本发明涉及用2，4-二氨基嘧啶-3-氧化物或其中一种盐 作为活性物质，制备在制药或兽医应用中用于治疗胶原成熟和组织 化生理失调的治疗组合物。

制备自然的原骨胶原束需要在Golgi装置中在粗糙的内质网状 组织中将一定数量的赖氨酰基和脯氨酰基羟基化，然后进行羟基- 赖氨酰基的糖基化反应。这种胶原成熟问题构成为许多研究工作的 课题。

于是，已经描述过Minoxidil，即2，4-二氨基-6-哌啶 基嘧啶-3-氧化物，并且已用于治疗某些高血压和治疗产生雄性 征的脱发。Minoxidil成为作为赖氨酰基羟化酶(即参与胶原成熟 过程的酶)的特定抑制剂的许多研究课题。

关于这个课题，Murad等人在Arch.of Biochem.Biophys.第 292卷，第1期，第234-238页(1992)和第308卷第1期第42 -47页(1994)中发表的这些研究结果事实上能够说明，抑制赖 氨酰基羟化酶的能力必需以在2，4-二氨基嘧啶环的N-氧化物 官能对位存在叔胺基团为前提，还说明，在Minoxidil中一样这种 基团是哌啶基为佳。

然而，现在惊奇地、出乎意料地观察到2，4-二氨基嘧啶- 3-氧化物，即2，4-DPO(后面用此缩写)，尽管在2，4- 二氨基嘧啶环的N-氧化物官能对位不含有叔胺基团，但是仍能够 专一地抑制赖氨酰基羟化酶。

在WO-92/01437中，作为局部涂敷化妆治疗头发脱落的活 性剂已经描述过这种化合物。但是，与Minoxidil相反，2，4- DPO没有任何抗高血压剂的作用，因此安全是特别令人满意的， 同时具有与Minoxidil同样的甚至更高的赖氨酰基羟化酶的抑制活 性。

因此，本发明的目的是用2，4-DPO或其中一种盐作为活性 物质，制备在制药或兽医应用中用于治疗人或动物胶原成熟的生理 失调的治疗组合物。

在后面，“2，4-DPO”术语不仅意味着2，4-DPO本 身，而且还意味着如上述定义的其中一种盐。

关于胶原成熟的生理失调，按照本发明应当理解为胶原的任何 不希望的积累，特别是皮肤组织或眼结膜的胶原基质结构的任何生 理失调；这些生理失调可以是自发的、外伤性的或手术后的生理失 调。在这些生理失调中，尤其可以列举透明视网膜病、全身性硬皮 病、由紫外光引起的皮肤增厚和瘢痕病。

因此，用本发明的2，4-DPO尤其可达到改善治疗病人的外 形的目的。

根据本发明，如果这种治疗能够达到治愈目的的话，最好还是 预防性地进行这种治疗，即在其组织化，因此还造成胶原积累的期 间进行这种治疗，尤其在愈合期间进行这种治疗。

2，4-DPO可以用于制备治疗组合物，这种组合物具有采用 局部的、经皮肤的或皮内用药形式。

关于生理学上可接受的盐，按照本发明应当理解为如硫酸、盐 酸、磷酸、乙酸、苯甲酸、水杨酸、羟乙酸、N-乙酰甘氨酸、丁 二酸、烟酸、酒石酸、马来酸、甲磺酸、苦味酸和乳酸之类的酸的 加合盐。

当这种治疗组合物是局部用药形式时，2，4-DPO的比例一 般是以这种组合物的总重量计为0.0001-5％(重量)，优选的是 0.01-2％(重量)。

其赋形剂本质上来说可以是各种各样的，但是优选的是局部涂 敷时生理学上可接受的，当然与这种活性物质相容的一种介质。

2，4-DPO在这种介质中可以呈溶解状态或者呈分散状态， 尤其是呈微粒化状。

生理学上可接受的介质可以由水，或水和溶剂的混合物，或溶 剂的混合物组成。在这些可以使用的溶剂中，具体可以列举如乙 醇、异丙醇、叔丁醇之类的C1-C4的低级醇、亚烷基二醇、亚烷 基二醇和二亚烷基二醇的烷基醚，如乙二醇的一乙基醚、丙二醇的 一甲基醚、二甘醇的一乙基醚。用于局部涂敷的这些组合物还可以 含有至少一种通常的添加剂或一种活性成分。

在这些添加剂和活性成分中，具体可以列举UV.A和UV.B防 晒剂，如甲氧基肉桂酸盐和二苯酮衍生物，如DMSO、α-生育 酚、BHA、BHT、超氧化物歧化酶之类的抗氧化剂和/或自由基 捕集剂、如尿素、甘油、乳酸、羟基酸、硫杂吗啉酮及其衍生物， 吡咯烷酮羧酸衍生物，特别是其钠盐和钾盐之类的水合剂，如氢化 可的松、β-倍他米松、地塞米松、乙酰水杨酸、吲哚美辛、异洛 芬、维生素D或尼氟灭酸之类的类固醇的或非类固醇的消炎剂、如 属于大环内酯类、吡喃糖苷类和如红霉素的四环素类的抗菌素。

这些组合物还可以含有防腐剂、稳定剂、pH调节剂、渗透压 调节剂和乳化剂。

局部涂敷用的以2，4-DPO为主要组分的这些组合物可以有 不同的形式，例如洗液、凝胶、摩斯、泡状分散液、喷洒液或气雾 摩斯。

这些组合物还可以是胶凝的或增稠的组合物。在胶凝的组合物 中，具体可以列举由如合成生物聚合胶，硬葡聚糖或纤维素衍生 物，特别是纤维素醚之类的异生物形成多糖化合物胶凝的、主要含 水的组合物，或由聚羟基乙基丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯胶凝的水醇 组合物。在增稠的含水组合物中，可以列举具体地用多官能剂交联 的聚丙烯酸得到的这种组合物，如Goodrich公司以商品名 “Garbopol”销售的这种组合物。但是，药品中或皮肤药中常用 的任何试剂当然都可被用作增稠剂。

对于局部给药来说，2，4-DPO一般按0.0001-5毫克/公斤/ 天，优选的是0.001-1毫克/公斤/天涂在待治疗的身体部位。一般 在造成胶原积累的整个期间都要进行这种治疗，或许在其后90天 的时间里也要进行这种治疗。

根据本发明，还可以使用2，4-DPO制备采用经皮肤用药方 法给药的治疗组合物。

2，4-DPO的比例一般是以该组合物总重量计为基准计 0.001-5％，优选的是0.01-2％。

在这些组合物中使用的赋形剂一般选自或许添加渗透促进剂 的这些共聚物，即乙烯共聚物。

这些经皮肤施用的组合物具体地可以采用粘着在皮肤上的自 粘合体系给药，这样保证在血液循环时活性物质在至少24小时都 以可控量连续通过皮肤。

在这些体系中，具体可以列举在FR-88.11685(2635979)专利 申请描述的体系以及由Tilderm公司销售的体系。

2，4-DPO还可以用于制备采用皮内方法给药的治疗组合 物。

2，4-DPO的比例一般是以这种组合物的总重量计为基准计 0.0001-5％(重量)，优选地0.01-1％(重量)。

2，4-DPO在如生理血清之类生理学可接受的赋形剂中呈可 溶形式。

这些皮内给药的组合物还可以含有不同的治疗剂，例如抗菌 剂、抗氧化剂和类固醇的和非类固醇的消炎剂。

2，4-DPO一般按照低于或等于5毫克/公斤/天的剂量，优 选的是0.0001-1毫克/公斤/天的剂量采用皮内的方法给药。一般在 产生胶原积累的整个过程中都可进行这种治疗，或许可以在其后的 30天内进行这种治疗。

尽管可更具体地参考上述那些药用组合物，但是当然可以将这 些组合物配制成兽用的更合适的形式，特别是治疗如马之类马科动 物用的更适合的形式。

本发明组合物，不管其组合物的药用方式或使用的方式如何， 但都可根据已知的方法进行制备。

现在，给出了用以说明的研究结果，证明2，4-DPO的效果 以及各种治疗组合物的实施例。

I-赖氨酰基羟化酶(LH)编码的RNA表达的抑制研究

由来自第5次接种的人发外层结缔层的成纤维细胞培养物，在 含有Dulbecco改进“Eagle”型培养介质，并补充2mM L-谷酰 胺、1mM丙酮酸钠、100单位/毫升青霉素G、100微克/毫升链 霉素S、250毫克/毫升两性霉素(amphoterine)和由Gibco BRL公 司销售的10％牛胎血清的直径为60mm的平皿中接种2.105成纤维 细胞。

在95％空气/5％CO2的烘箱中于37℃培养24小时后，用不 含牛胎血清的类似介质代替上述介质。然后在5mM Minoxidil、 5mM2，4-DPO或5mM Minoxidil硫酸盐存在下，在37℃培育 这些细胞3小时(图1A)或18小时(图1B)。

根据在“Short protocoles in molecular biology，Harvard medical school J.Willey and sons publisher，1992”中描述的方法， 从每一个细胞制剂提取总RNA，然后采用在280nmUV分光光度 法定量测定其RNA。

为了能够分析RNA表达，通过聚合酶链式反应(PCR)进行 其RNA扩增。

由2微克前面制得的每个细胞制剂的总RNA，用Pharmacia LKB Biotechnology AB公司以商品名“First Strand C-DNA Synthsis kit”销售的反转录试剂盒体外合成互补DNA。然后采用 严格意义上的PCR法，在特定的赖氨酰基羟化酶(LH)和下述 脯氨酰基羟化酶(PH)引物存在下，将前面得到的其中一份互补 DNA扩增：

LH有义引物：5’GAAATGGGCCATGTGAGAGCG3’

LH反义引物：5’TGTGGATGACAATAGTCGGCACG3’

PH有义引物：5’GTGGATGGAACAAGCCCTAAGGC3’

PH反义引物：5’CCTCCCCACGGCACAGCATTTCG3’

最后的体积为50微升。

将PCR后得到的20微升混合物放到在0.5微克/毫升溴化乙锭 和Tris乙酸EDTA(TAE)1x电泳缓冲液存在下的2％琼脂糖 电泳凝胶上。

在电场100伏下迁移1小时后，对分别相应于编码赖氨酰基羟 化酶和脯氨酰基羟化酶的RNA的带强度进行了分析，用Vilbert Lourmat公司的以商品名“Bioprofil”销售的软件和图象分析仪 进行了定量分析。

根据前面描述的相同操作方式，还测定了在没有任何处理的情 况下，成纤维细胞培养3小时和18小时后，编码赖氨酰基羟化酶 和脯氨酰基羟化酶的RNA的相对表达率。

这些结果列于图1A和1B。

于是，人们看到在Minoxidil或Minoxidil硫酸盐存在下，在3 小时期间成纤维细胞的培养降低了编码赖氨酰基羟化酶的RNA相 对表达率，其表达率是0.75。

在2，4-DPO存在下培养3小时后，赖氨酰基羟化酶编码的 RNA相对表达率是0.55。

因此，2，4-DPO对编码赖氨酰基羟化酶的RNA表达的抑 制程度高于Minoxidil或其硫酸盐化类似物。

人们观察到在不同的试验抑制剂存在下培养18小时后的类似 结果。

另外，在Minoxidil或Minoxidil硫酸盐存在下培养3小时后， 编码脯氨酰基羟化酶的RNA相对表达率增加，分别达到1.25和 1.85。

在2，4-DPO存在下培养3小时后，编码脯氨酰基羟化酶的 RNA相对表达率也更高，其表达率是约1.3。

在Minoxidil、Minoxidil硫酸盐或2，4-DPO存在下培养 18小时后，编码脯氨酰基羟化酶的RNA相对表达率分别达到1.6、 1.3和1.15。

因此，人们观察到，在这三种化合物作用下来对编码脯氨酰基 羟化酶的RNA的相对表达率产生抑制效果。

这样，这些试验化合物具有赖氨酰基羟化酶的特定抑制活性。

II-2，4-DPO对培养物中成纤维细胞的细胞外基质中胶 原网的影响的研究

在来自乳房质粒体的人的皮肤成纤维细胞的第一次培养物 中，在补充10％牛胎血清的DMEM介质中，添加10μM 2，4 -DPO。

在三天后，用低渗冲击溶解这些细胞，并用5％戊二醛溶液固 定胶原沉淀。

然后借助扫描电子显微镜观察成纤维细胞的细胞外基质。

还借助扫描电子显微镜观察了未处理成纤维细胞第一次培养 物的细胞外基质。

这些照片示于图2和3。

正如根据图2和3照片所观察到那样，未处理成纤维细胞的细 胞外基质具有粗的纤维团块，该纤维团块围绕着没有胶原网的大片 区域，而用2，4-DPO处理的成纤维细胞的细胞外基质的结构 规则得多，其中未观察到粗的纤维团块，没有胶原网的范围也小得 多。

因此，在成纤维细胞培养物中使用2，4-DPO导致胶原纤维 微网空间再构造。

治疗组合物实施例

实施例1皮肤脂

将下述组分混合制备皮肤脂：

-2，4-DPO        0.5克

-Ceteareth30     7克

-硬脂酸甘油酯    2克

-十六烷醇        1.5克

-聚二甲基硅氧烷  1.5克

-石蜡油          15克

-纯的药典甘油    20克

-防腐剂适量

-软化水适量至    100克 实施例2：喷雾皮肤洗液 将下述组合混合制备喷雾皮肤洗液： -2，4-DPO        0.25克 -乙醇            30克 -软化水适量至    100克 实施例3：注射液 将下述组分混合制备皮内给药注射液： -2，4-DPO        0.7毫克 -生理血清(NaCl9克/H2O适量至100毫升)适量1毫克