一株防治棕榈害虫红棕象甲的绿僵菌及应用
阅读：53发布：2020-05-23
专利汇可以提供一株防治棕榈害虫红棕象甲的绿僵菌及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一株防治棕榈 害虫 红棕象甲 的绿僵菌及应用，该菌株命名为金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2，已于2013年6月9日保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.7692。本发明所提供的金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2的用途是其在防治红棕象甲中的应用，通过直接涂抹 给药 的试验，表明金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2对红棕象甲有很好的杀虫作用，可以有效地控制红棕象甲种群数量，是一株在防治红棕象甲上具有潜在意义的生防菌株，为我国棕榈产业的发展提供帮助。，下面是一株防治棕榈害虫红棕象甲的绿僵菌及应用专利的具体信息内容。
一株防治棕榈害虫红棕象甲的绿僵菌及应用
技术领域
背景技术
[0002] 红棕象甲(Rhynchophorus ferrugineus Oliv.)属于鞘翅目（Coleoptera）象甲科（Curculionidae）棕榈象属Rhynchophorus sp.,英文名为Red Palm Weevil(简称RPW)，又称亚洲棕榈象甲、锈色棕榈象、椰子甲虫、椰子隐喙象、印度红棕象甲等。红棕象甲在国内主要分布于台湾、福建、香港、海南、广东、广西、上海、云南、西藏(墨脱)等地。对红棕象甲进行有害生物风险分析结果显示，其属于高风险有害生物，在我国很多地区易定殖，对我国的油棕、槟榔、椰子等棕榈作物威胁很大，在我国具有严重的经济危害性。
[0003] 目前已知的绿僵菌属真菌（Metarhizum anisopliae var.anisopliae）能广泛寄生于大约8个目、30个科，总共200多种昆虫、线虫和螨类体内，绿僵菌是在生物防治上使用仅次于白僵菌的昆虫病原真菌，而绿僵菌属中又以金龟子绿僵菌应用最为广泛，在全世界各种生境中广泛的使用，在森林、农业作物以及公共卫生害虫中都用金龟子绿僵菌进行了效果的评估。绿僵菌真菌生防制剂最先使用在防控蝗虫、叶蝉等一些害虫，Scholte E J等人在非洲的一些研究还发现，金龟子绿僵菌对疟疾的主要传播昆虫蚊子有着十分明显的防控效果。绿僵菌作为生防真菌中最重要的一种，它在使用上有着寄生物种多、适应性强、致病周期短、专一性强、对人类和牲畜不会造成毒害，以及环境友好型的特点。经检索，目前利用真菌控制红棕象甲尚未见到相关报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一株防治棕榈害虫红棕象甲的绿僵菌及应用。
[0005] 一株绿僵菌菌株，命名为金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2，已于2013年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC NO.7692。
[0006] 本发明所提供的金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2菌株，分离于自然感染的红棕象甲僵虫，经形态学、培养性状、常规生理生化和DNA序列鉴定，该菌株为金龟子绿僵菌小孢变种，是绿僵菌属真菌的一个新菌株，命名为金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2。
[0007] 本发明所提供的金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2的基本生物学特性为：
[0008] 菌株在平板SDAY培养基上划线培养后菌丝体呈透明状并且有隔膜；在SDAY培养基上初期为白色或淡黄色向黄色过度，形状为絮状或绒毛状突起，后期出现绿色为基础色调的相邻色谱的颜色；分生孢子梗呈瓶颈状，有分叉，单生或多生交叉生长，相互缠绕成围栏状。分生孢子每个大小为4.8～9.3μm×2.2～3.1μm，长椭圆形，棒状，两端圆滑脱落的孢子多数聚集成团块状。
[0009] 本发明所提供的金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2的用途是其在防治红棕象甲中的应用。
[0010] 以本发明所提供的金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2为活性成分的生物制剂也属本发明的保护范围。需要的时候，该制剂可以包含生物制剂制备的常用载体和辅料。
[0011] 本发明通过直接涂抹给药的方法研究金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2对红棕象甲的杀虫活性，实验结果表明金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2对红棕象甲有很好的杀虫作用。表明该菌株是一株在防治红棕象甲上具有潜在意义的生防菌株。
[0012] 本发明通过对自然感染的红棕象甲僵虫中微生物的筛选分离，获得金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2，经过杀虫试验表明该菌株对红棕象甲有很好的杀虫作用，可以有效地控制红棕象甲种群数量，减少损失，是一株在防治红棕象甲上具有潜在意义的生防菌株，具有杀虫毒力强、杀虫效果好等特点，为我国棕榈科产业的发展提供帮助。
具体实施方式
[0013] 下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0014] 实施例一菌株的筛选及其鉴定
[0015] 1、菌株的筛选
[0016] 取采集好的红棕象甲僵虫样品，先用70%酒精消毒一分钟，无菌水清洗后再用0.1%的氯化汞对感病样品进行表面消毒30s，无菌水清洗3次，挑取少许僵虫组织接种于分离SDAY培养基（4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉、2%琼脂及500μg/mL链霉素），倒置于
28±1℃恒温倒置培养3-4d，选取单孢子接种于纯化SDAY培养基（4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉及2%琼脂），每皿3点，呈三角形排列，经单孢子纯化后获得具有杀虫作用的菌株，命名为金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2，已于2013年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC NO.7692。
28±1℃恒温倒置培养3-4d，选取单孢子接种于纯化SDAY培养基（4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉及2%琼脂），每皿3点，呈三角形排列，经单孢子纯化后获得具有杀虫作用的菌株，命名为金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2，已于2013年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC NO.7692。
[0017] 2、菌株形态鉴定
[0018] 将分离纯化得到的菌株在直径为90mm的平板SDAY培养基上划线培养，放入28℃培养箱中培养4-5天后，挑取幼嫩的白色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗的形态；10-12天后挑取成熟的分生孢子制片并再次对比观察孢子的大小与形状；14天左右观察记录菌落的外观形态特征。菌株在SDAY培养基上产生孢子以前为白色或淡黄色向黄色过度，形状为絮状或绒毛状突起，随着时间的推移开始出现绿色为基础色调的相邻色谱的颜色。菌丝体呈透明状并且有隔膜。在感染死亡的僵虫身上一般初期成白色绒毛覆盖，慢慢被深绿色的孢子所替代；分生孢子梗呈瓶颈状，有分叉，单生或多生交叉生长，相互缠绕成围栏状，紧密的大量聚集成分生孢子座。分生孢子每个大小为
4.8-9.3μm×2.2-3.1μm，长椭圆形，棒状，两端圆滑脱落的孢子多数聚集成团块状。
4.8-9.3μm×2.2-3.1μm，长椭圆形，棒状，两端圆滑脱落的孢子多数聚集成团块状。
[0019] 3、菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类
[0020] 分别在28℃、200rpm/min条件下恒温摇床培养72h，用纱布抽滤收集菌丝，使用65℃水浴锅预热2%CTAB抽提缓冲液。刮取少量绿僵菌菌丝（约1g）置于研钵中，用液氮磨至白色粉末；在研磨好的粉末中，加入700ul的预热好的2%CTAB抽提缓冲液，缓慢搅动；将混合液转移到1.5ml的灭菌离心管中，注意混合液的体积不要超过离心管的三分之二；放置于60℃的水浴摇床中，100rpm/min摇动1h后取出备用；取出后常温冷却2min后，向离心管内加入氯仿-异戊醇（24：1）约0.5ml，缓慢摇匀使两者混合均匀；用移液枪吸取上清夜，转入含有600μl异丙醇的灭菌离心管内，将离心管缓慢摇动30sec，不可剧烈晃动，防治损坏DNA使水层与异丙醇充分混合，直至能够见到DNA絮状物悬浮物；继续10000rpm离心
1min后，缓慢吸出清液体倒掉保留沉淀，注意白色沉淀为DNA切勿倒出，将离心管倒立放置于铺开的纸巾上吸取剩余液体；1min后，直立离心管，加入80μl5M的醋酸钠及加入720μl的75%的乙醇，轻轻晃动，用手指弹管底，使管底与沉淀的DNA悬浮物漂浮于液体中；放置
30min，使DNA悬浮物的不纯物逐渐溶解；再次10000rpm离心30sec后，倒掉上清液，再加入
75%的乙醇，将沉淀物再洗30min；10000rpm离心30sec后，立即倒掉上清液，自然干燥DNA沉淀（超净台吹风）；将DNA沉淀溶解于1ml无菌水中，加入RNA酶（终浓度50μg/ml），使DNA充分溶解，-20℃保存备用。
1min后，缓慢吸出清液体倒掉保留沉淀，注意白色沉淀为DNA切勿倒出，将离心管倒立放置于铺开的纸巾上吸取剩余液体；1min后，直立离心管，加入80μl5M的醋酸钠及加入720μl的75%的乙醇，轻轻晃动，用手指弹管底，使管底与沉淀的DNA悬浮物漂浮于液体中；放置
30min，使DNA悬浮物的不纯物逐渐溶解；再次10000rpm离心30sec后，倒掉上清液，再加入
75%的乙醇，将沉淀物再洗30min；10000rpm离心30sec后，立即倒掉上清液，自然干燥DNA沉淀（超净台吹风）；将DNA沉淀溶解于1ml无菌水中，加入RNA酶（终浓度50μg/ml），使DNA充分溶解，-20℃保存备用。
[0021] 采 用 真 菌 核 糖 体 基 因 转 录 间 隔 区（ITS） 通 用 引 物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)扩增致病菌的ITS1-5.8s-ITS2rDNA区段，由深圳华大基因公司合成。PCR仪：takara公司。
PCR反应体系（50μL）：50ng DNA模板，10×PCR buffer5μL，10pmol/L引物ITS4和ITS5各1μL，10mmol/L dNTPs1μL，4U/μL Taq DNA聚合酶1μL，加ddH2O补足至50μL。PCR反应条件：94℃5min，1个循环；94℃30sec，52℃30sec，72℃30sec，29个循环；72℃延伸
10min，1个循环；PCR产物送上海生工生物公司进行测序。采用DNAMAN5.2软件的Multiple Sequence Alignment进行rDNA-ITS同源性分析，并构建系统发育树发育树的构型和稳定性用DNAMAN5.2软件取样分析1000次，进行Bootstrap值分析和评价。分子生物学鉴定结果显示该菌株的ITS序列与金龟子绿僵菌属的相似性最高，为99%。
PCR反应体系（50μL）：50ng DNA模板，10×PCR buffer5μL，10pmol/L引物ITS4和ITS5各1μL，10mmol/L dNTPs1μL，4U/μL Taq DNA聚合酶1μL，加ddH2O补足至50μL。PCR反应条件：94℃5min，1个循环；94℃30sec，52℃30sec，72℃30sec，29个循环；72℃延伸
10min，1个循环；PCR产物送上海生工生物公司进行测序。采用DNAMAN5.2软件的Multiple Sequence Alignment进行rDNA-ITS同源性分析，并构建系统发育树发育树的构型和稳定性用DNAMAN5.2软件取样分析1000次，进行Bootstrap值分析和评价。分子生物学鉴定结果显示该菌株的ITS序列与金龟子绿僵菌属的相似性最高，为99%。
[0022] 4、菌株产孢特性
[0023] 将浓度为1×108cfu/ml的WENCHANG-LV2孢子悬浮液接种在SDAY平板培养基上（100μl/皿），在不同温度20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、35℃的培养条件下培养15天后测定单位面积上的产孢量，确定WENCHANG-LV2菌株在28℃条件下产孢子量为最佳。
[0024] 实施例二菌株对红棕象甲室内杀虫活性测定
[0025] 取分离纯化培养好的金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2菌株，将分生孢子粉装入10ml无菌离心管中，加入5mL0.1％吐温80无菌水后，用涡旋振荡器振荡15min混匀，然后用血球计数板测定每毫升悬浮液中孢子个数，通过适当调整，将8
菌株配置成孢子浓度为1.0×10 个/mL，保存于4℃冰箱中保存备用。将金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2菌株的孢子以梯度稀释的方法配成5个浓度的油
8 7 7 7 6
剂，浓度分别是1.0×10、5×10、2.5×10、1.25×10、6.25×10 个/ml。孢子油悬浮液配制方法是：刮取菌株分生孢子粉，以棕榈油和精制椰子油10:1的比例加入混合油剂，用涡旋振荡器振荡15min混匀成高浓度的孢子油悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，再稀释成系列孢子含量的油剂。用1ml移液枪吸取1ml孢子油悬浮液涂抹于幼虫腹部后，再将它们转移到饲料中，置于28℃、相对湿度80％人工气候箱中饲养。每处理试虫15头，3次重复。处理后每24h观察1次，记录死亡虫数，直至处理后第15d，以纯混合油剂同样处理为对照饲养，并对死虫进行保湿培养，根据虫尸体表面长出的特征菌丝确定试虫是否为真菌侵染致死，结果见表1。由室内实验结果可以看出，WENCHANG-LV2菌株对红棕象甲具有致死作
6
用，其半致死浓度为6.05×10cfu/ml。
菌株配置成孢子浓度为1.0×10 个/mL，保存于4℃冰箱中保存备用。将金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2菌株的孢子以梯度稀释的方法配成5个浓度的油
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剂，浓度分别是1.0×10、5×10、2.5×10、1.25×10、6.25×10 个/ml。孢子油悬浮液配制方法是：刮取菌株分生孢子粉，以棕榈油和精制椰子油10:1的比例加入混合油剂，用涡旋振荡器振荡15min混匀成高浓度的孢子油悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，再稀释成系列孢子含量的油剂。用1ml移液枪吸取1ml孢子油悬浮液涂抹于幼虫腹部后，再将它们转移到饲料中，置于28℃、相对湿度80％人工气候箱中饲养。每处理试虫15头，3次重复。处理后每24h观察1次，记录死亡虫数，直至处理后第15d，以纯混合油剂同样处理为对照饲养，并对死虫进行保湿培养，根据虫尸体表面长出的特征菌丝确定试虫是否为真菌侵染致死，结果见表1。由室内实验结果可以看出，WENCHANG-LV2菌株对红棕象甲具有致死作
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用，其半致死浓度为6.05×10cfu/ml。
[0026] 表1菌株不同浓度15天后对红棕象甲幼虫的生物活性测定
[0027]
[0028] 实施例三菌株室外防治效果
[0029] 将金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2菌株的油剂带至田间，8
用混合油稀释至含分生孢子1×10 个/mL，并搅拌均匀，超低量喷雾。
用混合油稀释至含分生孢子1×10 个/mL，并搅拌均匀，超低量喷雾。
[0030] 2013年5月6日开始喷雾防治，当时天晴，气温34，℃微风，喷雾时侧风夹角为3
50°，雾滴在树头（生长点附近）上分布较多且均匀，覆盖密度平均23.8滴／cm。每周检查一次，每次选取受害状相同的3株椰子树解剖，统计活虫和感染死虫数量，结果见表2。由结果看出在处理15天后，树干内幼虫的存活率开始显著下降，40天后存活率仅为41.25%，表明金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2具有较强的杀虫毒力，且杀虫效果好，可以有效地控制红棕象甲种群数量，减少损失，是一株在防治红棕象甲上具有潜在意义的生防菌株。
50°，雾滴在树头（生长点附近）上分布较多且均匀，覆盖密度平均23.8滴／cm。每周检查一次，每次选取受害状相同的3株椰子树解剖，统计活虫和感染死虫数量，结果见表2。由结果看出在处理15天后，树干内幼虫的存活率开始显著下降，40天后存活率仅为41.25%，表明金龟子绿僵菌（Metarhizum anisopliae）WENCHANG-LV2具有较强的杀虫毒力，且杀虫效果好，可以有效地控制红棕象甲种群数量，减少损失，是一株在防治红棕象甲上具有潜在意义的生防菌株。
[0031] 表2.菌株野外对红棕象甲的生物活性测定
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