8天递送细胞因子。在优选实施例中，在每奇数个周期的第1天、第3天和第8天递送细胞因子。

[0085] 各个周期之间的中介时段可以为约1周到约6周、约2周到约5周。在优选实施例中，周期之间的中介时段为约3周。

[0086] 当使用PD-1拮抗剂尤其是派姆单抗时，全身给药在2mg/kg到10mg/kg之间，优选2mg/kg。可替代地，派姆单抗的给药在每周期100mg到500mg之间，优选每周期200mg到400mg并且最优选每周期200mg。

[0087] 参考以下实例对本发明的广泛范围进行最佳理解，以下实例旨在将本发明限制到具体实施例。

[0088] 实例

[0089] I.通用方法.

[0090] 描述了分子生物学中的标准方法。Maniatis等人(1982)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州；Sambrook和Russell(2001)《分子克隆(Molecular Cloning)》第3版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州；Wu(1993)《重组DNA(Recombinant DNA)》第217卷,学术出版社,圣地亚哥,加利福尼亚州。标准方法还出现在以下文献中：Ausbel等人(2001)《分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)》第1到4卷,约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons,Inc.)纽约,纽约州，所述文献描述了细菌细胞和DNA诱变中的克隆(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷)。

[0091] 描述了用于蛋白质纯化的方法，包含免疫沉淀法、色谱法、电泳法、离心法和结晶法。Coligan等人(2000)《蛋白质科学实验室指南(Current Protocols in Protein Science)》,第1卷,约翰·威利父子出版公司,纽约。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化。参见例如Coligan等人(2000)《蛋白质科学实验室指南》,第2卷,约翰·威利父子出版公司,纽约；Ausubel等人(2001)《分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,第3卷,约翰·威利父子出版公司,纽约,纽约州,第16.0.5到16.22.17页；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Co.)(2001)《生命科学研究产品(Products for Life Science Research)》,圣路易斯,密苏里州,第45到89页；安玛西亚法玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech)(2001)《生物目录(BioDirectory)》,皮斯卡塔韦,新泽西州,第384到391页。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和碎裂。Coligan等人(2001)《免疫学实验室指南(Current Protocols in
Immunology)》,第1卷,约翰·威利父子出版公司,纽约；Harlow和Lane(1999)《使用抗体(Using Antibodies)》,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州；Harlow和Lane,同上。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可获得的。参见例如Coligan等人(2001)《免疫学实验室指南》,第4卷,约翰·威利父子出版公司,纽约。

[0092] 包含荧光活化细胞分选检测系统在内的用于流式细胞术的方法是可获得的。参见例如Owens等人(1994)《临床实验室实践用流式细胞术原理(Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice)》,约翰·威利父子出版公司,霍博肯,新泽西州；Givan(2001)《流式细胞术(Flow Cytometry)》第2版；威利-里斯公司(Wiley-Liss),霍博肯,新泽西州；Shapiro(2003)《实用流式细胞术(Practical Flow
Cytometry)》,约翰·威利父子出版公司,霍博肯,新泽西州。用作例如诊断试剂的适于修改包含核酸引物和探针在内的核酸、多肽和抗体的荧光试剂是可获得的。分子探针公司
(Molecular Probes)(2003)《目录(Catalogue)》,分子探针公司(Molecular Probes,
Inc.),尤金,俄勒冈州；西格玛奥德里奇公司(2003)《目录(Catalogue)》,圣路易斯,密苏里州。

[0093] 描述了免疫系统的组织学标准方法。参见例如Muller-Harmelink(编)(1986)《人类胸腺：组织病理学与病理学(Human Thymus:Histopathology and Pathology)》,施普林格出版社(Springer Verlag),纽约,纽约州；Hiatt等人(2000)《组织学颜色图集(Color Atlas of Histology)》,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams,and Wilkins),费城,宾夕法尼亚州；Louis等人(2002)《基础组织学：文本与图集(Basic Histology:Text and Atlas)》,麦格劳-希尔公司(McGraw-Hill),纽约,纽约州。

[0094] 用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可获得的。参见例如GenBank,Vector 套件(马里兰州贝塞斯达的Informax公司)；GCG威斯康星州包(加利福尼亚州圣地亚哥的Accelrys公司)；
(内华达州水晶湾的TimeLogic公司)；Menne等人(2000)《生物信息学
(Bioinformatics)》16:741-742；Menne等人(2000)《生物信息学应用笔记(Bioinformatics Applications Note)》16:741-742；Wren等人(2002)《生物医学计算机方法和程序
(Comput.Methods Programs Biomed.)》68:177-181；vonHeijne(1983)《欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)》133:17-21；von Heijne(1986)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》14:
4683-4690。

[0095] II.临床前

[0096] A.同基因小鼠肿瘤模型

[0097] 从杰克逊实验室(Jackson Laboratories)获得6周龄到8周龄的雌性C57B1/6J小鼠并且根据AALAM指南进行饲养。

[0098] 用补充有10％FBS和50ug/ml庆大霉素的McCoy 5A培养基(2mM左旋谷酰胺)来培养B16.F10或B160VA细胞。通过用0.25％胰蛋白酶消化来收获细胞并将细胞重新悬浮于汉克氏(Hank's)平衡盐溶液(HBSS)中。将总体积为0.1ml的1百万个细胞皮下注射到被麻醉的小鼠中的每个小鼠的右翼。将总体积为0.1ml的50万个细胞皮下注射到每个小鼠的左翼。从第8天开始，通过数字卡尺测量来监测肿瘤生长，直到平均肿瘤体积达到-100mm3。一旦肿瘤进阶到期望体积，就淘汰具有非常大或非常小的肿瘤的小鼠。将剩余小鼠分为每10个小鼠一组，通过植入右翼上的肿瘤体积随机化。

[0099] 将这个方案用作标准模型来同时测试对治疗的肿瘤(原发性)和未治疗的肿瘤(对侧的)的影响。每周测量肿瘤体积两次。当原发性肿瘤和对侧肿瘤的总肿瘤负荷达到2000mm3时，对小鼠进行安乐死。

[0100] B.瘤内电穿孔

[0101] 用异氟烷麻醉小鼠以进行治疗。在0.9％无菌盐水中将环状质粒DNA稀释到1ug/ul。使用具有26Ga针的1ml注射器将50ul编码小鼠IL-12的质粒DNA注射到原发性肿瘤的中心。用于表达小鼠Il-12的质粒结构与图1所示的人类IL-12(tavo)的质粒结构相同。在一些实验中，将这个质粒的不同版本与替换内部核糖体进入位点(IRES)的外显子跳跃基序P2A一起使用。在一些实验中，注射空pUMVC3载体作为对照物。在注射之后立即执行电穿孔。使用临床电穿孔参数为1500V/cm、100ps脉冲、0.5cm、6针电极的MedPulser来实现DNA电穿孔。所使用的替代性参数为350V/cm、10-msec脉冲、300ms脉冲频率、0.5cm针刺针。这个程序此后被称为 mIL-12。

[0102] 表3.治疗的肿瘤和未治疗的肿瘤在瘤内电穿孔之后的B16F0肿瘤消退。在肿瘤细胞植入之后8天、12天和15天执行参数为1500V/cm、100ps、0.5cm、6针电极的电穿孔。在第16天采集所示肿瘤体积测量结果。

[0103]

[0104] 对质粒编码小鼠IL-12进行瘤内电穿孔( mIL-12)造成了治疗的肿瘤和未治疗的对侧肿瘤两者的显著减小的肿瘤生长。

[0105] C.腹膜内注射

[0106] 使注射溶液达到室温并抽到带无菌27号针的注射器中。用酒精浸泡过的垫片将注射位点消毒。以30度角将200ul抗体溶液注射到中线正上方的右侧至0.5cm的深度。用200ul l mg/ml对照物IgG(克隆：LTF-2，BioXCell目录号：BE0090)或抗PD-L1(克隆：10F.9G2；BioXCell目录号：BE0101)溶液每周治疗小鼠两次。

[0107] 表4.用 mIL-12和抗PDL1抗体治疗的B16F10对侧肿瘤模型中的肿瘤消退。在第0天和第7天(肿瘤细胞植入后8天和15天)，用350V/cm、10-msec脉冲来执行mIL-12。在第0天开始，每周两次IP注射抗PD-L1抗体。

[0108] 第7天.示出了第16天的肿瘤体积测量结果。

[0109]

[0110] 用拮抗性抗PD-L1抗体进行的额外治疗提高了小鼠体内用 mIL-12治疗的和未治疗的B16F10肿瘤两者的消退，从而表明了将瘤内IL-12基因疗法与PD-1/PD-L1信号传导途径组合的积极效果。

[0111] D.流式细胞术

[0112] 在各个时间点，在 mIL-12治疗之后，处死小鼠并通过手术移除肿瘤和脾组织。

[0113] 通过压制脾穿过70微米滤纸将脾细胞分离，之后进行红细胞裂解(RBC裂解缓冲液，VWR，4203010BL)和Lymphocyte(Cedarlane公司CL5035)分馏。用SIINFEKL-四聚体(MBL国际公司T03002)将淋巴细胞染色，之后用含有以下的抗体混合物进行染色：抗CD3(Biolegend公司100225)、抗CD4(Biolegend公司100451)、抗CD8a(Biolegend公司100742)、抗CD19(Biolegend公司115546)和活体染色剂(活-死水(live-dead Aqua)；赛默飞世尔科技公司(Thermo-Fisher)L-34966)。将细胞固定并在LSRII流式细胞仪(贝克曼公司
(Beckman))上进行分析。

[0114] 使用肿瘤用Gentle-MACS(Miltenyi肿瘤解离试剂盒130-096-730，C管，130-093-TM237)将肿瘤解离并使用带加热器的Miltenyi gentleMACS Octo解离器(130-096-427)进行均质化。在4℃下将细胞以800x g沉淀5分钟、重新悬浮于5mL PBS+2％FBS+1mM EDTA(PFB)中并且覆盖到5mL Lympholyte-M(Cedarlane公司)上。在无制动的情况下，在室温下将Lymphocyte柱以1500x g在离心机中旋转20分钟。用PBF洗涤Lymphocyte层。用Fc阻断剂(BD生物科学公司(BD Biosciences)553142)将细胞沉淀物轻轻地重新悬浮于500uL PFB中。在96孔板中，将细胞与SIINFEKL四聚体(MBL公司)溶液混合，从而根据制造商的说明书来表示B160VA肿瘤中的免疫显性抗原，并在室温下孵育10分钟。加入含有以下的抗体染色混合物并在室温下孵育30分钟：抗CD45-AF488(Biolegend公司100723)、抗CD3-BV785
(Biolegend公司100232)、抗CD4-PE(eBioscience公司l2-0041)、抗CD8a-APC(eBioscience公司17-0081)、抗CD44-APC-Cy7(Biolegend公司103028)、抗CD19-BV711(Biolegend公司
11555)、抗CD127(135010)、抗KLRGl(138419)。用PFB将细胞洗涤3次。在冰上，用1％多聚甲醛将细胞固定在PFB中1分钟。用PFB将细胞洗涤两次并在黑暗中储存在4℃下。在LSR II流式细胞仪(贝克曼公司)上分析样本。

[0115] 通过从尾尖移除血液(每个小鼠采集血液少于100ul)来从治疗的小鼠中分离出外周血淋巴细胞，之后使用烙笔将伤口密封。将提取的血液与EDTA溶液轻轻地混合。按照制造商的方案使用Pharmlyse(BD公司；Cat#555899)来裂解红细胞。通过离心使淋巴细胞沉淀并将其重新悬浮于PBS中。根据制造商的方案使用活/死可固定水死亡染色剂(Live/Dead Fixable Aqua Dead stain)(赛默飞世尔科技公司，目录号L34957)将细胞染色。将细胞用抗Fc抗血清阻断，用含有来自Biolegend公司的以下抗体的混合物染色并在黑暗中在2℃到8℃下孵育30分钟：抗CD45(103116)、抗CDllb(117318)、抗CD3(100228)、抗CD8(100742)、抗CD127(135010)、抗KLRGl(138419)、抗CD19(115546)。洗涤样本并在LSFortessa X-20(BD生物科学公司)上进行分析。将短命CD8T细胞(SLEC)定义为CD3(+)CD8(+)CD19(-)KLRG1(+)CD
127(-)事件。

[0116] 表5. mIL-12增加了经治疗的荷B160VA瘤小鼠的脾中的SIINFEKL-四聚体结合CD8+T细胞。利用0.5cm针刺针，使用350V/cm、10-msec脉冲、300ms脉冲频率，在第0天对小鼠进行一次瘤内电穿孔。

[0117]

[0118] mIL-12诱导针对来自卵白蛋白的SIINFEKL肽的循环CD8(+)T细胞增加，所述SIINFEKL肽是B160VA肿瘤中的显性抗原。

[0119] 这些数据指示，局部IL-12疗法会使小鼠产生全身性肿瘤免疫。

[0120] 表6. mIL-12改变了B160VA对侧(未治疗的)肿瘤中的免疫环境。利用0.5cm针刺针，使用350V/cm、10-msec脉冲、300ms脉冲频率，在第0天对小鼠进行一次瘤内电穿孔。示出了在治疗后18天测量的未治疗的肿瘤中浸润性淋巴细胞(TIL)的组成。

[0121]

[0122] 表7.用 mIL-12和抗PD-Ll进行的组合治疗在治疗的小鼠的血液中诱导了可检测水平的短命效应T细胞(SLEC)。在第0天和第7天(肿瘤细胞植入后8天和15天)，用350V/cm、10-msec脉冲来执行 mIL-12。在第7天开始，每周两次IP注
射抗PD-L1抗体。在第17天抽取血液并进行分析。

[0123]

[0124] 对荷B16瘤小鼠进行的 mIL-12治疗诱导了未治疗的肿瘤中SLEC T细胞增加。当与拮抗性PD-L1抗体组合施用时，还在荷瘤小鼠的外周血样本中检测到SLEC[0125] 显著增加。这些结果表明了通过这些疗法诱导的稳健的全身性肿瘤免疫，从而证实了未治疗的对侧肿瘤的生长减小(表3和表4)。

[0126] E.对小鼠基因表达的分析

[0127] 使用来分析通过 mIL-12诱导的未治疗的肿瘤中的基因表达变化。使用解剖刀从小鼠小心地收获肿瘤组织并在液氮中快速冷冻。使用天平(梅特勒-托利多公司(Mettler Toledo)，型号ML54)对组织进行称重。将1ml Trizol(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA))加入组织中并在冰上使用探针均质器进行均质化。使用制造商的说明书从Trizol中提取RNA。通过DNA酶(赛默飞世尔科技公司，目录号：EN0525)处理移除污染性DNA。使用NanoDrop ND-
1000分光光度计(赛默飞世尔科技公司)来确定总RNA浓度。使用技术来执行
基因表达图谱分析。简单地说，用 (小鼠免疫‘vl’表达组，技术
有限公司( Technologies))将50ng总RNA在96℃下杂交过夜。这个组通过图
谱分析了561种免疫学相关小鼠基因以及两种内置对照物：阳性对照物(各个浓度下的掺杂型RNA以评估总体测定性能)和15个阴性对照物(以使总RNA输入的差异归一化)。然后，使用nCounter 断面仪以数字方式分析杂交样本中每个RNA物种的频率。使用
分析软件2.5pack来分析原始mRNA丰度频率。在这个过程中，使用了从管家基因
的几何平均值、阴性对照物的平均值以及阳性对照物的平均值导出的归一化因子。

[0128] 表8. mIL-12使原发性肿瘤和对侧肿瘤两者中淋巴细胞和单核细胞的细胞表面标志的瘤内水平增加。示出了治疗的小鼠与未治疗的小鼠的倍数变化值

[0129]

[0130] 表9. mIL-12使原发性肿瘤和对侧肿瘤两者中INF-γ调控的基因的瘤内水平增加。示出了治疗的小鼠与未治疗的小鼠的倍数变化值

[0131]

[0132]

[0133] 对来自治疗的肿瘤和未治疗的肿瘤的组织的基因表达分析证实了流式细胞术分析，从而示出了肿瘤TIL的稳健增加。另外，干扰素γ调控的基因的增加表明诱导了肿瘤内的免疫刺激环境。检查点蛋白表达的显著增加指示， mIL-12可以为了组合使用的检查点抑制剂的作用而增加底物。

[0134] II.临床试验数据

[0135] A.基本原理

[0136] 用单克隆抗体(mAb)抑制PD-L1/PD-1轴作为单一疗法展示了客观应答率(ORR)在20％到40％的范围内(即，Chen等人,2015《, 临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》125:3384)。
不幸的是，即便是患有被视为最具免疫应答性的实体瘤类型之一的黑色素瘤，大多数患者也对用抗PD-1药剂进行的单一疗法无应答。这些原发性PD-1-无应答者表示了可以从被定制成将这一队列中的大部分转变成PD-1应答者群体的组合疗法中受益的显著未满足的医学需要。

[0137] PD-1被示出为表达在活化淋巴细胞上，包含外周CD4+和CD8+T细胞、B细胞、Treg和自然杀伤(NK)细胞(Agata等人,1996《,国际免疫学(Int.Immunol)》8:765；Vibhakar等人,1997《, 实验细胞研究(Exp.Cell Res.)》232:25)。还示出了在胸腺发育期间对CD4-CD8-(双阴性)T细胞以及巨噬细胞和树突细胞亚群的表达(Nishimura,2000,《实验医学杂志
(J.Exp.Med.)》191:891)。组成性地表达PD-1的配体(PD-L1和PD-L2)或者可以在各种细胞类型和各种肿瘤中诱导所述配体(Francisco等人,2010《, 免疫学评论(Immunol.Rev.)》
236:219)。具有通常在与PD-L1+细胞缔合的不同簇中见到的高密度CD8+PD-1+TIL的患者对抗PD-1单一疗法做出应答的可能性常常较高。这些患者从强劲的内源性抗肿瘤应答中受益，从而生成细胞毒性T淋巴细胞。另一方面，黑色素瘤中大量TIL的缺少与对PD-1疗法的应答的缺乏高度相关(Tumeh等人,2014《, 自然(Nature)》515:568)。将抗PD-1药剂派姆单抗与能够驱动有效T细胞应答的药剂如IL-12组合可以增加非应答者表型中的免疫原性并且增强对PD-1/PD-L1阻断的应答。

[0138] 瘤内注射通过电穿孔递送的质粒表达IL-12(例如，tavo)(例如，IL-12)展示了肿瘤体积减小并且较差免疫原性和抗PD1难治性B16.F10小鼠黑色素瘤模型中CD4+和的CD8+的瘤内浸润增加(参见上文)。在I期试验中见到的IFN-γ的IL-12蛋白质表达和肿瘤水平的剂量比例性增长进一步展示了治疗后瘤内变化(Daud等人,2008《, 临床肿瘤学杂志(J.Clin Oncol.)》26:5896)。新出现的II期数据指示，经过第11天的预治疗的瘤内NK细胞在第39天加倍，并且活化循环NK细胞的频率增加(OncoSec医药公司(OncoSec Medical),2013年新闻稿)。

[0139] B.方案

[0140] 有23名患者参加的正在进行的多中心开放标记单臂试验正在估计基于公布的生物标志预期会对派姆单抗单一疗法具有非常低的应答率的预选患者群体中，对用通过电穿孔递送的tavokinogene teslaplasmid(tavo)(Intratumoral IL-12)和IV派姆单抗的组合进行的治疗的最佳总体应答率(Loo和Daud,2017《, 临床研究通视杂志(J Clin Invest Insight)》2:e93433；Daud等人,2016《,临床研究杂志(J Clin Invest)》126:
3447)。

[0141] 在参加之前，收集所有患者的组织活检，以估计研究可行性。基于流式细胞术测定来选择患者，从而量化瘤内CD8+T细胞的频率，所述瘤内CD8+T细胞是PD-1hiCTLA4hi部分耗竭的细胞毒性淋巴细胞(被称为peCTL；Loo和Daud,2017《,临床研究通视杂志》2:e93433；Daud等人,2016《,临床研究杂志》126:3447)。这一患者预选的目的是丰富不太可能会针对抗PD-1/PD-L1单一疗法做出应答的患者的研究群体。每个派姆单抗治疗周期为3周。患者与
intratumoral IL-12的第一周期同时开始派姆单抗治疗。

[0142] 表10.治疗方案

[0143]

[0144] 在门诊患者的基础上施用所有试验治疗。

[0145] 每个治疗周期(即每3周)施用200mg派姆单抗一次。在已经完成所有程序/评估之后，在每个周期(±2天)的第1天施用派姆单抗。以30分钟IV输注的方式施用派姆单抗(治疗周期间隔可能由于毒性而增加)。目标输注时间为30分钟：-5分钟/+10分钟)。

[0146] 只要受试者有至少一处可及表面损伤(ASL)，就在每个奇数周期施用IL-12以进行治疗。将ASL定义为满足以下标准：(1)最长垂直直径为至少
0.3cm x 0.3cm；(2)处于施加电穿孔的适合位置。在受试者具有多处ASL的情况下，在每个周期治疗最大数量的损伤，牢记(1)患者耐受性以及(2)不应超过最大每日剂量20mL。在开始pIL-12EP新治疗周期之前，研究者确定在那个周期期间要治疗的ASL。在周期的多天(即，第1天、第5天、第8天)治疗相同的ASL。只要每名患者每天的最大质粒注射体积不超过20mL，就可以治疗满足ASL的定义的以下损伤：之前治疗的损伤、基线处存在的未治疗的但在之前识别出的损伤和/或在研究期间出现的新损伤。如果后续周期不存在ASL，则受试者可以跳过那个 IL-12周期并且继续研究日程。

[0147] C.电穿孔(EP)程序

[0148] DNA质粒载体tavo含有被内部核糖体进入位点隔开并且被单个CMV启动子驱动的人类IL-12p35和p40亚单元。图1中示出了这个质粒结构的示意图。

[0149] 在进行质粒注射之前，通过各种方法(例如，注射在损伤周围的冰或1％利多卡因)施加局部麻醉。另外，在治疗之前或期间，必要时可以给予患者镇痛药或抗焦虑药。将质粒溶液注入可及肿瘤之后，将含有6个不锈钢电极的无菌施用器共定位在质粒注射位点周围，所述质粒注射位点可以在肿瘤内或周围。将施用器与电源连接，并且以1秒的间隔在1500V/cm的场强度(E+)和100ps的脉冲宽度下向每个之前注射过的肿瘤施加六个脉冲。瘤内tavo注射之后，EP以方波脉冲图案的方式递送受控电脉冲，从而产生最佳跨膜电位以供电穿孔发生(Hofmann等人,1999《IEEE生物化学工程汇刊(IEEE Trans Biomed Eng)》46:752)。电穿孔脉冲在六个六边形对置针电极之间。第一脉冲之后，将对置针电极对之间的极性颠倒并且再次向这对针发送脉冲。在初始成对脉冲发送之后，将脉冲递送按顺时针方向旋转到下一对对置针,直到总共递送了六个脉冲，从而完成电穿孔顺序。当在同一天注射多个肿瘤时，在对每个肿瘤进行质粒注射之后立即执行EP。一旦已经完成对肿瘤的治疗，就可以对下一个肿瘤进行注射并且立即进行电穿孔。

[0150] 用于递送质粒的OncoSec医疗系统(OMS)由两个主要部件组成：(1)电极施用器(例如，由可重复使用手柄和一次性针电极施用器组成；“OMS施用器”)，其具有带针电极的一次性施用器尖端(例如，OMS施用器尖端)；以及(2)电脉冲生成装置(例如，OMS电脉冲疗法发生器；“OMS发生器”)。OMS施用器经由电缆通过近端连接器与OMS发生器连接。

[0151] D.终点

[0152] 这个试验的主要终点是使用RECIST vl.l来估计 IL-12与派姆单抗的组合在患有低peCTL黑色素瘤的患者中的抗肿瘤功效。通过研究者评估大致每12周对患者的客观应答率(ORR)进行评估，并且如果在疾病评估时患者患有稳定疾病或更佳，则患者将会继续治疗，或者如果患者患有进行性疾病，则由主要研究者酌情决定。在出现疾病进展或不可接受的毒性之前，给予了治疗并且将继续给予治疗，持续长达两年。唯一例外的是经历了确认CR的患者；这些患者可以由研究者酌情决定中断治疗。患者可以在完全缓解或复发之后重新开始任一治疗，如果研究仍开放并且患者满足方案所概括的条件的话。通过估计不良事件，继续关注患者的安全性和耐受性。

[0153] 次要终点包含：(1)估计 IL-12与派姆单抗的组合的安全性和耐受性；(2)估计用 IL-12与派姆单抗的组合治疗的低peCTL黑色素瘤患者的
应答时长；(3)估计用 IL-12与派姆单抗的组合治疗的低T-ex黑色素瘤患
者的无进展存活期(PFS)和总体存活期(OS)；(4)估计通过免疫相关应答标准(irRC)或
RECIST vl.l确定的最佳总体应答率(BORR)。

[0154] 表11.如在24周内通过RECIST vl.l测量的经历组合疗法的22名患者的中期客观应答率(ORR)。

[0155]通过RECIST vl.l确定的客观应答患者数量
完全应答(CR) 6
部分应答(PR) 4
无应答(SD和PD) 12

[0156] 进行估计的患者均具有＜22％的PD-lhi CTLA-4hi TIL频率(低peCTL状态)，之前与针对抗PD-1的低应答概率相关联的表型(Loo和Daud,2017《, 临床研究通视杂志》2:e93433；Daud等人,2016《, 临床研究杂志》126:3447)。这些患者的年龄范围为39岁到89岁。
治疗耐受性良好；38％的不良事件(AE)被分类为已解决的治疗位点反应(1级到2级)。用5d抗生素解决蜂窝组织炎的一个SAE。用皮质类固醇解决腹泻的一个3级AE。基于临床判断和/或RECIST vl.l，BORR为48％(9CR，2PR)。

[0157] 另外的探索性终点包含研究候选生物标志，所述候选生物标志包含通过IHC估计的PD-L1表达水平和通过肿瘤组织中的CD8T细胞密度估计的TIL图谱。与临床结果相关联地估计组织和血液中的其它生物标志和免疫应答的变化。

[0158] E.流式细胞术

[0159] 从患者中获得血液样本，以便通过流式细胞术来分析免疫细胞亚群。将外周血单核细胞(PBMC)从 CPTTM单核细胞制备管(新泽西州富兰克林湖的BD生物科学公司，目录号362753)中分离出来并且冷冻保存以进行分批分析。从 BCT管
(内布拉斯加州奥马哈的Streck公司，目录号213386)中收集保存的白细胞。

[0160] 将解冻的冷冻PBMC或保存的白细胞的表面细胞标志在4℃下染色30分钟。根据制造商的方案，使用FoxP3固定/透化缓冲液套装(Biolegend公司，目录号421403)来进行胞内染色。在室温下进行胞内染色30分钟。

[0161] Ki67是由分裂细胞表达的蛋白质并且仅由发现于肿瘤中的一小部分PD-1+CD8T细胞而不由正常组织或外周血中的T细胞表达(参见例如Ahmadzadeh等人(2009)《血液(Blood)》114:1537-1544)。

[0162] 将辅助性CD4T细胞(CD4Th)定义为CD3+CD4+FoxP3-；将CD8T细胞定义为CD3+CD4-；将调节性T细胞(Treg)定义为CD3+CD4+FoxP3+CD127-；将PD-1+CD4Th细胞定义为CD3+CD4+FoxP3-PD-l+；将PD-1+Ki67+CD4Th细胞定义为CD3+CD4+FoxP3-PD-l+Ki67+；将PD-1+Ki67-CD4Th细胞定义为CD3+CD4+FoxP3-PD-l+Ki67-；将PD-1+CD8T细胞定义为CD3+CD4-PD-1+；将PD-1+Ki67+CD8T细胞定义为CD3+CD4-PD-1+Ki67+；将PD-1+Ki67-CD8T细胞定义为CD3+CD4-PD-1+Ki67-；将自然杀伤(NK)细胞定义为CD3-CD56highCD16-、CD3-CD56dimCD16+、
CD56dimCD16-或CD3-CD56-CD16+。将增生效应记忆T细胞定义为CD3+CD8+CCR7-CD45RA-Ki67+。将短命效应T细胞(SLECS)定义为CD3+CD8+CCR7-CD45RA+KLRG1+。

[0163] 表12.在与临床应答相关的一个治疗周期之后观察到患者血液中的增生效应记忆T细胞增加。将应答者定义为具有完全应答(CR)或部分应答(PR)的患者；将无应答者定义为患有稳定疾病(SD)或进行性疾病(PD)

[0164]

[0165] 表13.在与临床应答相关的第2治疗周期第1天(C2D1)患者血液中的短命效应细胞(SLEC)的增加。将应答者定义为具有完全应答(CR)或部分应答(PR)的患者；将无应答者定义为患有稳定疾病(SD)或进行性疾病(PD)

[0166]

[0167] 一个治疗周期之后对患者血液样本的分析指示，与无应答患者相比，应答患者在属于增生效应记忆T细胞(高1.8倍)和短命效应细胞(高1.7倍)的PBMC的百分比方面增加更多。在第24周(第8治疗周期结束时)通过RESIST来测量患者应答。

[0168] F.对患者肿瘤活检中的相对基因表达的分析

[0169] 用蛋白酶抑制剂(cComplete迷你剂，不含EDTA；印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏生命科学公司(Roche Life Science,Indianapolis,ID))在无Ca2+或Mg2+的磷酸盐缓冲盐水(加利福尼亚州卡尔斯巴德的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Carlsbad,CA))中将通过穿孔活检或细针抽吸物(FNA)得到的肿瘤组织样本均质化。在-80℃下各自储存澄清的上清液和细胞沉淀物。根据制造商的方案，使用-RNeasy FFPE试剂盒(德国希尔登的Qiagen公司(Qiagen,Hilden,Germany))从细胞沉淀物中分离出总RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(赛默飞世尔科技公司)来确定总RNA浓度，并且使用2100生物分析器(加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦科技有限公司(Agilent,Santa Clara,CA))来估计质量，以用于LabCorp公司(华盛顿州西雅图)的标准分析和涂片分析两者。如果生物分析器RIN得分小于2.0并且涂片分析指示＜30％的RNA小于300bp，则将样本从分析中排除。
由LabCorp公司(华盛顿州西雅图)根据制造商的方案将总RNA与 nCounter系
统(华盛顿州西雅图的技术有限公司( Technologies,
Seattle,WA))一起使用。简单来说，用 (人类免疫学v2基因表达组，
技术有限公司)在96℃下将5μl(100ng)总RNA杂交过夜。这组通过图谱分析
了594种免疫学相关人类基因以及两种内置对照物：阳性对照物(各个浓度下的掺杂型RNA以评估总体测定性能)和15个阴性对照物(以使总RNA输入的差异归一化)。另外，在相同活检上运行图谱分析了来自13种癌症相关典型途径的770种基因的人类Pan-Cancer IO 360 Beta。然后，使用nCounter SPRINTTM断面仪以数字方式分析杂交样本中每个RNA物种的频率。使用分析软件3.0pack来分析原始mRNA丰度频率。在这个过程中，使用了从
管家基因的几何平均值、阴性对照物的平均值以及阳性对照物的平均值导出的归一化因子。针对免疫相关基因亚群，以成对IL-12治疗患者活检与筛查预先治疗患者活检之比的方式估计基因表达分析。(加利福尼亚州拉荷亚的GraphPad公司的Prism(GraphPad Prism,La Jolla,CA))。如通过RECISTvl.l测量的，将应答者(R)队列定义为具有部分应答或完全应答的患者。

[0170] 表14.与筛查活检相比，在第2周期第1天(C2D1)， IL-12与派姆单抗治疗的组合增加了经治疗损伤中包括INFγ标签基因集的基因的表达(Ribas A等人,
2015《,临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol.)》,33Abstr 3001；Ayers M等人,2015《, 癌症免疫疗法杂志(J Immunother Cancer.)》,3:80)。

[0171]

[0172] 表15.与筛查活检相比，在第2周期第1天(C2D1)， IL-12与派姆单抗治疗的组合增加了存在于经治疗损伤中活化自然杀伤(NK)细胞中的基因的表达。

[0173]

[0174] 表16.与筛查活检相比，在第2周期第1天(C2D1)， IL-12与派姆单抗治疗的组合增加了经治疗损伤中的在抗原呈递中起作用的基因的表达

[0175]

[0176] 表17.与筛查活检相比，在第2周期第1天(C2D1)， IL-12与派姆单抗治疗的组合增加了经治疗损伤中的在T细胞存活以及T细胞介导的细胞毒性中起作用的基因的表达

[0177]

[0178] 表18.与筛查活检相比，在第2周期第1天(C2D1)， IL-12与派姆单抗治疗的组合增加了经治疗损伤中的免疫检查点基因的表达

[0179]

[0180] 表19.与筛查活检相比，在第2周期第1天(C2D1)， IL-12与派姆单抗治疗的组合增加了经治疗损伤中的淋巴细胞表面标志的表达。

[0181]

[0182] 对患者活检的分析示出了肿瘤中多产免疫相关基因的上调，从而表明治疗可以改变肿瘤微环境以募集和活化T细胞和NK细胞，实现抗原呈递并且增加作为检查点抑制剂的底物的免疫检查点蛋白质的呈递。与无应答患者相比，表4、表5、表6、表7、表8和表9所示的所有基因的表达的增加在应答患者中显著更高。这些基因的表达的增加可以用作用于预测总体临床应答的生物标志。

[0183] G.ELISPot测定

[0184] 从患者中获得血液样本。将外周血单核细胞(PBMC)从 CPTTM单核细胞制备管(新泽西州富兰克林湖的BD生物科学公司，目录号362753)中分离出来并且冷冻保存以进行分批分析。

[0185] 在37℃下将PBMC解冻并静置过夜。在MultiScreen滤板(马萨诸塞州比勒利卡的EMD密理博公司(EMD Millipore Billerica Massachusetts)，目录号MAIPS4510)中，将细胞一式三份每份1.0x 105个细胞进行铺板并且在37℃下用gp100、NY-ESO-1、Mage-A3、Melan-A/MART-1肽(JPT Peptide Technologies Berlin,Germany)、白细胞凝集素PHA-L(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich St.Louis,MO)，目录号L2769)或在没有抗原的情况下孵育48小时。通过抗人类IFN-γ酶联免疫斑点测定(ELISpot)(瑞典斯特兰的纳卡的MABTECH公司(MABTECH Nacka Strand Sweden)，目录号3420-2A)使分泌IFN-γ的细胞可视化。用ELISpot读板仪(俄亥俄州谢克海茨的细胞科技有限公司(CTL)(Cellular Technology Limited Shaker Heights，OH)—免疫斑点分析仪)对板进行扫描并且使用CTL免疫斑点5.0分析仪软件进行计数。通过从测试孔减去对照孔(无抗原)中数出的斑点数来获得抗原特异性IFN-γ分泌细胞的最终计数。如果阳性对照物PHA孔具有＞100个斑点/孔的平均值并且阴性对照物(无抗原)孔具有＜200个斑点/孔，则接受使样本包含在最终分析中。

[0186] 表20.用INFγELISpot进行的抗原特异性免疫应答

[0187]

[0188]

[0189] 从患者血液得到的对从淋巴细胞离体产生的IFN-γ的ELISpot测量展示了，与健康供体或无应答患者相比，对治疗做出应答的患者在筛查时对黑色素瘤特异性抗原gp110和Trp2具有可测量的应答，其中在一个治疗周期后，斑点数/100,000个细胞增加。

[0190] H.对患者活检的免疫组织化学分析：IHC显色测定

[0191] 在带正电玻片上以大致5pm的厚度对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)活检组织进行切片。

[0192] 根据Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx试剂盒文件(PhenoPath实验室)所提供的经FDA批准的说明书对玻片进行染色和评分。报告整个肿瘤中的肿瘤细胞阳性百分比到最近的十分位，并且在大于50％时注意肿瘤-间质边缘处的阳性。关于CD8标志染色(DAKO公司，目录号M7103)以细胞在瘤内和瘤周区域的百分比呈现结果到最近的十分位。还检验了H&E染色的玻片以用于高级整体形态。

[0193] 在第2周期第1天，将对筛查时取得的来自患者的活检的PD-L1和CD8显色分析与第一治疗周期之后取得的分析进行比较。如通过RECISTvl.l测量的，将应答者(R)队列定义为具有部分应答或完全应答的患者。如通过RECISTvl.l测量的，将无应答者(NR)队列定义为具有进行性疾病或稳定疾病的患者。

[0194] 表21.与筛查活检相比，来自应答者(R)队列和无应答者(NR)队列的患者活检中的PD-L1和CD8蛋白质水平在第2周期第1天的变化。

[0195]

[0196] I.对患者活检的免疫组织化学分析：IHC多谱测定

[0197] 从福尔马林固定石蜡包埋块切出5um的组织切片。将所有切片去福尔马林(deparaffmize)并在pH 9.0柠檬酸盐缓冲液(加利福尼亚州菲蒙的Biogenex公司
(Biogenex,Fremont,CA))中经受热诱导的表位检索。使用以下抗体对每个组织玻片进行6重组(6-plex panel)免疫组织化学法：抗FoxP3(克隆236A/E7，马萨诸塞州坎布里奇的Abeam公司(Abeam,Cambridge,MA))、抗PD-Ll(克隆E1L3N，马萨诸塞州丹佛的细胞信号传导公司(Cell Signaling,Danvers,MA))、抗CD8(克隆SP16，加利福尼亚州普莱森顿的春天生物科学公司(Spring Bioscience,Pleasanton,CA))、抗CD3(克隆SP7，春天生物科学公司)、抗CD163(克隆MRQ26，亚利桑那州图森的Ventana公司(Ventana,Tucson,AZ))、抗细胞角蛋白(克隆AE1/AE3，加利福尼亚州卡平特里亚的DAKO公司(DAKO,Carpinteria,CA))。分别用TSA-Cy5(马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(PerkinElmer,Waltham,MA))、TSA-Cy3(珀金埃尔默公司)、TSA-FITC(珀金埃尔默公司)、TSA-Alexa594(加利福尼亚州卡尔斯巴德)、TSA-Cy5.5(珀金埃尔默公司)和TSA-香豆素(珀金埃尔默公司)使抗原-抗体结合可视化。在pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中，在检测的抗体之间进行微波处理，以防止交叉反应。用DAPI孵育组织玻片作为复染色并且用VectaShield封片剂(mounting media)(加利福尼亚州伯林盖姆的Vector Labs公司(Vector Labs,Burlingame,CA))来加上盖玻片。

[0198] 用珀金埃尔默公司Vectra平台捕获数字图像。在20X下对具有最高免疫细胞(CD3+CD8+)浸润的肿瘤区域进行扫描并且进行选择以用于分析。针对每个样本，用InForm软件(珀金埃尔默公司)分析各自具有0.36mm2的三个图像。枚举以下表型的细胞总数：间质和肿瘤区室中的PD-L1+肿瘤细胞+、PD-L1+其它细胞、CD3+PD-L1+、CD3+PD-L1-FoxP3+、CD8+PD-L1+、CD8+PD-L1-、CD163+PD-L1+、CD163+PD-L1-。

[0199] 针对每个样本执行苏木精和伊红染色并且由病理学家进行观察以确保代表性组织样本。如通过RECISTvl.l测量的，将应答者(R)队列定义为具有部分应答或完全应答的患者。如通过RECISTvl.l测量的，将无应答者(NR)队列定义为具有进行性疾病或稳定疾病的患者。

[0200] 表22.与筛查活检相比，在第2治疗周期第1天，通过来自应答者(R)队列和无应答者(NR)队列的患者活检中CD8阳性细胞与PD-L1阳性细胞之比(示出了CD 163阳性巨噬细胞和全部肿瘤细胞两者)测量的变化。

[0201]

[0202] PD-L1阳性细胞的较高频率以及应答患者中CD8+细胞与PD-Ll+细胞的治疗后比值表明， IL-12与派姆单抗治疗的组合使发炎肿瘤具有适合底物以用于组合使用的抗PD-1检查点阻断。

[0203] 通过多谱IHC对不直接用 IL-12治疗的带损伤的两名患者进行分析并且其展示出有显著淋巴细胞浸润的证据。

[0204] 对于具有抗PD-1无应答表型的患者， IL-12与派姆单抗的组合产生了48％的临床应答，具有关联的基于免疫的阳性生物标志数据和优异安全性图谱。这些数据表明， IL-12调节了肿瘤微环境以在以其它方式不可能做出应答的患
者中实现有效的抗PD-1mAb应答。

[0205] 开始另外的II期试验以测试 IL-12和IV派姆单抗在患有III/IV期黑色素瘤的患者体内的功效，所述患者在抗PD-1抗体单一疗法下病情正在恶化。符合条件的患者是在病理学上诊断为不可切除的或转移性黑色素瘤的那些患者，所述患者在派姆单抗或纳武单抗的情况下病情正在恶化或已经恶化。如果 IL-12与派姆单
抗组合可以将PD-1检查点抑制剂无应答者转变成应答者，则研究包括核心研究(24周)、延展期以及长期安全性随访和评估。

[0206] 核心研究：在每6周的第1天、第5天和第8天用 IL-12在可及损伤处对符合条件的患者进行治疗并且在每个3周周期的第1天用IV派姆单抗(200mg)对符合条件的患者进行治疗持续24周。在治疗多个可及损伤时，如治疗医生每次探访时认为可行的那样。

[0207] 完成24周治疗(核心研究)的患者由研究者酌情决定进入延展期并且继续接受IL-12与派姆单抗组合治疗，从基线起持续长达35个派姆单抗周期(大致2
年)或直到出现后续疾病进展为止。

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