技术领域
[0001] 本
发明属
微生物领域,涉及一种绿僵菌菌株及其应用,具体的说,涉及一株防治棕榈害虫红棕象甲的绿僵菌及应用。
背景技术
[0002]红掠象甲(Rhynchophorus ferrugineus Oliv.)属于鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)掠榈象属 Rhynchophorus sp.,英文名为 Red Palm Weevil (简称 RPW),又称亚洲棕榈象甲、锈色棕榈象、椰子甲虫、椰子隐喙象、印度红棕象甲等。红棕象甲在国内主要分布于台湾、福建、香港、海南、广东、广西、上海、
云南、西藏(墨脱)等地。对红棕象甲进行
有害生物风险分析结果显示,其属于高风险有害生物,在我国很多地区易定殖,对我国的油棕、槟榔、椰子等棕榈作物威胁很大,在我国具有严重的经济危害性。
[0003] 目前已知的绿僵菌属
真菌(Metarhizum anisopliae var.anisopliae)能广泛寄生于大约8个目、30个科,总共200多种昆虫、
线虫和螨类体内,绿僵菌是在
生物防治上使用仅次于白僵菌的昆虫病原真菌,而绿僵菌属中又以金龟子绿僵菌应用最为广泛,在全世界各种生境中广泛的使用,在森林、农业作物以及公共卫生害虫中都用金龟子绿僵菌进行了效果的评估。绿僵菌真菌生防制剂最先使用在防控幢虫、叶蝶等一些害虫,Scholte E J等人在非洲的一些研究还发现,金龟子绿僵菌对疟疾的主要传播昆虫蚊子有着十分明显的防控效果。绿僵菌作为生防真菌中最重要的一种,它在使用上有着寄生物种多、适应性强、致病周期短、专一性强、对人类和牲畜不会造成毒害,以及环境友好型的特点。经检索,目前利用真菌控制红棕象甲尚未见到相关报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一株防治棕榈害虫红棕象甲的绿僵菌及应用。·[0005] 一株绿僵菌菌株,命名为金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae)WENCHANG-LV2,已于2013年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号;保藏编号=CGMCC N0.7692。
[0006] 本发明所提供的金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae) WENCHANG-LV2菌株,分离于自然感染的红棕象甲僵虫,经形态学、培养性状、常规生理生化和DNA序列鉴定,该菌株为金龟子绿僵菌小孢变种,是绿僵菌属真菌的一个新菌株,命名为金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae) WENCHANG-LV2。
[0007] 本发明所提供的金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae)WENCHANG_LV2的基本生物学特性为:
[0008] 菌株在平板SDAY培养基上划线培养后菌丝体呈透明状并且有隔膜;在SDAY培养基上初期为白色或淡黄色向黄色过度,形状为絮状或绒毛状突起,后期出现绿色为
基础色调的相邻色谱的
颜色;分生孢子梗呈
瓶颈状,有分叉,单生或多生交叉生长,相互缠绕成
围栏状。分生孢子每个大小为4.8〜9.3 μ mX 2.2〜3.1 μ m,长椭圆形,棒状,两端圆滑脱落的孢子多数聚集成团
块状。
[0009] 本发明所提供的金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae)WENCHANG_LV2的用途是其在防治红棕象甲中的应用。
[0010] 以本发明所提供的金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae)WENCHANG_LV2为活性成分的生物制剂也属本发明的保护范围。需要的时候,该制剂可以包含生物制剂制备的常用载体和辅料。
[0011] 本发明通过直接涂抹
给药的方法研究金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae)WENCHANG-LV2对红棕象甲的
杀虫活性,实验结果表明金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)WENCHANG-LV2对红棕象甲有很好的杀虫作用。表明该菌株是一株在防治红棕象甲上具有潜在意义的生防菌株。
[0012] 本发明通过对自然感染的红棕象甲僵虫中微生物的筛选分离,获得金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae) WENCHANG-LV2,经过杀虫试验表明该菌株对红棕象甲有很好的杀虫作用,可以有效地控制红棕象甲种群数量,减少损失,是一株在防治红棕象甲上具有潜在意义的生防菌株,具有杀虫毒
力强、杀虫效果好等特点,为我国棕榈科产业的发展提供帮助。
具体实施方式
[0013] 下面结合
实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0014] 实施例一菌株的筛选及其鉴定
[0015] 1、菌株的筛选`
[0016] 取采集好的红棕象甲僵虫样品,先用70%酒精消毒一分钟,无菌
水清洗后再用0.1%的氯化汞对感病样品进行表面消毒30s,无菌水清洗3次,挑取少许僵虫组织接种于分离SDAY培养基(4%
葡萄糖、1%蛋白胨、1%
酵母粉、2%琼脂及500 μ g/mL
链霉素),倒置于28 土 I °C恒温倒置培养3-4d,选取单孢子接种于纯化SDAY培养基(4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉及2%琼脂),每皿3点,呈三
角形排列,经单孢子纯化后获得具有杀虫作用的菌株,命名为金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae)WENCHANG_LV2,已于2013年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号;保藏编号:CGMCC N0.7692。
[0017] 2、菌株形态鉴定
[0018] 将分离纯化得到的菌株在直径为90mm的平板SDAY培养基上划线培养,放入28°C
培养箱中培养4-5天后,挑取幼嫩的白色菌丝制片在
显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗的形态;10_12天后挑取成熟的分生孢子制片并再次对比观察孢子的大小与形状;14天左右观察记录菌落的外观形态特征。菌株在SDAY培养基上产生孢子以前为白色或淡黄色向黄色过度,形状为絮状或绒毛状突起,随着时间的推移开始出现绿色为基础色调的相邻色谱的颜色。菌丝体呈透明状并且有隔膜。在感染死亡的僵虫身上一般初期成白色绒毛
覆盖,慢慢被深绿色的孢子所替代;分生孢子梗呈瓶颈状,有分叉,单生或多生交叉生长,相互缠绕成围栏状,紧密的大量聚集成分生孢子座。分生孢子每个大小为4.8-9.3 μ mX 2.2-3.1 μ m,长椭圆形,棒状,两端圆滑脱落的孢子多数聚集成团块状。
[0019] 3、菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类
[0020] 分别在28°C、200rpm/min条件下恒温摇床培养72h,用纱布抽滤收集菌丝,使用65°C水浴锅预热2%CTAB抽提缓冲液。刮取少量绿僵菌菌丝(约Ig)置于研钵中,用液氮磨至白色粉末;在
研磨好的粉末中,加入700ul的预热好的2%CTAB抽提缓冲液,缓慢搅动;将
混合液转移到1.5ml的灭菌离心管中,注意混合液的体积不要超过离心管的三分之二 ;放置于60°C的水浴摇床中,100rpm/min摇动Ih后取出备用;取出后常温冷却2min后,向离心管内加入氯仿-异戊醇(24:1)约0.5ml,缓慢摇匀使两者混合均匀;用移液枪吸取上清夜,转入含有600 μ I异丙醇的灭菌离心管内,将离心管缓慢摇动30sec,不可剧烈晃动,防治损坏DNA使水层与异丙醇充分混合,直至能够见到DNA絮状物悬浮物;继续IOOOOrpm离心Imin后,缓慢吸出清液体倒掉保留沉淀,注意白色沉淀为DNA切勿倒出,将离心管倒立放置于铺开的纸巾上吸取剩余液体;lmin后,直立离心管,加入80 μ 15Μ的
醋酸钠及加入720 μ I的75%的
乙醇,轻轻晃动,用
手指弹管底,使管底与沉淀的DNA悬浮物漂浮于液体中;放置30min,使DNA悬浮物的不纯物逐渐溶解;再次IOOOOrpm离心30sec后,倒掉上清液,再加入75%的乙醇,将沉淀物再洗30min ;IOOOOrpm离心30sec后,立即倒掉上清液,自然干燥DNA沉淀(超净台吹风);将DNA沉淀溶解于Iml无菌水中,加入RNA酶(终浓度50 μ g/ml ),使DNA充分溶解,_20°C保存备用。
[0021] 采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS4(5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ' )ITS5(5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 ')扩增致病菌的ITS1-5.8s-1TS2rDNA区段,由深圳华大基因公司合成。PCR仪:takara公司。PCR 反应体系(50 μ L):50ng DNA 模板,IOXPCR buffer5 μ L,10pmol/L 引物 ITS4 和 ITS5各 I μ L,10mmol/L dNTPsl μ L,4U/μ L Taq DNA 聚合酶 I μ L,加 ddH20 补足至 50 μ L。PCR反应条件:94°C 5min, I 个循环;94°C 30sec,52°C 30sec,72°C 30sec,29 个循环;72°C延伸IOmin, I个循环;PCR产物送上海生`工生物公司进行测序。采用DNAMAN5.2
软件的MultipleSequence Alignment进行rDNA_ITS同源性分析,并构建系统发育树发育树的构型和
稳定性用DNAMAN5.2软件取样分析1`000次,进行Bootstrap值分析和评价。分子生物学鉴定结果显示该菌株的ITS序列与金龟子绿僵菌属的相似性最高,为99%。
[0022] 4、菌株产孢特性
[0023] 将浓度为I X 108cfu/ml的WENCHANG-LV2孢子悬浮液接种在SDAY平板培养基上(10(^1/皿),在不同
温度20°〇、221:、241:、251:、261:、271:、281:、291:、301:、351:的培养条件下培养15天后测定单位面积上的产孢量,确定WENCHANG-LV2菌株在28°C条件下产孢子量为最佳。
[0024] 实施例二菌株对红棕象甲室内杀虫活性测定
[0025] 取分离纯化培养好的金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae) WENCHANG-LV2菌株,将分生孢子粉装入IOml无菌离心管中,加入5mL0.1 %吐温80无菌水后,用涡旋
振荡器振荡15min混匀,然后用血球计数板测定每毫升悬浮液中孢子个数,通过适当调整,将菌株配置成孢子浓度为1.0X IO8个/mL,保存于4°C
冰箱中保存备用。将金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae)WENCHANG-LV2菌株的孢子以梯度稀释的方法配成5个浓度的油剂,浓度分别是 1.0X IO8,5X IO7,2.5XlO7U.25X 107、6.25X IO6 个/ml。孢子油悬浮液配制方法是:刮取菌株分生孢子粉,以
棕榈油和精制
椰子油10:1的比例加入混合油剂,用涡旋振荡器振荡15min混匀成高浓度的孢子油悬浮液,用血球计数板测定孢子含量,再稀释成系列孢子含量的油剂。用Iml移液枪吸取Iml孢子油悬浮液涂抹于幼虫腹部后,再将它们转移到
饲料中,置于28°C、
相对湿度80%人工
气候箱中饲养。每处理试虫15头,3次重复。处理后每24h观察I次,记录死亡虫数,直至处理后第15d,以纯混合油剂同样处理为对照饲养,并对死虫进行保湿培养,根据虫尸体表面长出的特征菌丝确定试虫是否为真菌侵染致死,结果见表I。由室内实验结果可以看出,WENCHANG-LV2菌株对红棕象甲具有致死作用,其半致死浓度为6.05 X 106cfu/ml。
[0026] 表I菌株不同浓度15天后对红棕象甲幼虫的生物活性测定
[0027]
[0028] 实施例三菌株室外防治效果
[0029] 将金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae) WENCHANG-LV2菌株的油剂带至田间,用混合油稀释至含分生孢子I X IO8个/mL,并搅拌均匀,超低量喷雾。
[0030] 2013年5月6日开始喷雾防治,当时天晴,气温34,°C微风,喷雾时侧风夹角为50°,雾滴在树头(生长点附近)上分布较多且均匀,覆盖
密度平均23.8滴/ cm3。每周检查一次,每次选取受害状相同的3株椰子树解剖,统计活虫和感染死虫数量,结果见表2。由结果看出在处理15天后,树干内幼虫的存活率开始显著下降,40天后存活率仅为41.25%,表明金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae) WENCHANG-LV2具有较强的杀虫
毒力,且杀虫效果好,可以有效地控制红棕象甲种群数量,减少损失,是一株在防治红棕象甲上具有潜在意义的生防菌株。
[0031] 表2.菌株野外对红棕象甲的生物活性测定
[0033] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。