一、技术领域 免疫学器官移植分型配型。

                              二、发明背景

组织器官移植中排斥反应是生物机体免疫系统对外来移植物(非已)产生的免疫应答反 应。当移植物细胞表面的蛋白成分(非已抗原)与受者免疫系统接触时，通过免疫识别这些 非已抗原成分并激发受者体液免疫系统、细胞免疫系统对移植物发动免疫攻击，破坏、排斥 非已移植物，导致组织器官移植失败。

器官移植中，受者免疫系统通过MHC(组织相溶性复合物)识别机制对移植物MHC表 型及短肽复合物进行双重免疫识别。在人类MHC称为人类白细胞抗原(HLA)，如果移植供 者与受者HLA型别不相符合，则受者免疫系统将移植物识别为非已并对其发生免疫应答，导 致“免疫排斥反应”。

在免疫排斥反应中，超急性排斥反应主要由受者体液免疫成分即受者体内在移植前已经 存在的针对供者HLA的抗体分子所介导。这些抗体由受者怀孕、接受输血、器官移植等使其 免疫系统接触非已HLA分子而产生。这类抗体的特征是能迅速与供者HLA结合并通过固定补 体，激活补体系统发生级联反应，诱发CDC效应。这种超急性排斥反应发生异常迅速，通常 为几分钟到数小时，而急性、慢性免疫排斥反应由受者的体液免疫及细胞免疫系统同时介入。 因此，为了预防器官移植中免疫排斥反应的发生，除尽量选择HLA型别与受者HLA型别相匹 配的供者外，在移植前利用供者淋巴细胞与受者血清进行交叉配型，以鉴别受者体内是否存 在针对供者HLA的抗体是预防超急性排斥反应发生的关键。同时，在器官移植后，对受者体 内HLA抗体的检测，包括PRA(群体反应性HLA抗体)测定对急性、慢性排斥反应发生的监 测以及移植后受者生存期限的预测具有极其重要的价值。

根据抗体是否能够固定激活补体，诱发CDC效应与否，人类HLA抗体主要可分为两类： 一类为与相应的HLA结合后可固定补体并激活补体系统诱发CDC效应，该类HLA抗体称补体 固定性HLA抗体(CFAbs：Complement Fixing Antibodies)；其在诱发免疫排斥反应中的作用 已十分明确，是直接导致免疫排斥反应的体液免疫成分；而另一类HLA抗体，虽能与HLA发 生特异性结合，但并不固定补体，不激发CDC效应，称为非补体固定抗体(Non-CFAbs； Non-Complement Fixing Antibodies)。此类抗体甚至在机体免疫系统没有接触任何非已HLA的 情况下，以天然形式存在于人类身体内；并可与自身的HLA分子结合(也可与非已HLA分子 结合)但并不激活补体，诱发免疫攻击效应。迄今，人们对这类抗体的作用并不十分明了。 但多数学者认为，这些抗体属于一种天然抗体(Natural Antibody)成分，对生物体具有保 护作用。美国、法国等曾对此作过较为深入的研究。体外大量实验以及临床实验都获得完全 一致结论：即正常人体内存在天然抗体，由于其具有免疫调节功能，对维持生物机体健康发 挥某种有益的保护作用(Protection Effects)并可有效地应用于抑制器官移植中的免疫排 斥反应。

目前，国际上对HLA抗体测定的方法分为两类：一类为Terasaki’s微量淋巴细胞毒性试 验，简称为CDC血清学方法，是一种普遍认为经典的标准CDC测定方法。该方法以CDC诱发 的淋巴细胞死亡率作为评判标准，其主要特征是直接测定由CFAbs诱发的CDC最终效应，为 一种CDC生物效应测定方法。该方法已广泛应用于临床器官移植的交叉配型以及PRA测定； 但其存在费时长、技术复杂、实验条件不易控制等很多缺点。另一类方法可同时测定CFAbs 和Non-CFAbs；包括流式细胞仪测定结合于细胞表面的抗体测定法，或以纯化的HLA包 被固相颗粒的抗HLA抗体测定法；以及使用纯化HLA包被96孔微孔板测定结合HLA的抗 体ELISA方法等。这些方法最大的缺点是忽略了天然HLA抗体的存在，即通常为Non-CFAbs， 它们并不引起CDC效应；相反，这些抗体与相应的HLA结合后，可封闭该HLA抗原位点， 阻止HLA毒性抗体-CFAbs与相应HLA的结合，从而阻断随之发生的CDC效应，使受者 产生对移植物的免疫耐受。这就是为什么许多实验室经常得出令人难以解释或与CDC血清学 相互矛盾的结果，甚至与受者临床转归完全相反的结果：如接受IVIG抑制免疫排斥反应治疗 的受者，上述方法结果持续阳性，而临床病人病情正常或转好。另外，在临床器官移植中， 该类方法结果经常引起对供者选择的误导，致使某些急待器官移植的患者错过移植机会而病 情恶化甚至死亡。

目前所有测定HLA抗体的方法另一明显不足是所需时间较长，这在尸体供者器官移植中 是导致移植失败的首要原因。

综上所述，组织交叉配型在器官移植前，对受者体内已经存在的CFAbs测定，是决定器 官移植成败的关键因素之一；在器官移植后，是监测受者有无免疫排斥的重要指标；同时， 对移植受者的病情转归具有预测作用。

目前，国际上普遍使用的上述测定HLA抗体的组织交叉配型方法，均不能充分满足以上 要求。因此，建立一种简便、快速、准确、灵敏、稳定的CFAbs测定的标准化方法成为器官 移植中的迫切需要。

本发明根据免疫学CDC的发生原理，即CDC发生必须由HLA抗体结合于相应的靶细 胞，继而固定第一种补体成分激活补体的经典途径或/和旁路途径，在一系列酶和多种因子 的参与下，发生补体激活的级联反应，直至形成膜攻击物(MAC)，使生物细胞膜受损，形 成小孔导致细胞内渗透压降低，细胞溶解、死亡。由于CFAbs固定补体的相对数量与样品 CFAbs浓度及CDC效应程度成正相关关系，因此，测定HLA-CFAbs固定补体的水平或测 量补体活化途径中任一因子或补体本身及其复合物，一方面可直接反映HLA-CFAbs的有无 或相对浓度，另一方面可间接反映CDC效应或细胞损伤、死亡的相对程度及数量。

由于本发明测定的对象为CDC发生最初始阶段的HLA-CFAbs-补体复合物成分，因此 该方法需要的反应时间相对现存的方法为最短。

由于本发明采用荧光标记作为示踪物，因此具有极高的灵敏度。

由于本发明利用受者自身血清中存在的补体作为反应测量对象，且反应系统主要组成部 分为受者血清和供者细胞；因此，最能真实地模拟受者体内的生理内环境。

由于血清中CFAbs及补体成分在低温状态下，活性能得以长期保存(数年)，因此本方 法具有方法学上的稳定性及很好的重复性。

由于采用流式细胞仪为分析测量工具，因此同一反应系统中，可同时对发生在同一细胞 的CDC效应进行单或/和多标记相对定量测量，并可同时对发生在多种不同细胞群体的CDC 效应进行分别测定。最后还可对收集数据进行统计学分析处理，给出科学、准确、可靠的结 果；永久储存试验资料。

综上所述，本发明所建立的CFAbs交叉配型方法综合了现存多种交叉配型方法学上的主 要优点，弥补了其不足，具有理论上的合理性，并在实际交叉配型实验中得到了与理论基础 完全吻合的一致性结果。 例一、直接交叉配型方法： 1、在反应试管中加入一定量器官移植供者(以下简称供者)的有核细胞； 2、在上述试管中加入一定量器官移植受者(以下简称受者)的血清； 3、经温育一定时间后，以洗涤液对细胞进行洗涤； 4、将细胞重新悬浮在含有至少一种荧光标记抗补体抗体(如FITC-抗C1q和/或C3 抗体等)的缓冲液中； 5、加入含有至少一种另一荧光标记的抗细胞表面蛋白成分的抗体(如PE-抗CD3抗体、 PerCP抗CD19或CD20抗体)的缓冲液； 6、经温育一定时间后，对细胞进行洗涤； 7、将细胞悬浮在一定缓冲液中； 8、以流式细胞仪对细胞样品进行收集、分析，最后对样品中特定的各细胞群表面抗补体抗体 的荧光强度结果进行相应分析计算，与正常对照样品比较，给出交叉配型的半定量结果； 9、交叉配型结果可表达为：T淋巴细胞交叉型阴性或阳性；B淋巴细胞交叉配型阴性或阳性； 巨噬细胞交叉配型阴性或阳性；单个核细胞交叉配型阴性或阳性；中性粒细胞交叉配型阴 性或阳性等。 例二、间接交叉配型方法(一) 1、将受体血清经56℃处理30分钟处理灭活补体； 2、步骤同例一中1、2，但与例一步骤2中不同的是加入一定量经补体灭活处理的受者血清； 3、再加入一定量的补体成分(为人类补体或动物补体，通常为C1q或C3)； 4、以下步骤同例一中步骤3、4、5、6、7、8、9。 间接交叉配型方法(二) 1、同间接交叉配型方法(一)中1、2； 2、在上述反应中加入一定量荧光标记的补体成分； 3、步骤同例一中步骤6、7、8、9。 例三、固相HLA抗原颗粒测定CFAbs的流式细胞仪方法(一) 1、在反应试管中加入一定量包被有已知特定HLA抗原如HLA-I类、HLA-II类的 固相颗粒； 2、再加一定量的补体成分； 3、同例一中步骤3、4，但此时“细胞”为HLA包被的颗粒； 4、将上述颗粒混悬于含有一定量荧光标记的抗补体抗体的缓冲液中； 5、同例一中步骤6、7、8，其中“细胞”为HLA抗原包被的固相颗粒； 6、根据固相颗粒包被的HLA抗原成分不同，结果可表示为：HLA-I类CFAbs或/和HLA -II类CFAbs阴性或/和阳性。 注：*上述同一反应系统中固相颗粒可为一种或一种以上，不同大小，分别包被有已知特定 的纯化HLA抗原颗粒或同一大小但含不同标记(如含荧光不同)的一种或一种以上的颗粒并 分别包被已知特定的纯化HLA抗原，借此在流式细胞仪上获得分类测定。 固相HLA抗原颗粒测定CFAbs的流式细胞仪方法(二) 1、同例三步骤1； 2、再加入荧光标记的补体，如FITC-C1q或/和FITC-C3等； 3、同例三中步骤5、6。 例四、抗血管内皮细胞的CFAbs流式细胞仪测定方法 方法(一)： 1、在试管中加入一定数量人血管内皮细胞(如培养的细胞系)； 2、同例一中步骤2、3、4、5、6、7、8； 3、交叉配型结果表达为：内皮细胞交叉配型阴性或阳性。 方法(二)： 1、将受者血清经56℃处理30分钟灭活补体； 2、同例四方法(一)中的步骤1； 3、加入一定量步骤1中的经补体灭活处理的血清； 4、加入一定量的补体成分(如C1q、C3等)； 5、同例一中步骤3、4、5、6、7、8； 6、同例四方法(一)中步骤3。 方法(三)： 1、同例四方法中步骤1、2、3； 2、加入一定量荧光标记的补体成分(如C1q、C3等)； 3、同例一中步骤6、7、8； 4、同例四方法(一)中步骤3。

                            三、发明内容

本发明所建立的方法为一种HLA-CFAbs测定的流式细胞仪组织交叉配型方法，其通过 测定由CFAbs所固定在细胞膜表面补体的存在及其水平，达到对HLA-CFAbs及其所诱发 CDC效应程度的测量。该方法除可用于器官移植中供者、受者的交叉配型外；根据相同原理 及其方法学，可用于其它任何一种需要评估CDC效应或补体其它效应的类似试验，具有方法 学的通用性。 本发明所建立的CDC-FXM方法试剂盒包括以下主要组成部分： (一)、样品：

1、液相部分：包括可能含有CFAbs或含有引起补体固定的任何蛋白或其它成分的液体，如 所有生物体液、组织、细胞提取液或人为配制的类似液体。

2、固体成分：为可能导致CFAbs或补体直接或间接结合其上的任何具有一定几何形态的物 质成分。包括一种或一种以上相同或不同几何形态的固体成分存在于同一反应系统，并可 在流式细胞仪上进行分类鉴别测定的任何人工合成或天然存在的非生物固体成分和生物 固体成分；如人工合成不同大小的球状颗粒或相同大小但带有在流式细胞仪上可测量的不 同标记球状颗粒等；生物体内的各种固体成分包括各种细胞、血小板、细菌等。 (二)、标记示踪物：

反应系统中，至少包含一种可被流式细胞仪测量的标记，通常为各种荧光标记的所有补 体成分，以及参与或与补体激活级联反应的各种直接成分或间接成分；或针对上述成分的 各种荧光标记抗体。反应系统中如采用荧光补体成分作为示踪物，可直接对结合在固相颗 粒或细胞表面的标记补体进行直接测量；如在反应系统中使用标记的抗补体或抗其它参与 补体反应的成分抗体，可实现对CFAbs固定补体的间接测量。如在反应系统中，使用一种 或多种不同与以上荧光标记的针对细胞膜表面特征性成分(如CD系列标记、受体等)的抗 体便可实现在流式细胞仪上对同一反应系统中的不同成分进行分类测量，(如T淋巴细胞、 B淋巴细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞、杂交瘤细胞、各种干细胞、基因重组细胞等)。

                           四、具体实施方式 本发明建立的典型方法学大致分为以下主要步骤(以HLA交叉配型为例)： 一、反应系统设定：

(一)、温育反应：受者血清(含各种抗体成分和补体C1q、C3等)与供者有核细胞(包括 淋巴细胞、巨噬细胞、多形核中性粒细胞、单核细胞等)共同温育5分钟以上，温 育温度控制在零上1℃到50℃之间。通常为4℃或室温(25℃±)或37℃。通过 温育，受者血清中的HLA抗体结合于供者细胞表面的HLA分子，受者血清中的补体 成分可选择性地固定在结合在细胞膜表面CFAbs的特定区域。

(二)、洗涤：洗涤液可选用含有不影响细胞形态、活性和不具有解离细胞-CFAbs-补体复 合物的生理性缓冲液。通过洗涤、离心、吸弃上清可去除存在于液相中的各种游离 蛋白成分，尤其是抗体、可溶性抗原-抗体复合物，游离补体等，经过洗涤，反应 系统只剩下细胞等其它固体成分。

(三)、标记：小心将细胞沉淀部分混悬在含有FITC-抗C1q或/和抗C3抗体(或F(ab)、 F(ab′)2片段)、PE-抗CD3抗体和/或PerCP-抗CD19(或CD20)抗体的缓冲液 中；继续温育。此时，反应系统中FITC-抗C1q或/和抗C3抗体，可与步骤(二) 中细胞-CFAbs-补体三联合物中的补体结合，形成四联复合物；作为反映结合在细 胞表面CFAbs的半定量指标；而PE-抗CD3抗体和PerCP-抗CD19(或CD20) 抗体分别可与T、B淋巴细胞结合，借以鉴别区分这两群不同特征的淋巴细胞。

(四)、洗涤：同步骤(二)，此时通过洗涤去除液相中所有未被结合的游离荧光标记抗体成 分，至此，交叉配型的反应基本完成。

(五)、测定：将细胞小心悬浮在含有2％Formadyhyde的磷酶缓冲液中，使用流式细胞仪进 行细胞收集、同时对各细胞表面的不同荧光标记强度信号进行测量并储存收集的相 应图形、原始数据。

(六)、分析、结果判定：以阴性对照的平均值(可为FITC荧光强度的Channel Value或Channel Shift；在正式实验前业已确定)加上两个标准差(X+2SD)为阴性上限，高 出此上限者，可判定为T或/和B淋巴细胞交叉配型阳性；低于此上限者，判定为 T或/和B淋巴细胞交叉配型阴性。 二、阴性对照和阴性上限设定：

血清为采自从未接受输血、移植的正常健康男性的AB-血清，血清可来自同一个体或多 个个体的混合血清。该血清可经56C，30分钟的补体灭活处理，也可不经处理。细胞可来自 血清的同一群体或不同的正常人群体，但样本数目必须超过10个以上，计算交叉配型获得的 抗补体荧光强度值的平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD作为阴性结果判定上限。 三、阳性对照设定：

可选用多个高PRA的血清样品混合，目的为尽可能最大限度地包含针对所有HLA型别 的CFAbs。通过预试验，分别设三种不同CFAbs的阳性质控对照；即高、中、低CFAbs浓度 血清，其中低CFAbs宜设在约50个Channel Shifts左右。 四、自身对照设定：

由受者自身血清加自身单个核细胞组成的反应系统；通过与上述正常阴性对照比较，以 判定受者体内自身CFAbs的存在与否。该指标可作为预测排斥反应发生的参考。 说明1、CFAbs的型别鉴别：

如需鉴别交叉配型阳性反应中的抗体型别，可以DTT对血清进行处理(降解IgM)；再 进行交叉配型，如果结果转为阴性，则CFAbs为IgM型；反之为IgG型。 说明2、上述交叉配型中，可将步骤(一)至步骤(三)合并，即在反应系统中同时加入血 清、细胞及上述各种荧光标记抗体或在血清、细胞、荧光抗补体抗体温育后，不经洗涤，直接 加入荧光标记的抗CD3或/和抗CD19或CD20抗体。 说明3、根据需要，利用不同荧光抗体组合，可实现单独的T或B淋巴细胞交叉配型。 说明4、以上只是例举交叉配型的基本步骤，实际应用过程中可根据本专利中所述及的基本 原理以及具体检测对象以及研究、观察目的不同，在方法学上进行相应的调整。因此，具体 实验条件及步骤并不局限于本专利中所述及的举例。 小结：

本发明所建立的测定固定补体抗体的HLA交叉配型流式细胞仪方法综合了抗IgG流式细 胞仪交叉配型方法灵敏度高、稳定重复性好、多标记分类测量以及传统CDC血清学交叉配型 方法能够直接测定CDC免疫学生物效应的特点；以CDC效应的诱发机制为基础，通过测定 CDC效应的最早期(初始诱发效应)阶段所形成的靶细胞HLA-CFAbs-补体复合物作为评 价样品中CFAbs水平以及CDC效应程度的指标。由于CDC发生过程中，从补体毒性抗体 (CFAbs)结合，补体固定到可被体外测量的CDC终末效应——细胞死亡出现，需要较长时 限；因此，本发明方法学的显著特点是能够利用样品自身具有的补体成分，模拟生物体内生 理微环境，通过测定HLA CFAbs固定补体的早期免疫学结合效应反映CDC免疫学生物的终 末效应；并能够在同一反应系统中对多种细胞群体的CFAbs进行多标记分类分析测定。因此， 上述方法(试剂盒)具有国际上现存所有类似方法所不具有的独特优点。可广泛应用于HLA 领域中的交叉配型、PRA测定等，以及免疫学中补体及CDC效应的研究。

                        增：附图说明

图1，图中显示共117例HLA交叉配型两种方法的单盲配型结果。CDC-FXM与传统 CDC血清学方法结果一致的共109例，两种方法结果均为阳性者26例；两种方法结果均为 阴性者83例。在传统CDC血清学方法结果阴性的样品，CEC-FXM检出8例阳性；证实传 统CDC血清学方法的假阴性结果高达7％。

图2，将含有CFAbs的血清1∶4稀释，经56℃，30分钟补体灭活处理。然后分别加 入不同量的人C1q，观察CDC-FXM结果出现阳性时所需C1q的浓度。结果表明：使CDC -FXM阳性的C1q浓度为3μg/ml(正常C1q血清平均浓度为75μg/ml)。

图3，将含有CFAbs的血清Protein-G亲和层析法提取纯化全部IgG成分，然后在 CDC-FXM反应中分别按不同剂量回加纯化的IgG，观察引起CDC-FXM阳性时所需IgG浓 度。

结果表明：

1、CDC-FXM阳性血清经去除IgG后，单独补体不能结合于细胞表面；即 CDC-FXM测定的补体结合率直接反映了CFAbs与靶细胞的结合率，并存在正相 关系。

2、使CDC-FXM结果转为阳性时的IgG浓度为0.4mg/ml(正常人血清IgG浓度平 均值为：12.5mg/ml)。

图4，利用固相包被有纯化HLA抗原的塑料小珠，分别与一定量的IVIG反应，利用荧 光标记的抗人IgG抗体在流式细胞仪上检测与HLA抗原IgG(IVIG)含量。结果表明：在IgG 明显低于正常生理浓度平均值(＜10mg/ml)时，仍能导致极显著的IgG与纯化HLA抗原的 结合。

图5，利用CDC-FXM，IgG-FXM，CDC血清学交叉配型法分别对同一接受IVIG治 疗的器官移植病人进行测定：结果显示：IVIG治疗前，三种方法的交叉配型结果均为阳性； 而IVIG治疗后，病人排斥反应受到IVIG抑制，临床病情好转，但IgG-FXM极呈阳性；而 CDC-FXM和CDC血清学结果呈阴性，与临床观察一致。

图6，在含CFAbs的血清中加入不同量的IVIG；与相应靶细胞反应；同时以流式细胞仪 平行测定靶细胞表面固定的补体及IgG含量。结果显示：IVIG对CFAbs固定补体的能力具 有极强的抑制作用，但对IgG的结合无显著影响。上述结果与临床使用IVIG有效抑制器官 移植中免疫排斥反应的结果相吻合；即IVIG可通过与靶细胞结合，封闭CFAbs结合位点从 而达到抑制免疫排斥中的CDC杀伤效应。

图7，分别以Protein-G亲和层析法提取纯化两名正常人的IgG，然后与包被有纯化HLA 抗原的固相颗粒反应，以荧光标记的抗人IgG抗体，在流式细胞仪上检测IgG与HLA抗原 的结合率。

结果显示：多次怀孕生产(三次)的正常女性(53岁)和从未接受任何输血、器官移植的正常 青年男性(20岁)的纯化IgG均能与HLA抗原发生显著性结合效应。该结果进一步证实：正常 人在没有接受任何外来HLA刺激前，其体内已经存在天然的HLA抗体(NaturalHLAAntibody) 成分。 表1：CDC-FXM方法的特异性鉴定结果(见下页) 表2：CDC-FXM批间批内差异质控结果 表3：三种交叉配型方法比较

           表2：CDC-FXM批间批内差异质控结果

                CDC-FXM QC RESULT  QC     N                 CV％     QC-L     QC-M     QC-H  Inter-Assay     10     1.88     3.61     4.2  Intra-Assay     17     4.6     6.2     3

                                Sheet1

              表1：CDC-FXM方法的特异性鉴定结果

         SPECIFICITY OF C1q FIXING ANTIBODY FLOW CROSSMATCH

                            (CHANNEL SHIFT) CELL ID    CELL    TYPING     HOLDEN     WALLAU   AFRAM    ADUBIFA   NOORI     RIVAS    ELIZABETH     MARY     B51+     B51+   A11+    *A11+   A2+     A2+    *A2+     A2+ 06FP82119    A2+；A11+     19     13   287    137   593     269    232     672 LF28291    A11+     8     16   217    187   7     7    8     7 K16297    A2+     3     19   24    1   578     306    124     666 K16355    A2+；B51+     662     302   20    9   660     492    374     549 M17563    A2+；B52+     692     301   7    4   544     290    68     520

表3：三种交叉配型方法比较