经改良的模块化抗原转运分子及其在动物中的用途
阅读：1013发布：2020-05-17
专利汇可以提供经改良的模块化抗原转运分子及其在动物中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及(经分离的)重组 蛋白质 ，也称作经改良的MAT(iMAT)分子，其包含至少一个移位模 块 、至少一个靶向模块及至少一个 抗原 模块，其中至少一个半胱胺酸残基经不同的 氨 基酸残基取代。所述iMAT分子特别可用作 疫苗 ，例如用于在动物优选 反刍动物 、猪、人、狗和/或猫，但 马 科动物 除外)中 治疗 和/或 预防 变态反应和/或传染病和/或防止传染病的传播。本发明还涉及编码所述iMAT分子的核酸，相应的载体和原代细胞或细胞系。，下面是经改良的模块化抗原转运分子及其在动物中的用途专利的具体信息内容。
1.一种经改良的MAT(iMAT)分子，其包含：
(i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸
序列；
(ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子物种特异性地在细胞内靶向至细胞器的氨
基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原；和(iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自至少一种抗原、优选至少一种变应
原的至少一个完全或部分表位的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
其特征在于，至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优
选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代，其用于一种预防和/或治疗除马科动物外的动物的一种或多种变态反应的方法和/或用于预防和/或治疗除马科
动物外的动物的一种或多种传染性疾病的方法和/或用于一种防止除马科动物外的动物的一种或多种传染性疾病的传播的方法和/或用于一种防止除马科动物外的动物的一种或多种传染性疾病经载体传播的方法。
2.用于根据权利要求1所述用途的iMAT分子，其中在所述至少一个抗原模块中，所有半
胱氨酸残基均经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代，其中优选在整个iMAT分子中，所有半胱氨酸残基均经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。
3.用于根据权利要求1或2所述用途的iMAT分子，其中所有此类模块彼此共价连接，且
其中在所述第一、第二和/或第三模块中的两个或更多个相邻模块之间根本不存在额外间隔模块。
4.用于根据权利要求1至3中任一项所述用途的iMAT分子，其中所述至少一个第二模块
包含选自犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊科动物、山羊科动物和/或猪科动物的不变链或其部分序列，前提条件为该至少一个第二模块功能是作为使得iMAT分子物种特异性地在细胞内靶向至细胞器的模块，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原。
5.用于根据权利要求1至3中任一项所述用途的iMAT分子，其中所述至少一个第二模块
包含SEQ ID NO：4(犬科动物)或SEQ ID NO：5(猫科动物)的氨基酸序列中之一或多种或其片段，优选由SEQ ID NO：4(犬科动物)或SEQ ID NO：5(猫科动物)的氨基酸序列中之一或多种或其片段组成，前提条件为这些片段保持它们的胞内转运功能。
6.用于根据权利要求1至5中任一项所述用途的iMAT分子，其中所述至少一个抗原模块
包含衍生自至少一种在除马科动物外的动物中引发变态反应的变应原的至少一个完全或
部分表位，优选至少一种优选衍生自如下变态反应的变应原的至少一个完全或部分表位：
对跳蚤叮咬的变态反应，优选在狗和/或猫中；对某些食物成分的变态反应，优选在狗和/或猫中；特应性皮炎，优选在狗和/或猫中；气道变应性炎症和/或阻塞，优选在猫中。
7.用于根据权利要求6所述用途的iMAT分子，其中此类至少一种抗原，优选至少一种变
应原，为Der f 15变应原(SEQ ID NO:11和/或18)。
8.用于根据权利要求1至5中任一项所述用途的iMAT分子，其中所述至少一个抗原模块
包含衍生自至少一种引起除马科动物外的动物的一或多种传染性疾病的病原体的抗原的
至少一个完全或部分表位，优选至少一种选自弯曲杆菌属(Campylobacter)、恶丝虫属
(Dirofilaria)、埃利希氏体属(Ehrlichia)、利什曼原虫属(Leishmania)、锥虫属
(Trypanosoma)、疏螺旋体属(Borrelia)、正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)、环状病毒属(Orbivirus)、黄病毒属(Flavivirus)、轮状病毒属(Rotavirus)、冠状病毒属
(Coronavirus)、毛癣菌属(Trichophyton)、小孢子菌属(Microsporum)、古柏线虫属
(Cooperia)、血矛线虫属(Haemonchus)、胃线虫属(Ostertagia)、毛圆线虫属
(Trichostrongylus)、网尾线虫属(Dictyocaulus)、后圆线虫属(Metastrongylus)、艾美虫属(Eimeria)、等孢子球虫属(Isospora)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、贾第鞭毛虫属(Giardia)的、引起除马科动物外的动物的一或多种传染性疾病的病原体的抗原的至少一个完全或部分表位，其中优选所述至少一个抗原模块也可以是参与除马科动物外的动物的一或多种传染性疾病传播的载体的抗原，优选选自吸血虫、苍蝇、蠓、扁虱和/或蚊子的载体。
9.用于根据权利要求1至8中任一项所述用途的iMAT分子，其进一步包含至少一个标签
模块，优选至少一个His标签，其中该至少一个标签模块优选存在于N端和/或C端，更优选为一个标签模块，优选为在一个甲硫氨酸残基后N端的一个His标签。
10.用于根据权利要求1至9中任一项所述用途的iMAT分子，其中所述至少一个第一模
块包含HIV-tat、VP22和/或触角足蛋白的氨基酸序列或其部分序列，优选由HIV-tat、VP22和/或触角足蛋白的氨基酸序列或其部分序列组成，前提条件为该至少一个第一模块功能是作为使iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部中的模块，最优选该至少一个第一模块包含SEQ ID NO：1，优选由SEQ ID NO：1组成。
11.用于根据权利要求1至10中任一项所述用途的iMAT分子，其中所述第三模块包含
SEQ ID NO：14至23中的任何一个，优选由SEQ ID NO：14至23中的任何一个组成。
12.用于根据权利要求1至11中任一项所述用途的iMAT分子，其包含SEQ ID NO：24至83
中的任何一个，优选由SEQ ID NO：24至83中的任何一个组成。
13.用于根据权利要求1至12中任一项所述用途的iMAT分子，其中所述动物选自反刍动
物，包括牛、山羊、绵羊，如牛属(Bos)、山羊属(Capra)、羊属(Ovis)中的成员，犬属(Canis)中的成员，如狗、狼、狐狸、土狼、豺狼，猫属(Felis)中的成员，如狮子、老虎、家猫、野猫、其他大型猫科动物以及其他包括猎豹和山猫在内的猫科动物，和/或猪属(Sus)中的成员，如猪，其中优选所述动物选自猫和/或狗。
14.一种氨基酸序列/一种经改良的MAT(iMAT)分子，其包含：
(i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸
序列，优选所述第一模块包含SEQ ID NO：1，更优选由SEQ ID NO：1组成；
(ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子物种特异性地在细胞内靶向至细胞器的氨
基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原，优选所述第二模块包含SEQ ID NO：4或5，更优选由SEQ ID NO：4或5组成；及
(iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自至少一种抗原、优选至少一种变应
原的至少一个完全或部分表位的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
其特征在于至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优
选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代，由此所述第三模块优选包含SEQ ID NO：14至23中的任何一个，或由SEQ ID NO：14至23中的任何一个组成。
15.根据权利要求14所述的氨基酸序列/iMAT分子，其中所述第二模块由SEQ ID NO：4
或5所组成。
16.根据权利要求14或15所述的氨基酸序列/iMAT分子，由此所述第三模块由SEQ ID
NO：14至23中的任何一个所组成，优选SEQ ID NO：18。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的氨基酸序列/iMAT分子，其中所有此类模块彼
此共价连接，且其中在所述第一、第二和/或第三模块中的两个或更多个相邻模块之间根本不存在额外间隔模块。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的氨基酸序列/iMAT分子，其进一步包含至少一
个标签模块，优选至少一个His标签，其中该至少一个标签模块优选存在于N端和/或C端，更优选为一个标签模块，优选为在一个甲硫氨酸残基后N端的一个His标签。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的氨基酸序列/iMAT分子，其中所述氨基酸序
列/iMAT分子包含SEQ ID NO：24至83中的任何一个，优选由SEQ ID NO：24至83中的任何一个组成；或其中所述氨基酸序列/iMAT分子包含SEQ ID NO：24、27、30、33、36、39、42、45、48、
51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81中的任何一个，优选由SEQ ID NO：24、27、30、33、36、
39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81中的任何一个组成；或其中所述氨基酸序列/iMAT分子包含SEQ ID NO：25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、
73、76、79、82中的任何一个，优选由SEQ ID NO：25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、
61、64、67、70、73、76、79、82中的任何一个组成；或其中所述氨基酸序列/iMAT分子包含SEQ ID NO：26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83中的任何一个，优选由SEQ ID NO：26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、
83中的任何一个组成；或其中所述氨基酸序列/iMAT分子包含SEQ ID NO：36(猫的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：37(猫的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：38(猫的Der f15 iMAT分子)，或SEQ ID NO：57(狗的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：58(狗的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：59(狗的Der f15 iMAT分子)，优选由SEQ ID NO：36(猫的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：37(猫的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：38(猫的Der f15 iMAT分子)，或SEQ ID NO：57(狗的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：58(狗的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：
59(狗的Der f15 iMAT分子)组成。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的氨基酸序列/iMAT分子，其中所述氨基酸序
列/iMAT分子包含SEQ ID NO：66至83(杂交/嵌合样iMAT)中的任何一个，优选由SEQ ID NO：
66至83(杂交/嵌合样iMAT)中的任何一个组成，优选所述氨基酸序列/iMAT分子包含SEQ ID NO：66、69、72、75、78、81中的任何一个，更优选SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:75，或SEQ ID NO：67、70、73、76、79、82中的任何一个，更优选SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：76，或SEQ ID NO：68、71、74、77、80、83中的任何一个，更优选SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：77；优选由SEQ ID NO：66、69、72、75、78、81中的任何一个，更优选SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:75，或SEQ ID NO：67、70、73、76、79、82中的任何一个，更优选SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：76，或SEQ ID NO：68、71、74、77、80、83中的任何一个，更优选SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：77组成。
21.一种氨基酸序列/经改良的MAT(iMAT)分子，其包含：
(i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸
序列，优选所述第一模块包含SEQ ID NO：1，更优选由SEQ ID NO：1组成；
(ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子物种特异性地在细胞内靶向至细胞器的氨
基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原，优选所述第二模块包含SEQ ID NO：4或5，更优选由SEQ ID NO：4或5组成；及
(iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自两种或更多种选自由SEQ ID NO：
7、8、9、10、11、12、84、85、86、87和88所组成的组的抗原的任意组合的至少一个完全或部分氨基酸序列、优选表位的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
其特征在于至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优
选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。
22.根据权利要求21所述的氨基酸序列/经改良的iMAT分子，其中所述抗原模块是衍生
自两种或更多种选自由SEQ ID NO：10、11、84、85、86、87和88所组成的组的抗原的任意组合(杂交体1)的至少一个完全或部分氨基酸序列、优选表位的氨基酸序列；或其中所述抗原模块是衍生自两种或更多种选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12所组成的组的抗原的任意组合(杂交体2)的至少一个完全或部分氨基酸序列、优选表位序列的氨基酸序列；或其中所述抗原模块是衍生自两种或更多种选自由SEQ ID NO：7、8、10和11所组成的组的抗原的任意组合(杂交体3)的至少一个完全或部分氨基酸序列、优选表位序列的氨基酸序列。
23.根据权利要求21或22所述的氨基酸序列/经改良的iMAT分子，其中所述抗原模块是
基于衍生自SEQ ID NO：84的主链、包含包埋在所述主链序列中的一种或多种根据SEQ ID NO：91至96的肽的任意组合的氨基酸序列；或其中所述抗原模块是衍生自两种或更多种根据SEQ ID NO：97至102的肽的任意组合的氨基酸序列；或其中所述抗原模块是衍生自两种或更多种根据SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：102的肽的任意组合的氨基酸序列。
24.一种氨基酸序列，其包含SEQ ID NO：24至83中的任何一个，优选SEQ ID NO：36(猫
的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：37(猫的Der f15 iMAT分子)、ID NO：38(猫的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：57(狗的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：58(狗的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：59(狗的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：66(猫的杂交体1 iMAT分子)、SEQ ID NO：67(猫的杂交体1 iMAT分子)、SEQ ID NO：68(猫的杂交体1 iMAT分子)、SEQ ID NO：
75(狗的杂交体1 iMAT分子)、SEQ ID NO：76(狗的杂交体1 iMAT分子)和/或SEQ ID NO：77(狗的杂交体1iMAT分子)；优选其由SEQ ID NO：24至83中的任何一个，优选SEQ ID NO：36(猫的Der f15iMAT分子)、SEQ ID NO：37(猫的Der f15 iMAT分子)、ID NO：38(猫的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：57(狗的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：58(狗的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：59(狗的Der f15 iMAT分子)、SEQ ID NO：66(猫的杂交体1 iMAT分子)、SEQ ID NO：67(猫的杂交体1 iMAT分子)、SEQ ID NO：68(猫的杂交体1 iMAT分子)、SEQ ID NO：
75(狗的杂交体1 iMAT分子)、SEQ ID NO：76(狗的杂交体1 iMAT分子)和/或SEQ ID NO：77(狗的杂交体1iMAT分子)组成。
25.一种疫苗或免疫原性组合物或一种药物组合物，其包含根据权利要求14或24中任
一项所述的iMAT分子或氨基酸序列。
26.一种核酸，其编码根据权利要求14至24中任一项所述的iMAT分子或氨基酸序列。
27.一种载体，其包含至少一种根据权利要求26的核酸。
28.一种原代细胞或细胞系，其包含至少一种根据权利要求26的核酸和/或至少一种根
据权利要求27的载体。
经改良的模块化抗原转运分子及其在动物中的用途
发明领域
[0001] 本发明涉及(经分离的)重组蛋白质，也称作经改良的MAT(iMAT)分子，其包含至少一个移位模块、至少一个靶向模块及至少一个抗原模块，其中至少一个半胱胺酸残基经不同的氨基酸残基取代。所述iMAT分子能够通过大幅减少的制造工作来生产，并且具有物种特异性，更高的安全性以及极好的免疫效果。此类(经分离的)重组蛋白质特别可用作疫苗，例如用于在动物(优选反刍动物、猪、人、狗和/或猫，但马科动物除外)中治疗和/或预防变态反应和/或传染病和/或防止传染病的传播。
[0002] 发明背景
[0003] Crameri等人的现有技术出版物对背景技术进行了更详细的描述((Crameri R.et al.,Allergy 2007,62:197–206)。简言之，通过抗原呈递细胞(APC)加工抗原是经由两种不同的途径发生。细胞内所产生的抗原经细胞表面上的MHC I(I类主要组织相容性复合体，I类MHC)分子来呈递，而细胞外抗原是经由细胞表面上的MHC II(II类主要组织相容性复合体，II类MHC)分子来呈递。
[0004] 这两种机制都由宿主引发对抗原的免疫应答。II类主要组织相容性分子是将肽呈递至CD4+T细胞的细胞表面糖蛋白。在内质网中，MHC-II分子与称为不变链(也称为Ii)的II型跨膜蛋白质结合在一起，防止肽结合到内质网中的MHC-II上。Ii的同源三聚体在内质网中与三个II类MHCαβ二聚体结合在一起，这将防止内源性肽与结合到II类分子上。Ii的N端细胞质结构域含有使得其停留在内质网中或使得II类MHCαβ二聚体经由高尔基体靶向至内涵体-溶酶体途径中的靶向基序。后续Ii蛋白质降解会使一小片段的CLIP(II类结合的Ii肽)结合至肽结合沟中的II类MHCαβ二聚体。通过II类αβ/CLIP复合体与II类相关的αβ二聚体HLA-DM在特定的区室中的相互作用，会将CLIP释放并使得II类分子与衍生自外源蛋白的肽结合。已有证据表明，通常排除在MHC-II呈递途径外的内源性合成的蛋白质在被表达为Ii融合蛋白时能够有效地作为肽-MHC-II复合体而呈递。这一特性已被利用于从用Ii-cDNA融合文库转染的细胞系克隆出编码II类MHC限制抗原的基因。通过使用可移位的Ii-变应原融合，获得了针对MHC-II加工和呈递途径的高效的变态反应疫苗。称为模块化抗原移位
(MAT)技术以融合蛋白为基础，该融合蛋白由将细胞外蛋白转化成细胞质蛋白的TAT衍生的移位肽、用于使融合蛋白靶向至内涵体/溶酶体区室的不变链的前110个氨基酸以及用于诱导特异性免疫应答的抗原所组成。
(MAT)技术以融合蛋白为基础，该融合蛋白由将细胞外蛋白转化成细胞质蛋白的TAT衍生的移位肽、用于使融合蛋白靶向至内涵体/溶酶体区室的不变链的前110个氨基酸以及用于诱导特异性免疫应答的抗原所组成。
[0005] 提供用于调节免疫应答的模块化抗原转运(MAT)分子、相关构建物、方法及其用途的概念公开于WO 2004/035793(美国等同申请US 2005/0281816)中。此文献描述了一种三部分分子的有用性，该MAT分子用于引入抗原的表位至细胞中从而确定要经过该MAT分子调节的免疫应答。其中，描述了各种移位模块、靶向模块及抗原模块。该技术及其方法使得以下成为可能：首先，可有效地从细胞外空间将抗原传送进入标靶细胞的细胞内空间中，以及其次使得此类抗原可在到达细胞内部中之后有效地到达细胞器以便随后处理用于抗原呈递。一般而言，两步法可用于靶向地、有效地调节个体的免疫应答。MAT分子的用途公开于例如Martínez-Gómez JM等人[Allergy 2009,64(1):172-178]；Rose H(Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim Langen Hess,2009,96,319-327)及
最近Senti G等人[J Allergy Clin Immunol.,2012,129(5):1290-1296]中。基于MAT技术，主要猫变应原Fel d1被融合至TAT衍生的蛋白质移位结构域以及被融合至人截短的不变链以靶向II类MHC途径。在小鼠中评估了免疫原性，而可能的安全性问题则是通过基于猫毛变态反应患者的嗜硷细胞反应性的适宜测试来进行评估。已证实此模型化合物的可能用途。
其中描述了，预期MAT分子相较于重组变应原或变应原萃取物在常规变应原特异性免疫疗法(SIT)中可更安全且更有效地诱导期望的免疫应答，也即，脱敏作用。在Senti G.等人最新公开的申请中，描述了针对人的猫毛变态反应的淋巴内免疫疗法于三次注射后诱导耐受性。描述了使用MAT-Fel d1的人类首次(first-in-human)临床研究，证实仅在淋巴内注射的三次注射后的安全性及诱导变应原耐受性。
最近Senti G等人[J Allergy Clin Immunol.,2012,129(5):1290-1296]中。基于MAT技术，主要猫变应原Fel d1被融合至TAT衍生的蛋白质移位结构域以及被融合至人截短的不变链以靶向II类MHC途径。在小鼠中评估了免疫原性，而可能的安全性问题则是通过基于猫毛变态反应患者的嗜硷细胞反应性的适宜测试来进行评估。已证实此模型化合物的可能用途。
其中描述了，预期MAT分子相较于重组变应原或变应原萃取物在常规变应原特异性免疫疗法(SIT)中可更安全且更有效地诱导期望的免疫应答，也即，脱敏作用。在Senti G.等人最新公开的申请中，描述了针对人的猫毛变态反应的淋巴内免疫疗法于三次注射后诱导耐受性。描述了使用MAT-Fel d1的人类首次(first-in-human)临床研究，证实仅在淋巴内注射的三次注射后的安全性及诱导变应原耐受性。
[0006] 其他现有技术如下：
[0007] Gadermaier G等人(Molecular Immunology 2010,47:1292-1298)描述了将经半胱氨酸稳定的Art v1折叠靶向用于艾属花粉变态反应的免疫治疗。作者使用靶向Art v1翻译后修饰作用的遗传改造方法，旨在产生出低致敏性分子：(i)通过定点诱变破坏防卫素结构域的二硫键及(ii)在大肠杆菌中表达的突变体构建物以产生出非糖基化蛋白。然而，明显地，该目标仅操纵Art v1防卫素结构域的三维折叠以通过用丝氨酸交换单一半胱氨酸残基，同时保持完整(即，未修饰)所识别的T-细胞表位(即使其包含半胱氨酸残基)，来消除IgE-结合(换言之，产生出低致敏性分子)。
[0008] 第3届Havemeyer马变应原性疾病研讨会报告(Hólar,Iceland,June 2007，Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008,126:351-361)聚焦于昆虫叮咬过敏
(IBH)及复发性气管阻塞(RAO)的免疫学及遗传方面。在此研讨会上，讨论了新颖的对抗IBH的SIT方法，尤其论述具有偶联至模块化抗原移位(MAT)分子的变应原的病毒载体或蛋白质疫苗接种的用途。
(IBH)及复发性气管阻塞(RAO)的免疫学及遗传方面。在此研讨会上，讨论了新颖的对抗IBH的SIT方法，尤其论述具有偶联至模块化抗原移位(MAT)分子的变应原的病毒载体或蛋白质疫苗接种的用途。
[0009] 在2010年及2011年SIAF年度报告中，Crameri R报告了MAT技术在感染IBH的马的疫苗接种中的用途。
[0010] Zhao等人(Int J临床与实验医学2015；8(4)：6436-6443)报告了用嵌合融合蛋白与WO 2004/035793中公开的MAT结构和3段编码Der p1的T细胞表位一起作为抗原模块的实验的结果。他们将这些序列以线性方式重新组装起来，形成用于蛋白质表达的融合基因。他们称其获得的构建物与Der p1蛋白质相比将显示出更强的变应原性(超变应原性)。
[0011] 然而，当生产及制造现有技术中所述的MAT分子时出现了主要问题。具体而言，在开发用于根据优良制造规范(GMP)制造的MAT分子的下游方法(DSP)中所使用的标准方法可能不适用。无法纯化MAT分子的均质分子种类，这明显由于MAT分子的异常物理化学性质。
[0012] 对于现有技术中所述的MAT分子而言，虽然测试了不同分离原理(例如，大小排阻层析、RP-HPLC)，但是若干纯化方法可能不适用(参见本文实施例4)。用于测定重组蛋白质纯度的方法一般包括层析分离(例如，RP-HPLC)及电泳分离(例如，毛细管区带电泳、等电聚焦、还原或非还原条件下的SDS-PAGE)。另外，这些分析方法不能应用于未有分子特异性调适的MAT分子。为了评估纯度，必须开发一种经调适的特异性SDS-PAGE测试程序。此测试程序包括利用还原剂及十二烷基硫酸锂(LDS)并加热至75℃的样品生产，在电泳分离后获得多个可再现明显谱带。以考马斯蓝染料染色导致凝胶的线性定量行为(密度测定法)。使用能够实现检测MAT分子中之变应原模块的单株抗体，展现一条主要谱带及若干次要谱带。所有谱带也在使第二凝胶重新负载第一凝胶的切除谱带后可再现地迁移至原始凝胶的相同位置。出乎意料地，在所有这些具有较低及较高表观分子量的谱带中，通过从凝胶中切除谱带，胰蛋白酶消化并随后通过质谱(nanoLC/ESI-MS-MS)对其进行分析，来识别全长MAT分子。可从此类实验得出在SDS-PAGE中MAT分子的不同折叠变化的异常行为(“凝胶迁移”)的结论。另外，在所有批次的MAT分子中，可检测到蛋白质的多聚体形式，其难以与单体形式分离。
[0013] 就例如经济观点以及就监管要求而言，必需经改良(i)MAT分子的制造方法及(ii)其用于纯度测定的标准分析方法的适合性。另外，就调适MAT分子适于特异性标靶物种(如反刍动物、猪、狗和/或猫)而言，需要调适在MAT技术中的免疫学靶向。由于哺乳动物之间存在同源体不变链氨基酸序列的差异，有必要在所述iMAT分子中表现这一物种特异性(图10)。然而，就所述iMAT分子中的抗原而言，为达到最佳的免疫功能，需要将不变链融合蛋白质(iMAT)与II类MHC的αβ亚单元恰当地结合，特别是在CLIP区域。若iMAT中的不变链序列确实与原始的序列尽可能地相似，则可实现与所述II类MHC分子的恰当结合。
[0014] 另外，MAT分子可轻易地用于由已知主要变应原诱导的变态反应(例如，由Fel d1引发的对猫毛的变态反应)中。然而，现有技术的MAT分子似乎很难用于临床设定如变态反应中，其中，例如，已知涉及各种非交叉反应性变应原，但尚不知晓这些变应原在诱导变态反应时的重要性(换言之，尚不知晓主要变应原)。
[0015] 另外，该现有技术没有描述一个以上(例如，2，3，4或更多个)的变应原如何能够在不超过融合蛋白质的限制蛋白质制造的特定大小的情况下而被包埋入(i)MAT分子中。
[0016] 本发明的基本目标是提供经改良的MAT分子，其可用作药物组合物如疫苗中的活性剂，以及在除马科动物外的动物中的相应的治疗和/或预防用途，可克服现有技术的问题。
[0017] 发明公开
发明内容
[0018] 在一个方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供(经分离的)重组蛋白质、优选经改良的MAT(iMAT)分子而得以解决，所述经分离的重组蛋白质包含：
[0019] (i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸序列；
[0020] (ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子物种特异性地在细胞内靶向至细胞器的氨基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原；及
[0021] (iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自至少一种抗原(优选至少一种变应原)的至少一个完全或部分表位的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
[0022] 其特征在于，至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代，以用于一种预防和/或治疗除马科动物外的动物的一种或多种变态反应的方法和/或用于预防和/或治疗除马科动物外的动物的一种或多种传染性疾病的方法和/或用于一种防止除马科动物外的动物的一种或多种传染性疾病的传播的方法和/或用于一种防止除马科动物外的动物的一种或多种传染性疾病经载体传播的方法。
[0023] 相应的预防和/或治疗除马科动物外的有此需要的动物的方法以及制备用于预防和/或治疗除马科动物外的动物的药物组合物/药物的用途也旨在落入本发明的范围之内。
[0024] 优选地，在所述至少一个抗原模块中，所有半胱氨酸残基均经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。更优选地，在整个iMAT分子中，所有半胱氨酸残基均经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。
[0025] 优选地，如果不是全部半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代，则在整个iMAT分子中留下偶数个半胱氨酸。
[0026] 优选地，所有此类模块彼此共价连接，任选通过所述第一、第二和/或第三模中的两个或更多个(任选所有的)相邻模块之间的额外间隔模块共价连接。
[0027] 更优选地，所有此类模块彼此共价连接，且该第一、第二和/或第三模块中的两个或更多个相邻模块之间根本不存在额外间隔模块。
[0028] 在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供与一个或多个根据SEQ ID NO：2或3的氨基酸序列有关的，优选包含一个或多个根据SEQ ID NO：4或5的氨基酸序列的iMAT分子而得以解决。在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供包含一个或多个根据SEQ ID NO：14至23的氨基酸序列的iMAT分子而得以解决。在一个优选方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供包含一个或多个根据SEQ ID NO：24至83的氨基酸序列，优选由一个或多个根据SEQ ID NO：24至83的氨基酸序列所组成的iMAT分子而得以解决。
[0029] 在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供包含如本文中所公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质的疫苗或免疫原性组合物或药物组合物而得以解决。
[0030] 在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供如本文中所公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质或如本文中所公开并要求保护的疫苗或免疫原性组合物或药物组合物而得以解决，其用于一种预防和/或治疗动物(优选狗和/或猫，但马科动物除外)的一种或多种变态反应的方法，优选狗和/或猫的对跳蚤叮咬的变态反应；优选狗和/或猫的对某些食物成分的变态反应；优选狗和/或猫的特应性皮炎；优选猫的气道变应性炎症和/或阻塞。相应的预防和/或治疗有此需要的动物(优选狗和/或猫，但马科动物除外)的方法以及制备用于预防和/或治疗动物(优选狗和/或猫，但马科动物除外)的药物组合物/药物的用途也旨在落入本发明的范围之内。
[0031] 在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供如本文中所公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质或如本文中所公开并要求保护的疫苗或免疫原性组合物或药物组合物而得以解决，其用于一种预防和/或治疗除(优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的一种或多种传染性疾病，和/或防止动物(优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的一种或多种传染性疾病经载体传播的方法，其中所述经载体传播优选是经食血蝽、苍蝇、蠓、壁虱和/或蚊子传播。所述传染性病原体和/或传染性疾病可以是选自如下一种或多种：弯曲杆菌、犬恶丝虫、埃里希氏体病、利什曼病、锥体虫病、疏螺旋体属、施马伦贝格病毒、蓝舌病毒和/或西尼罗病毒感染、皮真菌病和/或消化道和/或其他器官的通过病毒(如轮状病毒、环状病毒)和/或寄生虫(如蠕虫)和/或原虫(如球虫病、隐孢子虫病)和/或其潜隐期引起的传染病。相应的预防和/或治疗有此需要的动物(优选反刍动物、猪、人、狗和/或猫，但马科动物除外)的方法以及制备用于预防和/或治疗动物(优选反刍动物、猪、人、狗和/或猫，但马科动物除外)的药物组合物/药物的用途也旨在落入本发明的范围之内。
[0032] 在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供编码如本文中所公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质的核酸而得以解决。
[0033] 在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供包含至少一种如本文中所公开并要求保护的核酸的载体而得以解决。
[0034] 在又一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供包含至少一种如本文中所公开并要求保护的核酸和/或至少一种如本文中所公开并要求保护的载体的原代细胞或细胞系而得以解决。
[0035] 出乎意料地，如本文中所公开并要求保护的根据本发明的iMAT分子确实具有使其优于相关现有技术MAT分子的物理化学和/或免疫学特性：
[0036] (i)抗原模块，优选整个iMAT分子中至少一个半胱氨酸残基，优选所有半胱氨酸经不同的氨基酸残基取代，其经计算机模拟方式选择为不损失最终iMAT分子的稳定性，使得根据本发明的iMAT分子出乎意料地适合应用用于生物医药的标准纯化程序及标准分析方法。
[0037] (ii)iMAT分子的模块即第一移位模块、第二靶向模块及第三抗原模块的优选直接共价连接，而无任何额外间隔模块介于此类模块之间，即，根本无其他间隔模块介于该第一、第二和/或第三模块的两个或更多个相邻模块之间，除了上述(i)外还造成根据本发明的iMAT分子的优异特性：这些被认为是三维结构更刚性且因此无法形成构象IgE表位的iMAT分子甚至更具低致敏性，实质上没有变应原性。
[0038] (iii)(准)N端或C端His标签的优选存在导致，根据本发明的iMAT分子可用作用于监测免疫性和/或免疫性持续时间的替代物标记，这是因为该标签模块任选连同一个或多个来自移位模块的相邻氨基酸残基一起可用于诱导目标个体的对iMAT分子的结构具特异性的特异性免疫可检测信号(例如抗体)(参见本文实施例1)。另外，该标签模块的存在可用于分离包含根据本发明的iMAT分子的样品中的蛋白质，例如，使用载锌或载钴的固体支持物，且因此进一步增加制造本发明的iMAT分子而在纯化制程期间无聚积的可能性。优选
(准)N端His标签。
(准)N端His标签。
[0039] (iv)根据本发明的iMAT分子中的至少一个靶向模块优选具物种特异性，即，就此类iMAT分子对犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊、山羊和/或猪的预期应用而言，相应地选择靶向模块，例如，犬科动物不变链。通过该物种特异性靶向，可成功地达成根据本发明的iMAT分子对II类MHC分子的最佳化结合特性。
[0040] (v)根据本发明的iMAT分子中的至少一个抗原模块优选为变应原。其可衍生自食物和/或霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、室内尘埃或饲料螨(和/或其粪便)和/或跳蚤，优选来自树、草、草本、豚草的花粉和/或十字花科花粉和/或曲霉菌属、链格孢菌属、灰霉菌属、尾孢菌属、枝孢菌属、弯孢菌属、内脐蠕孢菌属、散囊菌属、麦类胡麻叶枯病菌属、附球孢菌属、白粉菌属/粉孢菌属、镰孢菌属、横梗霉属、黑孢菌属、青霉菌属、黑团孢菌属、霜霉菌属、浪梗霉菌属、糖多孢菌属(此前也称作干草菌属或小多孢菌属)、高温放线菌属、匍柄霉菌属、圆酵母属的真菌和/或其孢子和/或粉螨属、糖螨属、食酪螨属、尘螨属、嗜霉螨属、嗜鳞螨属、无爪螨属的螨(和/或其粪便)和/或角叶蚤属、栉首蚤属、蚤属、昔蚤属的跳蚤。根据本发明的iMAT分子中的至少一个抗原模块更优选为尘螨属变应原。依照以下标准来选择变应原：在尚不知晓诱导个体变态反应的主要变应原时，可通过本文实施例5及6中示例性地且详细描述的生物信息方法来选择根据本发明的iMAT分子中的至少一个抗原模块。依此方式可获得特别适用作例如用于治疗和/或预防动物(优选狗和/或猫，但马科动物除外)的变态反应的疫苗的经改良的MAT分子。根据本发明的iMAT分子中的至少一个抗原模块也可以是参与一种或多种传染性疾病的病原体的抗原。其可衍生自：弯曲杆菌属(Campylobacter)、恶丝虫属(Dirofilaria)、埃利希氏体属(Ehrlichia)、利什曼原虫属(Leishmania)、锥虫属(Trypanosoma)、疏螺旋体属(Borrelia)、正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)、环状病毒属(Orbivirus)、黄病毒属(Flavivirus)、轮状病毒属(Rotavirus)、冠状病毒属
(Coronavirus)、毛癣菌属(Trichophyton)、小孢子菌属(Microsporum)、古柏线虫属
(Cooperia)、血矛线虫属(Haemonchus)、胃线虫属(Ostertagia)、毛圆线虫属
(Trichostrongylus)、网尾线虫属(Dictyocaulus)、后圆线虫属(Metastrongylus)、艾美虫属(Eimeria)、等孢子球虫属(Isospora)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、贾第鞭毛虫属(Giardia)–假设衍生自潜隐期的寄生虫即抗原也可以被采用。根据本发明的iMAT分子中的至少一个抗原模块也可以是参与一种或多种传染性疾病(例如，属于蚊科、蠓科、白蛉亚科、硬蜱科和/或臭虫科的)的传播的载体的抗原(例如，唾液组分)。依此方式可获得特别适用作例如用于治疗和/或预防动物(优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的传染性疾病和/或防止其传染性疾病传播的疫苗的经改良的MAT分子。
(Coronavirus)、毛癣菌属(Trichophyton)、小孢子菌属(Microsporum)、古柏线虫属
(Cooperia)、血矛线虫属(Haemonchus)、胃线虫属(Ostertagia)、毛圆线虫属
(Trichostrongylus)、网尾线虫属(Dictyocaulus)、后圆线虫属(Metastrongylus)、艾美虫属(Eimeria)、等孢子球虫属(Isospora)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、贾第鞭毛虫属(Giardia)–假设衍生自潜隐期的寄生虫即抗原也可以被采用。根据本发明的iMAT分子中的至少一个抗原模块也可以是参与一种或多种传染性疾病(例如，属于蚊科、蠓科、白蛉亚科、硬蜱科和/或臭虫科的)的传播的载体的抗原(例如，唾液组分)。依此方式可获得特别适用作例如用于治疗和/或预防动物(优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的传染性疾病和/或防止其传染性疾病传播的疫苗的经改良的MAT分子。
[0041] (vi)能够实现在仅仅一个所述iMAT分子即嵌合融合蛋白质中包含一个以上变应原的序列基序的新型iMAT分子的生产。对包埋在变应原模块中的肽序列的选择是基于相关主要变应原中通过生物信息学工具所检测到的泛(pan)变应原性基序。依此方式可保持此类iMAT分子的大小足够低，使得在合适的表达系统中能够进行高效的生产。
[0042] 具体而言，本发明提供展现经改良溶解度的(经分离的)重组蛋白质，其可轻易地应用于层析分离技术且表现出经改良的稳定性。
[0043] 此外，根据本发明的(经分离的)重组蛋白质优选表现出在诱导期望的免疫学效应方面的高活性及效力，也即有利地以物种特异性调节对象(例如动物，更优选狗和/或猫，但马科动物除外)的抗变应原的免疫应答变成可行，可以在不同靶器官(如皮肤、呼吸和/或胃肠道系统)中对变应原特异性IgE介导过敏反应进行调节。和/或治疗和/或预防动物(优选反刍动物、猪、人、狗和/或猫，但马科动物除外)的传染性疾病和/或防止其传染性疾病经载体传播也变成可行。
[0044] 治疗性变应原的变应原性至关重要，它是衡量诱发不良事件，例如激起过敏性反应的可能性的尺度。针对现有技术MAT分子，在现有技术中已报告了关于它们的变应原性与相应的天然变应原相比的矛盾的结果。Senti G.等人(J Allergy Clin Immunol.2012,129(5):1290-1296)在细胞抗原刺激测试(CAST)测定以及在皮内注射和在皮内试验中证明了MAT-Fel d1的低变应原性。变应原和包括Fel d1的MAT分子之间的灵敏度的定量差异分别为100、23和16倍。虽然MAT-Fel d1显然是低变应原性的，但仍保持一些变应原性。相比之下，Zhao等人(Int J临床与实验医学2015；8(4):6436-6443)称其MAT-Der p1G构建物与天然的Der p1蛋白质相比将展现出更强的变应原性(超变应原性)。
[0045] 出乎意料地，正如本文所公开和要求的那样，经改良的MAT分子的安全性在这方面是优越的。与通常引起强烈组胺释放的天然变应原相比，出乎意料地，根据本发明的iMAT分子实际上表现为根本没有组胺释放应答。因此，与现有技术中描述的MAT分子(见上文)相比，iMAT分子表现出有关安全性的优越性。
[0046] 与现有技术MAT分子不同，iMAT分子的这一出乎意料的安全性特性的结果是，用作脱敏蛋白质的iMAT分子能够类似于抗病原体疫苗来使用。由于包含iMAT分子的疫苗并没有表现出在变应性不良事件方面的变应原特性，因此不需要像传统治疗性变应原那样增加剂量。已经仅基于疗效考虑选定了治疗疗程中iMAT分子的首次注射剂量，因此没有必要再考虑可能的变应性不良反应。这不可使用现有技术中所描述的MAT分子来进行，这是因为与天然变应原相比MAT的变应原性仅降低至一定水平。然而，现有技术中描述的MAT分子仍然是变应原，但相比之下，iMAT分子却不是。这一改良的性质的优点是可通过例如以高生物药学含量三次皮下或淋巴管内注射(例如，3次1μg至100μg，优选3次10μg至50μg iMAT蛋白质)实现更有效的治疗方案。
[0047] 所述iMAT分子的变应原性的缺乏可用如下事实来解释：即，与现有技术中描述的MAT分子不同，不使用接头氨基酸残基[即，介于第一、第二和/或第三模块之间的间隔模块]来分隔此类iMAT分子中的不同模块。
[0048] 现有技术中已知包含两种或更多种经肽或蛋白质接头接合的功能性多肽的改造融合蛋白质对于蛋白质的功能(例如，通过免疫系统识别表位)具重要作用[Klein JS et al.,Protein Eng Des Sel.2014,27(10):325-330]。功能性单元之间的分隔距离可影响表位进入及以抗体亲抗原性结合能力。
[0049] 可以假设，在本发明的iMAT分子中，若其缺失模块间，具体为靶向结构域和抗原模块间的氨基酸残基接头，则获得更刚性的结构，可能因不正确折叠而无法形成变应原模块的构象表位。结合于嗜碱细胞表面上的抗体(例如IgE)与其高亲和力受体交联是引发活化及组胺释放必需的。然而，错误折叠的变应原可能无法引发该交联。因此，在第一、第二和第三模块之间不具有额外的间隔模块/接头的iMAT分子可不形成构象IgE表位，这使得iMAT分子不具有变应原性。因此，在具体实施方案中，本发明的iMAT分子在第一、第二和第三模块之间没有任何额外的间隔模块或接头。
[0050] 发明详述
[0052] 除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及科学术语具有如本发明所属技术领域的技术人员所通常了解的含义。除非另有指示或以其他方式为本领域技术人员已知，否则所有的给定范围及数值可改变1％至5％，因此，术语“约”通常从描述及权利要求省去。虽然类似于或等效于那些如本文所述者的任何方法及材料可用于实施或测试本发明，但现将描述优选的方法、装置、及材料。本文中述及的所有公开的申请是出于如可结合本发明使用的公开申请中所报告般描述并揭示物质、赋形剂、载剂、及方法的目的而援引加入本文中。本文任何内容均不应被解释为承认本发明无权先于藉助在先发明的这些揭示内容。
[0053] 术语“经分离的重组蛋白质”、“重组蛋白质”和/或“经改良的MAT(iMAT)分子”可在本发明上下文中互换使用。其均具有相同含义。
[0054] 在本发明上下文中，术语“模块”指具有明确功能的特定氨基酸序列，例如多肽的一部分、单元或部分，通常是短氨基酸/肽序列。
[0055] 本文中术语“第一模块，其为使得(经分离的)重组蛋白质，优选经改良的MAT(iMAT)分子从细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸序列”也可互换地称作“移位模块”或“移位序列”，在本发明上下文中是指促使货物分子，例如氨基酸序列、肽、多肽、蛋白质及其他类别物质如核酸或药物活性成分(API)转运至细胞内部，具体而言真核细胞内部，更具体而言如文献中已知的表面上表达II类MHC分子和/或表面上表达I类MHC分子的细胞内部中
的特定氨基酸序列。
的特定氨基酸序列。
[0056] 移位模块的存在，可促使该货物分子进入至此类细胞中。
[0057] 适用作移位模块的氨基酸序列述于现有技术中。例如，US 7,653,866公开了若干有用的移位序列，其包含衍生自单纯疱疹病毒的HIV-tat分子或蛋白质VP22。促使指定标靶分子进入细胞内部中的该原理多数地述于相关专利申请及非专利申请文献中的不同研究中。此外，适宜的移位序列包括同源异型蛋白质序列、亮氨酸拉链序列、富含精氨酸和/或富含赖氨酸的序列、及(不管缺乏分泌信号序列)分泌的蛋白质或多肽的各种其他序列。特别有用的是病毒肽序列，例如蛋白质HIV转录活化蛋白(HIV tat)。已在现有技术中描述Tat序列或Tat肽(包括各种不同修改)。现有技术中所述的Tat的肽序列的所有变型一般适用作移位模块。其他实例包括VP22肽及衍生自果蝇同源蛋白触角足蛋白的触角足蛋白肽
(antennapedia)。此外，可使用其他同源异型蛋白质。适宜的同源异型蛋白质的各种实例述于现有技术中。此外，可使用亮氨酸拉链蛋白质，例如人cFos-(139-164)、或人cJun-(252-
279)。除此之外，富含精氨酸和/或富含赖氨酸的肽适用作包含例如HIV-1rev(34-50)或衍生自病毒或酵母的其他肽之序列的移位模块。当然，富含聚精氨酸和/或富含聚赖氨酸的肽可以合成方式制得。此类富含聚精氨酸和/或富含聚赖氨酸的肽可包含其他氨基酸。适宜的实例述于相关现有技术中。
(antennapedia)。此外，可使用其他同源异型蛋白质。适宜的同源异型蛋白质的各种实例述于现有技术中。此外，可使用亮氨酸拉链蛋白质，例如人cFos-(139-164)、或人cJun-(252-
279)。除此之外，富含精氨酸和/或富含赖氨酸的肽适用作包含例如HIV-1rev(34-50)或衍生自病毒或酵母的其他肽之序列的移位模块。当然，富含聚精氨酸和/或富含聚赖氨酸的肽可以合成方式制得。此类富含聚精氨酸和/或富含聚赖氨酸的肽可包含其他氨基酸。适宜的实例述于相关现有技术中。
[0058] 在优选实施方案中，该至少一个移位模块包含氨基酸序列，优选由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列不是由如上所说明的完全蛋白质序列组成而是由仍旧具功能性(即，可有效地促进细胞进入)的最小序列组成的氨基酸序列。适宜的最小序列为例如氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)。
[0059] 在另一优选实施方案中，该至少一个移位模块包含HIV-tat、VP22和/或触角足蛋白或其部分序列，优选由此所组成，前提条件是该至少一个移位模块功能是作为用于从细胞外空间移位进入细胞内部中的模块。
[0060] 本文中术语“第二模块，其为使得(经分离的)重组蛋白质，优选经改良的MAT(iMAT)分子物种特异性地在细胞内靶向细胞器的氨基酸序列，所述细胞器参与加工抗原
和/或使MHC分子加载抗原，优选经处理之抗原”也可互换地称作“靶向模块”或“靶向序列”，在本发明上下文中，是指能够实现/促进将本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质细胞内转运至此类参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原的细胞器的特定氨基酸序列。
和/或使MHC分子加载抗原，优选经处理之抗原”也可互换地称作“靶向模块”或“靶向序列”，在本发明上下文中，是指能够实现/促进将本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质细胞内转运至此类参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原的细胞器的特定氨基酸序列。
[0061] 具体而言，此类细胞器包括内质网、高尔基体、反面高尔基体管网状结构、溶酶体、内涵体及MHC II区室。这些细胞内细胞器参与诸如例如转运和/或处理抗原、制造和/或使MHC II分子加载抗原或经加工的抗原、和/或转运加载此类抗原的MHC II分子至细胞表面的过程。
[0062] 相关技术中已知多种序列。有用的靶向序列的突出实例包括II类MHC分子的不变链，也称作Ii不变链或MHC IIγ链。不变链的各种变体述于专利申请及非专利申请文献中。
[0063] 在本发明的优选实施方案中，不变链选自应当调节免疫应答的物种和/或选自iMAT分子应当细胞内靶向的物种。由于哺乳动物之间存在同源体不变链氨基酸序列的差
异，有必要在所述iMAT分子中表现这一物种特异性(图10)。然而，就所述iMAT分子中的抗原而言，为达到最佳的免疫功能，需要将不变链融合蛋白质(iMAT)与II类MHC的αβ亚单元恰当地结合，特别是在CLIP区域。若iMAT中的不变链序列确实与原始的序列尽可能地相似，则可实现与所述II类MHC分子的恰当结合。
异，有必要在所述iMAT分子中表现这一物种特异性(图10)。然而，就所述iMAT分子中的抗原而言，为达到最佳的免疫功能，需要将不变链融合蛋白质(iMAT)与II类MHC的αβ亚单元恰当地结合，特别是在CLIP区域。若iMAT中的不变链序列确实与原始的序列尽可能地相似，则可实现与所述II类MHC分子的恰当结合。
[0064] 例如，就狗、猫、牛、绵羊、山羊或猪而言，所选的优选不变链为犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊科动物、山羊科动物或猪科动物不变链。就狗和猫而言，优选不变链为根据SEQ ID NO:2(犬科动物的)和SEQ ID NO:3(猫科动物的)的氨基酸序列或其片段，前提条件为此类片段维持其细胞内转运功能(如如图10所示的前110个氨基酸)。
[0065] 靶向序列的其他适宜实例包括溶酶体膜蛋白，其包含适用作靶向模块的序列。即，许多膜蛋白产生于溶酶体中，其具有能够实现靶向溶酶体的序列基序。蛋白质的此类组别尤其包括lamp 1、lamp 2、lamp 3、limp II及lap。此外，四跨膜蛋白在现有技术中已知为靶向模块。其他蛋白质可在显示靶向性质的内涵体/溶酶体区室中发现。本领域技术人员明了如何据此确定适宜的靶向序列。
[0066] 在另一实施方案中，所述至少一个靶向模块包含犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊科动物、山羊科动物或猪科动物不变链或其片段，优选由其所组成，前提条件为此类片段维持其细胞内转运功能。
[0067] 在优选实施方案中，所述至少一个靶向模块为犬科动物不变链，其包含SEQ ID NO:4(犬科动物)，优选由其所组成。
[0068] 在又一优选实施方案中，所述至少一个靶向模块为猫科动物不变链，其包含SEQ ID NO:5(猫科动物)，优选由其所组成。
[0069] 本文中术语“第三模块作为抗原模块，其为衍生自至少一种抗原(优选至少一种变应原)的至少一个完全或部分表位的氨基酸序列，其确定(对象的，优选动物的，更优选反刍动物、猪、狗和/或猫的，但马科动物除外)由该(经分离的)重组蛋白质(优选经改良的MAT(iMAT)分子)调节的免疫应答的特异性”也可互换地称作“抗原模块”或“抗原序列”，在本发明的上下文中是指能够实现调节对象(优选动物，更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的针对表位/抗原的免疫应答及确定其免疫应答的特异性的具体氨基酸序列。
[0070] 在此背景下，此(类)抗原模块包含至少一个经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代的半胱氨酸残基。因此，所述免疫应答相较于对象(优选动物，更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的暴露于抗原的未经改变的氨基酸序列的免疫应答有所不同。
[0071] 在该方法基础上，不存在与抗原相关的限制。该方法可例如用于活化对象的针对病原体的免疫系统，如例如针对病毒、细菌、真菌、寄生虫、原生动物等，即，最常见是用作疫苗。另外，该方法不仅可用于直接针对此类病原体，而且可用于活化宿主免疫系统以防止涉及病毒、细菌、真菌、寄生虫、原生动物等的载体传播疾病的传播。此外，该方法可用于活化抗退化细胞如例如肿瘤细胞等的免疫系统。然而，该方法另一方面也可用于对象抗如例如衍生自食物和/或气源性变应原，如霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、动物毛发、室内尘埃或饲料螨(和/或其粪便)、昆虫毒素等的变应原的免疫系统的脱敏或用于免疫系统的靶向抑制，例如，假若存在自体免疫应答，如例如关节炎、风湿病、糖尿病、SLE(全身性红斑狼疮)等，及用于抑制移植排斥反应。未具体提及但与过强或过弱的免疫应答相关联的其他疾病可同样地经本文公开并要求保护的iMAT分子治疗。
[0072] 原则上，可调节免疫应答的所有类型的抗原都可以作为抗原模块用于本发明的目的。目前已经知晓的抗原及会在将来发现的抗原均适宜。在一些情况中，抗原也可是利用目前相关技术中已知的常规免疫接种方法不会导致免疫应答但在对象应用本发明所述的新颖方法时导致免疫应答的那些抗原。进一步地，术语抗原涵盖包含抗原决定簇(也称作表位)的抗原片段。因此，抗原模块可为整体分子，例如蛋白质，或为分子包含至少一个抗原决定簇或表位的部分，也即其片段，例如肽。所述至少一个抗原决定簇或表位可引起针对抗原的免疫应答。表位可包含一个或多个氨基酸或肽或可引起免疫应答的其他结构(如糖结构、磷酸化氨基酸等)或其组合。抗原可为连续表位(即，不依赖于构象，例如存在于例如天然及变性蛋白质)或不连续表位(即，依赖于构象，例如仅以天然、折叠形式存在，但不存在于变性蛋白质)。不仅可使用蛋白质及肽，而且可使用糖结构、脂质(例如脂多糖)、脂磷壁酸及细菌膜的其他组分(CD1b与例如糖结构及脂质结合)、核酸(如例如包含CpG基序之DNA)、有机物质(如例如乳胶或用作用于本发明目的的抗原的药物活性物质)。抗原可衍生自所有可能的生命形式，如例如动物、植物、真菌、寄生虫、单细胞或多细胞微生物、病毒及其他生命形式。抗原可从生物材料分离，已制成重组抗原或已通过合成，例如通过肽合成制得。以合成方式制得的抗原可为自然生成或非自然生成而是通过化学合成获得的物质。非自然生成物质(但在一些情况中适用作抗原)的实例有：例如存在于药物中的以合成方式制得的物质、或具有非自然生成的氨基酸序列的合成肽、或模拟肽等。自然生成或合成或重组抗原可通过分子生物学方法、酶方法、化学方法和/或其他方法修饰以赋予其更有利地用于特定应用的性质。此类有利的性质可以具体是：作为抗原的更高或更低活性、作为抗原的更宽广或更特异性的作用、在亲水性或疏水性溶剂中更好的溶解度、抗原模块对细胞膜、对细胞器膜、对血脑障壁、对血液-CSF障壁等的更大渗透性、更长或更短体内或体外半衰期、更低或更高毒性、施用呈iMAT分子形式的抗原后体内或体外抗原更好的可检测性等。另外，可出于本发明的目的而将多种抗原组合在一个抗原模块中。为此，相同抗原可呈多于一个拷贝存在于抗原模块中，或例如相同抗原的不同变体可在抗原模块中组合。抗原模块中抗原(例如抗原
1)及其他抗原(例如抗原2)的组合也是可以的。如例如呈多于一个拷贝的抗原1及呈单一拷贝的抗原2的其他组合也可在抗原模块中组合等。另外，一个或多个不同和/或一个或多个相同抗原模块也可存在于一个iMAT分子中。原则上，衍生自一种或多种不同抗原的抗原单一及多重存在的相同的或改变的拷贝所有可能的组合可出于本发明目的而进行组合。
1)及其他抗原(例如抗原2)的组合也是可以的。如例如呈多于一个拷贝的抗原1及呈单一拷贝的抗原2的其他组合也可在抗原模块中组合等。另外，一个或多个不同和/或一个或多个相同抗原模块也可存在于一个iMAT分子中。原则上，衍生自一种或多种不同抗原的抗原单一及多重存在的相同的或改变的拷贝所有可能的组合可出于本发明目的而进行组合。
[0073] 在一优选实施方案中，抗原模块包含衍生自至少一种抗原的至少一个完全或部分表位，其中该抗原为变应原。至少一个表位可引起针对变应原的免疫应答，由此该表位可包含一种或多于一种可引起免疫应答的结构，例如肽。表位可以是变应原的连续表位或不连续表位。表位优选为至少八个氨基酸长度，优选为至少十个氨基酸长度，更优选为至少13个氨基酸长度。抗原模块包含至少一个完全或部分表位，但也可包含两个或更多个可彼此相同或相异的完全或部分表位。另外，抗原模块可包含邻接该至少一个完全或部分表位的额外氨基酸序列。表位可以是自然生成的表位或可以是经修饰的表位，在其氨基酸序列中修饰和/或通过一次或多次翻译后修饰来修饰。
[0074] 在一个实施方案中，所述至少一个(第三)抗原模块包含衍生自至少一种参与动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的一种或多种传染性疾病的病原体的抗原的至少一个完全或部分表位。其可衍生自：弯曲杆菌属、恶丝虫属、埃利希氏体属、利什曼原虫属、锥虫属、疏螺旋体属、布尼亚病毒属、环状病毒属、黄病毒属、轮状病毒属、冠状病毒属、毛癣菌属、小孢子菌属；其它蠕虫，像古柏线虫属、血矛线虫属、胃线虫属、毛圆线虫属、网尾线虫属、后圆线虫属；和/或带胃肠道侵染的原虫，像艾美虫属、等孢子球虫属、隐孢子虫属、贾第鞭毛虫属–假设衍生自潜隐期的寄生虫即抗原也可以被采用。根据本发明的iMAT分子中的至少一个抗原模块也可以是参与一种或多种传染性疾病(例如，属于蚊科、蠓科、白蛉亚科、硬蜱科和/或臭虫科的)的传播的载体的抗原(例如，唾液组分)。
[0075] 在又一优选实施方案中，所述至少一个(第三)抗原模块包含衍生自至少一种在动物(更优选狗和/或猫，但马科动物除外)中引发一种或多种变态反应的变应原的至少一个完全或部分表位。其可以是至少一种衍生自如下的变应原的至少一个完全或部分表位：食物和/或霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、室内尘埃或饲料螨(和/或其粪便)和/或跳蚤，优选来自树、草、草本、豚草的花粉和/或十字花科花粉和/或曲霉菌属(aspergillus)、链格孢菌属(alternaria)、灰霉菌属(botrytis)、尾孢菌属(cercospora)、枝孢菌属(cladosporium)、弯孢菌属(curvularia)、内脐蠕孢菌属(drechslera)、散囊菌属
(eurotium)、麦类胡麻叶枯病菌属(helminthosporium)、附球孢菌属(epicoccum)、白粉菌属/粉孢菌属(erysiphe/oidium)、镰孢菌属(fusarium)、横梗霉属(lichtheimia)、黑孢菌属(nigrospora)、青霉菌属(penicillium)、黑团孢菌属(periconia)、霜霉菌属
(peronospora)、浪梗霉菌属(polythrincium)、糖多孢菌属(saccharopolyspora)(此前也称作干草菌属(faenia)或小多孢菌属(micropolyspora))、高温放线菌属
(thermoactinomyces)、匍柄霉菌属(stemphylium)、圆酵母属(torula)的真菌和/或其孢子和/或粉螨属(acarus)、糖螨属(glycophagus)、食酪螨属(tyrophagus)、尘螨属
(dermatophagoides)、嗜霉螨属(euroglyphus)、嗜鳞螨属(lepidoglyphus)、无爪螨属
(blomia)的螨(和/或其粪便)和/或角叶蚤属(Ceratophyllus)、栉首蚤属
(Ctenocephalides)、蚤属(Pulex)、昔蚤属(Archaeopsylla)的跳蚤。
(eurotium)、麦类胡麻叶枯病菌属(helminthosporium)、附球孢菌属(epicoccum)、白粉菌属/粉孢菌属(erysiphe/oidium)、镰孢菌属(fusarium)、横梗霉属(lichtheimia)、黑孢菌属(nigrospora)、青霉菌属(penicillium)、黑团孢菌属(periconia)、霜霉菌属
(peronospora)、浪梗霉菌属(polythrincium)、糖多孢菌属(saccharopolyspora)(此前也称作干草菌属(faenia)或小多孢菌属(micropolyspora))、高温放线菌属
(thermoactinomyces)、匍柄霉菌属(stemphylium)、圆酵母属(torula)的真菌和/或其孢子和/或粉螨属(acarus)、糖螨属(glycophagus)、食酪螨属(tyrophagus)、尘螨属
(dermatophagoides)、嗜霉螨属(euroglyphus)、嗜鳞螨属(lepidoglyphus)、无爪螨属
(blomia)的螨(和/或其粪便)和/或角叶蚤属(Ceratophyllus)、栉首蚤属
(Ctenocephalides)、蚤属(Pulex)、昔蚤属(Archaeopsylla)的跳蚤。
[0076] 在一优选实施方案中，即优选至少一种衍生自螨，更优选衍生自尘螨属的变应原的至少一个完全或部分表位。
[0077] 图9(9A和9B)示出了尘螨属变应原的实例，标识了物种、变应原及UNIPROT收录号。
[0078] 在又一优选实施方案中，该至少一种抗原为根据SEQ ID NO:11(完全)和SEQ ID NO:18(iMAT形式)的Der f 15。抗原模块的优选具体序列为根据SEQ ID NO：7至23，优选据SEQ ID NO：14至23(iMAT形式)的氨基酸序列。
[0079] 在本发明上下文中的术语“通过……调节的免疫应答”或可互换的“免疫调节免疫应答”与“(经分离的)重组蛋白质”和/或“iMAT分子”结合时是指免疫原性和/或致耐受性免疫应答。
[0080] 术语“杂交iMAT”或“iMAT杂交体”或“嵌合样iMAT”可互换使用。这些术语是指其第三模块中包含来自两种或更多种抗原的一个以上完全或部分表位序列的iMAT分子。优选地，所述抗原为两种或更多种变应原，更优选两种或更多种来自不同变应原的短肽序列，其决定由(在对象中，优选动物)该iMAT分子调节的免疫应答的特异性。
[0081] 在本发明之过程中，术语“变应原”是指一类呈天然形式产生异常显著免疫应答的抗原，在所述免疫应答中，免疫系统消除所有感知到的可能原本对对象无害的威胁。典型地，这些类型的反应导致称作变态反应的表型。现有技术中描述了各种类型的变应原，包括食物、药物、动物产品或天然或合成物质。优选地，当蛋白质呈天然形式引起至少五个对象(优选动物，更优选狗和/或猫，但马科动物除外)的特异性IgE反应时，蛋白质被认为是变应原。为避免疑义，“变应原”与“至少一个包含衍生自至少一种变应原的至少一个完全或部分表位的(第三)抗原模块”结合时不再必需呈天然形式，此点亦优选，换言之，在本发明上下文中术语“变应原”也具体是指作为如本文所描述并要求保护的iMAT分子之部分的非天然氨基酸序列，其不再引起至少五个对象(优选动物，更优选狗和/或猫，但马科动物除外)的特异性IgE应答。
[0082] 术语治疗性变应原的“变应原性”是衡量诱发不良事件，例如激起过敏性反应的可能性的尺度。作为示例，就哺乳动物中的变应原而言，在Griffin等人的文章[Griffin CE.Diagnosis of canine atopic dermatitis DOI:10.1002/9781118738818.ch10]中描
述了一种测定狗的变应原性的方法。这篇文章描述了在作为反应原激发试验，特别是针对皮肤的那些试验的过程中，对变应原特异性IgE介导过敏反应进行测量。皮内试验用于重组变应原的生物学评估及用于基因改造的低变应原性衍生物的验证。通过对狗的真皮层直接实施多次小剂量的变应原溶液注射，从而进行狗的皮内试验。这是通过使用小号(27号)注射针及在各部位进行0.05-0.1mL注射而完成的。阳性反应任意地通过红斑的出现、小疙瘩的膨胀度、高度和大小来体现。皮内试验的优点是灵敏性较高。若测试是为变应原性提供一个定量测度，则这是尤为重要的。Griffin等人用根据本发明的iMAT分子进行了所述试验，与相应的用于同一试验中的自然的、天然的变应原相比，那些iMAT分子表现出变应原性组分具有10倍、100至1000倍甚至更高的摩尔浓度，从而达到在致敏个体，例如猫和狗中的阳性反应。
述了一种测定狗的变应原性的方法。这篇文章描述了在作为反应原激发试验，特别是针对皮肤的那些试验的过程中，对变应原特异性IgE介导过敏反应进行测量。皮内试验用于重组变应原的生物学评估及用于基因改造的低变应原性衍生物的验证。通过对狗的真皮层直接实施多次小剂量的变应原溶液注射，从而进行狗的皮内试验。这是通过使用小号(27号)注射针及在各部位进行0.05-0.1mL注射而完成的。阳性反应任意地通过红斑的出现、小疙瘩的膨胀度、高度和大小来体现。皮内试验的优点是灵敏性较高。若测试是为变应原性提供一个定量测度，则这是尤为重要的。Griffin等人用根据本发明的iMAT分子进行了所述试验，与相应的用于同一试验中的自然的、天然的变应原相比，那些iMAT分子表现出变应原性组分具有10倍、100至1000倍甚至更高的摩尔浓度，从而达到在致敏个体，例如猫和狗中的阳性反应。
[0083] 本文中术语“表位”也可以互换地称作“抗原决定簇”，在本发明上下文中是指抗原可通过免疫系统(无论通过B-细胞或T-细胞)所识别的部分。表位借助其所结合的MHC分子呈递于抗原呈递细胞的表面上。
[0084] 本文中术语“对象”也可以互换地称作“个体”和/或“生物体”，在本发明上下文中，优选是指动物和/或人，例如反刍动物、猪，更优选狗和/或猫，但马科动物除外。术语“反刍动物”，在本发明上下文中，包含反刍动物，包括牛、山羊和绵羊。因此，牛属、山羊属和/或羊属中的成员可以互换地称作“牛科动物”、“山羊科动物”和/或“绵羊科动物”物种。本文中所使用的术语“动物”包括哺乳动物。所述动物可以选自由反刍动物，或犬属(其可互换地称作“犬科动物”物种(如狗、狼、狐狸、土狼、豺狼)中的成员，或猫属(其可互换地称作“猫科动物”物种(如狮子、老虎、家猫、野猫、其他大型猫科动物以及其他包括猎豹和山猫在内的猫科动物)中的成员，或猪(即猪属或可互换地称作“猪科动物”物种中的成员)所组成的组。
[0085] 术语“肽”及“蛋白质”在本发明上下文中并列用作等效物。肽或蛋白质出于本发明目的意指至少两个氨基酸经肽键的共价连接。术语“氨基酸”及术语“氨基酸残基”在本申请中用作等效物，即，此两术语的含义相同。术语氨基酸/氨基酸残基及肽/蛋白质在本申请中呈最宽广可能定义形式进行使用。
[0086] 就此而言，术语“重组蛋白质”是指可通过遗传改造及在真核或原核系统中表达获得的多肽。此外，所述术语包含通过人工(例如，固相)合成获得的多肽。
[0087] 除非另有说明，本文中所使用的术语“不同氨基酸残基”是指除了半胱氨酸之外的已知氨基酸残基。例如，所述氨基酸残基可以是自然生成的氨基酸残基，如丝氨酸或异亮氨酸。
[0088] 本文中所使用的术语“线性形式”是指根据本发明的缺乏二级结构的蛋白质。此类蛋白质通常假设为展现随机卷曲构象，其中唯一的固定关系是由肽键将相邻氨基酸残基接合。
[0089] 在优选的实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质系以单体形式和/或线性形式存在。
[0090] 本文中所使用的术语“治疗”是指施用本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质、和/或相应的疫苗和/或免疫原性组合物和/或药物组合物以获得所需的临床结果，包括预防和/或治疗性治疗。
[0091] 本文中所使用的术语“免疫治疗”是指例如通过预防性和/或治疗性疫苗接种来治疗性和/或预防性治疗对象。
[0092] 本文中所使用的术语“载体”与“一种或多种传染性疾病的传播”结合时是指活生物体，及在本文中可与术语“生物学载体”、“生物学携带者”和/或“疾病携带者”如食血虫、蠓、壁虱和/或蚊互换使用。
[0093] 另外，可能且优选地，本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质另外包含至少一个标签模块。即，可能且优选地，一个或多个不同和/或相同标签模块是本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质的部分。标签模块通常是由至多20个氨基酸或由非氨基酸组成的官能团所组成的短肽，如例如生物素或毛地黄毒苷。适宜的标签模块包括熟知且优选的包含4至12个或更多个组氨酸序列，优选直接连续组氨酸残基，优选5、6或7个连续组氨酸残基的His标签。其他适宜的标签模块包括HA-标签、FLAG-标签、GST-标签或Strep-标签。虽然标签可存在于本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质的任何位置，但是在优选的实施方案中，标签模块存在于(经分离的)重组蛋白质的(准)N端和/或C端。
[0094] 标签模块适用于分离出本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质，及此外可检测体外或体内此类(经分离的)重组蛋白质的存在。另外，可使用任选连同来自相邻模块的一个或多个相邻氨基酸残基或间隔开不同模块的接头一起的标签模块以引起目标对象中可用作免疫性和/或免疫性持续时间的替代标记的特异性免疫上可检测信号(例如抗
体)。利用本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质进行免疫治疗，引发目标对象的抗原特异性，优选变应特异性免疫应答，其在暴露于自然存在的抗原(优选变应原)后可与自然免疫应答定性区别。因此，结合至抗原模块的抗体不适用于作为iMAT诱导的免疫调节效应的效之替代标记。该障碍可通过确定通过C端和/或N端标签模块(任选连同相邻氨基酸残基一起)获得的独特抗原特异性免疫学信号来消除。因此，可相应地提供适宜的替代标记。
体)。利用本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质进行免疫治疗，引发目标对象的抗原特异性，优选变应特异性免疫应答，其在暴露于自然存在的抗原(优选变应原)后可与自然免疫应答定性区别。因此，结合至抗原模块的抗体不适用于作为iMAT诱导的免疫调节效应的效之替代标记。该障碍可通过确定通过C端和/或N端标签模块(任选连同相邻氨基酸残基一起)获得的独特抗原特异性免疫学信号来消除。因此，可相应地提供适宜的替代标记。
[0095] 在一个优选实施方案中，本文所公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质进一步包含至少一个标签模块，优选至少一个His标签，其中该至少一个标签模块优选存在于(经分离的)重组蛋白质的N端和/或C端，更优选是紧随一个甲硫氨酸残基后面的N端。
[0096] 而且，本文所公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质的模块，即，至少一个移位模块、至少一个靶向模块及至少一个抗原模块，可任选由一个或多个位于至少两个这些模块之间的间隔模块所间隔开。
[0097] 具体而言，该间隔模块可以是肽序列或有机分子。现有技术中已知许多可用于本发明目的的间隔分子。此外，也可以使用未来将会出于本发明目的而开发或发现的间隔分子。适宜的间隔模块尤其可以是肽间隔子、交联剂、天然或合成聚合物(如例如核酸)、经取代或未经取代的烃等。
[0098] 偶联不但可通过共价连接(优选)而且可通过非共价连接来进行。间隔模块尤其具有这样的作用：其使本文所公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质的各个不同模块空间上彼此分离，使得其对彼此在其功能性方面无不良影响。用于本发明目的的(经分离的)重组蛋白质的模块可通过一个或多个可经化学和/或酶促反应例如通过蛋白酶裂解的间隔模块来偶联。因此可视需要使本文所公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质的经间隔模块连接的模块彼此分离。
[0099] 然而，在一个优选实施方案中，具体而言，若抗原模块衍生自至少一种抗原(至少一种变应原)的至少一个完全或部分表位的氨基酸序列，则在所述第一、第二和/或第三模块的两个或更多个相邻模块之间根本不存在任何此类额外间隔模块，即，不存在额外间隔模块。
[0100] 本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质的个别模块的任何期望配置一般是可行的。各模块可一次或多次地存在于(经分离的)重组蛋白质中。最低要求存在至少一个移位模块、至少一个靶向模块及至少一个抗原模块。额外模块如标签模块、间隔模块等可任选存在但并非必需存在。所有模块可一次或多次地存在于本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质中。假若模块多于一次地存在，则其可呈相同拷贝形式存在，或模块的不同变型可在各情况中呈单一拷贝或呈多于一个拷贝形式存在。相同类别模块的完全不同的模块例如His标签模块及生物素标签模块也可以存在于本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质中。这两个模块在(经分离的)重组蛋白质中功能上发挥相同的作用(标签模
块)，但并非必需在分子结构方面有任何共同之处。
块)，但并非必需在分子结构方面有任何共同之处。
[0101] 在优选的实施方案中，此类模块中之一的两个或更多个拷贝可存在于本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质中。即，可存在相同或不同抗原模块的两个或更多个拷贝。或者，(经分离的)重组蛋白质可包含两个不同抗原模块以调节对象的免疫应答。
[0102] 重组蛋白质中的抗原模块的两个或更多个相同拷贝可例如对所述相关抗原引起增强的免疫应答。两个或更多个不同抗原模块可例如经组合在一个(经分离的)重组蛋白质中以同时地对两个或更多个不同抗原调节免疫应答。两个或更多个不同移位模块可用于本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质中。例如，Tat序列及VP22序列可用来使得移位更有效，这是因为(经分离的)重组蛋白质的移位接着可有效地在更广范围的不同细胞类型或组织类型中发生。也可以例如使用两个或更多个标签模块于(经分离的)重组蛋白质中，例如，His标签及FLAG标签，在该情况中，例如His标签可用于分离重组蛋白质及例如FLAG标签用于检测(经分离的)重组蛋白质。可使用两个或更多个不同靶向模块于(经分离的)重组蛋白质中，例如，衍生自MHC II分子的不变链的序列，及使用甘露糖6磷酸基团作为另一靶向模块。例如，不变链作为进入MIIC中的靶向模块，及甘露糖6磷酸基团介导靶向进入溶酶体中，因此，可增加抗原呈递的效率或总体上通过抗原呈递细胞呈递的抗原不同表位的数量。此外，本发明iMAT分子可包含两条或更多条不同的源于相同或不同物种的不变链，因此，使得根据本发明的蛋白质能够用于不同物种中。
[0103] 本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质中个别模块的位置也可以视需要改变，只要存在至少一个移位模块、至少一个靶向模块及至少一个抗原模块即可。(经分离的)重组蛋白质的所有或某些模块也可以例如不是以模块的线性连续配置形式存在，而是呈圆形或呈分支化模块结构象式或呈树枝状聚合物形式、或呈线性和/或分支化和/或圆形和/或树枝状聚合物分子部分的组合形式存在。有表达载体的商业供应商可供应特定载体，这些特定载体使得可通过这些机制制备圆形融合蛋白质，如例如美国马萨诸塞州比佛利
New England Biolabs的IMPACTTM-TWIN系统。分支化模块可例如通过从聚L-赖氨酸开始，将新赖氨酸残基附着至随后赖氨酸残基各者之两个游离胺基合成肽来制得。依此方式可建立具有实质上任何分支化程度之肽结构。然后，后续可以将例如移位模块和/或靶向模块合成至该分支化肽基本结构上。其他模块也可以通过蛋白质接合偶联至线性、圆形或分支化肽基本结构上。也可以在肽合成期间将例如生物素基团引入至肽基本结构中，然后可以经由例如链霉亲和素Strep标签系统或经由PinPointTM系统(分别来自德国哥廷根IBA GmbH及美国加州圣路易斯奥比斯波Promega Biosciences Inc.)将模块附着于此类生物素基团上。
依此方式附着的模块接着经由非共价连接偶联至肽的基本结构。
New England Biolabs的IMPACTTM-TWIN系统。分支化模块可例如通过从聚L-赖氨酸开始，将新赖氨酸残基附着至随后赖氨酸残基各者之两个游离胺基合成肽来制得。依此方式可建立具有实质上任何分支化程度之肽结构。然后，后续可以将例如移位模块和/或靶向模块合成至该分支化肽基本结构上。其他模块也可以通过蛋白质接合偶联至线性、圆形或分支化肽基本结构上。也可以在肽合成期间将例如生物素基团引入至肽基本结构中，然后可以经由例如链霉亲和素Strep标签系统或经由PinPointTM系统(分别来自德国哥廷根IBA GmbH及美国加州圣路易斯奥比斯波Promega Biosciences Inc.)将模块附着于此类生物素基团上。
依此方式附着的模块接着经由非共价连接偶联至肽的基本结构。
[0104] 根据本发明的IMAT分子的抗原模块可以通过本文实施例5及6中示例性地且详细描述的生物信息方法来选择。依此方式，可以使得iMAT分子成为特别适用作例如用于治疗和/或预防基于不同靶器官(如皮肤、呼吸以及胃肠道系统)中发生的变应原特异性IgE介导过敏反应的变应性疾病的对象(优选动物，更优选狗和/或猫，但马科动物除外)的特应性皮炎、食物变态反应和/或变应性哮喘)的疫苗。
[0105] 在一个优选实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质包含根据SEQ ID NO：24至83的氨基酸序列中的一个或多个，优选由根据SEQ ID NO：24至83的氨基酸序列中的一个或多个组成。
[0106] 本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质特别可用于具体解决治疗和/或预防患有基于不同靶器官(例如皮肤、呼吸以及胃肠道系统)中发生的变应原特异性IgE介导过敏反应的变应性疾病的对象(如动物，更优选狗和/或猫，但马科动物除外)的方法中。
[0107] 在兽医学中，尤其在陪伴动物领域中，变态反应至关重要。
[0108] 狗和猫常患例如犬科动物异位性皮炎或猫科动物特应性皮炎或猫科动物哮喘等疾病。
[0109] 犬科动物或猫科动物特应性皮炎(AD)已被定义为遗传易感的炎症性及瘙痒性变应性皮肤疾病，具有典型的临床特征。其最常与环境变应原的IgE抗体相关。特应性表型可见于有IgE介导的皮肤病、食物变态反应或称之为“类变应性皮炎”(ALD)的病症的动物。类变应性皮炎定义为狗的瘙痒性皮肤病，带有典型的变应性皮炎的特征，但IgE抗体试验呈阴性。猫科动物变应性皮炎与犬科动物变应性皮炎具有许多相似之处。常见的犬科动物特应性皮炎的临床症状包括季节性的或非季节的瘙痒、外耳炎、特别发生在腋窝、腹股沟和屈肌的皮肤表面的复发性及慢性炎症性皮炎、复发性细菌感染、蹭脸和/或舔足及咀嚼的病史。
[0110] 特应性皮炎的病原和发病机理极为复杂，涉及遗传易感性、皮肤正常屏障功能受损及免疫方面的畸变。带有特应性皮炎的动物被认为是由于基因易于对环境中的变应原敏感。变应原是当通过皮肤、呼吸道或胃肠道吸入或吸收时，引起变应原特异性IgE生产的蛋白质。这些变应原特异性IgE模块经由组织肥大细胞或嗜碱细胞上的Fcε受体将自身粘附在这些细胞上。当这些已接触抗原的细胞再次与特异性变应原接触时，肥大细胞脱颗粒作用会导致蛋白水解酶、组胺、缓激肽及其他血管活性胺释放，从而导致炎症(红斑、浮肿及和瘙痒)。皮肤是狗和猫的主要靶器官，但鼻炎与哮喘也可能发生在约15％左右的受感染动物身上。
[0111] 已知螨是例如狗和猫的特应性皮炎及哮喘等变应性疾病的主要病因。照惯例，使用变态反应的诱发性物质作为变应性疾病的治疗剂的脱敏疗法被认为是最重要的基础治疗方法。具体而言，脱敏疗法被广泛实施用于如由难以避免的吸入性变应原诱发的花粉病、室内尘埃变态反应及真菌变态反应等疾病。然而，脱敏疗法包含不良事件尤其是因敏化抗原的作用而产生的过敏性反应的风险，使得需要施用像iMAT分子这样的安全的治疗性抗
原。
原。
[0112] 对于螨变应性疾病，已对几个相关的物种进行了描述：屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、粉尘螨(Dermatophagoides farinae)、埋内欧尘螨(Euroglyphus maynei)、丝泊尘螨(Dermatophagoides siboney)、微角尘螨(Dermatophagoides
microceras)、害鳞嗜螨(Lepidoglyphus destructor)、热带无爪螨(Blomia tropicalis)、腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)、家食甜螨(Glycophagus domesticus)、粗脚粉螨(Acarus siro)。然而，屋尘螨和粉尘螨这两种螨已被报告为室内尘埃中的主要变应原来源(Thomas,WR.et al.,Chang Gung Med J 2004；27:563-569)。已从这些螨中分馏出了主要的螨变应原。
microceras)、害鳞嗜螨(Lepidoglyphus destructor)、热带无爪螨(Blomia tropicalis)、腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)、家食甜螨(Glycophagus domesticus)、粗脚粉螨(Acarus siro)。然而，屋尘螨和粉尘螨这两种螨已被报告为室内尘埃中的主要变应原来源(Thomas,WR.et al.,Chang Gung Med J 2004；27:563-569)。已从这些螨中分馏出了主要的螨变应原。
[0113] 在80％的变态反应患者中屋尘螨的第1组和第2组变应原诱导了高滴度的IgE和Th2细胞激素。在约50％的对象中变应原Der p 3、5、6、7和8诱导了IgE，通常是以较低的滴度。92/98kDa副肌球蛋白(第11组)变应原在80％的由有变应性的对象中与IgE结合，而98和
60kDa几丁质酶(Der f 15和18)在约70％和54％之间的有变应性的的对象中与IgE结合且
对于有变应性的狗而言，其是重要的变应原(McCall C et al.,Vet Immunol Immunopath
2001；78:231-247)。
60kDa几丁质酶(Der f 15和18)在约70％和54％之间的有变应性的的对象中与IgE结合且
对于有变应性的狗而言，其是重要的变应原(McCall C et al.,Vet Immunol Immunopath
2001；78:231-247)。
[0114] 一般而言，已经描述了多种环境变应原可促成在犬科动物特应性皮炎中狗的致敏，如禾本科植物的花粉、树、杂草、室内尘埃、灰尘及仓储螨以及霉菌和/或霉菌孢子，而且还有表皮及昆虫抗原(Hill et al.。Vet Immunol Immunopathol,2001；81(3-4):169-
186)。
186)。
[0115] 如上所述，特应性表型还可以通过食物变态反应(其是一种具有若干临床表现的过敏)诱导。除胃肠道改变(如胃肠炎、腹泻或呕吐)之外，食物过敏在动物中时常表现为面部和颈部的瘙痒性皮炎和/或皮肤病、栗粒状皮炎、全身性的鳞屑或对称性脱毛。尤其在猫中，嗜酸性细胞肉芽肿的所有实体可能是对特定食物变应原的过敏的结果。
[0116] 最常见的食物变应原源自肉、奶、鱼，而且还有大豆和/或更多源自普通罐头食物和干制食物。据报告，尤其是后者，还涉及对添加剂和/或仓储螨的变态反应(Guaguere E et al.EJCAP,2009,19(3),234-241；Jackson HA,EJCAP,2009,19(3),230-233)。
[0117] 当前，兽医治疗方案局限于对症(例如肾上腺皮质素)疗法和/或排除引起病症的食物。然而，必须小心不对饲料的营养平衡产生不良影响。最近已能够获得含有水解蛋白质的饲料。蛋白质经分解，因此变应原性更低了，这极为有效且耐受良好。然而，这些饲料易于昂贵且不那么适口，后者是对动物依从性的一个主要限制。
[0118] 治疗由食物变应性的动物，优选狗和/或猫的变应原特异性免疫治疗尚未被应用。
[0119] 在又一实施方案中，如本文所公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质特别可用于具体解决治疗和/或预防患有气道变应性炎症和/或阻塞(变应性哮喘)的猫的方法中。
[0120] 猫会自发嗜酸细胞性气道炎症和气道过度反应，其与人的变应性哮喘非常相似，也即是，猫科动物的变应性哮喘是一种下气道的慢性炎症性疾病，其可表现有急性的危及生命的临床症状。
[0121] 传统疗法仅涉及姑息治疗(例如支气管扩张药和/或皮质甾类)，而目前并没有病因疗法。以Carol Reinero为中心的大学研究组已通过一个在猫中诱导狗牙草变应性哮喘的动物模型对变应原特异性免疫疗法进行了一些先导研究。
[0122] 猫科动物的变应性哮喘是一种复杂性疾病，但无疑暴露于空气传播变应原在病因方面中起关键作用。通过避免暴露于空气传播变应原能够实现临床缓解。然而，迄今为止尚未清楚地识别触发触发猫科动物的变应性哮喘相关的主要抗原。在猫的习惯性环境中还存在大量潜在致病物，例如花粉、霉菌、猫砂的灰尘、香水、空气清新剂、地毯除臭剂、喷发胶、气溶胶清洁剂或香烟烟雾。在用血清或皮内试验进行筛选时，关在房子里的天生具有变应性的猫对许多同样涉及人的变应性哮喘的变应原，也即，主要对室内尘埃及仓储螨和/或花粉产生了IgE反应(Prost C,Rev Fr Allergol Immunol Clin,2008,48(5),409–413)。
[0123] 在又一实施方案中，如本文所公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质特别可用于具体解决治疗和/或预防患有由跳蚤叮咬(FAD))引起的变应性皮炎的猫和/或狗的方法中。
[0124] FAD是猫和/或狗的由跳蚤感染引起的最严重的皮肤变态反应之一。FAD具有速发型和迟发型两种过敏性的临床表现。易受FAD的动物的速发过敏性反应通常会在跳蚤叮咬部位引起小疙瘩的形成。这种小疙瘩会发展成带有痂皮的疹块，代表迟发型过敏性。对跳蚤叮咬的过敏性反应可发生于遗传易感的动物中以及通过早先遭受跳蚤叮咬而致敏的动物
中。此外，由于宿主的红斑、疹块、痂皮及脱毛的炎症性刺激的结果，跳蚤叮咬可引起抓伤相关的二次感染。通过前人的工作发现，一旦使宠物对跳蚤的叮咬产生了变应性，它们很少对其脱敏。所以，除消除跳蚤之外，缓解动物的不适成为了具有挑战性的问题。当前针对该疾病的疗法包括脱敏疗法或使用某些类型的药物干预。然而，这些治疗的方法各自都具有一些缺点。例如，抗组胺药物会加剧困倦、口干燥、排尿困难及便秘，而传统的脱敏疗法会引起危及生命的过敏性休克。这些疗法的其他缺点是复发可能性较高及需要长期治疗。因此，需要且应当建立新型有效的治疗的方法，以便克服有害的不良反应。不是无法就是难于实现对FAD的有效治疗。在跳蚤流行区中大约15％的猫和狗饱受跳蚤叮咬之苦，且频率还在逐年增加。在某一地理区域中，有效防治跳蚤需要对所有的动物进行处理。研究人员已提出的一种处理方案包括用跳蚤变应原对动物进行脱敏。然而，对于这样的处理方案，需要跳蚤变应原的可靠、规定的制剂。已将全跳蚤抗原制剂用于诊断和脱敏受跳蚤叮咬的动物。然而，可购得的商品全跳蚤提取物仅包含作为一小部分的唾液蛋白质，从而无法对其特异性变应原含量进行预测，因此其有用性受到了限制。现有技术美国专利第7,629,446号以及
McDermott MJ等人(Molecular Immunology 2000,37:361-375)描述了作为FAD中的主要变应原的Cte f 1变应原的发现。在该出版物中，他们描述了对cDNA进行克隆和对跳蚤唾液蛋白(Cte f l，具有跳蚤变应性的狗和猫的一种主要变应原)进行鉴定。天然的Cte f 1的计算得到的分子量为18kDa，等电点为9.3。质谱分析表明，该天然分子没有翻译后修饰，且所有16个半胱氨酸都包括在分子内二硫键中。然而，在同一出版物中，作者给出了该重组蛋白的若干个异构体。分泌性蛋白质中的16个半胱氨酸导致了这些异构体的出现，这使得在优良制造规范条件下纯化以及由此制造这种产品变得困难甚至不可能。
中。此外，由于宿主的红斑、疹块、痂皮及脱毛的炎症性刺激的结果，跳蚤叮咬可引起抓伤相关的二次感染。通过前人的工作发现，一旦使宠物对跳蚤的叮咬产生了变应性，它们很少对其脱敏。所以，除消除跳蚤之外，缓解动物的不适成为了具有挑战性的问题。当前针对该疾病的疗法包括脱敏疗法或使用某些类型的药物干预。然而，这些治疗的方法各自都具有一些缺点。例如，抗组胺药物会加剧困倦、口干燥、排尿困难及便秘，而传统的脱敏疗法会引起危及生命的过敏性休克。这些疗法的其他缺点是复发可能性较高及需要长期治疗。因此，需要且应当建立新型有效的治疗的方法，以便克服有害的不良反应。不是无法就是难于实现对FAD的有效治疗。在跳蚤流行区中大约15％的猫和狗饱受跳蚤叮咬之苦，且频率还在逐年增加。在某一地理区域中，有效防治跳蚤需要对所有的动物进行处理。研究人员已提出的一种处理方案包括用跳蚤变应原对动物进行脱敏。然而，对于这样的处理方案，需要跳蚤变应原的可靠、规定的制剂。已将全跳蚤抗原制剂用于诊断和脱敏受跳蚤叮咬的动物。然而，可购得的商品全跳蚤提取物仅包含作为一小部分的唾液蛋白质，从而无法对其特异性变应原含量进行预测，因此其有用性受到了限制。现有技术美国专利第7,629,446号以及
McDermott MJ等人(Molecular Immunology 2000,37:361-375)描述了作为FAD中的主要变应原的Cte f 1变应原的发现。在该出版物中，他们描述了对cDNA进行克隆和对跳蚤唾液蛋白(Cte f l，具有跳蚤变应性的狗和猫的一种主要变应原)进行鉴定。天然的Cte f 1的计算得到的分子量为18kDa，等电点为9.3。质谱分析表明，该天然分子没有翻译后修饰，且所有16个半胱氨酸都包括在分子内二硫键中。然而，在同一出版物中，作者给出了该重组蛋白的若干个异构体。分泌性蛋白质中的16个半胱氨酸导致了这些异构体的出现，这使得在优良制造规范条件下纯化以及由此制造这种产品变得困难甚至不可能。
[0125] 在实验上使狗对跳蚤叮咬敏感的研究中，Cte f 1是一个主要的变应原。通过将大肠杆菌产生的rCte f 1用作皮内试验中及固相ELISA中的抗原，在100％的这些实验上致敏的受FAD的狗中都可以检测到IgE。另外，采用14只致敏的狗的血清进行的竞争ELISA表明，在三个不同表达系统(大肠杆菌、毕赤酵母和杆状病毒感染的昆虫细胞)中产生的rCte f 1可抑制抗原特异性IgE与天然Cte f 1的大约95％的结合。
[0126] J.Jin等人已证明了包括Cte f 1的免疫治疗方法的治疗潜力(Jin J.et al.Vaccine 28(2010)1997–2004)。他们的报告指出，在小鼠模型中同时用DNA疫苗及其同源编码蛋白质抗原(Cte f 1)进行联合免疫显示出了保护动物免于FAD的潜力。而且，在其研究中，他们在临床上对这一治疗方案进行试验，用于治疗跳蚤感染之后在猫中形成的
FAD。他们提供了数据，表明了对两次联合免疫之后的这些FAD的猫的皮炎的疗效的改善。
FAD。他们提供了数据，表明了对两次联合免疫之后的这些FAD的猫的皮炎的疗效的改善。
[0127] 包含以其他氨基酸残基取代半胱氨酸的修饰的Cte f 1序列的iMAT分子也可以包括在iMAT分子中连同猫或狗的不变链一起作为变应原模块，以实现最佳化的物种特异性免疫调节效果。出乎意料地，这些分子：(i)使得在合适的表达系统中能够高效生产重组蛋白质；(ii)由于作为肥大细胞的效应细胞以相较于未修饰的Cte f 1高得多的浓度被激活，因此其安全风险大为降低；及(iii)仅三次注射后，其诱导持续的免疫效应及持久的临床改善。
[0128] 在又一实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质特别可用于具体解决治疗和/或预防患有细菌引起的传染性疾病的动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的方法中。
[0129] 革兰氏阴性细菌-弯曲杆菌-是引起家养动物(例如狗、猫、猪、反刍动物)肠胃炎的最常见的细菌性病因。通常，年轻哺乳动物的临床症状会更严重。已经有报告指出，除了肠炎外，在各物种中还会出现流产及不育。感染主要是通过摄取实现–在进入时，细菌需要通过各种定殖及毒力决定簇的表达来克服宿主防御。那些决定簇很多都是抗原性表面或外膜蛋白质，其与例如胃肠道上皮细胞的相互作用对于定殖即感染宿主是至关重要的。
[0130] 为了解决这一医学问题，本文公开并要求保护的弯曲杆菌病专用(经分离的)重组蛋白中的至少一个抗原模块可以选自衍生自弯曲杆菌属物种，例如鞭毛蛋白、暴露蛋白质(CadF及PEB1)或其他表面蛋白质。经改良的MAT分子可具体用作疫苗，例如用于治疗和/或预防弯曲杆菌病。根据本发明的治疗可以包括对后代施用iMAT分子和/或也可以包含对妊娠的母亲进行治疗。
[0131] 在另一实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质特别可用于具体解决治疗和/或预防患有病毒引起的传染性疾病的动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的方法中。
[0132] 例如，西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)属于黄病毒科中黄病毒属的日本脑炎病毒血清型群的经蚊传播的正链RNA病毒。为疾病综合征的致病物，也称作西尼罗发热。鸟类为自然贮存宿主，且WNV在自然中维持蚊–鸟–蚊传播循环。然而，人、马、狗、猫以及反刍动物也被描述成易受感染。尽管多数西尼罗河病毒传染病仍然临床表现隐匿(西尼罗河病毒是一种潜在的神经感染性病毒)，但是其可能引起性脑膜炎或脑炎。在动物中，西尼罗河病毒常常仍未被识别出，但动物可能因西尼罗河病毒常引起的重度神经症状(包括轻瘫、失调、仰卧及肌肉颤动)而被安乐死，而其他的则表现出轻度至重度脑脊髓灰质炎。
[0133] 在另一实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质特别可用于具体解决防止动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的传染性疾病经载体(例如食血蝽、苍蝇、蠓、壁虱和/或蚊)传播的方法中。
[0134] 病原体连同包含多种生物活性分子的节肢动物唾液一起递送至哺乳动物宿主皮肤中。这些唾液组分能够改变止血及免疫应答及可促成病原体诱发感染的能力。食血节肢动物自身唾腺中传染性微生物的存在会改变唾液组成，例如，受感染蚊中腺苷三磷酸双磷酸酶或抗凝血酶浓度的改变。载体结合或唾液组分可以(例如改变宿主的血管活性和/或调节宿主的免疫应答，且对传染性疾病的传播至关重要。对宿主进行节肢动物唾液组分疫苗接种可以干扰病毒的传播，正如对于白蛉唾液蛋白质及利什曼原虫属物种的传播所显示的那样。然而，这些疫苗并未通过最近的临床前研究(WHO PD-VAC 2014-Status of Vaccine Research and Development of Vaccines for Leishmaniasis)。
[0135] 节肢动物唾液抗原非常适合于在根据本发明的iMAT分子的抗原模块中使用，并可具体用作例如用于激活宿主免疫系统的疫苗，以防止动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)中的传染性病原体(例如病毒、真菌和/或寄生虫和/或其潜隐期)经载体传播。
[0136] 在另一实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质特别可用于具体解决治疗和/或预防患有真菌引起的传染性疾病的动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的方法中。
[0137] 皮肤真菌病或癣菌病是发生于动物与人中的毛发和皮肤表面角质化细胞层的真菌感染。属于亲动物性或亲土壤性皮癣菌病群组的小孢癣菌属或毛癣菌属的若干物种可引起动物的临床感染。真菌和/或其孢子的许多表面抗原都非常适合于在根据本发明的iMAT分子的抗原模块中使用，并可具体用作例如用于治疗和/或预防动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的皮肤真菌病的疫苗。
[0138] 在另一实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质特别可用于具体解决治疗和/或预防患有寄生虫引起的传染性疾病的动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的方法中。
[0139] 感染哺乳动物的寄生虫无处不在，在世界范围内都具有临床重要性。对于反刍动物、猪、狗和/或猫的主要寄生虫威胁是，例如古柏线虫、血矛线虫、胃线虫、毛圆线虫、网尾、后圆线虫。全球报告在马寄生虫中驱虫药耐药性程度渐增。就原虫例如隐孢子虫属而言，很少药物可始终抑制宿主中寄生虫感染和/或再现。主要是初生活幼小哺乳动物受感染且结果依赖于先天及适应性免疫应答。
[0140] 衍生自寄生虫成虫以及潜隐期的抗原是另一个可在根据本发明的iMAT分子的抗原模块中使用的实例，并可具体用作例如用于治疗和/或预防动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的寄生虫感染的疫苗。
[0141] 根据本发明的治疗可以包括对后代施用iMAT分子和/或也可以包含对妊娠的母亲进行治疗。
[0142] 具体而言，若对犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊科动物、山羊科动物或猪科动物等物种的免疫应答进行调节，则该至少一个靶向模块优选是各自相应的不变链。
[0143] 在一个优选实施方案中，该至少一个靶向模块为根据SEQ ID NO:2或4的犬科动物不变链。在另一个优选实施方案中，该至少一个靶向模块为根据SEQ ID NO:3或5的猫科动物不变链。
[0144] 在一个有利实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质呈单体形式存在，这是因为例如重组引入的变应原倾向于形成聚积物，尤其假若经由包含体产生。通过取代(经分离的)重组蛋白质的整体序列中的至少一个、优选全部半胱氨酸残基，优选通过取代为丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸，可防止形成分子间二硫键，因此，避免任何聚积，具体而言，避免任何非自然形成分子间-和/或分子内键。即，整体缺乏半胱氨酸残基的(经分离的)重组蛋白质不会聚积。因此，蛋白质可轻易地表达并展现经改良的靶向及MHC呈递。
[0145] 另外，例如变应原的此类不含半胱氨酸的变体，其中野生型变应原氨基酸序列中的半胱氨酸残基已单独地或以组合方式突变，显示与相应的野生型变应原相比降低的IgE反应性且同时实质上保持对T-淋巴细胞反应性及因此具低变应原性。
[0146] 本发明因此涉及那些引起动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)中例如对跳蚤叮咬的变态反应、对特定食物组分的变态反应和/或特应性皮炎和/或气道变应性炎症和/或阻塞的变应原的此类低变应原性变体，其中在这些变体中，野生型变应原的半胱氨酸残基已单独地或以组合方式突变。
[0147] 另外，用于分离包含本发明iMAT分子的样品中蛋白质的标签模块的存在，例如使用载锌或载钴固体支持物，进一步提高产生出融合蛋白质而不在纯化过程期间聚积的可能性。通常，标签模块包括5至6个连续组氨酸残基的聚组氨酸标签。
[0148] 本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质可用于药物组合物中。例如，(经分离的)重组蛋白质用于疫苗中。因此，本发明提供包含一种或多种本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质的疫苗组合物。该疫苗组合物可治疗上和/或预防上用于患有基于不同靶器官(如皮肤、呼吸以及胃肠道系统)中发生的变应原特异性IgE介导过敏反应的变应性疾病的动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)中；或者，该疫苗组合物可治疗上和/或预防上用于患有病原体(例如病毒、真菌和/或寄生虫和/或其潜隐期)诱发的传染性疾病的动物(更优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)中。另外，该方法可不仅针对抗此类病原体使用，而且可用于活化宿主免疫系统以防止经载体(例如食血蝽、苍蝇、蠓、壁虱和/或蚊)传播。
[0149] 因此，在本发明的优选实施方案中，提供用于对象(如除马科动物外的动物，更优选狗和/或猫)的疫苗以治疗和/或预防由例如遭受尘螨叮咬的反应引起特应性皮炎和/或变应性哮喘。
[0150] 在本发明的又一实施方案中，提供用于对象(如除马科动物外的动物，更优选狗和/或猫)的疫苗以治疗和/或预防因对例如霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、室内尘埃或饲料螨(和/或其孢子)反应而引起的变应性哮喘。
[0151] 在本发明的又一实施方案中，提供用于对象(如除马科动物外的动物，更优选狗和/或猫)的疫苗以治疗和/或预防与如下所列有关的传染性疾病：例如，弯曲杆菌属、恶丝虫属、埃利希氏体属、利什曼原虫属、锥虫属、疏螺旋体属、布尼亚病毒属、环状病毒属、黄病毒属、轮状病毒属、冠状病毒属、毛癣菌属、小孢子菌属；其它蠕虫，像古柏线虫属、血矛线虫属、胃线虫属、毛圆线虫属、网尾线虫属、后圆线虫属；和/或带胃肠道侵染的原虫，像艾美虫属、等孢子球虫属、隐孢子虫属、贾第鞭毛虫属–假设衍生自潜隐期的寄生虫即抗原也可以被采用。另外，可提供疫苗以活化宿主免疫系统来防止疾病经载体(例如属于蚊科、蠓科、白蛉亚科、硬蜱科和/或臭虫科的和/或其他食血昆虫)传播。
[0152] (经分离的)重组蛋白质的(例如呈疫苗形式的)药物组合物优选经用于舌下施用、皮下和/或皮内注射、注射至淋巴结中和/或用于经粘膜(具体而言，经胃肠道或呼吸系统的粘膜)施用。
[0153] 在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物是肠道外施用。
[0154] 根据本发明的iMAT分子可用作医药或用作疫苗来调节例如变应性疾病。例如，特应性皮炎和/或变应性哮喘可通过此类iMAT分子来治疗。
[0155] 少量(1至1000μg，指仅一个或多个抗原模块的重量)包含尘螨属的螨引发的特应性皮炎和/或变应性哮喘的变应原的重组iMAT分子例如经皮下、皮内或直接注射至淋巴结中1至5次，可引发猫和/或狗的强力且持久免疫应答，从而预防疾病和/或缓解临床症状。
[0156] 在一个优选实施方案，本发明的iMAT分子与至少一个佐剂结合施用。该佐剂包括(但不限于)以下中之一或多者：明矾、BCG、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、脂质乳液、脂质或聚合纳米-或微球体、胶束、脂质体、皂苷、脂质A、或胞壁酰二肽、细菌产物、趋化激素、细胞激素及激素、甲壳素、淀粉、海藻盐、纤维素衍生物(例如，乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、核酸、或核酸构建物。可添加此类组分中之一或多者以增进或经改良免疫应答。或者，iMAT分子可在不含佐剂下或呈水溶液形式施用。
[0157] iMAT分子可以约1μg至1000μg(该剂量及随后的剂量是指仅一个或多个抗原模块的重量)的剂量，更优选以约10μg至约100μg的剂量，甚至更优选以约20μg至约50μg的剂量施用，然而，最佳剂量可根据注射的抗原(优选变应原)、对象体重、对象的免疫系统等改变。在许多情况中，有效的治疗可通过一次施用来实现。在一些实施方案中，治疗包括1至15次施用。在优选实施方案中，治疗包括1至5次施用，更优选包括1至3次施用。就初始治疗而言，施用可例如在数天中定期进行，每月或每年一次或两次、或每年数次。就维持免疫应答而言，施用可以数月至数年的时间间隔进行。
[0158] 在本发明的优选实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质是经设计用于淋巴结内施用。在直接注射至淋巴结中的过程中，相应的淋巴结可在注射程序期间例如通过超音波可视化，以监测针头位置及淋巴结改变(如肿胀)。由于超声引导定位及注射较容易，优选注射至下颌、腋、腹股沟和/或腘肌淋巴结中。
[0159] 本领域中已知，螨虫粪便以及螨虫全身的若干已识别的蛋白质会诱发狗和/或猫的IgE反应性和皮肤及呼吸系统病理反应[Allergome(www.allergome.org)]。因此，预期只有在用于特异性免疫治疗的药物中包括有大多数相关变应原时治疗才会取得成功。然而，出乎意料地，若将此类根据本发明的iMAT分子经皮下、皮内和/或直接注射至淋巴结中1至5次，则仅1、2、3或4种此类iMAT分子(各自包含例如螨或嵌合样表位构建物的不同的抗原模块)便足以促使免疫调节和/或患病对象的临床改善。
[0160] 在优选实施方案中，采用单一iMAT分子，足以诱发治疗效应和/或预防和/或防止例如动物(更优选狗和/或猫，但马科动物除外)的不同靶器官(如皮肤、呼吸以及胃肠道系统)中变应原特异性IgE介导过敏反应的发展。还可以实现治疗和/或预防动物(优选反刍动物、猪、狗和/或猫，但马科动物除外)的传染性疾病和/或防止其传染性疾病经载体传播。
[0161] 在另一优选实施方案中，2种、3种或4种iMAT分子的组合通过同时、连续和/或时序交错地共同施用进行使用。
[0162] 在优选实施方案中，采用单一iMAT分子，足以诱发治疗效应和/或预防和/或防止动物(更优选反刍动物、选狗和/或猫，但马科动物除外)的传染性疾病(例如由病毒、真菌和/或寄生虫和/或其潜隐期诱发的)传播和/或防止这些传染性疾病经例如食血蝽、苍蝇、蠓、壁虱和/或蚊传播。
[0163] 在另一优选实施方案中，2种、3种或4种iMAT分子的组合通过同时、连续和/或时序交错地共同施用进行使用。
[0164] 基于本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质的热动力评估，稳定性受到半胱氨酸突变(即，不同氨基酸残基的取代)的影响。例如，该取代可以是Cys至Ser取代。然而，使用除Ser氨基酸外的不同氨基酸残基，稳定性可更高以达成期望的稳定性及溶解性。也就是说，尽管第一选择可以是改由Ser取代Cys，然而，在不稳定的情况下，应改由除Ser外的其他氨基酸残基取代Cys。
[0165] 为选择稳定氨基酸残基作为标靶序列中半胱氨酸的替代，选用如下三步法：
[0166] 1.建立包含末端六聚组氨酸标签、iMAT序列及受关注蛋白质的一级氨基酸序列的靶向蛋白质的三级结构的模型。建模可利用天然序列且并与半胱氨酸取代来进行。
[0167] 2.基于单点取代，如改由不同氨基酸残基例如Ser和/或Ile取代半胱氨酸残基来反复测定蛋白质稳定性并评分，以通过分析所有可取得的三维结构来确定稳定的替代。
[0168] 3.通过重复步骤1和2进行稳定结构重建模及稳定性验证。
[0169] 三维蛋白质结构对于在分子水平上了解蛋白质功能至关重要且对于许多不同类型的生物实验(如定点诱变)的合理设计受到极大关注。然而，与已知蛋白质序列的数目相比，经结构表征的蛋白质的数目很小。对于给定蛋白质序列(标靶)，可识别具有已知结构的同源蛋白质(模板)。在这些情况下，已证实同源模型化选择性地自蛋白质一级氨基酸序列产生出其可靠3D模型的方法。构建同源模型包括四个主要步骤：(1)识别结构模板，(2)将标靶序列及模板结构比对，(3)构建模型及(4)模型质量评估。可以重复这些步骤直到达成令人满意的建模结果。在无法确定准确同源模型的情况下，使用从一级结构(氨基酸序列)开始确定蛋白质结构的计算方法。“重新”或“从头开始”方法基于物理原理及尝试模拟折叠过程。此类方法必须对大量构象取样及需要极准确能量函数以识别在总体自由能最小的结
构。许多方法都利用了此类所述原理的组合。
构。许多方法都利用了此类所述原理的组合。
[0170] 产生合理地准确估计氨基酸取代对蛋白质稳定性影响的计算工具的可利用性在广泛范围应用中具关键重要性。具体而言，此类工具具有刺激并支持专门用于产生出经修改蛋白质的蛋白质改造及设计工程的潜力。
[0171] 可在就可逆地快速去折叠及再折叠的蛋白质的热动力稳定性方面考虑蛋白质稳定性。在这些情况下，蛋白质稳定性是折叠及去折叠状态之间的吉布斯自由能差。影响稳定性的唯一因素为折叠及去折叠状态的相对自由能。折叠自由能差越大且为越大的正值，则蛋白质的变性更稳定。折叠自由能差通常很小，对于球蛋白而言，在5至15kcal/mol级别。然而，另一方面，蛋白质稳定性可作为耐受苛刻温度或溶剂条件的蛋白质性质。这是与热动力稳定性相关而又与折叠/去折叠的可逆性或不可逆性(动力学稳定性)有关。
[0172] 为预测因蛋白质中单点取代所引起的热动力稳定性改变，可应用数种不同方法来研究此类取代对蛋白质结构及功能的影响【Pires DE et al.，Bioinformatics 2014,30(3):335-342】。此类方法可大致被归类为那些寻求了解自仅蛋白质的氨基酸序列取代的效应者、以及那些利用大量结构信息者。基于结构的方法通常尝试基于取代或实际自由能值(ΔΔG)中来预测蛋白质稳定性改变。
[0173] 就特定取代出现的次数而言使用评分系统对各特异性蛋白质及其对应模型的结果作统计分析，该评分系统基于在使用的模型中的出现及蛋白质稳定性自由能改变(ΔΔG)而对替代评级，因而确定输入结构及可能替代中最不稳定的残基(若有的话)。通过测定各模型中受关注各位置处的最低ΔΔG(ΔΔG<0)及对各可能取代位置指派相应的线性值
及累积ΔΔG值来计算评分且接着评估结果以确定模型之间的一致性。由于经过计算的蛋白质模型具有不同质量(预测正确三维结构的可能性)，故可实施加权因子以优先排序更准确模型的结果。明显(基于ΔΔG而言)不稳定的残基(若有的话)经取代；生成新模型且反覆再分析直到达成稳态。通过主要组分分析法分析xyz坐标来评估额外产生出的模型以确定由于在特定位置替代氨基酸所致的可能结构错误折叠。
及累积ΔΔG值来计算评分且接着评估结果以确定模型之间的一致性。由于经过计算的蛋白质模型具有不同质量(预测正确三维结构的可能性)，故可实施加权因子以优先排序更准确模型的结果。明显(基于ΔΔG而言)不稳定的残基(若有的话)经取代；生成新模型且反覆再分析直到达成稳态。通过主要组分分析法分析xyz坐标来评估额外产生出的模型以确定由于在特定位置替代氨基酸所致的可能结构错误折叠。
[0174] 在又另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供一种识别预定氨基酸序列中的氨基酸取代使得此类预定氨基酸序列稳定的方法得以解决，该方法包括以下步骤：
[0175] (i)建立标靶预定氨基酸序列的三维/三级结构的模型；
[0176] (ii)基于单点取代，如改由不同氨基酸残基，优选丝氨酸和/或异亮氨酸残基取代半胱氨酸残基来反复确定蛋白质稳定性，及基于蛋白质稳定性自由能改变(ΔΔG)的评分系统通过分析所有可取的三维/三级氨基酸序列结构来确定稳定的取代；
[0177] (iii)通过重复步骤(ii)及(iii)对取代的三维/三级氨基酸序列结构重建模及计算其稳定性直到达成稳态。
[0178] 在又另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质得以解决，其中其完全或部分氨基酸序列系通过本文公开并要求保护的识别预定氨基酸序列中的氨基酸取代的方法而稳定化(参见本文中实施例5以及实施例6)。
[0179] 序列
[0180] 在本发明中详细描述并据此公开了如下蛋白质序列(aa或AA为氨基酸的简称)：
[0181] SEQ ID NO：1涉及根据本发明的一个移位模块的适宜的最短氨基酸序列，其仍具功能性，也就是说，仍能够有效地促进细胞进入->TAT序列；
[0182] SEQ ID NO:2至5不变链(全序列及110个氨基酸)：
[0183] SEQ ID NO:2涉及犬科动物的完全不变链氨基酸序列；
[0184] >gi|545496086|家犬|XP_536468.5|预测：II类HLA组织相容性抗原γ链异构体X1【家犬】
[0185] SEQ ID NO:3涉及猫科动物的完全不变链氨基酸序列；
[0186] >gi|410949651|家猫|XP_003981534.1|预测：II类HLA组织相容性抗原γ链异构体X1【家猫】
[0187] SEQ ID NO:4涉及犬科动物的完全不变链氨基酸序列的前110个氨基酸；
[0188] SEQ ID NO：5涉及猫科动物的完全不变链氨基酸序列的前110个氨基酸；
[0189] SEQ ID NO：6涉及22个氨基酸的N端标记；
[0190] SEQ ID NO：7至13变应原，完全序列：
[0191] SEQ ID NO：7涉及Der f 1变应原的完全不变链氨基酸序列；
[0192] >Q58A71Der f 1变应原预酶前体粉尘螨(美洲房尘螨)
[0193] SEQ ID NO：8涉及Der f 2变应原的完全不变链氨基酸序列；
[0194] >Q00855螨2组变应原Der f 2(变应原Der f II)(变应原Der f 2)粉尘螨(美洲房尘螨)
[0195] SEQ ID NO：9涉及Der f 23变应原的完全不变链氨基酸序列；
[0196] >A0A088SAW7Der f 23变应原粉尘螨(美洲房尘螨)
[0197] SEQ ID NO：10涉及Der f 18p变应原的完全不变链氨基酸序列；>Q86R84 60kDa变应原
[0198] Der f 18p粉尘螨(美洲房尘螨)
[0199] SEQ ID NO：11涉及Der f 15变应原的完全不变链氨基酸序列；
[0200] >Q9U6R7 98kDa HDM变应原(Der f 15变应原)(组15变应原Der f 15)粉尘螨(美洲房尘螨)
[0201] SEQ ID NO：12涉及Zen 1蛋白质变应原的完全不变链氨基酸序列；
[0202] >I7HDR2Zen 1蛋白质粉尘螨(美洲房尘螨)
[0203] SEQ ID NO：13涉及Cte f 1变应原的完全不变链氨基酸序列；
[0204] >Q94424唾液腺抗原1(FS-I)(变应原Cte f 1)(栉头蚤)(猫蚤)
[0205] SEQ ID NO:14至20变应原，IMAT形式(短)：
[0206] SEQ ID NO：14涉及Der f 1变应原氨基酸序列的iMAT形式(短)；
[0207] SEQ ID NO：15涉及Der f 2变应原氨基酸序列的iMAT形式(短)；
[0208] SEQ ID NO：16涉及Der f 23变应原氨基酸序列的iMAT形式(短)；
[0209] SEQ ID NO：17涉及Der f 18p变应原氨基酸序列的iMAT形式(短)；
[0210] SEQ ID NO：18涉及Der f 15变应原氨基酸序列的iMAT形式(短)；
[0211] SEQ ID NO：19涉及Zen 1蛋白质变应原氨基酸序列的iMAT形式(短)；
[0212] SEQ ID NO：20涉及Cte f 1变应原氨基酸序列的iMAT形式(短)；
[0213] SEQ ID NO:21至23源自杂交体1、2和3的变应原-IMAT形式(短)：
[0214] SEQ ID NO：21涉及iMAT形式(短)的杂交体1变应原；
[0215] SEQ ID NO：22涉及iMAT形式(短)的杂交体2变应原；
[0216] SEQ ID NO：23涉及iMAT形式(短)的杂交体3变应原；
[0217] SEQ ID NO：22至44猫的iMAT(带有N端或C端六聚组氨酸或没有六聚组氨酸/蛋氨酸(IMAT_纯)):
[0218] SEQ ID NO:24涉及带有N端六聚组氨酸标签的Der f 1iMAT分子(猫)；
[0219] SEQ ID NO:25涉及带有C端六聚组氨酸标签的Der f 1iMAT分子(猫)；
[0220] SEQ ID NO:26涉及无标签的Der f 1iMAT分子(猫)；
[0221] SEQ ID NO:27涉及带有N端六聚组氨酸标签的Der f 2iMAT分子(猫)；
[0222] SEQ ID NO:28涉及带有C端六聚组氨酸标签的Der f 2iMAT分子(猫)；
[0223] SEQ ID NO:29涉及无标签的Der f 2iMAT分子(猫)；
[0224] SEQ ID NO:30涉及带有N端六聚组氨酸标签的Der f 23iMAT分子(猫)；
[0225] SEQ ID NO:31涉及带有C端六聚组氨酸标签的Der f 23iMAT分子(猫)；
[0226] SEQ ID NO:32涉及无标签的Der f 23iMAT分子(猫)；
[0227] SEQ ID NO:33涉及带有N端六聚组氨酸标签的Der f 18p iMAT分子(猫)；
[0228] SEQ ID NO:34涉及带有C端六聚组氨酸标签的Der f 18p iMAT分子(猫)；
[0229] SEQ ID NO:35涉及无标签的Der f 18p iMAT分子(猫)；
[0230] SEQ ID NO:36涉及带有N端六聚组氨酸标签的Der f 15iMAT分子(猫)；
[0231] SEQ ID NO:37涉及带有C端六聚组氨酸标签的Der f 15iMAT分子(猫)；
[0232] SEQ ID NO:38涉及无标签的Der f 15iMAT分子(猫)；
[0233] SEQ ID NO:39涉及带有N端六聚组氨酸标签的Zen 1蛋白质iMAT分子(猫)；
[0234] SEQ ID NO:40涉及带有C端六聚组氨酸标签的Zen 1蛋白质iMAT分子(猫)；
[0235] SEQ ID NO:41涉及无标签的Zen 1蛋白质iMAT分子(猫)；
[0236] SEQ ID NO:42涉及带有N端六聚组氨酸标签的Cte f 1蛋白质iMAT分子(猫)；
[0237] SEQ ID NO:43涉及带有C端六聚组氨酸标签的Cte f 1蛋白质iMAT分子(猫)；
[0238] SEQ ID NO:44涉及无标签的Cte f 1蛋白质iMAT分子(猫)；
[0239] 狗的SEQ ID NO：45至65(带有N端或C端六聚组氨酸或没有六聚组氨酸/蛋氨酸(IMAT_纯)):
[0240] SEQ ID NO:45涉及带有N端六聚组氨酸标签的Der f 1iMAT分子(狗)；
[0241] SEQ ID NO:46涉及带有C端六聚组氨酸标签的Der f 1iMAT分子(狗)；
[0242] SEQ ID NO:47涉及无标签的Der f 1iMAT分子(狗)；
[0243] SEQ ID NO:48涉及带有N端六聚组氨酸标签的Der f 2iMAT分子(狗)；
[0244] SEQ ID NO:49涉及带有C端六聚组氨酸标签的Der f 2iMAT分子(狗)；
[0245] SEQ ID NO:50涉及无标签的Der f 2iMAT分子(狗)；
[0246] SEQ ID NO:51涉及带有N端六聚组氨酸标签的Der f 23iMAT分子(狗)；
[0247] SEQ ID NO:52涉及带有C端六聚组氨酸标签的Der f 23iMAT分子(狗)；
[0248] SEQ ID NO:53涉及无标签的Der f 23iMAT分子(狗)；
[0249] SEQ ID NO:54涉及带有N端六聚组氨酸标签的Der f 18p iMAT分子(狗)；
[0250] SEQ ID NO:55涉及带有C端六聚组氨酸标签的Der f 18p iMAT分子(狗)；
[0251] SEQ ID NO:56涉及无标签的Der f 18p iMAT分子(狗)；
[0252] SEQ ID NO:57涉及带有N端六聚组氨酸标签的Der f 15iMAT分子(狗)；
[0253] SEQ ID NO:58涉及带有C端六聚组氨酸标签的Der f 15iMAT分子(狗)；
[0254] SEQ ID NO:59涉及无标签的Der f 15iMAT分子(狗)；
[0255] SEQ ID NO:60涉及带有N端六聚组氨酸标签的Zen 1iMAT分子(狗)；
[0256] SEQ ID NO:61涉及带有C端六聚组氨酸标签的Zen 1iMAT分子(狗)；
[0257] SEQ ID NO:62涉及无标签的Zen 1iMAT分子(狗)；
[0258] SEQ ID NO:63涉及带有N端六聚组氨酸标签的Cte f 1蛋白质iMAT分子(狗)；
[0259] SEQ ID NO:64涉及带有C端六聚组氨酸标签的Cte f 1蛋白质iMAT分子(狗)；
[0260] SEQ ID NO:65涉及无标签的Cte f 1蛋白质iMAT分子(狗)；
[0261] SEQ ID NO：66至74猫的杂交/嵌合样iMAT(带有N端或C端六聚组氨酸或没有六聚组氨酸/蛋氨酸(IMAT_纯)):
[0262] SEQ ID NO:66涉及带有N端六聚组氨酸标签的杂交体1iMAT分子(猫)；
[0263] SEQ ID NO:67涉及带有C端六聚组氨酸标签的杂交体1iMAT分子(猫)；
[0264] SEQ ID NO：68涉及无标签的杂交体1iMAT分子(猫)(由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：21组成)；
[0265] SEQ ID NO:69涉及带有N端六聚组氨酸标签的杂交体2iMAT分子(猫)；
[0266] SEQ ID NO:70涉及带有C端六聚组氨酸标签的杂交体2iMAT分子(猫)；
[0267] SEQ ID NO：71涉及无标签的杂交体2iMAT分子(猫)(由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：22组成)；
[0268] SEQ ID NO:72涉及带有N端六聚组氨酸标签的杂交体3iMAT分子(猫)；
[0269] SEQ ID NO:73涉及带有C端六聚组氨酸标签的杂交体3iMAT分子(猫)；
[0270] SEQ ID NO：74涉及无标签的杂交体3iMAT分子(猫)(由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：23组成)；
[0271] SEQ ID NO：75至83狗的杂交/嵌合样iMAT(带有N端或C端六聚组氨酸或没有六聚组氨酸/蛋氨酸(IMAT_纯)):
[0272] SEQ ID NO:75涉及带有N端六聚组氨酸标签的杂交体1iMAT分子(狗)；
[0273] SEQ ID NO:76涉及带有C端六聚组氨酸标签的杂交体1iMAT分子(狗)；
[0274] SEQ ID NO：77涉及无标签的杂交体1iMAT分子(狗)(由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：21组成)；
[0275] SEQ ID NO:78涉及带有N端六聚组氨酸标签的杂交体2iMAT分子(狗)；
[0276] SEQ ID NO:79涉及带有C端六聚组氨酸标签的杂交体2iMAT分子(狗)；
[0277] SEQ ID NO：80涉及无标签的杂交体2iMAT分子(狗)(由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：22组成)；
[0278] SEQ ID NO:81涉及带有N端六聚组氨酸标签的杂交体3iMAT分子(狗)；
[0279] SEQ ID NO:82涉及带有C端六聚组氨酸标签的杂交体3iMAT分子(狗)；
[0280] SEQ ID NO：83涉及无标签的杂交体3iMAT分子(狗)(由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：23组成)；
[0281] SEQ ID NOs:84-88非冗余杂交体变应原：
[0282] SEQ ID NO：84涉及A1KXC1_DERFA DFP1(UNIPROT数据库)
[0283] SEQ ID NO：85涉及A0A088SAS1_DERFA Der f 28变应原(UNIPROT数据库)；
[0284] SEQ ID NO：86涉及B7U5T1_DERFA Der f 6变应原(UNIPROT数据库)；
[0285] SEQ ID NO：87涉及T2B4F3_DERPT LytFM(UNIPROT数据库)
[0286] SEQ ID NO：88涉及A7XXV2_DERFA Der f 2变应原(UNIPROT数据库)；
[0287] SEQ ID NO：89-90其他序列
[0288] SEQ ID NO：89涉及带有N端六聚组氨酸的Cul o2iMAT分子；
[0289] SEQ ID NO：90涉及带有N端六聚组氨酸的Cul o3iMAT分子；
[0290] SEQ ID NO：91至102杂交体的肽组分：
[0291] SEQ ID NO：91涉及衍生自SEQ ID NO:10的杂交体的肽部分；
[0292] SEQ ID NO：92涉及衍生自SEQ ID NO:85的杂交体的肽部分；
[0293] SEQ ID NO：93涉及衍生自SEQ ID NO:88的杂交体的肽部分；
[0294] SEQ ID NO：94涉及衍生自SEQ ID NO:86的杂交体的肽部分；
[0295] SEQ ID NO：95涉及衍生自SEQ ID NO:87的杂交体的肽部分；
[0296] SEQ ID NO：96涉及衍生自SEQ ID NO:11的杂交体的肽部分；
[0297] SEQ ID NO：97涉及衍生自SEQ ID NO:7的杂交体的肽部分；
[0298] SEQ ID NO：98涉及衍生自SEQ ID NO:10的杂交体的肽部分；
[0299] SEQ ID NO：99涉及衍生自SEQ ID NO:12的杂交体的肽部分；
[0300] SEQ ID NO：100涉及衍生自SEQ ID NO:9的杂交体的肽部分；
[0301] SEQ ID NO：101涉及衍生自SEQ ID NO:11的杂交体的肽部分；
[0302] SEQ ID NO：102涉及衍生自SEQ ID NO:8的杂交体的肽部分；
[0303] 杂交/嵌合样iMAT分子：
[0304] 在本发明的一个具体方面，若在抗原模块中包括有一个以上变应原的组分(氨基酸序列/表位)，则iMAT分子将进一步经改良。为此，可以以不同的方式应用所述生物信息学选择方法(实施例5)的基础原则。不同于基于变应原数据库中找到的变应原肽的命中计数来选择完全变应原，而是仅使用数种此类变应原的最富足的肽来改造iMAT抗原模块(见实施例6)。因此，这种iMAT分子由源自若干变应原的肽的抗原模块组成。这使得能够相对于其靶向免疫学的分析展宽单个iMAT分子的光谱，从而有益于药理学药物的开发。
[0305] 作为改造杂交iMAT分子的另一个步骤，添加TAT和靶向结构域及任选的His标签。最后，用如实施例5和6中描述的稳定性最高的残基替代半胱氨酸残基。
[0306] 杂交体I
[0307] 从对应于最高等级肽的前体蛋白质清单中选取蛋白质前体，作为用于包埋来自其他抗原(SEQ ID NO：10、11、85、86、87、88—)的最高等级肽的骨架蛋白质(SEQ ID NO：84)。将信号肽序列从骨架蛋白质中移除。如下文所述，在骨架蛋白质的原始序列内插入任选额外的相邻N端或C端氨基酸，替代骨架蛋白质的部分原始序列。
[0308] 采用下列蛋白质的组分来构建杂交体1：
[0309] SEQ ID NO：84(A1KXC1_DERFA DFP1OS＝粉尘螨)
[0310] SEQ ID NO：10(Q86R84_DERFA 60kDa变应原Der f 18p OS＝粉尘螨GN＝Der f 18PE＝2SV＝1)
[0311] SEQ ID NO：85(A0A088SAS1_DERFA Der f 28变应原OS＝粉尘螨PE＝2SV＝1)
[0312] SEQ ID NO：88：(A7XXV2_DERFA Der f 2变应原OS＝粉尘螨PE＝4 SV＝1)
[0313] SEQ ID NO：86(B7U5T1_DERFA Der f 6变应原OS＝粉尘螨PE＝2 SV＝1)
[0314] SEQ ID NO：87(T2B4F3_DERPT LytFM OS＝屋尘螨GN＝lytFM PE＝4 SV＝1)
[0315] SEQ ID NO：11(Q9U6R7_DERFA 98kDa HDM变应原OS＝粉尘螨PE＝2 SV＝1)
[0316] 杂交体1的主链：
[0317] SEQ ID NO：84(A1KXC1 18-400，无以下替代部分)
[0318] [SEQ ID NO：84AA 39-52的替代1]：
[0319] SEQ ID NO：10(Q86R84_AA 97-110)即GNAKAMIAVGGSTM(SEQ ID NO：91)
[0320] [SEQ ID NO：84AA 261-274的替代2]：
[0321] SEQ ID NO：85(A0A088SAS1_AA 611-624)即MMKIYQQQQQQHHP(SEQ ID NO：92)
[0322] [SEQ ID NO：84AA 234-246的替代3]：
[0323] SEQ ID NO：88(A7XXV2_AA 48-61)即FLVYIHIANNEIKK(SEQ ID NO:93)
[0324] [SEQ ID NO：84AA 53-65的替代4]：
[0325] SEQ ID NO：86(B7U5T1_AA 166-178)即IVDGDKVTIYGWG(SEQ ID NO：94)
[0326] [SEQ ID NO：84AA 276-289的替代5]：
[0327] SEQ ID 87：(T2B4F3_AA 134-147)即REENIWSDHIANVA(SEQ ID NO：95)
[0328] [SEQ ID NO：84AA 203-216的替代6]
[0329] SEQ ID NO：11(Q9U6R7_AA 469-482)即TPTTPTPAPTTSTP(SEQ ID NO：96)
[0330] 在应用实施例5和6中所述的生物工程工艺将半胱氨酸残基用稳定性最高的残基替代后，结果得到SEQ ID NO：21。
[0331] 杂交体1的主链由氨基酸序列SEQ ID NO：84构成。将杂交体1抗原模块的另外的肽组分SEQ ID NO：91-96包埋入衍生自SEQ ID NO：84的主链序列中。杂交体1抗原模块的这些另外的肽组分SEQ ID NO：91-96可以以任何顺序/不同顺序(若与上文所述的替代顺序相比)排列。通过本发明可以设想到任何基于上文所述的抗原/变应原的这样重新排列的肽顺序。
[0332] 杂交体2
[0333] 通过选择完全变应原和/或最高等级的肽拼接在一起来获得下文所述的指定IMAT分子的变应原模块。
[0334] 采用下列蛋白质的组分以所述的部分1为N端的特定顺序构建杂交体2。根据下面的顺序在前述部分的C端添加其他部分。就杂交体2而言，其他部分有5个。则总共有6个部分。
[0335] 部分1：SEQ ID NO 7(Q58A71Der f 1变应原预酶前体粉尘螨(美洲房尘螨)AA 99-321)即TSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGIKDLRAFQHYDGRTIIQHDNGYQPNYHAVNIVGYGSTQGVDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM
(SEQ ID NO：97)
(SEQ ID NO：97)
[0336] 部分2：SEQ ID NO 10(Q86R84 60kDa变应原Der f 18p粉尘螨(美洲房尘螨)AA 277-304)即FTQTDGFLSYNELCVQIQAETNAFTITR(SEQ ID NO：98)
[0337] 部分3：SEQ ID NO 12(I7HDR2Zen 1蛋白质粉尘螨(美洲房尘螨)AA181-220)即EPTTPTPEPTTKTPEPTTKTPEPSTPTPEPTTKTPEPTTK(SEQ ID NO：99)
[0338] 部分4：SEQ ID NO 9(A0A088SAW7Der f 23变应原粉尘螨(美洲房尘螨)AA 22-91)即DIDHDDDPTTMIDVQTTTVQPSDEFECPTRFGYFADPKDPCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCT(SEQ ID NO：100)
[0339] 部分5：SEQ ID NO 11(Q9U6R7 98kDa HDM变应原(Der f 15变应原)(15组变应原Der f 15)粉尘螨(美洲房尘螨)AA 437-463)即SPTTPTTTPSPTTPTTTPSPTTPTTTP(SEQ ID
NO：101)
NO：101)
[0340] 部分6：SEQ ID NO 8(Q00855螨2组变应原Der f 2(变应原Der f II)(变应原Der f 2)粉尘螨(美洲房尘螨)AA 18-146)即DQVDVKDCANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANQNTKTAKIEIKASLDGLEIDVPGIDTNACHFMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKLIGDNGVLACAIATHGKIRD(SEQ ID NO：102)
[0341] 在应用实施例5和6中所述的生物工程工艺将半胱氨酸残基用稳定性最高的残基替代后，结果得到SEQ ID NO：22。
[0342] 然而，杂交体2抗原模块的上述肽组分可以以任何顺序/不同顺序(若与上文所述的替代顺序相比)排列。通过本发明可以设想到任何基于上文所述的抗原/变应原的这样重新排列的肽顺序。
[0343] 杂交体3
[0344] 采用下列蛋白质的组分以所述的部分1为N端的特定顺序构建杂交体3。根据下面的顺序在前述部分的C端添加其他部分。就杂交体3而言，其他部分有4个。则总共有5个部分。
[0345] 部分1：SEQ ID NO 7(Q58A71Der f 1变应原预酶前体粉尘螨(美洲房尘螨)AA 99-321)即TSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGIKDLRAFQHYDGRTIIQHDNGYQPNYHAVNIVGYGSTQGVDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM
(SEQ ID NO：97)
(SEQ ID NO：97)
[0346] 部分2：SEQ ID NO 10(Q86R84 60kDa变应原Der f 18p粉尘螨(美洲房尘螨)AA 277-304)即FTQTDGFLSYNELCVQIQAETNAFTITR(SEQ ID NO：98)
[0347] 部分3：SEQ ID NO 11(Q9U6R7 98kDa HDM变应原(Der f 15变应原)(15组变应原Der f 15))粉尘螨(美洲房尘螨)AA 437-463)即SPTTPTTTPSPTTPTTTPSPTTPTTTP(SEQ ID
NO：101)
NO：101)
[0348] 部分4：SEQ ID NO 8(Q00855螨2组变应原Der f 2(变应原Der f II)(变应原Der f 2)粉尘螨(美洲房尘螨)AA 18-146)即DQVDVKDCANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANQNTKTAKIEIKASLDGLEIDVPGIDTNACHFMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKLIGDNGVLACAIATHGKIRD(SEQ ID NO：102)
[0349] 在应用实施例5和6中所述的生物工程工艺将半胱氨酸残基用稳定性最高的残基替代后，结果得到SEQ ID NO：23。
[0350] 然而，杂交体3抗原模块的上述肽组分可以以任何顺序/不同顺序(若与上文所述的替代顺序相比)排列。通过本发明可以设想到任何基于上文所述的抗原/变应原的这样重新排列的肽顺序。
[0351] 本发明其他具体方面：
[0352] 本发明涉及一种氨基酸序列/经改良的MAT(iMAT)分子，其包含：
[0353] (i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸序列；
[0354] (ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子物种特异性地在细胞内靶向至细胞器的氨基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原；及
[0355] (iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自至少一种抗原(优选至少一种变应原)的至少一个完全或部分表位的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
[0356] 其特征在于，至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代，以用于一种预防和/或治疗除马科动物外的动物的一种或多种变态反应的方法和/或用于预防和/或治疗除马科动物外的动物的一种或多种传染性疾病的方法和/或用于一种防止除马科动物外的动物的一种或多种传染性疾病的传播的方法和/或用于一种防止除马科动物外的动物的一种或多种传染性疾病经载体传播的方法。
[0357] 本发明进一步涉及一种预防和/或治疗除马科动物外的动物的一种或多种变态反应的方法和/或用于预防和/或治疗除马科动物外的动物的一种或多种传染性疾病的方法
和/或用于一种防止除马科动物外的动物的一种或多种传染性疾病的(优选经载体)传播的方法，其包括施用治疗有效量的氨基酸序列/经改良的MAT(iMAT)分子，该氨基酸序列/经改良的MAT(iMAT)分子包含：
和/或用于一种防止除马科动物外的动物的一种或多种传染性疾病的(优选经载体)传播的方法，其包括施用治疗有效量的氨基酸序列/经改良的MAT(iMAT)分子，该氨基酸序列/经改良的MAT(iMAT)分子包含：
[0358] (i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸序列；
[0359] (ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子物种特异性地在细胞内靶向至细胞器的氨基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原；及
[0360] (iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自至少一种抗原(优选至少一种变应原)的至少一个完全或部分表位的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
[0361] 其特征在，至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。
[0362] 在一个具体方面，在所述至少一个抗原模块中，所有半胱氨酸残基均经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。优选地，在整个iMAT分子中，所有半胱氨酸残基均经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。
[0363] 在又一个方面，所有此类模块彼此共价连接，任选通过所述第一、第二和/或第三模中的两个或更多个(任选所有的)相邻模块之间的额外间隔模块共价连接。
[0364] 在一个优选方面，所有此类模块彼此共价连接，且该第一、第二和/或第三模块中的两个或更多个相邻模块之间根本不存在额外间隔模块。
[0365] 在另一个方面，所述至少一个第二模块包含选自犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊科动物、山羊科动物和/或猪科动物物种的不变链或其部分序列，前提条件为该至少一个第二模块功能是作为使得iMAT分子物种特异性地在细胞内靶向至细胞器的模块的作用，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原。犬科动物不变链序列优选为SEQ ID NO：2。猫科动物不变链序列优选为SEQ ID NO：3。
[0366] 在一个优选方面，所述至少一个第二模块包含根据SEQ ID NO：4(犬科动物)或SEQ ID NO：5(猫科动物)的氨基酸序列，优选由根据SEQ ID NO：4(犬科动物)或SEQ ID NO：5(猫科动物)的氨基酸序列组成。SEQ ID NO：4和5分别代表SEQ ID NO：2和3的不变链的110个氨基酸。
[0367] 在另一个优选方面，所述至少一个第二模块包含根据SEQ ID NO：4(犬科动物)或SEQ ID NO：5(猫科动物)的氨基酸序列或其片段(优选由其所组成)，前提条件为这些片段仍保持它们的胞内转运功能。
[0368] 在又一个方面，所述至少一个抗原模块包含衍生自至少一种引起除马科动物外的动物的变态反应的变应原的至少一个完全或部分氨基酸序列(优选表位)，优选至少一种优选衍生自如下变态反应的变应原的至少一个完全或部分氨基酸序列(优选表位)：对跳蚤叮咬的变态反应，优选在狗和/或猫中；对某些食物成分的变态反应，优选在狗和/或猫中；特应性皮炎，优选在狗和/或猫中；气道变应性炎症和/或阻塞，优选在猫中。
[0369] 在一个优选方面，此类至少一种抗原(优选至少一种变应原)为根据SEQ ID NO:11或18的Der f 15变应原。在一个优选方面，此类至少一种抗原包含SEQ ID NO:18，优选由SEQ ID NO:18所组成。
[0370] 在一个具体方面，此类至少一种抗原(优选至少一种变应原)衍生自食物和/或霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、室内尘埃或饲料螨(和/或其粪便)和/或跳蚤，优选来自树、草、草本、豚草的花粉和/或十字花科花粉和/或曲霉菌属、链格孢菌属、灰霉菌属、尾孢菌属、枝孢菌属、弯孢菌属、内脐蠕孢菌属、散囊菌属、麦类胡麻叶枯病菌属、附球孢菌属、白粉菌属/粉孢菌属、镰孢菌属、横梗霉属、黑孢菌属、青霉菌属、黑团孢菌属、霜霉菌属、浪梗霉菌属、糖多孢菌属(此前也称作干草菌属或小多孢菌属)、高温放线菌属、匍柄霉菌属、圆酵母属的真菌和/或其孢子和/或粉螨属、糖螨属、食酪螨属、尘螨属、嗜霉螨属、嗜鳞螨属、无爪螨属的螨(和/或其粪便)和/或角叶蚤属、栉首蚤属、蚤属、昔蚤属的跳蚤，更优选为尘螨属变应原。
[0371] 在又另一个具体方面，所述至少一个抗原模块包含衍生自至少一种引起除马科动物外的动物的一或多种传染性疾病的病原体的抗原的至少一个完全或部分氨基酸(优选表位)，优选至少一种选自弯曲杆菌属、恶丝虫属、埃利希氏体属、利什曼原虫属、锥虫属、疏螺旋体属、布尼亚病毒属、环状病毒属、黄病毒属、轮状病毒属、冠状病毒属、毛癣菌属、小孢子菌属、古柏线虫属、血矛线虫属、胃线虫属、毛圆线虫属、网尾线虫属、后圆线虫属、艾美虫属、等孢子球虫属、隐孢子虫属、贾第鞭毛虫属的、引起除马科动物外的动物的一或多种传染性疾病的病原体的抗原的至少一个完全或部分氨基酸(优选表位)，其中优选所述至少一个抗原模块也可以是参与除马科动物外的动物的一或多种传染性疾病传播的载体的抗原，优选选自载体(选自食血虫、苍蝇、蠓、扁虱和/或蚊子)的唾液组分的抗原。
[0372] 在一个优选方面，所述iMAT分子进一步包含至少一个标签模块，优选至少一个His标签。优选地，该至少一个标签模块存在于N端。在另一个优选的具体方面，该至少一个标签模块存在于C端。在另一个优选的具体方面，该至少一个标签模块存在于N端和C端。
[0373] 在一个具体优选方面，所述iMAT分子包含一个标签模块，优选一个His标签，其位于一个甲硫氨酸残基后的N端。
[0374] 在另一个优选的具体方面，在所述iMAT分子中不存在标签。
[0375] 在又一个方面，所述至少一个第一模块包含HIV-tat、VP22和/或触角足蛋白的氨基酸序列或其部分序列(优选由其所组成)，前提条件为该至少一个第一模块功能是作为使iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部中的模块，其最优选为氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：1)。
[0376] 在另一个方面，所述iMAT分子以单体形式和/或线性形式存在。
[0377] 在又一个方面，至少一个第三模块包含SEQ ID NO：14至23中的任何一个，优选由SEQ ID NO：14至23中的任何一个组成。
[0378] 在一个优选方面，所述iMAT分子包含根据SEQ ID NO：24至83的氨基酸序列中的一个或多个，优选由SEQ ID NO：24至83的氨基酸序列中的一个或多个组成。
[0379] 特别优选的iMAT分子包含SEQ ID NO：36(猫的Der f15iMAT分子)或SEQ ID NO：57(狗的Der f15iMAT分子)，优选由SEQ ID NO：36(猫的Der f15iMAT分子)或SEQ ID NO：57(狗的Der f15iMAT分子)组成。进一步优选的iMAT分子(包含N端His标签)选自由SEQ ID NO：24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81组成的组。进一步优选的iMAT分子(包含C端His标签)选自由SEQ ID NO：25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、
55、58、61、64、67、70、73、76、79、82组成的组。进一步优选的iMAT分子(无His标签)选自由SEQ ID NO：26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83组成的组。
55、58、61、64、67、70、73、76、79、82组成的组。进一步优选的iMAT分子(无His标签)选自由SEQ ID NO：26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83组成的组。
[0380] 进一步优选的iMAT分子(杂交/嵌合样iMAT)选自由SEQ ID NO：66至83组成的组。进一步优选的杂交iMAT分子为66、69、72、75、78、81(带有N端His标签)。特别优选为SEQ ID NO：66和/或75。进一步优选的具体杂交iMAT分子为67、70、73、76、79、82(带有C端His标签)。
特别优选为SEQ ID NO：67和/或76。进一步优选的具体杂交iMAT分子为68、71、74、77、80、83(无His标签)。特别优选为SEQ ID NO：68和/或77。
特别优选为SEQ ID NO：67和/或76。进一步优选的具体杂交iMAT分子为68、71、74、77、80、83(无His标签)。特别优选为SEQ ID NO：68和/或77。
[0381] 在又一个方面，所述动物选自反刍动物，包括牛、山羊、绵羊，如牛属、山羊属、羊属中的成员，犬属中的成员，如狗、狼、狐狸、土狼、豺狼，猫属中的成员，如狮子、老虎、家猫、野猫、其他大型猫科动物以及其他包括猎豹和山猫在内的猫科动物，和/或猪属中的成员，如猪，其中优选所述动物选自猫和/或狗。
[0382] 本发明涉及一种氨基酸序列，其包含：
[0383] (i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸序列，优选所述第一模块包含SEQ ID NO：1，更优选由SEQ ID NO：1组成；
[0384] (ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子物种特异性地在细胞内靶向至细胞器的氨基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原，优选经加工的抗原，优选所述第二模块包含SEQ ID NO：4或5，更优选由SEQ ID NO：4或5组成；
[0385] (iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自至少一种抗原(优选至少一种变应原)的至少一个完全或部分氨基酸序列(优选表位)的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
[0386] 其特征在于，至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。所述第三模块包含SEQ ID NO：14至23中的任何一个，更优选由SEQ ID NO：14至23中的任何一个组成。
[0387] 本发明涉及一种经改良的MAT(iMAT)分子，其包含：
[0388] (i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸序列，优选所述第一模块包含SEQ ID NO：1，更优选由SEQ ID NO：1组成；
[0389] (ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子物种特异性地在细胞内靶向至细胞器的氨基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原，优选经加工的抗原，优选所述第二模块包含SEQ ID NO：4或5，更优选由SEQ ID NO：4或5组成；
[0390] (iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自至少一种抗原(优选至少一种变应原)的至少一个完全或部分氨基酸序列(优选表位)的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
[0391] 其特征在于，至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。所述第三模块包含SEQ ID NO：14至23中的任何一个，更优选由SEQ ID NO：14至23中的任何一个组成。
[0392] 在一个具体方面，在所述至少一个抗原模块中，所有半胱氨酸残基均经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代，优选地，在整个iMAT分子中，所有半胱氨酸残基均经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。
[0393] 在又一个方面，所有此类模块彼此共价连接，任选通过所述第一、第二和/或第三模中的两个或更多个(任选所有的)相邻模块之间的额外间隔模块共价连接。
[0394] 在一个优选方面，所有此类模块彼此共价连接，且该第一、第二和/或第三模块中的两个或更多个相邻模块之间根本不存在额外间隔模块。
[0395] 在另一个优选方面，所述至少一个第二模块包含根据SEQ ID NO：4(犬科动物)或SEQ ID NO：5(猫科动物)的氨基酸序列或其片段(优选由其所组成)，前提条件为这些片段仍保持它们的胞内转运功能。SEQ ID NO：4和5分别代表SEQ ID NO：2和3的不变链的110个氨基酸。在一个更优选的方面，所述至少一个第二模块包含根据SEQ ID NO：4(犬科动物)或SEQ ID NO：5(猫科动物)的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：4(犬科动物)或SEQ ID NO：5(猫科动物)的氨基酸序列组成。
[0396] 在又一个方面，所述至少一个抗原模块包含衍生自至少一种引起除马科动物外的动物的变态反应的变应原的至少一个完全或部分氨基酸序列(优选表位)，优选至少一种优选衍生自如下变态反应的变应原的至少一个完全或部分氨基酸序列(优选表位)：对跳蚤叮咬的变态反应，优选在狗和/或猫中；对某些食物成分的变态反应，优选在狗和/或猫中；特应性皮炎，优选在狗和/或猫中；气道变应性炎症和/或阻塞，优选在猫中。
[0397] 在一个具体方面，此类至少一种抗原包含根据SEQ ID NO:11或18的氨基酸序列。在一个优选方面，此类至少一种抗原(优选至少一种变应原)为根据SEQ ID NO:11或18的
Der f 15变应原。在另一个优选方面，此类至少一种抗原包含SEQ ID NO:18，优选由SEQ ID NO:18组成。
Der f 15变应原。在另一个优选方面，此类至少一种抗原包含SEQ ID NO:18，优选由SEQ ID NO:18组成。
[0398] 在又一个优选方面，所述iMAT分子包含根据SEQ ID NO：24至83的(一个)氨基酸序列(那些替代物中的一个)。在又一个优选方面，所述iMAT分子包含(优选由其所组成)SEQ ID NO：36-38中的任何一个(猫的Der f15iMAT分子)，最优选SEQ ID NO：36，或者所述iMAT分子包含(优选由其所组成)SEQ ID NO：57-59中的任何一个(狗的Der f15iMAT分子)，最优选SEQ ID NO：57。
[0399] 在一个优选方面，所述iMAT分子进一步包含至少一个标签模块，优选至少一个His标签。优选地，该至少一个标签模块存在于N端。在一个具体优选方面，所述iMAT分子包含一个标签模块，优选一个His标签，其位于一个甲硫氨酸残基后的N端。
[0400] 优选的带有N端His标签的iMAT分子包含SEQ ID NO：24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81中的任何一个，优选由SEQ ID NO：24、27、30、33、
36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81中的任何一个组成。
36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81中的任何一个组成。
[0401] 在另一个具体优选方面，该至少一个标签模块存在于C端。在另一个具体优选方面，该至少一个标签模块存在于N端和C端。优选的带有C端His标签的iMAT分子包含SEQ ID NO：25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82中的任何一个，优选由SEQ ID NO：25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82中的任何一个组成。
[0402] 在另一个具体优选方面，不存在标签模块。优选的无His标签的iMAT分子包含SEQ ID NO：26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83中的任何一个，优选由SEQ ID NO：26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83中的任何一个组成。
[0403] 在又一个方面，所述至少一个第一模块包含HIV-tat、VP22和/或触角足蛋白的氨基酸序列或其部分序列(优选由其所组成)，前提条件为该至少一个第一模块功能是作为使iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部中的模块，其最优选为氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：1)。
[0404] 在另一个方面，所述iMAT分子以单体形式和/或线性形式存在。
[0405] 在又一个具体方面，所述iMAT分子是杂交iMAT分子(嵌合样iMAT分子)。优选地，这种杂交iMAT分子包含根据SEQ ID NO：21至23中的任何一个的氨基酸序列。最优选地，这种杂交iMAT分子包含根据SEQ ID NO：66至83中的任何一个的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：66至83中的任何一个的氨基酸序列组成。
[0406] 此外，本发明还涉及一种氨基酸序列，其包含根据SEQ ID NO：24至83的氨基酸序列中的一个或多个，优选由SEQ ID NO：24至83的氨基酸序列中的一个或多个组成。
[0407] 本发明进一步涉及一种iMAT分子，其包含根据SEQ ID NO：24至83的氨基酸序列中的一个或多个，优选由SEQ ID NO：24至83的氨基酸序列中的一个或多个组成。
[0408] 本发明进一步涉及一种氨基酸序列/iMAT分子，其包含一个或多个选自由SEQ ID NO：24至83所组成的组的氨基酸序列，优选由一个或多个选自由SEQ ID NO：24至83所组成的组的氨基酸序列组成。
[0409] 特别优选的氨基酸序列/iMAT分子包含SEQ ID NO：36(猫的Der f15iMAT分子)或SEQ ID NO：57(狗的Der f15iMAT分子)。进一步优选的氨基酸序列/iMAT分子(包含N端His标签)选自由SEQ ID NO：24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、
78、81组成的组。进一步优选的氨基酸序列/iMAT分子(包含C端His标签)选自由SEQ ID NO：
25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82组成的组。进一步优选的氨基酸序列/iMAT分子(无His标签)选自由SEQ ID NO：26、29、32、35、38、41、44、47、50、
53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83组成的组。
78、81组成的组。进一步优选的氨基酸序列/iMAT分子(包含C端His标签)选自由SEQ ID NO：
25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82组成的组。进一步优选的氨基酸序列/iMAT分子(无His标签)选自由SEQ ID NO：26、29、32、35、38、41、44、47、50、
53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83组成的组。
[0410] 进一步优选的氨基酸序列/iMAT分子(杂交/嵌合样iMAT)选自由SEQ ID NO：66至83组成的组。进一步优选的杂交iMAT分子为66、69、72、75、78、81(带有N端His标签)。进一步优选的杂交iMAT分子为67、70、73、76、79、82(带有C端His标签)。进一步优选的杂交iMAT分子为68、71、74、77、80、83(无His标签)。
[0411] 本发明涉及一种氨基酸序列/经改良的MAT(iMAT)分子，其包含：
[0412] (i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸序列，优选所述第一模块包含SEQ ID NO：1，更优选由SEQ ID NO：1组成；
[0413] (ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子在细胞内物种特异性地靶向至细胞器的氨基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原，优选经加工的抗原，优选所述第二模块包含SEQ ID NO：4或5，更优选由SEQ ID NO：4或5组成；
[0414] (iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、84、85、86、87和88组成的组中的两个或更多个抗原的任意组合的至少一个完全或部分氨基酸序列(优选表位序列)的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
[0415] 其特征在于，至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。
[0416] 在一个优选方面，所述抗原模块是衍生自选自由SEQ ID NO：10、11、84、85、86、87和88组成的组中的两个或更多个抗原的任意组合的至少一个完全或部分氨基酸序列(优选表位序列)的氨基酸序列(杂交体1)。
[0417] 在一个优选方面，所述抗原模块是衍生自选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12组成的组中的两个或更多个抗原的任意组合的至少一个完全或部分氨基酸序列(优选表位序列)的氨基酸序列(杂交体2)。
[0418] 在一个具体方面，所述抗原模块是衍生自选自由SEQ ID NO：7、8、10和11组成的组中的两个或更多个抗原的任意组合的至少一个完全或部分氨基酸序列(优选表位序列)的氨基酸序列(杂交体3)。
[0419] 因此，本发明具体涉及一种氨基酸序列/经改良的MAT(iMAT)分子，其包含：
[0420] (i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸序列，优选所述第一模块包含SEQ ID NO：1，更优选由SEQ ID NO：1组成；
[0421] (ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子在细胞内物种特异性地靶向至细胞器的氨基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原，优选经加工的抗原，优选所述第二模块包含SEQ ID NO：4或5，更优选由SEQ ID NO：4或5组成；
[0422] (iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是基于衍生自SEQ ID NO：84的主链、包含一种或多种根据SEQ ID NO：91至96(以任何顺序)的包埋在所述主链序列中的肽的任意组合的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
[0423] 其特征在于，至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。
[0424] 在一个优选方面，所述第三模块中的衍生自SEQ ID NO：84的主链内的肽序列的顺序如下：自N端起，依次为SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96。在一个最优选的方面，所述第三模块包含SEQ ID NO：21，优选由SEQ ID NO：21组成。
[0425] 在又一个优选方面，所述第三模块中的衍生自SEQ ID NO：84的主链内的肽序列的顺序如下：自N端起，依次为SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：95。本发明的另一些方面涉及根据SEQ ID NO：91至96的包埋在衍生自SEQ ID NO：84的主链序列中的肽的任意其他组合及顺序。
[0426] 因此，本发明进一步涉及一种氨基酸序列/经改良的MAT(iMAT)分子，其包含：
[0427] (i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸序列，优选所述第一模块包含SEQ ID NO：1，更优选由SEQ ID NO：1组成；
[0428] (ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子在细胞内物种特异性地靶向至细胞器的氨基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原，优选经加工的抗原，优选所述第二模块包含SEQ ID NO：4或5，更优选由SEQ ID NO：4或5组成；
[0429] (iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自根据SEQ ID NO：97至102(以任何顺序)的肽中的两种或更多种的任意组合的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
[0430] 其特征在于，至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。在一个优选方面，所述第三模块中的肽序列的顺序如下：自N端起，依次为SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102。在一个最优选的方面，所述第三模块包含SEQ ID NO：22，优选由SEQ ID NO：22组成。
[0431] 在又一个具体方面，所述第三模块中的肽序列的顺序如下：自N端起，依次为SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：97。本发明的另一些方面涉及根据SEQ ID NO：97至102的肽的任意其他组合及顺序。
[0432] 因此，本发明另外还涉及一种氨基酸序列/经改良的MAT(iMAT)分子，其包含：
[0433] (i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸序列，优选所述第一模块包含SEQ ID NO：1，更优选由SEQ ID NO：1组成；
[0434] (ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子在细胞内物种特异性地靶向至细胞器的氨基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原，优选经加工的抗原，优选所述第二模块包含SEQ ID NO：4或5，更优选由SEQ ID NO：4或5组成；
[0435] (iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自根据SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：101及SEQ ID NO：102(以任何顺序)的肽中的两种或更多种的任意组合的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性；
[0436] 其特征在于，至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和/或天冬氨酸取代。在一个优选方面，所述第三模块中的肽序列的顺序如下：自N端起，依次为SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102。在一个最优选的方面，所述第三模块包含SEQ ID NO：23，优选由SEQ ID NO：23组成。
[0437] 在又一个具体方面，所述第三模块中的肽序列的顺序如下：自N端起，依次为SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：97。本发明的另一些方面涉及根据SEQ ID NO：97、98、101及102的肽的任意其他组合及顺序。
[0438] 本发明进一步涉及一种疫苗或免疫原性组合物或一种药物组合物，其包含根据本发明的氨基酸序列/iMAT分子。
[0439] 此外，本发明还涉及一种编码根据本发明的氨基酸序列/iMAT分子的核酸。
[0440] 另外，本发明还涉及包含至少一种根据本发明的核酸的载体。
[0441] 此外，本发明还涉及一种包含至少一种根据本发明的核酸和/或至少一种根据本发明的载体的原代细胞或细胞系。
[0442] 另外，本发明还涉及一种鉴定经改良的MAT分子的方法，其包括以下步骤：
[0443] a)选取作为iMAT分子中的变应原模块的蛋白质；和
[0444] b)用所述变应原构建热力学稳定及能够通过蛋白质改造高效生产的iMAT分子。
[0445] 具体而言，本发明涉及一种鉴定经改良的MAT分子的方法，其包括以下步骤：
[0446] a)选取作为iMAT分子中的变应原模块的蛋白质，该蛋白质为变应原，因此有较高可能性引起受感染对象的过敏反应，从而也能够作为耐受诱导的目标；和
[0447] b)用所述的变应原构件iMAT分子，使得该iMAT分子具有热力学稳定性，能够通过蛋白质改造高效生产，另外还能够用标准方法分析以确定足够好的品质(即同一性、纯度及效力)。
[0448] 在所述方法的一个具体方面，步骤a)包括：
[0449] -基于衍生自给定蛋白质的肽与已知变应原性蛋白质的局部同源性检索选取变应原；
[0450] -从公共数据库(例如UNIPROT)中导出疑似具有变应原性质的蛋白质的氨基酸序列；
[0451] -通过分析导出的数据集中的序列的同源性确定冗余；
[0452] -消除高同源性序列对应物(余下的序列用作可能有效的抗原的规范序列数据库用于后续分析；
[0453] -以计算机模拟方式将蛋白质裂解成长度为6至15个氨基酸的肽(其中一个氨基酸移位)；
[0454] -进行蛋白质及对应的肽的局部成对比对；
[0455] -通过设定给定蛋白质相对一者的自比对评分及相应地对应肽的比对命中来进行所获得比对命中的缩放；
[0456] -对每个肽的超过给定阈值的比对命中计数；
[0457] 将局部成对比对与随机生成的没有已知变应原性质的蛋白质序列的数据库相比较；
[0458] -对命中进行缩放和计数；
[0459] -将“非变应原性蛋白质”计数从变应原结果中的那些减去；
[0460] -基于所有对应的肽的命中的次数计算各个蛋白质的累计命中评分；
[0461] -选取最高计数的蛋白质作为候选iMAT抗原模块。
[0462] 在所述方法的一个具体方面，步骤b)包括鉴定预定氨基酸序列中的使得该预定氨基酸序列稳定的氨基酸取代，优选包括以下步骤：
[0463] (i)建立标靶预定氨基酸序列的三维/三级结构的模型；
[0464] (ii)基于单点取代，如改由不同氨基酸残基，优选丝氨酸和/或异亮氨酸残基取代半胱氨酸残基来反复确定蛋白质稳定性，及基于蛋白质稳定性自由能改变(ΔΔG)的评分系统通过分析所有可取的三维/三级氨基酸序列结构来确定稳定的取代；
[0465] (iii)通过重复步骤(ii)及(iii)对取代的三维/三级氨基酸序列结构重建模及计算其稳定性直到达成稳态。
[0467] 图1：示出了MAT-Fel d1(IVN201)在还原条件下的SDS-PAGE；A)初始SDS-PAGE(10μg蛋白质/泳道，考马斯染色)及B)具有已从凝胶A中切除及重新加载于SDS-PAGE上的谱带的SDS-PAGE(银染色)。
[0468] 图2：示出了Fel d1在还原条件下的SDS-PAGE； 4-12％Bis-Tris凝胶。泳道：1)标记物：SeeBlue Plus2预染色标准；2)5μg Fel d1；3)5μg Fel d1。
[0469] 图3：示出了RP-HPLC层析图，0.1％TFA/乙腈梯度a)不含添加剂的天然蛋白质(MAT-Fel d1)(左图)；b)通过添加氯化胍加上DTT变性的MAT-Fel d1(右图)。
[0470] 图4：描绘了MAT-Fel d1分子及其Kyte Doolittle疏水性图。
[0471] 图5：示出了 SDS-PAGE-系统(4至12％Bis-Tris凝胶，1×MES-运行缓冲液，35分钟，200V)。泳道：1)溶菌酶，1μg蛋白质ox。2)PageRuler预染色蛋白梯；3)经碘乙酰胺氧化的MAT-Fel d1(5μg)(ox.)；4)iMAT-Cul o4(ox.)；5)PageRuler预染色蛋白梯；6)还原的MAT-Fel d1(5μg)；7)还原的iMAT-Cul o4；8)还原的溶菌酶。
[0472] 图6：示出了RP-HPLC层析图，0.1％TFA/乙腈梯度。峰反映不含添加剂之天然(经氧化)蛋白质(iMAT-Cul o4)。
[0473] 图7：示出了随后实验的结果：在RT下培养30分钟同时轻轻地混合的蛋白质及Adju- 在培养之后，将样品离心3分钟，并在随后进行SDS-Page分析。泳道1)
pageRuler预染色蛋白梯；2)iMAT-Cul o3上清液；3)在尿素中的iMAT-Cul o3细胞小球；4)iMAT-Cul o3上清液；5)在尿素中的iMAT-Cul o3细胞小球；6)空白；7)iMAT-Cul o2上清液；
8)在尿素中的iMAT-Cul o2细胞小球；9)iMAT-Cul o2上清液；10)在尿素中的iMAT-Cul o2细胞小球；11)空白；12)iMAT-Cul o4上清液；13)在尿素中的iMAT-Cul o4细胞小球；14)iMAT-Cul o4上清液；15)在尿素中的iMAT-Cul o4细胞小球；(2、3、7、8、12、13w/o冻融)；(4、
5、9、10、14、15系在两次冻融制程之后)。
pageRuler预染色蛋白梯；2)iMAT-Cul o3上清液；3)在尿素中的iMAT-Cul o3细胞小球；4)iMAT-Cul o3上清液；5)在尿素中的iMAT-Cul o3细胞小球；6)空白；7)iMAT-Cul o2上清液；
8)在尿素中的iMAT-Cul o2细胞小球；9)iMAT-Cul o2上清液；10)在尿素中的iMAT-Cul o2细胞小球；11)空白；12)iMAT-Cul o4上清液；13)在尿素中的iMAT-Cul o4细胞小球；14)iMAT-Cul o4上清液；15)在尿素中的iMAT-Cul o4细胞小球；(2、3、7、8、12、13w/o冻融)；(4、
5、9、10、14、15系在两次冻融制程之后)。
[0474] 图8：示出了相应的融合蛋白质的一般部分[即，不含相应的抗原模块]中MAT分子相对iMAT分子的Kyte-Doolittle疏水性图。疏水性指数相对在X轴上的氨基酸位置显示在Y轴上。指数的正数值指示疏水性。在疏水性图开始处iMAT分子的图相对MAT分子的图的位移归因于iMAT分子中N端额外存在His标签和一个甲硫氨酸残基以及不存在任何间隔模块所致。
[0475] 图9：示出了尘螨属变应原的实例，标识了物种、变应原及uniprot寄存号。(a)源自屋尘螨的变应原，(b)源自粉尘螨的变应原。
[0476] 图10：示出了狗和猫的不变链的N端序列比对。CLIP序列以灰色阴影示出。
[0477] 图11：示出了5种浓度的iMAT-Cul o2和iMAT-Cul o3以及多重致变态反应化的马(马1)中的相应的变应原的组胺释放测试(分析的详细内容可参见实例2)。
实施例
实施例
[0478] 下列实施例用于进一步说明本发明，但其不应理解为对本文所公开的本发明范围的限制。
[0479] 实施例1-免疫性/免疫性持续时间的替代标记
[0480] 将本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质施用给动物(例如，反刍动物、猪，更优选狗和/或猫，但马科动物除外)，对存在于抗原模块中的变应原和/或表位产生了免疫学反应。另外，可使用C端或N端标签(例如HIS标签)、TAT模块连同来自相邻模块的相邻氨基酸残基一起来检测可用作用于免疫性或免疫性持续时间的替代标记的目标对象中独
特的产物特异性免疫学信号(例如，抗体或T细胞反应)。作为一个治疗特异性免疫学参数，该替代标记可实现评估施用后的免疫性或免疫调节或免疫性持续时间或免疫调节持续时
间。因此，用于由根据本发明的(经分离的)重组蛋白质所触发的免疫应答的特异性指标为诱导末端标签(任选与相邻氨基酸残基)特异性抗体，如IgG抗体。作为选择地或者作为附加地，指标为诱导对间隔物及本文公开并要求保护的模块的接合或两个模块之间的接合特异性的抗体。
特的产物特异性免疫学信号(例如，抗体或T细胞反应)。作为一个治疗特异性免疫学参数，该替代标记可实现评估施用后的免疫性或免疫调节或免疫性持续时间或免疫调节持续时
间。因此，用于由根据本发明的(经分离的)重组蛋白质所触发的免疫应答的特异性指标为诱导末端标签(任选与相邻氨基酸残基)特异性抗体，如IgG抗体。作为选择地或者作为附加地，指标为诱导对间隔物及本文公开并要求保护的模块的接合或两个模块之间的接合特异性的抗体。
[0481] 采用根据本发明的如SEQ ID NO：57(带有N端六聚组氨酸标签的Der f 15iMAT分子(狗))等单一iMAT分子或一个或若干选自SEQ ID NO：45、51、54、57、60、63、66、69、72的包含不同抗原模块的iMAT分子的组合来治疗性或预防性地治疗患有或处于变应性疾病尤其
是特应性皮炎风险下的狗。在这些狗中，上述iMAT分子如实施例3中所述进行施用。在源自从这些用iMAT治疗的狗中抽取的血液的血清样品中，能够对iMAT处理时iMAT蛋白质N端的相对于抗体产生(更具体为特异性IgG)的免疫反应进行测定。所述测定采用标准ELISA(酶联免疫吸附测定)技术，其中在酶标板的表面上包被足够量的包含SEQ ID NO：6的合成肽。
然后，在这些酶标板上培养治疗动物的血清样品，随后通过第二生物素化抗体检测到IgG特异性结合至所述肽上，具体对于分别为猫和狗中的IgG，接着应用对应的检测系统例如链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)作为底物。
是特应性皮炎风险下的狗。在这些狗中，上述iMAT分子如实施例3中所述进行施用。在源自从这些用iMAT治疗的狗中抽取的血液的血清样品中，能够对iMAT处理时iMAT蛋白质N端的相对于抗体产生(更具体为特异性IgG)的免疫反应进行测定。所述测定采用标准ELISA(酶联免疫吸附测定)技术，其中在酶标板的表面上包被足够量的包含SEQ ID NO：6的合成肽。
然后，在这些酶标板上培养治疗动物的血清样品，随后通过第二生物素化抗体检测到IgG特异性结合至所述肽上，具体对于分别为猫和狗中的IgG，接着应用对应的检测系统例如链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)作为底物。
[0482] 通过这种ELISA试验，随着时间对由iMAT免疫治疗引发的免疫性的发作以及免疫性的持续时间进行确定及观察。在临床开发过程中通过这一替代参数确定治疗接种方案，即强化注射的次数及时间表。
[0483] 实施例2-低变应原性
[0484] 治疗性变应原的变应原性至关重要，它是衡量诱发不良事件，例如激起过敏性反应的可能性的尺度。以哺乳动物中变应原为示例，在作为反应原激发试验，特别是针对皮肤的那些试验的过程中，对变应原特异性IgE介导过敏反应进行研究[Griffin CE.Diagnosis of canine atopic dermatitis DOI:10.1002/9781118738818.ch10]。
[0485] 使用皮内试验对重组变应原进行生物学评价及对基因改造的低变应原性衍生物进行验证。
[0486] 通过对狗的真皮层直接实施多次小剂量的变应原溶液注射，从而进行狗的皮内试验。这是通过使用小号(27号)注射针及在各部位进行0.05-0.1mL注射而完成的。阳性反应任意地通过红斑的出现、小疙瘩的膨胀度、高度和大小来体现。
[0487] 皮内试验的优点是灵敏性较高。若测试是为变应原性提供一个定量测度，则这是尤为重要的。在所述试验中，与用于同一试验中的自然的、天然的变应原相比，iMAT分子表现出变应原性组分具有10倍、100至1000倍甚至更高的摩尔浓度，从而达到在致敏个体，例如猫和狗中的阳性反应。
[0488] 针对MAT分子，在现有技术中已报告了关于它们的变应原性与相应的天然变应原相比的矛盾的结果。Senti G.等人(J Allergy Clin Immunol.2012,129(5):1290-1296)在细胞抗原刺激测试(CAST)测定以及在皮内注射和在皮内试验中证明了MAT-Fel d1的低变
应原性。变应原和包括Fel d1的MAT分子之间的灵敏度的定量差异分别为100、23和16倍。虽然MAT-Fel d1显然是低变应原性的，但仍保持一些变应原性。相比之下，赵某等人(Int J临床与实验医学2015；8(4)：6436-6443)描述其MAT-Der p1构建物与Der p1蛋白质相比将显示出甚至更强的变应原性(超变应原性)。
应原性。变应原和包括Fel d1的MAT分子之间的灵敏度的定量差异分别为100、23和16倍。虽然MAT-Fel d1显然是低变应原性的，但仍保持一些变应原性。相比之下，赵某等人(Int J临床与实验医学2015；8(4)：6436-6443)描述其MAT-Der p1构建物与Der p1蛋白质相比将显示出甚至更强的变应原性(超变应原性)。
[0489] 出乎意料地，本文所公开并要求保护的经改良的MAT分子在这方面表现出明显的优越性。测试2种根据本发明制得的在抗原模块中分别包含Cul o2及Cul o3的iMAT分子的安全性。在如下所述的组胺释放试验(HRT)中采用被这些变应原致敏、患有昆虫叮咬过敏(IBH)的马的新抽取的血液。
[0490] 如图11所示，天然变应原引发强烈的组胺释放，而出乎意料地，这两个不同的iMAT分子(iMAT-Cul o3和iMAT-Cul o2)表现出实质上根本没有反应。
[0491] 因此，与现有技术中所描述的MAT分子(见上文)相比，iMAT分子在安全方面表现出明显的优越性。
[0492] 组胺释放试验(HRT)：准备对象的新抽取的血液以测试对本文公开并要求保护的(经分离的)重组蛋白质/iMAT分子的嗜碱细胞反应性。简言之，iMAT分子和/或重组变应原的10倍系列稀释(例如，范围自10nM至0.001nM最终变应原浓度)在PIPES缓冲液
(AppliChem，德国达姆斯塔特)(pH 7.4)中制得。在37℃利用个别稀释液培养自Na-EDTA凝结抑制的血液获得的经洗涤的红血球及白血球1小时。通过在冰上培养20分钟停止反应及在离心之后自各样品收集包含所释放组胺的上清液。通过在水浴中煮沸血液细胞维持10分钟，获得最大组胺含量(最大释放)。以经洗涤的血液细胞培养释放缓冲液作为阴性对照组(自发释放)。使用竞争性RIA(LDN Nordhorn，德国)按照制造商指示来测定组胺浓度。
(AppliChem，德国达姆斯塔特)(pH 7.4)中制得。在37℃利用个别稀释液培养自Na-EDTA凝结抑制的血液获得的经洗涤的红血球及白血球1小时。通过在冰上培养20分钟停止反应及在离心之后自各样品收集包含所释放组胺的上清液。通过在水浴中煮沸血液细胞维持10分钟，获得最大组胺含量(最大释放)。以经洗涤的血液细胞培养释放缓冲液作为阴性对照组(自发释放)。使用竞争性RIA(LDN Nordhorn，德国)按照制造商指示来测定组胺浓度。
[0493] 或者，另一嗜碱细胞活化试验为细胞抗原刺激测试 ELISA，其也可以被视为是体外变态反应激发试验。根据制造商指示(Bühlmann Laboratories AG，瑞士阿勒斯海姆)来进行此测定。在 中，从变态反应对象血液沉淀出的白血球同时获得细胞激素
IL-3并通过iMAT分子和/或重组变应原刺激。嗜碱细胞等产生出变态反应性介质、硫化白细胞三烯LTC4及其代谢产物LTD4和LTE4。随后，在ELISA试验(酶联免疫吸附测定)中测定此类新合成的硫化白细胞三烯(sLT)。
IL-3并通过iMAT分子和/或重组变应原刺激。嗜碱细胞等产生出变态反应性介质、硫化白细胞三烯LTC4及其代谢产物LTD4和LTE4。随后，在ELISA试验(酶联免疫吸附测定)中测定此类新合成的硫化白细胞三烯(sLT)。
[0494] 可利用此类试验，通过仅比较iMAT分子(包含变应原)及仅相应的重组变应原的效应来体外评估iMAT分子引起不良事件，例如作为施用副作用的激发变态反应性反应的可能性。
[0495] 与重组变应原相比，通过iMAT分子降低的嗜碱细胞去颗粒(例如，组胺和/或硫化白细胞三烯释放)表明不良效应的较低可能性，即，iMAT分子的安全性特性更好。
[0496] 该HRT(或 )可用作用于对象的1型变态反应的体外激发试验。变应原特异性组胺释放指示各个变应原针对嗜碱细胞活化的相关性及因此可用作用于对象的变应原
特异性敏化的定量参数。
特异性敏化的定量参数。
[0497] 可预期若患有变应原特异性IgE介导过敏的对象用相应的在iMAT-抗原模块中包含相关变应原的iMAT分子进行治疗，则不发生与变应原相关的不良反应。这使得应用iMAT蛋白质的脱敏疗法特别适合于治疗危及生命的疾病。
[0498] 与MAT分子不同，iMAT分子的这一出乎意料的安全性特性的结果是，用作脱敏蛋白质的iMAT分子能够类似于抗病原体疫苗来使用。由于包含iMAT分子的疫苗并没有表现出在变应性不良事件方面的变应原特性，因此不需要像传统治疗性变应原那样增加剂量。已经仅基于疗效考虑选定了治疗疗程中iMAT分子的首次注射剂量，因此没有必要再考虑可能的变应性不良反应。这不可使用现有技术中所描述的MAT分子来进行，这是因为与天然变应原相比MAT的变应原性仅降低至一定水平。然而，MAT分子仍然是变应原，但相比之下，iMAT分子却不是。这一改良的性质的优点是可通过例如以高生物医药含量三次皮下或淋巴管内注射(例如，3次，1μg至100μg，优选3次，10μg至50μg iMAT蛋白质)实现更有效的治疗疗程。
[0499] 所述iMAT分子的变应原性的缺乏可用如下事实来解释：即，与现有技术中描述的MAT分子不同，不使用接头氨基酸残基[即，介于第一、第二和/或第三模块之间的间隔模块]来分隔此类iMAT分子中的不同模块。现有技术中已知包含两种或更多种经肽或蛋白质接头接合的功能性多肽的改造融合蛋白质对于蛋白质的功能(例如，通过免疫系统识别表位)具重要作用[Klein JS et al.,Protein Eng Des Sel.2014,27(10):325-330]。功能性单元之间的分隔距离可影响表位进入及以抗体亲抗原性结合能力。假若模块之间，具体为靶向结构域与抗原模块之间，缺失氨基酸残基接头，则获得更刚性的结构，可能因不正确折叠而无法形成变应原模块的构象表位。必需使嗜碱细胞(例如IgE)表面上以其高亲和力受体结合的抗体交联以引发活化及组胺释放。然而，错误折叠的变应原可能无法引发该交联。因此，不含接头的iMAT分子可不形成构象IgE表位，这使得iMAT分子不具有变应原性。
[0500] 实施例3-狗和/或猫中特应性皮炎的治疗性疫苗/预防
[0501] 采用根据本发明包含不同抗原模块的单一iMAT分子或iMAT分子的组合来预防性或治疗性地治疗患有或即将处于特应性皮炎(AD)风险中的狗和/或猫。
[0502] 在第1个实例中，将根据SEQ ID NO：36(Der f 15)的iMAT分子施用至患有特应性皮炎的猫的胭窝淋巴结中。
[0503] 在第2个实例中，将根据SEQ ID NO：66(杂交体1)的iMAT分子施用至患有特应性皮炎的猫的胭窝淋巴结中。
[0504] 在第3个实例中，将根据SEQ ID NO：57(Der f 15)的iMAT分子施用至患有特应性皮炎的狗的胭窝淋巴结中。
[0505] 在第4个实例中，将根据SEQ ID NO：81(杂交体3)的iMAT分子施用至患有特应性皮炎的狗的胭窝淋巴结中。
[0506] 在每种情况下，夹住受感染动物的淋巴结上的毛发，进行手术准备。使用触诊和/或超声波引导，将25G针头插入至淋巴结中。注射的iMAT分子被吸附至佐剂。佐剂是由(例如)磷酸铝组成(Adju Brenntag Biosector，丹麦)。iMAT分子原液为小瓶中的例如375μg/mL蛋白质浓度的冷冻溶液，每小瓶装纳500μL，并在使用前解冻。
[0507] 在解冻iMAT分子溶液后，取400μL溶液与例如200μL佐剂混合。将该最终调配物在室温下静置例如60分钟再淋巴管内内注射以使得iMAT分子能够吸附至例如Adju-例如，将50μL的包含12,5μg iMAT分子的混合物移至500μL针筒中以用于淋巴结注射。通常在第0天、第28天及第56天以每次注射10μg与50μg(指仅一或多个抗原模块d重量)之间的剂量及iMAT分子首次施用该制剂。
[0508] 在整个治疗期中和/或于此后，可临床上通过定量、半定量或定性评估搔痒、皮肤病灶及药物评分(Hobi S,Mueller RS；Tierarztliche Praxis.Ausgabe K,Kleintiere/Heimtiere 2014,42(3):167-173)来研究治疗或预防特应性皮炎的疗效。
[0509] 将这些临床参数与各个狗和/或猫在开始治疗干预前的临床症状进行比较。或者，与未经治疗或经安慰剂治疗的感染特应性皮炎的狗和/或猫的比较可以证实由iMAT分子介导的对于特应性皮炎的临床症状的治疗和/或预防的疗效。
[0510] 作为选择地或者作为附加地，利用某些尘螨属变应原的真皮内激发试验可用于所述狗和/或猫中。降低的反应(速发和/或后期阶段反应性)指示iMAT分子施用的治疗和/或预防效果。
[0511] 另外，可监测免疫系统不同组分的调节，例如，变应原特异性IgE及IgG抗体效价的改变可指示治疗和/或预防效果。
[0512] 利用此类iMAT分子治疗狗或猫的特应性皮炎时，除了IgE含量改变外，可出乎意料地发现变应原特异性IgG的增加。这些抗体可阻断体内IgE介导的变态反应性反应且似乎不仅抑制变应原引发的发炎介质自嗜碱细胞及肥大细胞释放，而且抑制IgE介导的变应原对T细胞呈递。在iMAT引起的特异性结合至变应原的IgG抗体中，已表明一些变应原特异性亚型发挥重要“保护”作用，这是因为其与变应原特异性IgE抗体竞争及可通过抑制IgE介导的抗原呈递来防止活化CD4+T细胞。另外，所分泌的IgG子集促使肥大细胞及嗜酸细胞显著减少，伴随着发炎介质减少释放。
[0513] 变应原特异性免疫治疗可调节免疫系统的不同组分。细胞修饰由降低变应原引起的T-细胞增殖所组成，指示诱导变应原特异性T细胞中的外周耐受性及抗原特异性Th2主导的免疫应答的降低，随着IFN-γ生成增加有利于Th1反应。负责配位此免疫学切换的重要细胞类型为异质T细胞群体，称作调节T细胞(Treg)。在细胞水平上，成功的变应原免疫治疗的关键因素是1型Treg细胞的外周诱导。对在识别抗原上具特异性的1型Treg细胞的功能性研究显示，通过1型Treg细胞来调节Th1及Th2反应主要取决于具有免疫抑制特性的细胞激素IL-10的分泌。事实上，IL-10抑制外周T细胞抗特异性变应原的增殖反应且在诱导T细胞无反应性中具有重要作用。体外IL-10增进调节因子FoxP3的表达，调节嗜伊红血球功能及减少由肥大细胞释放之前发炎性介质。
[0514] 经此类iMAT分子介导的免疫治疗的杰出临床疗效的另一可能标记是检测变应原特异性T细胞的数量或性质的改变。基于(例如)Bet v1四聚物染色研究的基础上，循环桦树花粉特异性CD4+T细胞的含量及特性可潜在性地在SIT之前及之后进行比较。最近，转变生长因子(TGF)-β也已识别为成功SIT中的重要细胞激素。诸多作用可说明其相关性，如，特异性Th1、Th2及Th17细胞的抑制、FoxP3的诱导及Tregs的功能抑制。此外，TGF-β下调兰格罕细胞上的FcεRI表达并抑制IgE合成。这些免疫相关的T细胞介导的免疫应答可在离体实验中应用外周血单核细胞(PBMC)培养物及其细胞因子检测来测定，正如Nuttall等人所描述的那样(T.J.Nuttall et al.,Veterinary immunology and Immunopathology 84(2002)
[0515] 143-150)。
[0516] 实施例4-根据本发明的iMAT分子与根据WO 2004/035793(US等同申请US 2005/0281816)的现有技术MAT分子之间的比较
[0517] 就评估MAT蛋白质的纯度而言，已建立十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试验程序(Thompson J等人，J Biol Chem2002,277:34310-34331)。该方法包括利用还原剂十二烷基硫酸锂(LDS)制备样品及在75℃下加热，在电泳分离后产生可再现多条明显谱带。在负载有200至1000ng蛋白质的凝胶中利用考马斯蓝(Coomassie blue)染色可提供线性定量(密度测定法)特征。使用单株抗体，在具有Fel d 1作为变应原模块的MAT分子(MAT-Fel d1)中检测变应原模块，已显示主要谱带及13条次要谱带均包含MAT-Fel d1蛋白质。小型谱带也在重新装载于凝胶上之后迁移到如在初始凝胶上得相同位置(图1)。在PAGE之前用于制备样品的数种不同方法，如不同温度及缓冲剂组合物方案产生出相同谱带图谱。
[0518] 在所有此类谱带中，在各谱带从凝胶中切出之后，通过胰蛋白酶消化及于随后通过质谱法(nanoLC/ESI-MS)分析，可证实存在全长(完全)MAT-Fel d1蛋白质及仅微量的宿主细胞蛋白质。从这些实验可得出结论SDS-PAGE中MAT-Fel d1的例如不同折叠变体的异常特征(凝胶迁移)。这意味着所分析的制剂中的MAT-Fel d1不适合用作，具体而言用于临床和/或商业生物医药制造的生物医药分子，这是因为其纯度不可用标准方法(例如SDS-PAGE)来测定，而仅可通过上文所阐述的改良程序测定。
[0519] 与该MAT-Fel d1分子的凝胶迁移现象不同，Fel d1本身不显示SDS PAGE中的该异常特征(图2，泳道2及3)。Fel d1在预期分子量(19,6kD)下呈现单一明显谱带。
[0520] 可在RP-HPLC分析中观察到另一异常特征。在该分析方法中未见到MAT-Fel d1的单峰(图3)，在蛋白质的天然构象中或在通过离液(chaotropic)及还原条件诱导的变性形式中均未看到。然而，就经GMP验证的生物医药制造而言，所销售医药制剂中生物分子的单一同种型是必需的。
[0521] SDS-PAGE及RP-HPLC分析中的这些观察结果可通过基于氨基酸序列的物理化学性质来解释。Kyte及Doolittle疏水性图分析【Kyte J、Doolittle RF,Journal of Molecular Biology 1982,157(1),105-132】显示相邻极端疏水性及亲水性结构域(图4)，其可造成此异常行为结果。
[0522] 具体而言，融合蛋白质的靶向结构与的疏水性区域类似于现有技术中已知可引起该异常特征的膜蛋白的跨膜片段[Rath A et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2009,106(6):1760-1765]。
[0523] SDS-PAGE上与化学式分子量无关联的迁移(称作“凝胶迁移”)显示对于膜蛋白而言常见。这意味着，仅根据其分子量分离分子而与其天然2D-或3D结构无关的SDS-PAGE方法的先决条件不适用于这些情况。在上文引述的文献(PNAS文章)中，作者使用衍生自人囊性纤维化跨膜传导调节子(CFTR)的跨膜片段3及4的野生型及突变体螺旋-环-螺旋(“发夹(hairpin)”)序列库(包括疾病-表型残基取代)，来研究螺旋状膜蛋白的异常凝胶迁移。他们发现此类发夹以相对其实际化学式的分子量-10％至+30％的速率在SDS-PAGE上迁移及
以范围自3.4至10g SDS/g蛋白质的比装载清洁剂。其另外证实突变体凝胶迁移与发夹SDS装载能力改变、及发夹螺旋度有强烈相关性，指明凝胶迁移行为源自于清洁剂结合的改变。
在某些情况中，此通过SDS的差别性溶剂化作用可能由于蛋白质-清洁剂接触改为蛋白质-蛋白质接触替代所引起，这意味着清洁剂结合及折叠紧密地联结。
以范围自3.4至10g SDS/g蛋白质的比装载清洁剂。其另外证实突变体凝胶迁移与发夹SDS装载能力改变、及发夹螺旋度有强烈相关性，指明凝胶迁移行为源自于清洁剂结合的改变。
在某些情况中，此通过SDS的差别性溶剂化作用可能由于蛋白质-清洁剂接触改为蛋白质-蛋白质接触替代所引起，这意味着清洁剂结合及折叠紧密地联结。
[0524] MAT及iMAT蛋白质的SDS PAGE(图5)及RP-HPLC分析(图3和6)分别显示迁移图谱或洗脱方面的实质差异。MAT-Fel d1的氧化形式没有显示SDS-PAGE凝胶上单一明显谱带(泳道3)，然显示若干离散的具有比MAT-Fel d1的实际分子量32.2kD更大及更小表观分子量的谱带。相反地，作为一个实施例，带有不显库蠓变应原的抗原模块的IMAT分子(iMAT-Cul o4)在氧化条件下展现单一明显谱带(M＝41.6kD)。此外，RP-HPLC层析图显示单一峰(图6)。
[0525] 在还原条件下，SDS-PAGE中的MAT-Fel d1显示大约在已知分子量处迁移的主要谱带，但此外图1中所述已知包含MAT-Fel d1的完全序列的某些次要谱带再次出现(图5，泳道6)。这是表征MAT-Fel d1异常特征的属性。另外，MAT-Fel d1在还原条件下的RP-HPLC层析图(图3，右图)显示MAT-Fel d1的至少3种不同异构体。相反地，iMAT分子显示明显指示SDS-PAGE(图5，泳道7)及RP-HPLC(图6)中的单一异构体的特性。
[0526] 所述还原条件导致MAT分子中的二硫键裂解，因此，若二硫键是唯一造成MAT异常特征的原因，则MAT及iMAT分子在还原条件下的行为应相似。然而，这并非是该种情况，这是因为在还原条件下仍旧存在MAT分子的异常凝胶迁移及在RP-HPLC中出现异构体。
[0527] 然而，呈蛋白质的天然(氧化)形式的iMAT分子不显示该凝胶迁移但在RP-HPLC层析图中展现峰值。另外，MAT及iMAT分子的Kyte-Doolittle图在涵盖His标签、TAT及靶向结构域的序列的N端处几近相同(图8)。因此，本领域技术人员不可能有动机根据现有技术来构建为克服现有技术的缺点而用其他氨基酸残基取代了半胱氨酸残基的MAT分子。
[0528] iMAT分子能够通过根据以下实施例5的“生物信息工程”程序而构建，并通过在大肠杆菌中的重组表达技术进行生产。作为一个实施例，如图7所示的三个IMAT分子在冻融两次后于缓冲液(20mM柠檬酸盐、1M精氨酸，pH 6.0)中稳定并可吸附至作为佐剂的Adju-(Brenntag，丹麦)上，使得所述iMAT分子可用作疫苗。所述蛋白质可自Adju-
解吸附而不在相同缓冲液系统中降解(图7)。
解吸附而不在相同缓冲液系统中降解(图7)。
[0529] 实施例5-iMAT分子的“生物信息工程”：抗原模块的蛋白质的选择以及完全iMAT分子的优化
[0530] 为了例如有效地使用iMAT技术来治疗患有变应性疾病的狗和/或猫，可进一步执行：
[0531] a)选取作为iMAT分子中的变应原模块的蛋白质，该蛋白质为变应原，因此有较高可能性引起受感染对象过敏，从而也能够作为耐受诱导的目标；和
[0532] b)用所述的变应原构件iMAT分子，使得该iMAT分子具有热力学稳定性，能够通过蛋白质改造高效生产，另外还能够用标准方法分析以确定足够好的品质(即同一性、纯度及效力)。
[0533] 为满这些要求，选择一种生物信息方法以选取将包含于根据本发明的iMAT分子中的变应原。选取的目标为(i)选择一种或多种预期具给定变应性疾病相关性的变应原(即，患有变应性疾病的个体中大多数被相应变应原致敏)，及(ii)选择最有可能包含有变应原特性的线性表位的变应原，即，包含高数量的与已公开的变应原中的那些同源的短肽序列(7至13个氨基酸残基)。
[0534] 为选择用于医药制剂的合适抗原，选择进行基于与已知非变应原的局部序列比对的同源性比较。通常，用于抗体识别的表位检测(主要是构象表位)是通过功能性分析(例如肽微阵列)来实现，或T细胞表位(线性表位)的检测是通过计算与MHC分子的肽结合概率来实现。iMAT技术的治疗原理具体是以内涵体中酸依赖性蛋白酶的内吞及降解接着II类MHC结合及抗原呈递为基础。
[0535] 因此，选用不同的用于变应原选择的非实验但为生物信息的方法，该方法是基于衍生自给定蛋白质的肽与其中大多数可使人产生变态反应的已知变应原性蛋白质的局部同源性检索。从公共数据库(例如UNIPROT)导出疑似具有变应原性质的蛋白质氨基酸序列，并通过分析导出的数据集中的序列的同源性确定冗余。消除高度同源序列对应物且所得的其余序列作为可能有效抗原的正规序列数据库用于后续分析。为确定具有推定高变应原性可能性的蛋白质，将蛋白质计算机模拟裂解成具有6至15个氨基酸长度的肽，其中一个氨基酸移位。接着，在例如尘螨属蛋白质及对应的肽与正规序列数据库之间进行局部成对比对。
于此之后，通过设定给定蛋白质相对一者的自比对评分及相应地对应肽的比对命中来进行所获得比对命中的缩放。接着，对各肽计数超出给定阈值的比对对应数量及以局部逐对比对方式与不具有已知致变态反应性质的随机产生的蛋白质序列数据库进行比较，并于随后缩放并计数。将所得“非变态反应性蛋白质”计数从变应原结果中的那些中减去并基于所有对应的肽的命中数量来计算各蛋白质的累积命中评分。具有最高计数的蛋白质选作候选
iMAT抗原模块。
于此之后，通过设定给定蛋白质相对一者的自比对评分及相应地对应肽的比对命中来进行所获得比对命中的缩放。接着，对各肽计数超出给定阈值的比对对应数量及以局部逐对比对方式与不具有已知致变态反应性质的随机产生的蛋白质序列数据库进行比较，并于随后缩放并计数。将所得“非变态反应性蛋白质”计数从变应原结果中的那些中减去并基于所有对应的肽的命中数量来计算各蛋白质的累积命中评分。具有最高计数的蛋白质选作候选
iMAT抗原模块。
[0536] 将每个选取的变应原作为抗原模块整合入单独iMAT分子中，随后，通过三维蛋白质结构的迭代建模以及计算单氨基酸取代后自由能的改变，从而将热动力稳定性优化。通过于一级氨基酸序列中取代不同氨基酸残基，可影响物理化学性质及稳定性。
[0537] 将本文所述分析(抗原研究及建模)的结果转换成适用于的药理学制造及应用的iMAT氨基酸序列中。
[0538] 在一个具体实施例中，这一生物信息学工程方法对与衍生自螨物种粉尘螨的蛋白质引发的变应性疾病特应性皮炎相关的Zen 1和Der f 15进行了鉴定。而且，所述生物信息学分析揭示了半胱氨酸由其他氨基酸残基取代了的稳定的iMAT分子。这类稳定的iMAT分子的实例是SEQ ID NO：39(狗Zen1)和SEQ ID NO：57(狗Der f 15)。
[0539] 实施例6-根据本发明的嵌合样iMAT分子的构建
[0540] 如果多于一种变应原的组分包含于抗原模块中，则预期可进一步改良根据本发明的iMAT分子。为此目的，可以不同方式应用上文所述的生物信息选择方法(实施例5)的基本原理。不同于基于在变应原数据库中找到的变应原肽的命中计数来选择完全变应原，而是仅使用数种此类变应原的最富足的肽来改造iMAT抗原分子。因此，该iMAT分子由源于数种变应原的肽的抗原模块组成。这使得能够相对于其靶向免疫学的分析展宽单个iMAT分子的光谱，从而有益于药理学药物的开发。
[0541] 为寻求具有这类嵌合样iMAT分子资格的短肽序列，通过如上文所述的同源性比较来对来自如尘螨属物种的蛋白质进行分析。简言之，将经计算机模拟裂解的具有6至15个氨基酸残基的肽长度的蛋白质局部地与变应原相关蛋白质的正规序列数据库及非变态反应相关蛋白质的随机数据库进行比对。确定在正规数据库中发现的各肽的显著同源性差异
数。随后，将各肽局部地与大小三倍于正规数据库的随机数据库比对以减少假阳性命中。各肽长度的残余同源性的顶部(例如，前10％)尤其适合作为用于构建带有嵌合样或杂交变应原的iMAT分子的基底。构建嵌合样iMAT分子，选择蛋白质前体(例如，从对应于最高等级肽的前体蛋白质清单中)作为用于包埋最高等级肽的骨架蛋白质。自骨架蛋白质移除信号肽序列及可将具有额外相邻N端或C端氨基酸的最高等级肽插入至骨架蛋白质的原始序列中
或可替代骨架蛋白质的原始序列部分。使用相似比对或对应前体蛋白质中肽的参考位置来确定插入或取代的位置。作为下一步骤，新增His标签、TAT及靶向结构域。最后，如上所述改由最稳定的残基取代半胱氨酸残基。
数。随后，将各肽局部地与大小三倍于正规数据库的随机数据库比对以减少假阳性命中。各肽长度的残余同源性的顶部(例如，前10％)尤其适合作为用于构建带有嵌合样或杂交变应原的iMAT分子的基底。构建嵌合样iMAT分子，选择蛋白质前体(例如，从对应于最高等级肽的前体蛋白质清单中)作为用于包埋最高等级肽的骨架蛋白质。自骨架蛋白质移除信号肽序列及可将具有额外相邻N端或C端氨基酸的最高等级肽插入至骨架蛋白质的原始序列中
或可替代骨架蛋白质的原始序列部分。使用相似比对或对应前体蛋白质中肽的参考位置来确定插入或取代的位置。作为下一步骤，新增His标签、TAT及靶向结构域。最后，如上所述改由最稳定的残基取代半胱氨酸残基。
[0542] 在一个具体实施例(杂交体1)中，该生物信息学工程方法对与衍生自螨物种粉尘螨的蛋白质引发的变应性疾病特应性皮炎相关的SEQ ID NO：84(A1KXC1_DERFA DFP1OS＝粉尘螨)、SEQ ID NO：10(Q86R84_DERFA 60kDa变应原Der f 18p OS＝粉尘螨GN＝Der f
18PE＝2SV＝1)、SEQ ID NO：85(A0A088SAS1_DERFA Der f 28变应原OS＝粉尘螨PE＝2SV＝
1)、SEQ ID NO：88：(A7XXV2_DERFA Der f 2变应原OS＝粉尘螨PE＝4SV＝1)、SEQ ID NO：86(B7U5T1_DERFA Der f 6变应原OS＝粉尘螨PE＝2SV＝1)、SEQ ID NO：87(T2B4F3_DERPT LytFM OS＝屋尘螨GN＝lytFM PE＝4SV＝1)、SEQ ID NO：11(Q9U6R7_DERFA98kDa HDM变应原OS＝粉尘螨PE＝2SV＝1)的组合进行了鉴定。此外，所述生物信息学分析揭示了半胱氨酸由其他氨基酸残基取代了的稳定的iMAT分子。此类嵌合样iMAT分子的实例是
18PE＝2SV＝1)、SEQ ID NO：85(A0A088SAS1_DERFA Der f 28变应原OS＝粉尘螨PE＝2SV＝
1)、SEQ ID NO：88：(A7XXV2_DERFA Der f 2变应原OS＝粉尘螨PE＝4SV＝1)、SEQ ID NO：86(B7U5T1_DERFA Der f 6变应原OS＝粉尘螨PE＝2SV＝1)、SEQ ID NO：87(T2B4F3_DERPT LytFM OS＝屋尘螨GN＝lytFM PE＝4SV＝1)、SEQ ID NO：11(Q9U6R7_DERFA98kDa HDM变应原OS＝粉尘螨PE＝2SV＝1)的组合进行了鉴定。此外，所述生物信息学分析揭示了半胱氨酸由其他氨基酸残基取代了的稳定的iMAT分子。此类嵌合样iMAT分子的实例是
[0543] SEQ ID NOS：75(狗杂交体1)和SEQ ID NO：66(猫杂交体1)。
[0544] 实施例7-猫中特应性皮炎的治疗性疫苗/预防
[0545] 采用根据本发明包含不同抗原模块的单一iMAT分子或iMAT分子的组合来预防性或治疗性地治疗患有或处于特应性皮炎风险中的猫。在猫中如实施例3所述施用根据本发明的iMAT分子。
[0546] 研究中将列入有已知变应性哮喘病史的成年猫，即报告为表现出如痉挛性咳嗽发作、哮喘及呼气困难等临床症状的猫。
[0548] 通过例如静脉注射克他命盐酸使猫镇静。通过经气管内导管轻轻插入例如7Fr聚丙烯导管来采集气管肺泡灌洗液。当感受到阻力时，通过导管用达到20ml等份的加热的灭菌盐水进行灌洗，然后通过手动抽吸回收。经离心及重悬后，准备采集的气管肺泡灌洗液细胞的刮片细胞学检查，相当数量的嗜酸性粒细胞的存在可对猫科动物哮喘的诊断提供支
持。分类细胞计数能够定量评估气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞的比例(％)。
持。分类细胞计数能够定量评估气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞的比例(％)。
[0549] 作为选择地或者作为附加地，利用某些重组变应原，可在所述猫中监测真皮内激发试验、皮肤点刺试验或者气管肺泡灌洗液或血清中变应原特异性IgE和/或IgG测定(Norris et al.,Vet Immunol Immunopathol.etal.2003,96(3-4):119-127)。降低的反应(速发和/或后期阶段反应性)和/或抗体效价的改变指示iMAT分子治疗的治疗和/或预防效果。
[0550] 采用对呼吸努力/难度做出解释的如呼吸率及评分等临床症状。所述“呼吸评分系统”也可以用于响应气溶胶激发。简言之，处于密封室中的醒着的、自主呼吸的猫暴露于不同时间长短和/或不同浓度的雾化重组变应原之下。或者，可以在麻醉后的猫中进行气道高反应的数量测定。根据基线以支气管激发的治疗方案例如肺对醋甲胆碱和/或选取的重组变应原的抵抗的剂量反应来完成呼吸速率计测定。
[0551] 因此，在整个治疗期中和/或于此后，可临床上通过定量、半定量或定性评估来研究治疗或预防特应性皮炎的疗效。
[0552] 可在各个猫中将这些参数与在开始治疗干预之前的严重度进行比较。或者，与未经治疗或经安慰剂治疗的患有变应性哮喘的猫的比较可证实，iMAT分子介导的治疗和/或预防猫科动物变应性哮喘的临床症状的疗效。
[0553] 实施例8-猫和/或狗中跳蚤变态反应的治疗性疫苗/预防
[0554] 采用根据本发明包含不同抗原模块的单一iMAT分子或iMAT分子的组合来预防性或治疗性地治疗患有或处于跳蚤特应性皮炎风险中的猫和/或狗。
[0555] 在第1个实例中，将根据SEQ ID NO：42(猫Cte f 1)的iMAT分子施用至患有或处于跳蚤特应性皮炎风险中的猫和/或狗的胭窝淋巴结中。
[0556] 在第2个实例中，将根据SEQ ID NO：63(狗Cte f 1)的iMAT分子施用至患有或处于跳蚤特应性皮炎风险中的猫和/或狗的胭窝淋巴结中。
[0557] 进一步的治疗细节如上述实施例3所述。
[0558] 通过皮内试验(IDT)、T细胞分析及测定iMAT治疗前后被治疗的猫和/或狗中跳蚤变应原特异性IgE和IgG(Gerber,J.D.Vaccine 1990-12-8(6):536-542)来评估所述iMAT治疗的疗效，正如Jin所描述的那样(Jin J et al.,Vaccine 28(2010)1997-2004)。遵循
Hillier和DeBoer提出的治疗方案来完成皮内试验(IDT)(DeBoer,D.J.,Hillier,
A.Veterinary Immunology and Immunopathology 2001,81(3-4),271-276)。在最后一次免疫后的第4周，用100μl含100μg跳蚤提取物的PBS在猫和/或狗的胁肋皮肤上对猫和/或狗进行皮内注射；使用组胺作阳性控制，BSA作不相关刺激物以及盐水作阴性控制。用标记笔标记皮肤上的反应疱疹的大小，并在刺激后20分钟内用测微计对其进行垂直及水平测定。
对结果进行计算得到三次测定的平均值。降低的反应(速发和/或后期阶段反应性)和/或抗体效价的改变或Th1或Treg歪斜T细胞反应指示iMAT分子治疗的治疗和/或预防效果。
Hillier和DeBoer提出的治疗方案来完成皮内试验(IDT)(DeBoer,D.J.,Hillier,
A.Veterinary Immunology and Immunopathology 2001,81(3-4),271-276)。在最后一次免疫后的第4周，用100μl含100μg跳蚤提取物的PBS在猫和/或狗的胁肋皮肤上对猫和/或狗进行皮内注射；使用组胺作阳性控制，BSA作不相关刺激物以及盐水作阴性控制。用标记笔标记皮肤上的反应疱疹的大小，并在刺激后20分钟内用测微计对其进行垂直及水平测定。
对结果进行计算得到三次测定的平均值。降低的反应(速发和/或后期阶段反应性)和/或抗体效价的改变或Th1或Treg歪斜T细胞反应指示iMAT分子治疗的治疗和/或预防效果。
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