技术领域
[0001] 本
发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种筛选哺乳动物XY精子差异表达基因的方法。
背景技术
[0002] 差异表达基因分析则是获取基因功能信息的重要方法，分析群体基因差异表达的方法主要有差异显示(DD)、代表性差异分析(RDA)、抑制性消减杂交(SSH)、cDNA微阵列、表达序列标签比较测序分析、基因表达系列分析(SAGE)等。
[0003] 差示筛选(differential screening)是早期建立的差异基因筛选方法，主要原理是通过核酸探针杂交的方法从cDNA文库中筛选目的克隆。灵敏度低，仅对一小部分能在一种细胞中大量表达、而在另一种细胞中不表达或是表达量极低的基因才能奏效，而低丰度的mRNA则难以检测到。
[0004] mRNA差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR)可有效检测真核细胞中特定基因的表达模式，如
假阳性高、可重复性差、扩增
片段短、倾向于分离高拷贝数mRNA对应的cDNA序列、检测到的往往是3’端出现的差异基因，而5’端表现差异的基因不易被检测到等。
[0005] RNA指纹图谱技术(RNA fingerprinting by arbi-RNA)指纹图谱技术在一定的反应条件下，重复性好，条带的
亮度差异在20％以上即可定为是差异表达基因。但是，该方法需要较高的变性
温度和较低的离子浓度，并且随机引物可能是某一基因的保守区或分散的基因重复序列区，这样有可能只扩增这一类基因。
[0006] 代表性差异分析方法(representative differential analysis，RDA)。此技术具有假阳性较低、重复性好的特点，但操作步骤繁琐、实验周期长、
费用昂贵。
[0007] 微阵列技术(microarray)能同时比较不同样本的基因表达
水平的差异，也能够提供某一基因或某一群基因的表达模式的信息。这种方法大规模、高通量、灵敏度高，通过购买商品化的芯片和采用自动化分析技术，使寻找差异基因和功能基因的工作变得简便快速。但因其价格昂贵，且需要完善的基因数据信息限制了它的应用。
[0008] 抑制差减杂交技术(suppression subtractive hy-bridization，SSH)技术要求研究材料的遗传背景接近，差异不能太大；起始材料相对要求较多，需要0.5～2pg的mRNA，否则低丰度的差异表达基因的cDNA很可能会漏检；对照中带不同接头的低丰度单链cDNA与互补链杂交的几率很低，不易被扩增克隆；加接头的过程中会有cDNA的损失等。
[0009] 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有效的方法。但需要大量的poly(A)mRNA和多步耗时费
力的步骤，并且很难获得低丰度的差异表达基因。
发明内容
[0010] 精子RNA量非常低，比一般细胞低2个数量级，要提取足够量的RNA势必增加细胞数，高纯度流式分选XY精子费用较高，这是筛选的主要限制。
[0011] 针对上述
现有技术中存在的问题与不足，本发明的目的在于提供一种基于
磁珠的固相扣除杂交筛选哺乳动物XY精子差异表达基因的方法，采用该方法得到的mRNA纯度高、完整且浓度高体积小，又是层析柱式的逐级淋洗使cDNA与mRNA
吸附得更充分，而且层析柱上的对照cDNA可以反复多次用于扣除杂交反应，同时，操作简单、试验起始材料用量少(仅需1μg RNA)、灵敏、试验时间短(5h内可获得差异表达mRNA)、无污染。
[0012] 实现上述发明目的技术方案是：一种筛选哺乳动物XY精子差异表达基因的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：
[0013] 1)流式细胞仪分选X、Y精子；
[0014] 2)分离纯化X、Y精子mRNA；
[0015] 3)通过Y精子对X精子扣除杂交获得Y精子对X精子差异表达的mRNA；
[0016] 4)通过X精子对Y精子扣除杂交获得X精子对Y精子差异表达的mRNA；
[0017] 5)将得到的差异表达的mRNA采用Super SMART技术扩增，构建Y-X扣除杂交cDNA质粒库，克隆，测序，
生物信息学分析。
[0018] 所述的通过Y精子对X精子扣除杂交获得Y精子对X精子差异表达的mRNA包括下列步骤：
[0019] 1)在X精子mRNA中加入耦联了Oligo dT的磁珠悬液，混匀并立即加入磁式分离柱中，置于
磁场内，磁珠上的Oligo dT有效吸附mRNA并悬浮在磁场中，加入wash buffer反复淋洗挂上mRNA的磁珠，使其它杂质随溶液流出；
[0020] 2)利用磁珠上的Oligo dT作为RT引物直接进行反转录反应，得到耦联在磁珠上的X精子单链cDNA库；
[0021] 3)将Y精子mRNA加入磁式分离柱中，共同表达的基因对应的mRNA被磁珠上的cDNA吸附留在磁场中，而特异表达的mRNA不被吸附随溶液流出柱外，反复过柱后得到的就是Y精子对X精子差异表达的mRNA。
[0022] 所述的通过X精子对Y精子扣除杂交获得X精子对Y精子差异表达的mRNA包括下列步骤：
[0023] 1)在Y精子mRNA中加入耦联了Oligo dT的磁珠悬液，混匀并立即加入磁式分离柱中，置于磁场内，磁珠上的Oligo dT有效吸附mRNA并悬浮在磁场中，加入wash buffer反复淋洗挂上mRNA的磁珠，使其它杂质随溶液流出；
[0024] 2)利用磁珠上的Oligo dT作为RT引物直接进行反转录反应，得到耦联在磁珠上的Y精子单链cDNA库；
[0025] 3)将X精子mRNA加入磁式分离柱中，共同表达的基因对应的mRNA被磁珠上的cDNA吸附留在磁场中，而特异表达的mRNA不被吸附随溶液流出柱外，反复过柱后得到的就是X精子对Y精子差异表达的mRNA。
[0026] 本发明筛选哺乳动物XY精子差异表达基因的方法与现有技术相比，具有以下优点：
[0027] 1)本发明适合精子低RNA量的特点，充分利用磁珠的吸附能力得到的mRNA纯度高、完整且浓度高体积小，又是层析柱式的逐级淋洗使cDNA与mRNA吸附得更充分，而且层析柱上的对照cDNA可以反复多次用于扣除杂交反应。
[0028] 2)本发明采用固相扣除杂交策略即固相支持物磁珠上进行富集差异表达基因的方法，可以确保每一步反应都是在最优的条件下进行，操作简单、灵敏、试验起始材料用量少(仅需1μg RNA)、试验时间短(5h内可获得差异表达mRNA)、无污染。
具体实施方式
[0029] 以下通过
发明人给出的具体实施方式来进一步说明本发明的有益效果
实施例1一种筛选哺乳动物XY精子差异表达基因的方法，具体包括下列步骤：
[0030] 1)流式细胞仪分选X、Y精子；
[0031] 2)分离纯化X、Y精子mRNA；
[0032] 3)通过Y精子对X精子扣除杂交获得Y精子对X精子差异表达的mRNA；
[0033] 4)通过X精子对Y精子扣除杂交获得X精子对Y精子差异表达的mRNA；
[0034] 5)将得到的差异表达的mRNA采用Super SMART技术扩增，构建Y-X扣除杂交cDNA质粒库，克隆，测序，生物信息学分析。
[0035] 所述的通过Y精子对X精子扣除杂交获得Y精子对X精子差异表达的mRNA包括下列步骤：
[0036] 1)在X精子mRNA中加入耦联了Oligo dT的磁珠悬液，混匀并立即加入磁式分离柱中，置于磁场内，磁珠上的Oligo dT有效吸附mRNA并悬浮在磁场中，加入wash buffer反复淋洗挂上mRNA的磁珠，使其它杂质随溶液流出；
[0037] 2)利用磁珠上的Oligo dT作为RT引物直接进行反转录反应，得到耦联在磁珠上的X精子单链cDNA库；
[0038] 3)将Y精子mRNA加入磁式分离柱中，共同表达的基因对应的mRNA被磁珠上的cDNA吸附留在磁场中，而特异表达的mRNA不被吸附随溶液流出柱外，反复过柱后得到的就是Y精子对X精子差异表达的mRNA。
[0039] 所述的通过X精子对Y精子扣除杂交获得X精子对Y精子差异表达的mRNA包括下列步骤：
[0040] 1)在Y精子mRNA中加入耦联了Oligo dT的磁珠悬液，混匀并立即加入磁式分离柱中，置于磁场内，磁珠上的Oligo dT有效吸附mRNA并悬浮在磁场中，加入wash buffer反复淋洗挂上mRNA的磁珠，使其它杂质随溶液流出；
[0041] 2)利用磁珠上的Oligo dT作为RT引物直接进行反转录反应，得到耦联在磁珠上的Y精子单链cDNA库；
[0042] 3)将X精子mRNA加入磁式分离柱中，共同表达的基因对应的mRNA被磁珠上的cDNA吸附留在磁场中，而特异表达的mRNA不被吸附随溶液流出柱外，反复过柱后得到的就是X精子对Y精子差异表达的mRNA。
[0043] 试验例1
[0044] 材料
[0045] 天津XY公司有正常繁殖力的171号、176号、203号种公
牛。X精子和Y精子分选纯度均大于99％。
[0047] 主 要 试 剂：μMACS mRNA Isolation Kit 和 μMACSTM One-step cDNA TMKit(Miltenyi Biote，德国)，Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit和Advantage 2 PCR @
Kit和NucleoSpinExtract II Kit(Clontech laboratories，Inc.ATakara Bio Company，日本)，pMD 19-T Simple Vector和DNAMarker：DL2000(Inc.A Takara Bio Company，日本)，Tris稀释液。
[0048]
酵母提取物购自英国Oxoid公司，焦
碳酸二乙脂(Diethylpyroearbonate，DEPC，Sigma美国)，琼脂糖购自英国Oxoid公司，X-Gal(AMRESCO，美国)，IPTG(AMRESCO，美国)。无水
乙醇，异丙醇，三氯甲烷，
苯酚，异戊醇，Tris
碱，EDTA，
氯化钠，氯化
钾，
碳酸氢钠，
磷酸二氢钠，
磷酸氢二钾等均为国产分析纯产品。大肠杆菌DH5a购自日本Toyob，枪头和试管及用具均采用0.1％DEPC浸泡高压或干热灭菌。
[0049] 主要仪器：流式细胞仪(SX Dako Inc.，Beckman Coulter，Fullerton，TMCA，USA)，程序降温仪(IVM Inc.，法国)，thermoMACS Sparator(Miltenyi Biotec，德国)，高速冷冻离心机(Sigma3K30型，德国STM)，多功能PCR仪(美国Bio-Rad)，生物
显微镜，血球计数板，凝胶成像系统(GELDOC2000型，意大利)，二
氧化碳
培养箱(sony，日本)，超净台购自中国Airteeh公司，空气摇床(ThermoForma，美国)，
电子天平，小型水平
电泳槽和
冰箱(中国)，移液枪(Eppendorf，德国)，纯水系统(Millipore，美国)，液氮罐，涡旋混合器(SeientificIndustries，美国)。
[0050] 方法
[0052] 假
阴道法采集
公牛精液，每个样本在优化的Hoechst33342中
染色，染色样品用8
TALP稀释到2×10/mL。样本通过40μm的尼龙网
过滤器，消除凝集精子或碎片后上流式细胞分选仪(SX Cytomation Inc.，FortCollins，CO，USA)进行分选，分选指标
7
为50psi，150mW，100％纯度。收集X、Y精子，精子数为1×10/管，0.25mL细管分装精液，然后进入程序降温仪(IVM，France)进行精子程序性降温。按Welch等的方法重分析测定X和Y精子的纯度，最后转入液氮罐长期保存待用。
[0053] 奶牛X和Y扣除杂交
[0054] (1)奶牛X(driver)和Y(tester)RNA提取：从液氮灌取X精液、Y精液水浴解冻。X精液、Y精液中分别加入裂解液，涡旋振荡3-5min裂解精子(完全裂解非常重要)，离心去除细胞碎片，将裂解液加入磁式分离柱中，置于磁场内。加入oligo(dT)Micro Beads，
磁性标记的mRNA保留在柱上。加lysis/Binding Buffer除去蛋白和DNA；加Wash Buffer除去rRNA和DNA。X精子保留在柱内；Y精子中加入Elution Buffer，洗脱得到Y精子mRNA。
[0055] (2)奶牛X精子cDNA合成：加Equilibration/Wash Buffer到含X精子mRNA的磁式分离柱的柱基，淋洗挂上mRNA的磁珠，加反转录的酶混合物在柱基上，42℃培养1h，得到X精子cDNA。
[0056] (3)奶牛Y精子mRNA与X精子cDNA扣除杂交：反复将预热的Y精子mRNA加到含X精子cDNA的磁式分离柱的柱基上，收集洗脱液即得到Y-X精子差异表达的mRNA。
[0057] (4)将得到的差异表达的mRNA采用Super SMART技术扩增，构建Y-X扣除杂交cDNA质粒库，克隆，测序，生物信息学分析。
[0058] 奶牛Y-X精子扣除杂交结果
