发明领域

本发明涉及西尼罗河病毒疫苗，并且还涉及一些将其给药于哺乳 动物，尤其是马的方法。

                        发明背景

通常被称为黄病毒的西尼罗河病毒最早于1937年在非洲被鉴定， 并于1999年在北美洲首次发现。现在认为该感染在国家内部和国家之 间传播主要是由候鸟引起的。这种病毒通过吸食带病毒的鸟的血而获 得了感染的蚊子传播。然后，该病毒在成年蚊子吸血过程中扩增。感 染的蚊子随后在吸食人类和动物的血时将病毒传播给它们。

西尼罗河病毒是人类、其它哺乳动物和鸟类中盛行的西尼罗河病 毒病，尤其是西尼罗河脑炎的病原体。主要关注的问题是缺乏有效治 疗西尼罗河病毒病的方法。使用抗炎药来治疗中枢神经系统的肿胀， 但除此以外就没有任何医疗措施了。人们也不相信存在已知的能够预 防感染的合适的疫苗。至此，看起来似乎只有防止与携带者接触这种 唯一的方法来控制西尼罗河病毒。

科学家们认为，西尼罗河病毒遵循与发现的其它蚊子传播的病毒 相同的感染方式。当感染的蚊子叮咬马科动物时，病毒则可以进入皮 肤或恰好位于叮咬部位下的组织，在此处通过血液循环将其获得。该 病毒能够在血流中繁殖，并且马科动物可能会发热，这种发热通常不 被察觉，因为当时并没有疾病的其它体征。然而，一旦病毒侵入神经 系统，在1-3天内就会出现临床体征。大多数感染的马科动物，例如 马，首先表现出后肢无力或麻痹和协调不良的体征。伴随身体变化可 能会发生抑郁和相关的行为变化。在若干病例中，震颤、惊厥、肢体 蹒跚和麻痹都可能发生。此外，还发现了严重的神经问题和死亡。至 此，仍没有已知的能够预防马科动物中西尼罗河病毒感染的合适的疫 苗；并且控制西尼罗河病毒的唯一方法似乎只有防止与携带者接触。

因此，需要一些安全有效的方法来控制西尼罗河病毒在哺乳动物 和鸟类中的传播。特别是需要一种疫苗，主要用于给药于马科动物， 这种疫苗非常安全，以至于甚至适合给药于妊娠母马，而不会产生任 何副作用。此外，还需要一种能够预防或改善马科动物和其它哺乳动 物中西尼罗河病毒病，尤其是西尼罗河脑炎的疫苗。

                        发明概述

本发明提供一种疫苗组合物，其中包括：一种免疫原性活性成分， 该成分选自活的减毒的、灭活的或杀灭的完整或亚单位西尼罗河病 毒、一种来自所述病毒的抗原、来自所述病毒的DNA、质粒西尼罗河病 毒DNA、带有所述病毒插入序列的质粒，及其混合物；一种佐剂，优选 的是包括一种免疫原性刺激量的可代谢油；以及任选一种药学可接受 载体。

本发明还提供一种用于预防或改善马科动物中西尼罗河脑炎的方 法，包括：将一种疫苗组合物给药于所述马科动物，该疫苗组合物包 括一种免疫原性活性成分，该成分选自活的减毒的、灭活的或杀灭的 完整或亚单位西尼罗河病毒、一种来自所述病毒的抗原、来自所述病 毒的DNA、质粒西尼罗河病毒DNA、带有所述病毒插入序列的质粒，及 其混合物；一种佐剂，优选的是包括一种免疫原性刺激量的可代谢油； 以及任选一种药学可接受载体。

此外，本发明还提供一种适用于马的西尼罗河病毒疫苗，其中包 括：一种免疫原性活性成分，该成分选自活的减毒的、灭活的或杀灭 的完整或亚单位西尼罗河病毒、一种来自所述病毒的抗原、来自所述 病毒的DNA、质粒西尼罗河病毒DNA、带有所述病毒插入序列的质，及 其混合物；一种佐剂，优选的是包括一种免疫原性刺激量的可代谢油； 以及任选一种药学可接受载体。

在本发明的另一实施方案中，所述疫苗组合物包括每单位剂量至 少为1×104TCID50的灭活的西尼罗河病毒，或其成分，以及一种约4- 10％vol/vol的佐剂，该佐剂包括约1-3％的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共 聚物、约2-6％的角鲨烯和约0.1-0.5％的聚氧乙烯山梨聚糖一油酸酯。

此外，还提供一种用于马科动物的安全有效的西尼罗河病毒疫 苗，包括每单位剂量至少为1×106TCID50的杀灭的或灭活的西尼罗河病 毒，以及一种至少约1％vol/vol的佐剂，该佐剂包括至少一种可代谢 油和至少一种润湿剂或分散剂。

本发明的一项特别优选的实施方案是一种用于马的疫苗组合物， 包括至少两个剂量单位的杀灭的或灭活的西尼罗河病毒，其中每种所 述剂量单位都包括大约0.5-5ml的组合物，该组合物包含至少约5×107 TCID50的所述病毒和约1-10％vol/vol的佐剂，该佐剂包括至少一种 可代谢油和至少两种非离子型表面活性剂，并且其中所述剂量单位还 包括一种药学可接受载体。

此外，本发明的目的和特征将通过详细描述和下文阐述的权利要 求而变得显而易见。

                        发明详述

一般而言，设计一种新疫苗的困难是活病毒疫苗在特定靶宿主中 可能潜在地欠缺足够的安全性，而杀灭的或灭活的病毒疫苗可能潜在 地缺少能够刺激充分有效的免疫应答的能力。通常，为了获得令人满 意的效力，可以将佐剂或免疫原性刺激化合物与疫苗中杀灭的或灭活 的病毒联合使用。但是，添加佐剂通常会危及靶宿主的安全。举例来 说，已多次发现将含有佐剂的杀灭的或灭活的病毒疫苗给药于妊娠动 物，常引起流产率显著提高。

现已发现，将适当佐剂，例如SP油等可代谢的油，与文中描述的 免疫原性活性成分联合使用时，所得的西尼罗河疫苗组合物可以被安 全地使用，并且特别适用于马科动物，尤其适用于马，甚至还可用于 妊娠母马，同时也显示出重要效力。因此，本发明实现了有效免疫与 安全性的共同目标，特别是对妊娠动物。

一种安全有效的疫苗组合物包括：一种免疫原性活性成分，该成 分选自活的减毒的、灭活的或杀灭的完整或亚单位西尼罗河病毒、一 种来自所述病毒的抗原、来自所述病毒的DNA、质粒西尼罗河病毒DNA、 带有所述病毒插入序列的质粒，及其混合物；一种佐剂；以及任选一 种可选的药学可接受载体。可将该疫苗组合物安全有效地给药于哺乳 动物和鸟类，特别适用于马科动物，例如马、驴、骡，等等。该疫苗 组合物特别适用于预防或改善马的西尼罗河病毒病，例如脑炎。

西尼罗河病毒的DNA可以由已确诊患有西尼罗河脑炎的马或鸟的 体液或组织等来源中分离获得。这类来源包括脑脊液或脊髓或脑的切 片。此外还可通过诸如质粒技术等其它现有技术来获得该DNA。例如， 可以用含有西尼罗河蛋白插入序列的质粒转化诸如大肠杆菌的生物体 的适当细胞以获得一种宿主源。然后将该宿主源进行培养和传代。收 集含有西尼罗河DNA的转化细胞，再利用熟练技术人员所知的技术分 离并获得所述DNA。

可以用传统技术从感染的动物中分离出完整或亚单位西尼罗河病 毒。病毒样品也可以从组织培养物保藏中心获得，该保藏中心维持诸 如西尼罗河病毒等生物体的储存。例如，西尼罗河病毒以ATCC编号 VR-82、VR-1267和VR-1267AF保藏于美国典型培养物保藏中心 (ATCC)中。

完整或亚单位西尼罗河病毒可以被用作为活的减毒病毒。但是， 优选的是杀灭的或灭活的，其方法是传统的灭活法，例如用化学灭活 剂，如二元乙烯亚胺、β-丙内酯、甲醛、戊二醛、十二烷基硫酸钠等 等，或其混合物，优选甲醛进行化学灭活。此外，所述病毒还可以在 存在紫外线光的条件下通过加热或补骨脂素灭活。减毒可以用传统方 法实现。

完整或亚单位西尼罗河病毒可以在小鼠脑中或适当的组织培养基 中维持或生长，例如optiMEM(LTI，Grand Island，NY)或MEM培养 基，或者在本领域已知的细胞中维持或生长，例如非洲绿猴肾(Vero) 细胞或幼苍鼠(BHK)细胞，优选的是Vero细胞。然后可以用传统技 术，例如离心、过滤等，将所述病毒从组织培养物或细胞培养基中分 离出来。

优选的西尼罗河病毒分离物可以是从衣阿华州埃姆斯的National Veterinary Services Laboratory(美国农业部的一个部门)处获得 的VM-2株。该病毒株可以经噬菌斑纯化最多三次，然后传代到X+5Vero 细胞中。

文中使用的术语“免疫原性活性”是指刺激免疫应答的能力，即 刺激产生抗体，尤其是体液抗体的能力，或者刺激细胞介导的应答的 能力。举例来说，在局部粘膜区(例如肠粘膜)、外周血、脑脊液等 中刺激产生循环抗体或分泌抗体、或者刺激产生细胞介导的应答的能 力。

有效的并能够产生免疫的免疫原性活性成分的量是可以变化的， 并且可以是任何能够充分激发免疫应答并提供对抗西尼罗河病毒病的 免疫保护的量。每剂量单位的免疫原性活性成分的优选量至少约为 1×104TCID50，优选的是约为1×104TCID50-约1×109TCID50，更优选的 是至少约为1×106TCID50，特别优选为106-107TCID50(优选至少约为 1×107)。这些量适合于杀灭的或灭活的完整或亚单位病毒或抗原或来 自其的DNA或其混合物。特别理想的是，在本发明的疫苗组合物中使 用至少约为5×107TCID50的杀灭的或灭活的完整或亚单位西尼罗河病 毒或抗原或来自其的DNA或其混合物。

在本发明的另一实施方案中，一个剂量单位的疫苗组合物中可预 期使用约50-3,000微克(μg或10-6g)的西尼罗河质粒DNA。更优选 的是，使用约100-1,000μg，更优选的是约100-250μg质粒DNA。

在此将每只动物至少一个剂量单位设想为接种方案。两个或更多 剂量单位可能尤为有效。通常一个剂量单位可以约为0.1-10ml疫苗组 合物，优选约为0.5-5ml，甚至更优选的是约为1-2ml，并且每剂量单 位含有具有上文描述量的病毒或病毒成分。熟练技术人员将认识到， 每剂量单位的疫苗组合物的特定量和每种接种方案的总剂量单位数是 可以优化的，只要递送给动物的病毒或其成分的量能够有效地免疫。

本发明的西尼罗河病毒疫苗组合物含有一种或多种佐剂。在此使 用的术语“佐剂”是指能够改进机体对疫苗或免疫原的应答的任何成 分。佐剂通常包括约0.1-50％vol/vol的本发明的疫苗制剂，优选约 1-50％vol/vol的疫苗，更优选的是约1-20％，特别优选的是1-10％ vol/vol的疫苗。甚至更优选的量是约4-10％。

合适的佐剂包括免疫刺激性油，例如某些可代谢油。适用于本发 明组合物的可代谢油包括油乳剂，例如SP油(将在下文描述)、 Emulsigen(MPV Laboratories，Ralston，NZ)、Montanide264、 266、26(Seppic SA，Paris，France)，以及花生油和其它基于植 物的油、角鲨烯(鲨鱼肝油)或其它在兽医接种实践中显示可作为佐 剂的可代谢油。

佐剂可以是一种组合物，除了可代谢油之外还可包括一种或多种 润湿剂或分散剂，按佐剂体积，其含量约为0.1-25％，更优选约为1- 10％，并且还更优选约为1-3％。作为润湿剂或分散剂，特别优选的是 非离子型表面活性剂。有用的非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯/聚氧 丙烯嵌段共聚物，特别是那些从BASF公司(Mt.Olive，NJ)获得的 以商标PLURONIC销售的表面活性剂。其它有用的非离子型表面活性 剂包括聚氧乙烯酯，例如聚氧乙烯山梨聚糖一油酸酯，以商标TWEEN 80销售。理想的情况可以是作为本发明的疫苗组合物的一部分的佐剂 中含有多于一种，例如至少两种，润湿剂或分散剂。

佐剂的其它成分可包括诸如甲醛和硫柳汞等防腐化合物，其含量 可高达佐剂的1％vol/vol。

一种特别优选的佐剂被称为SP油。在描述和实施例中所使用的术 语“SP油”是指一种油乳剂，其中包括一种聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共 聚物、角鲨烯、聚氧乙烯山梨聚糖一油酸酯和一种缓冲盐溶液。一般 而言，该SP油乳剂可以包含约1-3％vol/vol的嵌段共聚物，约2-6％ vol/vol的角鲨烯，更具体地说是约3-6％的角鲨烯，以及约0.1-0.5％ vol/vol的聚氧乙烯山梨聚糖一油酸酯，其余部分为缓冲盐溶液。

当将SP油作为本发明疫苗组合物中的佐剂使用时，其免疫原性刺 激量可以根据免疫原性活性成分、潜在感染性接触的程度、疫苗组合 物的给药方法、马科动物的年龄和大小等等而变化。一般而言，约为 疫苗组合物1-50％vol/vol的含量是合适的，优选是约为4-10％ vol/vol，更优选的SP油含量是约为4-5％vol/vol。

适合用于本发明疫苗组合物中的药学(或药理)可接受载体可以 是任何适用于兽医药物组合物的传统的流体载体，优选的是一种平衡 盐溶液或其它适用于组织培养基的基于水的溶液。此外，也可以使用 其它可获得的载体。

根据至此描述的多种实施方案，疫苗组合物中还可以包括本领域 现有的其它赋形剂。例如，可以使用pH调节剂。

上文描述的本发明疫苗组合物的成分，包括载体，可以用现有技 术将其混合在一起。

除了前文描述的作为活性组分的西尼罗河病毒的免疫原性活性成 分之外，本发明的疫苗组合物还应该包含诸如抗病原体成分的其它活 性成分，这些活性成分可直接对抗狂犬病病毒、东方马脑炎病毒、西 方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、马疱疹病毒，如EHV-1或EHV-4、 立氏埃里希体、马链球菌、破伤风类毒素、马流感病毒(EIV)、东方 鼻肺炎病毒、西方鼻肺炎病毒和委内瑞拉鼻肺炎病毒等，及其组合。 一种或多种这些病毒的数量可以参考本领域的效力文献来确定，或者 用现有技术来确定。

在本发明的一项实施方案中，可以用已知的技术，例如可参阅 Nature， 1974，252，252-254或Journal of Immunology， 1978，120， 1109-13中的描述，将发明的免疫原性活性成分掺入到脂质体中。在 本发明的另一实施方案中，可以将本发明的免疫原性活性成分偶联到 适当的生物化合物上，例如聚多糖、肽、蛋白等等，及其组合。

在本发明的一项优选实施方案中，可以将本发明的疫苗组合物按 前文所述配制成剂量单位的形式，以方便给药和确保剂量一致。可以 用现有技术来实现配制，例如那些适用于制备乳剂的技术。

可以将本发明的疫苗组合物经肠胃外给药，例如经肌内、经皮下、 经腹膜内、经皮内等，优选的是经皮下给药；或者也可以将所述组合 物经口或鼻内给药。

因此，本发明还提供一种用于预防或改善马科动物，优选为马中 的西尼罗河脑炎的方法，其中包括将前文描述的安全的疫苗组合物给 药于所述马科动物。

在实际操作中，根据可通过预期的与西尼罗河病毒携带者潜在的 接触时间来确定的方案，将本发明的疫苗组合物以有效量经肠胃外给 药、经皮下给药、经口服给药、经鼻内给药，或通过其它现有技术给 药，优选的是经肠胃外给药，更优选的是经肌内给药。以这种方式， 受治疗动物就有时间在自然接触之前建立免疫。以非限制性实例举例 说明，一种典型的治疗程序或剂量方案可以包括肠胃外给药，优选的 是肌内注射一个剂量单位，至少在潜在性接触之前约2-8周。优选至 少两次给药，例如在潜在接触病毒之前约8周给一个剂量单位，然后 在受治疗动物的潜在接触之前3-5周给第二个剂量单位。如上所述， 剂量单位的范围通常约为0.1-10ml的疫苗组合物，其中含有如上所 述含量的活性成分和如上所述百分比的佐剂和灭活成分。更优选的剂 量单位的范围可能约为0.5-5ml，而特别优选的可能约为1-2ml。

为了更清晰的理解本发明，下面将对下列实施例进行阐述。这些 实施例仅作为举例，而从任何方面都不应理解成限制本发明的范围或 基本的原理。实际上，本领域的技术人员将从以下实施例和前文描述 中了解本发明的多种修改，除了那些在文中给出并描述的。这类修改 也应该包括在所附权利要求的范围内。

                        实施例1

                      疫苗的制备   A/SP油制剂   组分描述     体积   聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物   (PluronicL121，BASF，Mt.Olive，NJ)   角鲨烯(Kodak，Rochester，NY)   聚氧乙烯山梨聚糖一油酸酯   (Tween80，Sigma Chemical，St.Louis，MO)   缓冲盐溶液   (D-V PBS溶液，不含钙、镁)   20.0ml     40.0ml   3.2ml     936.8ml

将这些组分混合并搅匀，直至形成一种稳定的团块或乳剂。在搅 匀前，所述组分或混和物可以被高压灭菌。所述乳剂可以进一步被过 滤除菌。可以加入终浓度高达0.2％的甲醛。硫柳汞最终以1∶10,000 的稀释度加入。

B/疫苗制备

将西尼罗河病毒的马分离物，购自衣阿华州埃姆斯的USDA机构 (Lot No.VM-2，马源，1999北美分离物，在VeroM细胞中二次传代)， 在于OptiMEM(LTI，Grand Island，NY)组织培养基中的Vero细胞 的多个培养物中37℃培养。对收获物进行滴定并随后通过加入10％的 甲醛至终浓度为0.1％对其进行灭活。灭活可以于37℃下进行一段时间 但不能超过144个小时。然后，另外加入0.1％的甲醛并且在37℃下继 续温育一段时间，但不可超过144小时。

通过将适当体积的灭活病毒液悬浮于每1mL剂量为1-20体积％的 SP油中而配制疫苗。

                       实施例2

评定对肌内注射测试疫苗的抗体应答

在该评定中，将选用的马随机分为4组：第一组20匹马以1×107 TCID50剂量(组织培养感染剂量)的测试疫苗给药；第二组20匹马 以5×107TCID50剂量的测试疫苗给药；第三组5匹马以1×108TCID50 剂量的测试疫苗给药；而第四组8匹马被维持作为未接种的环境对照。 接受处理的马根据其被指定的分组而接受第一剂量的疫苗。在第一剂 量给药后第21天，将相同疫苗的第二剂量进行给药。在第一剂量给药 和第二剂量给药时，以及在第二剂量给药后整个28天内每间隔一周， 都将所有的马放血获取其血清。

                        测试疫苗A   成分   浓度/剂量   体积/mL   灭活的西尼罗河病毒   MEM1   SP油   多粘菌素B2   新霉素   硫柳汞(5％)   1×107TCID50   NA   5％   30.0mcg/mL   30.0mcg/mL   1∶20,000   0.0347mL   0.9138mL   0.0500mL   0.0003mL   0.0003mL   0.0010mL

                        测试疫苗B   成分   浓度/剂量   体积/mL   灭活的西尼罗河病毒   MEM   SP油   多粘菌素B2   新霉素3   硫柳汞4(5％)   5×107TCID50   NA   5％   30.0mcg/mL   30.0mcg/mL   1∶20,000   0.1734mL   0.7752mL   0.0500mL   0.0002mL   0.0002mL   0.0010mL

                        测试疫苗C   成分   浓度/剂量   体积/mL   灭活的西尼罗河病毒   MEM1   SP油   多粘菌素B2   新霉素3   硫柳汞4(5％)   1×108TCID 50   NA   5％   30.0mcg/mL   30.0mcg/mL   1∶20,000   0.3467mL   0.6019mL   0.0500mL   0.0002mL   0.0002mL   0.0010mL

所得的血清学数据显示在下面的表1中，其中：0 DPV 1表示指 定为接种前第0天；14 DPV 2接种后第14天。NR表示没有结果。

从表1中的数据可以看出，来自所有组的接受处理的马都表现出 抗西尼罗河病毒抗体的显著增加，而对照组的马的抗体水平都维持在 很低乃至没有的水平。接受疫苗的马的应答水平不依赖于其接受的疫 苗中的抗原水平。

                        表1   测试   疫苗   剂量   (TC1D50)   实验#1   实验#2   0DPV1   14DPV2   0DPV1   14DPV2   A   A   A   1×107   1×107   1×107   ＜10   ＜10   ＜10   160   20   ≥320   ＜10   ＜10   ＜10   80   10   40

1 LTI，Grand Island，NY

2 Sigma，St.Louis，MO

3 Sigma，St.Louis，MO

4 Sigma，St.Louis，MO

  A   A   A   A   A   A   A   A   A   A   A   A   A   A   A   A   A   B   B   B   B   B   B   B   B   B   B   B   B   B   B   B   B   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   1×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   5×107   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ≥20   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜20   80   80   80   40   80   160   40   40   160   ≥320   ≥320   ≥320   160   ≥320   80   80   160   80   20   ≥320   80   ≥320   80   160   80   160   40   20   ≥320   ≥40   80   80   ≥320   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ≥320   40   160   40   80   80   10   10   40   NR*   NR   80   20   160   80   160   160   40   ＜10   160   ≥320   160   80   ≥320   40   40   80   20   160   ≥320   40   NR   80   B   B   B   B   C   C   C   C   C   对照   对照   对照   对照   对照   对照   对照   对照   5×107   5×107   5×107   5×107   1×108   1×108   1×108   1×108   1×108   0   0   0   0   0   0   0   0   ≥20   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   160   ≥320   ≥320   80   ≥320   ≥320   160   ≥320   40   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   80   160   ≥320   160   ≥320   160   80   NR   40   ＜10   ＜10   ＜10   NR   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10

                            实施例3

评定野外环境下测试疫苗在马中的安全性

在该评定中，通过肌内给药将6×106TCID50剂量的灭活的测试疫 苗作为1mL剂量接种给药来对200匹健康的雄性马和雌性马进行接 种，并且在3-4周后再进行第二个1mL剂量接种。用农场或圈养的传 统饲养方法来饲养接受处理的马。由兽医在接种后30分钟内对所有接 受处理的马的急性反应进行观察，例如流涎、呼吸困难或不规律、震 颤以及过敏性反应。在接种后两周内，每天都对马的所有延迟性反应 进行观察，例如嗜睡、厌食或注射部位的非正常肿胀。在第一次接种 当天(第0天)通过静脉穿刺采集5-10ml的血样，并且在第二次接种 后两周或两周以上的时间(36天或更多)再进行一次采集。用PRNT5 测试来完成血清学测定。

                    测试疫苗   成分   浓度/剂量   体积/mL   灭活的西尼罗河病毒   SP油   MEM1   6×106TCID50   5％   N/A   0.21mL   0.05mL   0.74mL

只有少于2％的马被观测到衰弱的临床体征。该评定证明本发明的 疫苗可安全用于野外环境中的马。

                        实施例4

评定野外环境下测试疫苗(多滴度和单滴度制剂)在马中的效力

对含有杀灭的西尼罗河病毒(WNV)的组合疫苗的抗试验性WNV侵 袭的效力进行鉴定。

总共30匹马被分为一个接种组(20匹马)和一个对照组(10匹 马)。每隔3周，使接种组中的马经肌内接种两个剂量的含有杀灭的 西尼罗河病毒(每剂量5×107TCI50，含有5％SP油)、流感病毒、脑 脊髓炎病毒(东方、西方以及委内瑞拉)、鼻肺炎病毒(血清型1和 血清型4)以及破伤风类毒素的测试疫苗。通过斑减少中和试验(PRNT) 对定期收集的血清样品进行抗体应答测定。在第二次接种后24天，用 WNV对所有的马进行皮下侵袭。侵袭后，监测马的直肠温度，并在两周 内每天对任何临床体征监测两次，然后每周检测一次病毒血症。在第 21和22DPC时将马无痛处死并进行尸体检验。对脑脊髓液(CSF)、 脊髓(颈髓、胸髓以及腰髓)和脑(前脑、后脑、延髓以及脑干)的 组织样进行大体病理学检测，并将其收集以用于病毒分离。

第二次接种后14天，75％的接种动物血清转变(滴度≥5)，其几 何平均滴度为10，而对照组动物保持阴性(滴度＜5)。接种为对抗病 毒血症(将发展成为成熟西尼罗河病毒病的前期)提供了重要的防御 作用。对照组动物中十匹中有九匹(90％)在侵袭后出现病毒血症，而 20匹接种动物中只有8匹(40％)出现暂时的病毒血症，或至多只持续 数天的病毒血症。重要的是，在整个观察期间，在侵袭接种动物中观 测不到任何的WNV的疾病临床体征。(在一匹对照马和两匹接种马中 观察到暂时的发热反应。但是，没有迹象表明这些反应是由WNV侵染 所致。)从一匹对照动物的脑组织中发现白质中的瘀点出血和硬膜下 出血。从其脑中分离出WNV，而从CSF样和脊髓样品中未能分离出WNV。 从其它侵袭的动物的任何组织样品中均未能分离出WNV。

研究结果表明，经测试组合疫苗接种的马对病毒血症和WNV病的 临床体征都产生了重要的防御作用。

第二项研究以与所述类似的方案进行操作，除了使用单价WNV疫 苗(仅有WNV疫苗)，以及在第二次接种后12个月时对所有马进行WNV 侵袭。对照组中的11匹中有9匹(81.8％)在侵袭后出现病毒血症。 在整个观察期间，在任何侵袭动物中都未发现任何WNV相关的临床体 征。由任何侵袭动物中收集到的任何组织或CSF样品中都未分离出 WNV。(在12个月的时期末进行的侵袭之前，对19匹接种马中的17 匹进行斑减少中和试验(PRNT)，其滴度为5或更高，而对照组保持阴 性(＜5)。)

第二次研究的结果表明，经杀灭的单价WNV疫苗接种的马对MNV 的侵袭产生了重要的防御作用(94％的可预防比例)。这些结果也表明 保护性免疫具有长持续时间。

                        实施例5

评定野外环境下DNA测试疫苗在马中的效力

本实施例证明了西尼罗河病毒(WNV)DNA疫苗的效力，该DNA疫 苗作为本发明又一实施方案的一部分。每2mL剂量的该DNA疫苗中含 有100μg纯化DNA，并添加了5％作为佐剂的SP油，然后鉴定该疫苗对 试验性WNV侵袭的保护作用。

为了配制该WNV DNA疫苗，从用购自Invitrogen(Carlsbad，CA) 的大肠杆菌DH10B作为宿主源并传代10次的培养物中收集细菌细胞， 该大肠杆菌DH10B含有自疾病控制中心(Fort Collins，CO)获得的 西尼罗河质粒pCBWN。将该细菌细胞悬浮于葡萄糖-tris-EDTA缓冲液 中，并用氢氧化钠和十二烷基袭酸钠裂解。裂解液经醋酸钾溶液中和。 用过滤法去除含有DNA、RNA、细胞碎片和蛋白的沉淀复合物。通过加 入异丙醇使滤出物沉淀。用离心法收集沉淀，并重悬于缓冲液中。再 用醋酸铵重复该过程。将沉淀收集物重悬于缓冲液中，并加到装有 Polyflo树脂的层析柱中。然后清洗所述层析柱，并且将质粒DNA从 柱子上洗脱下来。最后将洗脱液对磷酸盐缓冲液彻底透析。然后，纯 化的质粒DNA储液就可以运送用于共混。该测试疫苗含有100μg质粒 DNA，并添加了5％作为佐剂的SP油。

将用于试验的马随机分为两组：20匹接受WNV DNA疫苗，10匹作 为对照。第一组隔三周经两次2.0mL剂量的疫苗进行肌内接种。对照 马不接受任何接种疫苗或安慰剂。一组马(9匹接种马和5匹对照马) 在第二次接种后5周进行侵袭，而第二组马(11匹接种马和5匹对照 马)在第二次接种后12周进行侵袭。简单的说，使在对马进行侵袭之 前12天感染了WNV的白纹伊蚊至少能够吸食每匹马血5分钟。侵袭 后，将发现充满了马血的蚊子在-20℃冻存起来，随后将病毒量合并进 行滴定。然后将蚊子用稀释液涡旋匀浆。将匀浆液离心，然后去除上 清液以用于在Vero细胞上进行滴定。

侵袭后，至少进行9天的每天两次检查直肠温度，并且至少进行 21天的每天两次监测临床体征。在侵袭后(DPC)头9天每天采集血清 样品两次；从10-14DPC每天一次，然后在第21DPC进行最后一次。从 来自第一侵袭组0DPC-10DPC的血清样品和来自第二侵袭组0DPC- 11DPC的血清样品中完成病毒分离。第一组的14匹马和第二组的16 匹马分别在28-37DPC和29-38DPC时被无痛处死并进行尸体检验。收 集脑脊液(CSF)和来自大脑、小脑和脑干的组织样品用于进行大体病 理学检测和病毒分离。

第二次接种后14天，20匹接种马中有6匹具有可检测的滴度，该 滴度为2或更高，并且一匹马的滴度为5。接种疫苗为用蚊子进行的试 验性西尼罗河侵袭提供了防御作用。在5匹对照马中5匹都检测到病 毒血症，在第一侵袭组9匹接种马中有4匹检测到病毒血症，而第二 侵袭组中4/5的对照马和2/11的接种马被发现有病毒血症。检测到的 病毒血症是暂时性的，并且只在侵袭后头6天内发生。总的来说，在 对照马中发现9/10(90％)有病毒血症，而只有6/20(30％)的接种马 被检测到病毒血症。

在整个侵袭观察期，在任何试验马中都没有发现由WNV感染引起 的神经学体征。从任何一匹试验马收集的任何组织样品中都未能分离 出WNV。来自第一侵袭组的一匹在7DPC被无痛处死的马没有显示出任 何脑炎或脑膜炎的大体或显微镜迹象。

研究结果表明，经测试组合疫苗接种的马对病毒血症有显著的防 御作用。

本申请要求2001年7月27日提交的共同未决的美国申请系列号 60/308,334的优先权。