将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法
阅读：337发布：2020-05-17
专利汇可以提供将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌 染色 体同一整合位点的方法。首先将外源基因表达单元克隆到含抗性基因筛选标记A的整合质粒，利用整合质粒将外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体获得重组菌1，然后利用替换抗性基因筛选标记的质粒将重组菌1中的抗性基因筛选标记A替换为另一抗性基因筛选标记B，得到重组菌2。整合质粒再转化重组菌2，通过抗性基因筛选标记A和B进行筛选得到包含两个外源基因表达单元的重组菌。重复替换抗性基因和整合，可以获得两个以上相同或不同的外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体的重组菌。这种方法对构建整合型枯草芽孢杆菌表达菌株具有重要的应用前景。，下面是将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法专利的具体信息内容。
1.将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点 的方法，其特征在于，是一种利用多种抗性基因筛选重组菌，将两个或两个以上外源基因表 达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一整合位点的方法，具体步骤是：1)将外源基因表达单元分别单独克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，每一个重组整合质 粒携带一个外源基因表达单元；2)第一个外源基因表达单元的整合是利用整合质粒将外源基因表达单元整合到枯草 芽孢杆菌染色体中，通过整合质粒上携带的抗性基因筛选标记A挑选得到外源基因表达单 元整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌1 ；3)用替换抗性基因筛选标记的质粒将上述重组枯草芽孢杆菌1的抗性基因筛选标记A 替换为抗性基因筛选标记B，通过抗性基因筛选标记B将替换成功的重组菌挑选出来，得到 带抗性基因筛选标记B的重组枯草芽孢杆菌2 ；4)第二个外源基因表达单元的整合是利用连接有第二个外源基因表达单元的整合质 粒以同源单交换形式将第二个外源基因表达单元整合到重组枯草芽孢杆菌2上，通过抗性 基因筛选标记A和抗性基因筛选标记B筛选得到含有两个外源基因表达单元的重组枯草芽 孢杆菌；5)重复上述步骤幻和步骤4)，将抗性基因筛选标记A替换为其他抗性基因筛选标记 后，用连接有外源基因表达单元的整合质粒以同源单交换形式整合到重组菌中，可以得到 两个以上表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组菌；所述的外源基因表达单元可以相同或不同：如不同，得到不同外源基因表达单元整合 到枯草芽孢杆菌染色体基因组的重组菌；如相同，得到两个或两个以上拷贝的外源基因表 达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的重组菌；所述的外源基因表达单元可以是单顺反子，也可以是多顺反子；所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168衍生菌株。
2.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染 色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草芽孢 杆菌染色体基因组发生同源交换的质粒PMLK83及其衍生质粒或pDK及其衍生质粒；所述的 抗性基因筛选标记A为新霉素；所述的替换抗性基因筛选标记的质粒为PVK71 ；所述的抗性 基因筛选标记B为状观霉素。
3.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染 色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草芽孢 杆菌染色体基因组发生同源交换的质粒PDG364及其衍生质粒或pDL及其衍生质粒；所述的 抗性基因筛选标记A为氯霉素；所述的替换抗性基因筛选标记的质粒为JM103 (pCm: :Er)、 JM103(pCm: :Nm)、JM103 (pCm: ： Sp)、JM103(pCm: :Tc)；所述的抗性基因筛选标记 B 为红霉 素、新霉素、状观霉素或四环素。
4.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌 染色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草 芽孢杆菌染色体基因组发生同源交换的质粒PDG1661及其衍生质粒或pDG1662及其衍 生质粒；所述的抗性基因筛选标记A为氯霉素；所述的替换抗性基因筛选标记的质粒为 JM103(pCm: :Er)、JM103(pCm: :Nm)、JM103(pCm: :Tc)；所述的抗性基因筛选标记 B 为红霉素、新霉素或四环素。
5.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌 染色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草 芽孢杆菌染色体基因组发生同源交换的质粒PDG1663及其衍生质粒或pDG1664及其衍 生质粒；所述的抗性基因筛选标记A为红霉素；所述的替换抗性基因筛选标记的质粒为 JM103(pEr: :Cm)、JM103(pEr: :Nm)、JM103(pEr: :Pm)；所述的抗性基因筛选标记 B 为氯霉 素、新霉素或腐草霉素。
6.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染 色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草芽孢 杆菌染色体基因组发生同源交换的质粒PSG1154、pSG1190、pSG1191、pSG1192、pSG1193或 pSG17^及它们相对应的衍生质粒；所述的抗性基因筛选标记A为状观霉素；所述的替换抗 性基因筛选标记的质粒为PVK73 ；所述的抗性基因筛选标记B为新霉素。
7.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染 色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草芽孢 杆菌染色体基因组发生同源交换的质粒pDG1728、pDG1729、pDG1730或pDG1731及它们相对 应的衍生质粒；所述的抗性基因筛选标记A为状观霉素；所述的替换抗性基因筛选标记的 质粒为pVK73 ；所述的抗性基因筛选标记B为新霉素。
8.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染 色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草芽孢 杆菌染色体发生同源交换的质粒PAXOl及其衍生质粒或pAX-spac及其衍生质粒；所述的 抗性基因筛选标记A为红霉素；所述的替换抗性基因筛选标记的质粒为JM103(pEr: :Cm)、 JM103(pEr: :Nm)、JM103 (pEr ： :Pm)或JM103 (pEr: : Sp)；所述的抗性基因筛选标记B为氯霉 素、新霉素、腐草霉素或状观霉素。
将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌 染色体同一个整合位点的方法
技术领域
背景技术
[0002] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)是非致病的，不产毒素和致热致敏蛋白质，是 一种食品安全的菌种，被归为食品级微生物范畴。而且枯草芽孢杆菌作为表达系统，具有以 下优点：1.具有很强的蛋白质分泌功能，不需要破碎细胞来提取蛋白质，只需要较简单地 处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质，目前已有多种外源蛋白在枯草芽孢杆菌中实 现了分泌表达。2.没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包函体。3.发酵 条件简单。开发利用枯草芽孢杆菌作为表达系统具有深远的意义。
[0003] 根据所采用载体的类型不同，枯草芽孢杆菌表达模式可分为染色体整合表达和可 复制质粒表达两种。在染色体整合表达中外源基因在宿主中可保持较好的稳定性，而复制 质粒通常不稳定，需加抗生素来维持。但是抗生素在食品及其添加剂生产中是不能添加的。 因此，枯草芽孢杆菌染色体整合表达是食品、药品生产未来发展的一个趋势。整合表达的一 个不足在于需表达基因的拷贝数低，从而影响外源蛋白的表达量。增加拷贝数的一种方法 是将外源基因分别整合在不同的位点。这种方法需要将外源基因克隆到不同的整合载体 上，而且外源基因在染色体不同的整合位点表达水平也可能不一样。另一种方法是通过不 断提高抗生素的浓度，筛选出整合拷贝数增加的重组子。这种方法利用抗生素浓度增加的 数量性状来筛选重组子，假阳性高，获得的整合菌株中的多拷贝外源基因不稳定，外源蛋白 的表达效果也不理想，往往需要高浓度的抗生素来维持外源基因的拷贝数。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种方法，将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草 芽孢杆菌染色体同一个整合位点。通过提高表达单元的拷贝数，以期获得更高的外源基因 表达量。本发明是将整合质粒整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组，利用整合质粒的抗性基 因筛选标记筛选出重组菌，再用替换抗性基因筛选标记的质粒替换抗性基因筛选标记，整 合质粒再转化得到的重组菌，再通过整合质粒上的抗性基因筛选标记和替换抗性基因筛选 标记质粒的抗性基因筛选标记筛选获得重组菌。经过若干轮整合-替换-再整合，可以获 得两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的重组菌。
[0005]本发明用到的整合质粒 pDG364、pMLK83、pDG1661、pDG1662、pDG1663、pDG1664、 PDG1728、pDG11729、pDG1730、pDG1731、ρAXOU pAX-spac、pSG1154、pSG1192、pSG1193、 PSG1729、pSG1190、pSG1191、pDL、pDK，及替换抗性基因筛选标记质粒 pVK71、pVK73、 JM103(pCm: :Er)、JM103(pCm: :Nm)、JM103 (pCm: : Sp)、JM103(pCm: :Tc)、JM103(pEr: :Cm)、 JM103(pEr: :Nm)、JM103 (pEr: :Pm)、JM103 (pEr: : Sp)均购自美国俄亥俄州立大学 Bacillus遗传保藏中心(the Bacillus Genetic Stock Center, BGSC, http://www. bgsc. org) „
[0006] 本发明通过以下步骤实现：
[0007] 1)将外源基因表达单元分别单独克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，每一个重组 整合质粒携带一个外源基因表达单元；
[0008] 2)第一个外源基因表达单元的整合是利用整合质粒将外源基因表达单元整合到 枯草芽孢杆菌染色体中，通过整合质粒上携带的抗性基因筛选标记A挑选得到外源基因表 达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌1 ；
[0009] 3)用替换抗性基因筛选标记的质粒将上述重组枯草芽孢杆菌1的抗性基因筛选 标记A替换为抗性基因筛选标记B，通过抗性基因筛选标记B将替换成功的重组菌挑选出 来，得到带抗性基因筛选标记B的重组枯草芽孢杆菌2 ；
[0010] 4)第二个外源基因表达单元的整合是利用连接有第二个外源基因表达单元的整 合质粒以同源单交换形式将第二个外源基因表达单元整合到重组枯草芽孢杆菌2上，通过 抗性基因筛选标记A和抗性基因筛选标记B筛选得到含有两个外源基因表达单元的重组枯 草芽孢杆菌；
[0011] 5)重复上述步骤幻和步骤4)，将抗性基因筛选标记A替换为其他抗性基因筛选 标记后，用连接有外源基因表达单元的整合质粒以同源单交换形式整合到重组菌中，可以 得到两个以上表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组菌；
[0012] 所述的外源基因表达单元可以相同或不同：如不同，得到不同外源基因表达单元 整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的重组菌；如相同，得到两个或两个以上拷贝的外源基 因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的重组菌；
[0013] 所述的外源基因表达单元可以是单顺反子，也可以是多顺反子；
[0014] 所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168衍生菌株，例如1A751，WB600，或WB800。
[0015] 根据使用的整合载体不同，本发明的方法的具体步骤如下：
[0016] 1.利用整合质粒pMLK83及其衍生质粒或pDK及其衍生质粒（为方便描述，两种质 粒统称为H。具体应用时，每次只用其中一个质粒。下同）进行整合。
[0017] 1)将两个外源基因表达单元A和B分别克隆到枯草芽孢杆菌整合型质粒PMLK83 及其衍生质粒或PDK及其衍生质粒，构建重组质粒H-A和H-B。
[0018] 2)用重组质粒H-A转化宿主枯草芽孢杆菌，通过新霉素抗性，挑选出外源基因同 源交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的菌株[A]Neo+。
[0019] 3)质粒pVK71作为替换抗性基因筛选标记质粒转化枯草芽孢杆菌[A]Neo+，挑选 出状观霉素抗性，新霉素抗性失活的菌株[A]Ne0-Spe+。
[0020] 4)用重组质粒H-B转化枯草芽孢杆菌[A]Ne0_Spe+，挑选出状观霉素抗性和新霉素 抗性的菌株[AB]Ne0+Spe+，从而将两个外源基因A、B表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体 基因组中。
[0021] 2.利用整合质粒PDG364及其衍生质粒或pDL及其衍生质粒（统称为K)进行整合。
[0022] 1)将外源基因表达单元A、B、C、D和E分别克隆到枯草芽孢杆菌整合型质粒 PDG364及其衍生质粒或pDL及其衍生质粒，构建重组质粒K_A、K_B、K_C、K-D和K-E。
[0023] 2)用重组质粒K-A转化宿主枯草芽孢杆菌，通过氯霉素抗性，挑选出外源基因同源交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的菌株[A] Cat+。
[0024] 3)质粒JM103 (pCm: :Er)作为替换抗性基因筛选标记质粒转化枯草芽孢杆菌[A] Cat+,挑选出红霉素抗性，氯霉素抗性失活的菌株[A]Cat_Erm+。
[0025] 4)用重组质粒K-B转化枯草芽孢杆菌[A]Cat_Erm+，挑选出氯霉素抗性和红霉素抗 性的菌株[AB]Cat+Erm+，从而将两个外源基因A、B表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基 因组中。
[0026] 5)分别以重组质粒K-C、K-D和K-E作为整合质粒，质粒JM103 (pCm: ：Nm)、 JM103(pCm::Sp)、JM103(pCm: :Tc)作为替换抗性基因筛选标记质粒，重复步骤3和4，最后 得到含有五个拷贝外源基因的重组菌[ABCDE]Cat+Erm+Neo+Spe+Tec+。
[0027] 3.利用整合质粒PDG1661及其衍生质粒或pDG1662及其衍生质粒（统称为M)进行整合。
[0028] 1)将外源基因表达单元A、B、C和D分别克隆到枯草芽孢杆菌整合型质粒pDG1661 及其衍生质粒或PDG1662及其衍生质粒，构建重组质粒M-A、M_B、M-C和M-D。
[0029] 2)用重组质粒M-A转化宿主枯草芽孢杆菌，通过氯霉素抗性，挑选出外源基因同 源交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的菌株[A] Cat+。
[0030] 3)质粒JM103(pEr: :Cm)作为替换抗性基因筛选标记质粒转化枯草芽孢杆菌[A] Cat+,挑选出红霉素抗性，氯霉素抗性失活的菌株[A]Cat_Erm+。
[0031] 4)用重组质粒M-B转化枯草芽孢杆菌[A]Cat_Erm+，挑选出氯霉素抗性和红霉素抗 性的菌株[AB]Erm+Cat+，从而将两个外源基因A、B表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基 因组中。
[0032] 5)分别以重组质粒M-C和M-D作为整合质粒，以质粒JM103 (pEr ： ：Nm)、 JM103(pEr: :Pm)作为替换抗性基因筛选标记质粒，重复步骤3和4，最后得到含有四个拷贝 外源基因的重组菌[ABCD] Cat+Erm+Neo+Phm+。
[0033] 4.利用整合质粒PDG1663及其衍生质粒或pDG1664及其衍生质粒（统称为N)进行整合。
[0034] 1)将外源基因表达单元A、B、C和D分别克隆到枯草芽孢杆菌整合型质粒 PDG1663及其衍生质粒或pDG1664及其衍生质粒，构建重组质粒N_A、N_B、N-C和N-D。
[0035] 2)用重组质粒N-A转化宿主枯草芽孢杆菌，通过红霉素抗性，挑选出外源基因同 源交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的菌株[A]Erm+。
[0036] 3)质粒JM103(pEr: :Cm)作为替换抗性基因筛选标记质粒转化枯草芽孢杆菌[A] Erm+,挑选出氯霉素抗性，红霉素抗性失活的菌株[A]Erm_Cat+。
[0037] 4)用重组质粒N-B转化枯草芽孢杆菌[A]Erm_Cat+，挑选出红霉素抗性和氯霉素抗 性的菌株[AB]Erm+Cat+，从而将两个外源基因A、B表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基 因组中。
[0038] 5)分别以重组质粒N-C和N-D作为整合质粒，以质粒JM103 (pEr ： ：Nm)、 JM103(pEr: :Pm)作为替换抗性基因筛选标记质粒，重复步骤3和4，最后得到含有四个拷贝 外源基因的重组菌[ABCD]Erm+Cat+Neo+Phm+。
[0039] 5.利用整合质粒pSGllM及其衍生质粒、PSG1190及其衍生质粒、pSG1191及其衍 生质粒、PSG1192及其衍生质粒、PSG1193及其衍生质粒或pSG17^及其衍生质粒（统称为R)进行整合。
[0040] 1)将两个外源基因表达单元A和B分别克隆到枯草芽孢杆菌整合型质粒pSGl 154 及其衍生质粒、PSG1192及其衍生质粒、PSG1193及其衍生质粒、pSG1729及其衍生质粒、 PSG1190及其衍生质粒或PSG191及其衍生质粒，构建重组质粒R-A和R-B。
[0041] 2)用重组质粒R-A转化宿主枯草芽孢杆菌，通过状观霉素抗性，挑选出外源基因 同源交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的菌株[A]Spe+。
[0042] 3)质粒pVK73作为替换抗性基因筛选标记质粒转化枯草芽孢杆菌[A] Spe+,挑选 出新霉素抗性，状观霉素抗性失活的菌株[A]Spe-Ne0+。
[0043] 4)用重组质粒R-B转化枯草芽孢杆菌[A] Spe—Neo+，挑选出状观霉素抗性和新霉素 抗性的菌株[AB]Ne0+Spe+，从而将两个外源基因A、B表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体 基因组中。
[0044] 6.利用整合质粒pDG17^及其衍生质粒、pDG17^及其衍生质粒、pDG1730及其衍 生质粒、或PDG1731及其衍生质粒（统称为X)进行整合。
[0045] 1)将两个外源基因表达单元A和B分别克隆到枯草芽孢杆菌整合型质粒PDG1728 及其衍生质粒、PDG1729及其衍生质粒、PDG1730及其衍生质粒、或pDG1731及其衍生质粒， 构建重组质粒X-A和X-B。
[0046] 2)用重组质粒X-A转化宿主枯草芽孢杆菌，通过状观霉素抗性，挑选出外源基因 同源交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的菌株[A]Spe+。
[0047] 3)质粒pVK73作为替换抗性基因筛选标记质粒转化枯草芽孢杆菌[A]Spe+，挑选 出新霉素抗性，状观霉素抗性失活的菌株[A]Neo+Spe-。
[0048] 4)用重组质粒X-B转化枯草芽孢杆菌[A]Ne0+Spe_，挑选出新霉素抗性和状观霉素 抗性的菌株[AB]Ne0+Spe+，从而将两个外源基因A、B表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体 基因组中。
[0049] 7.利用整合质粒pAXOl及其衍生质粒或pA-spac及其衍生质粒（统称为V)进行整合。
[0050] 1)将外源基因表达单元A、B、C、D和E分别克隆到枯草芽孢杆菌整合型质粒pAXOl 及其衍生质粒或pAX-spac及其衍生质粒，构建重组质粒V-A、V-B, V-C, V-D和V-E。
[0051] 2)用重组质粒V-A转化宿主枯草芽孢杆菌，通过红霉素抗性，挑选出外源基因同 源交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的菌株[A]Erm+。
[0052] 3)质粒JM103(pEr: :Cm)作为替换抗性基因筛选标记质粒转化枯草芽孢杆菌[A] Erm+,挑选出氯霉素抗性，红霉素抗性失活的菌株[A]Erm_Cat+。
[0053] 4)用重组质粒V-B转化枯草芽孢杆菌[A]Erm_Cat+，挑选出红霉素抗性和氯霉素抗 性的菌株[AB]Erm+Cat+，从而将两个外源基因A、B表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基 因组中。
[0054] 5)分别以重组质粒V-C、V-D和V-E作为整合质粒，以质粒JM103 (pEr ： ： Nm)、 JM103(pEr: :Pm)、JM103 (pEr ： ： Sp)作为替换抗性基因筛选标记质粒，重复步骤3和4，最后 得到含有五个拷贝外源基因的重组菌[AB⑶E]Erm+Cat+Neo+Phm+Spe+。
[0055] 本发明的优点是利用抗生素抗性的有无这个质量性状来挑选获得一个基因多拷 贝的重组菌，或多个基因整合到同一整合位点的重组菌，方法简单有效。7具体实施方式
[0056] 下面结合具体的实施例，进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了 举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0057] 实施例1 ：两个拷贝β -淀粉酶表达单元整合到枯草芽孢杆菌1Α751。
[0058] 1.整合质粒的构建 pMLK83-P43-CTBA
[0059] 根据Genbank中注释的启动子Ρ43序列，设计上游引物为 5‘attgctggacgcttatggac 3，和下游弓|物为 5，cgggatccattcctctcttacctataat 3，。PCR 反 应体系 IOOul :DNA模板（枯草芽孢杆菌 1A751 总 DNA) Iul (约 20ng)，5XPrimeSTAR Buffer 20ul, 10pmol/ul dNTP 2ul，lOpmol/ul 正反向引物各为 2ul，2. 5U/ul PrimeSTAR HS DNA聚 合酶 Iul，添加 ddH20 至 IOOul。PCR 反应程序-MV 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin ;4°C保存。PCR片段和质粒pMLK83用限制性内切酶BamH I、Hind III 分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5a中，经筛选鉴定获得重组质粒 pMLK83-P43。 [0060] 以全基因合成的方式合成如下DNA片断（β- 淀粉酶基因， 简称CTBA)[0061] 1 GGATCCATGA ΑΑΑΑΑΑΑΤΑΤ CATCACTTCT ATCACATCTC TGGCTCTGGT[0062] 51 TGCCGGGCTG TCTTTGACTG CTTTTGCAGC TACAACGGCT AGCATAGCAC[0063] 101 CAAATTTCAA AGTTTTTGTA ATGGGTCCAT TAGAAAAAGT CACAGATTTT[0064] 151 AATGCATTCA AAGATCAATT GATAACTTTA AAGAATAATG GTGTTTATGG[0065] 201 TATAACAACA GATATTTGGT GGGGCTATGT TGAAAATGCA GGTGAAAATC[0066] 251 AATTTGACTG GAGTTATTAT AAGACATATG CTGATACCGT ACGCGCTGCG[0067] 301 GGATTGAAGT GGGTTCCAAT AATGTCAACG CATGCCTGTG GAGGTAATGT[0068] 351 TGGTGATACA GTAAATATAC CTATTCCGTC ATGGGTATGG ACAAAAGATA[0069] 401 CCCAAGATAA TATGCAGTAT AAGGATGAAG CCGGAAATTG GGATAATGAA[0070] 451 GCAGTAAGTC CATGGTATTC TGGCTTAACC CAACTCTATA ATGAATTTTA[0071] 501 TTCATCTTTT GCATCAAATT TTAGCAGCTA TAAAGATATA ATTACTAAAA[0072] 551 TATATATATC TGGAGGCCCT TCTGGAGAAT TAAGATATCC TTCATATAAT[0073] 601 CCTTCGCATG GATGGACATA TCCTGGACGT GGCTCGCTGC AGTGCTATAG[0074] 651 TAAAGCGGCT ATAACAAGTT TTCAAAATGC TATGAAGTCT AAATATGGAA[0075] 701 CTATAGCAGC AGTTAATAGT GCATGGGGTA CAAGCCTAAC TGATTTTTCT[0076] 751 CAAATTAGTC CACCTACAGA TGGTGATAAT TTCTTTACAA ATGGTTATAA[0077] 801 AACTACTTAT GGTAATGACT TTTTGACATG GTATCAAAGT GTTTTGACTA[0078] 851 ATGAGTTAGC CAATATTGCT TCTGTAGCTC ATAGCTGCTT TGATCCAGTA[0079] 901 TTTAATGTTC CAATAGGAGC AAAAATAGCT GGAGTGCATT GGCTATATAA[0080] 951 TAGTCCGACA ATGCCACATG CTGCAGAATA TTGTGCCGGT ΤΑΤΤΑΤΑΑΤΤ[0081] 1001 ATAGCACGCT ACTCGATCAA TTTAAGGCAT CTAATCTTGC TATGACATTT[0082] 1051 ACATGTCTTG AAATGGATGA TTCTAATGCA TATGTAAGTC CATATTATTC[0083] 1101 TGCACCTATG ACGTTAGTCC ATTATGTAGC TAATCTTGCT AATAATAAAG[0084] 1151 GTATAGTCCA CAATGGAGAA AATGCTTTGG CTATATCCAA CAACAATCAA[0085] 1201 GCTTATGTGA ATTGTGCAAA TGAATTAACA GGATATAATT TTTCTGGATT
[0086] 1251 TACACTTTTA AGACTTTCGA ATATTGTAAA TAGTGATGGA TCTGTGACAT
[0087] 1301 CAGAGATGGC TCCTTTTGTA ATTAATATAG TTACACTAAC GCCTAACGGT
[0088] 1351 ACGATACCAG TTACATTTAC AATAAACAAT GCGACAACTT ATTATGGACA
[0089] 1401 AAATGTATAT ATTGTTGGTA GTACATCTGA TCTTGGAAAT TGGAATACAA
[0090] 1451 CCTATGCCCG TGGTCCTGCA TCATGCCCTA ATTATCCTAC TTGGACAATA
[0091] 1501 ACGCTTAATC TATTACCTGG TGAGCAGATA CAGTTTAAAG CTGTAAAAAT
[0092] 1551 TGATAGTTCA GGAAATGTAA CTTGGGAAGG TGGCTCGAAT CATACTTATA
[0093] 1601 CTGTGCCGAC ATCTGGGACT GGTAGTGTCA CCATTACATG GCAAAATTAA
[0094] 1651 TCAATAAAAT GTTACACATA GAACAAATTG TAAACACTGG AATATATTCC
[0095] 1701 GGTGTTTTTT TGTATATTAT GGGCGTTTAA TCCGCGG
[0096] 将合成的β -淀粉酶基因DNA片段和质粒PMLK83-P43用限制性内切酶BamH I和 Sac II进行双酶切后用Τ4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，经筛选 鉴定获得重组质粒PMLK83-P43-CTBA。
[0097] 2.质粒pMLK83-P43-CTBA同源双交换整合到枯草芽孢杆菌1Α751染色体基因组
[0098] 取一满环枯草芽孢杆菌1Α751甘油菌划LB平板，37°C培养箱培养过夜。转化前一 天晚间挑单菌落至3ml LB培养基中，37°C，250rpm培养过夜，第二天上午取160 μ 1培养液 转接至8ml SPI培养基中（SPI培养基：SP盐加体积浓度为50% (W/V)葡萄糖溶液和 1% (V/V)体积 100 X CAYE 溶液；SP 盐溶液：含 1. 96g/L (NH2) 2S04，13. 72g/L K2HPO4, 5. 88g/ L KH2PO4,0. 196g/LMgS047H20(单独灭菌）和 0. 98g/L 柠檬酸钠；100 X CAYE 溶液：含 20g/L 酪蛋白氨基酸和100g/L酵母抽提物。），37°C，250rpm培养至对数生长末期（约4〜5小 时）；取0. 2ml生长至对数末期的培养液至aiil SPII培养基中（SPII培养基：SPI培养基 加入 1 % (V/V，下同)体积 50mmol/L CaCl2 溶液，1 %体积 250mmol/L MgCl2 溶液)，37°C， IOOrpm培养90分钟；在上述SPII培养基的菌体中加入20ul 10mmol/L EGTA，再于37°C， IOOrpm培养10分钟；上述处理后的菌液即为枯草芽孢杆菌1A751感受态细胞。将1A751感 受态细胞分装成0. 5ml每管，加入5ul质粒pMLK83-P43-CTBA (50ng/ul)，再于37°C，250rpm 培养90分钟，取菌液涂布新霉素（20ug/ml)LB平板。用PCR方法筛选α-淀粉酶基因被破 坏的转化子即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌株lA751[CTBA]Neo+。筛选α-淀粉酶基因被 破坏的转化子的PCR方法如下：
[0099] 合成如下弓I 物:aaml :5，ggtctgatcgatgggatgtc 3，；aam2 ： 5‘ tcatcatcgctcatccatgt3' ；w2p ：5‘ actgacgattaccttgcg 3‘ ；baci-pl ： 5’ cttccaatcacccgctctt 3’ .将转化子在LB培养基中过夜培养后，提取总DNA.然后分别 用引物对aaml/aam2和w2p/baci_pl进行PCR. PCR反应条件分别如下：
[0100] aaml/aam2 :PCR 反应体系 20ul :DNA 模板（转化子总 DNA) Iul (约 20ng)，10 X Taq Buffer 2ul, 10pmol/ul dNTP 0. 4ul，10pmol/ul 正反向引物各为 0. 5ul，2. 5U/ul Taq DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 20ul。PCR 反应程序：94°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s，72°C 30s, 30 个循环；72°C IOmin ；4°C保存；
[0101] w2p/baci-pl :PCR反应体系 20ul :DNA模板（转化子总 DNA) lul (约 20ng)，IOXTaq Buffer 2ul, 10pmol/ul dNTP 0. 4ul，10pmol/ul 正反向引物各为 0. 5ul，2. 5U/ul Taq DNA聚合酶 lul，添加 ddH20 至 20ul。PCR 反应程序-MV 5min ；94°C 30s,60°C 30s，72°C 70s, 30 个循环；72°C IOmin ；4°C保存；
[0102] 如果某一转化子用W2pAaCi-pl引物对做PCR得到大约1. Ikb的产物，而用aaml/ aam2引物对做PCR得不到大约450bp的产物，则这个转化子是α -淀粉酶缺失的转化子。
[0103] 3.新霉素抗性基因的替换
[0104] 质粒pVK71与制备好的枯草芽孢杆菌1Α751 [CTBAjNeo+感受态细胞混合，220rpm, 37°C摇床培养90min，涂布到含壮观霉素60ug/ml的LB固体培养基中，长出的菌落再接种到 含新霉素20ug/ml的LB固体培养基验证，筛选出带状观霉素抗性而新霉素抗性失活的菌株 1A751 [CTBAJNeo-Spe+ο
[0105] 4.质粒pMLK83-P43-CTBA同源单交换整合到枯草芽孢杆菌1A751 [CTBA] Neo^Spe+ 染色体基因组。
[0106] 质粒pMLK83-P43-CTBA与制备好的枯草芽孢杆菌1A751 [CTBAjNeo^Spe+感受态细 胞混合，220rpm, 37°C摇床培养90min，涂布到含新霉素20ug/ml，壮观霉素60ug/ml的LB固 体培养基过夜培养，可筛选得到两个拷贝β -淀粉酶表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体 基因组的菌株 lA751[CTBA2]Neo+Spe+0
[0107] 5.枯草芽孢杆菌β -淀粉酶的表达
[0108] 枯草芽孢杆菌1Α751 [CTBAJNeo+在含新霉素20ug/ml的LB平板上活化，枯草芽孢 杆菌1A751 [CTBA2]Neo+Spe+在含新霉素20ug/ml、状观霉素60ug/ml的LB平板活化，分别 接种到LB液体培养基培养过夜，离心，上清液即为β -淀粉酶粗酶液。
[0109] 6.枯草芽孢杆菌1Α751 [CTBA] Neo+和枯草芽孢杆菌1Α751 [CTBA2] Neo+Spe+酶活 的比较
[0110] 吸取9ml 淀粉溶液于70°C 士0. 5°C恒温水浴预热5min后，加入1. Oml β -淀 粉酶粗酶液混勻，置于70°C 士0. 5°C恒温水浴准确反应30min，置于冰水浴^iin终止反应， 混勻，吸取1. Oml溶液至IOml具塞试管，加入1. Oml DNS试剂（甲液：称取6. 9g结晶酚溶 于15.2ml 10%的NaOH溶液，用蒸馏水稀释至69ml，再加入6. 9g亚硫酸氢钠。乙液：称取 255g酒石酸钾钠溶于300ml 10%的NaOH溶液，再加入880ml 1 %的3，5- 二硝基水杨酸溶 液。甲液和乙液混合得黄色试剂贮于棕色瓶内，室温下避光放置7天后作标准曲线），置沸 水浴中加热5min，流动水冷却至室温，用蒸馏水稀释至10ml，混勻，以空白对照调零，用分 光光度计在540nm波长下进行比色，记录吸光度。空白对照由灭活后的样品溶液代替样品 溶液。酶活定义为：1ml酶液在70°C、pH6.0条件下，1小时水解淀粉液生成Img麦芽糖， 即为1个酶活力单位，以U/ml表示。
[0111] 经测定，枯草芽孢杆菌1A751 [CTBAJNeo+的粗酶液酶活为400U/ml左右，枯草芽孢 杆菌1A751[CTBA2]Neo+Spe+的粗酶液酶活为700U/ml左右，双拷贝表达单元整合菌株的 β -淀粉酶酶活是单拷贝的1. 5-2倍。
[0112] 实施例2 ：四个拷贝β -淀粉酶表达单元整合到枯草芽孢杆菌1Α751。
[0113] 1.整合质粒的构建 pDG364-P43-CTBA
[0114] 根据Genbank中注释的启动子Ρ43序列，设计上游引物为 5，cgggatccagcttcgtgcatgcag 3，和下游弓I物为 5，cccaagcttattcctctcttacctataat 3，。 PCR 反应体系 IOOul =DNA 模板(枯草芽孢杆菌 1A751 总 DNA) Iul (约 20ng)，5XPrimeSTARBuffer 20ul, 10pmol/ul dNTP 2ul，10pmol/ul 正反向引物各为 2ul，2. 5U/ul PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 Iul，添加 ddH20 至 IOOul。PCR 反应程序-MV 5min ；94°C 30s, 60 °C 30s, 72°C lmin，30个循环；72°C IOmin ；4°C保存。PCR片段和质粒pDG364用限制性内切酶BamH I、Hind III分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌Dffia中，经筛选鉴 定获得重组质粒PDG364-P43。0115] 以全基因合成的方式合成如下DNA片断（β_淀粉酶基因，简称CTBA)：
0116] 1 AAGCTTTAATGA AAAAAAATAT CATCACTTCT ATCACATCTC TGGCTCTGGT
0117] 51 TGCCGGGCTG TCTTTGACTG CTTTTGCAGC TACAACGGCT AGCATAGCAC0118] 101 CAAATTTCAA AGTTTTTGTA ATGGGTCCAT TAGAAAAAGT CACAGATTTT0119] 151 AATGCATTCA AAGATCAATT GATAACTTTA AAGAATAATG GTGTTTATGG0120] 201 TATAACAACA GATATTTGGT GGGGCTATGT TGAAAATGCA GGTGAAAATC0121] 251 AATTTGACTG GAGTTATTAT AAGACATATG CTGATACCGT ACGCGCTGCG0122] 301 GGATTGAAGT GGGTTCCAAT AATGTCAACG CATGCCTGTG GAGGTAATGT0123] 351 TGGTGATACA GTAAATATAC CTATTCCGTC ATGGGTATGG ACAAAAGATA0124] 401 CCCAAGATAA TATGCAGTAT AAGGATGAAG CCGGAAATTG GGATAATGAA0125] 451 GCAGTAAGTC CATGGTATTC TGGCTTAACC CAACTCTATA ATGAATTTTA0126] 501 TTCATCTTTT GCATCAAATT TTAGCAGCTA TAAAGATATA ATTACTAAAA0127] 551 TATATATATC TGGAGGCCCT TCTGGAGAAT TAAGATATCC TTCATATAAT0128] 601 CCTTCGCATG GATGGACATA TCCTGGACGT GGCTCGCTGC AGTGCTATAG0129] 651 TAAAGCGGCT ATAACAAGTT TTCAAAATGC TATGAAGTCT AAATATGGAA0130] 701 CTATAGCAGC AGTTAATAGT GCATGGGGTA CAAGCCTAAC TGATTTTTCT0131] 751 CAAATTAGTC CACCTACAGA TGGTGATAAT TTCTTTACAA ATGGTTATAA0132] 801 AACTACTTAT GGTAATGACT TTTTGACATG GTATCAAAGT GTTTTGACTA0133] 851 ATGAGTTAGC CAATATTGCT TCTGTAGCTC ATAGCTGCTT TGATCCAGTA0134] 901 TTTAATGTTC CAATAGGAGC AAAAATAGCT GGAGTGCATT GGCTATATAA0135] 951 TAGTCCGACA ATGCCACATG CTGCAGAATA TTGTGCCGGT ΤΑΤΤΑΤΑΑΤΤ0136] 1001 ATAGCACGCT ACTCGATCAA TTTAAGGCAT CTAATCTTGC TATGACATTT0137] 1051 ACATGTCTTG AAATGGATGA TTCTAATGCA TATGTAAGTC CATATTATTC0138] 1101 TGCACCTATG ACGTTAGTCC ATTATGTAGC TAATCTTGCT AATAATAAAG0139] 1151 GTATAGTCCA CAATGGAGAA AATGCTTTGG CTATATCCAA CAACAATCAG0140] 1201 GCTTATGTGA ATTGTGCAAA TGAATTAACA GGATATAATT TTTCTGGATT0141] 1251 TACACTTTTA AGACTTTCGA ATATTGTAAA TAGTGATGGA TCTGTGACAT
0142] 1301 CAGAGATGGC TCCTTTTGTA ATTAATATAG TTACACTAAC GCCTAACGGT
0143] 1351 ACGATACCAG TTACATTTAC AATAAACAAT GCGACAACTT ATTATGGACA
0144] 1401 AAATGTATAT ATTGTTGGTA GTACATCTGA TCTTGGAAAT TGGAATACAA
0145] 1451 CCTATGCCCG TGGTCCTGCA TCATGCCCTA ATTATCCTAC TTGGACAATA
0146] 1501 ACGCTTAATC TATTACCTGG TGAGCAGATA CAGTTTAAAG CTGTAAAAAT
0147] 1551 TGATAGTTCA GGAAATGTAA CTTGGGAAGG TGGCTCGAAT CATACTTATA
0148] 1601 CTGTGCCGAC ATCTGGGACT GGTAGTGTCA CCATTACATG GCAAAATTAA[0149] 1651 TCAATAAAAT GTTACACATA GAACAAATTG TAAACACTGG AATATATTCC
0116] 1 AAGCTTTAATGA AAAAAAATAT CATCACTTCT ATCACATCTC TGGCTCTGGT
0117] 51 TGCCGGGCTG TCTTTGACTG CTTTTGCAGC TACAACGGCT AGCATAGCAC0118] 101 CAAATTTCAA AGTTTTTGTA ATGGGTCCAT TAGAAAAAGT CACAGATTTT0119] 151 AATGCATTCA AAGATCAATT GATAACTTTA AAGAATAATG GTGTTTATGG0120] 201 TATAACAACA GATATTTGGT GGGGCTATGT TGAAAATGCA GGTGAAAATC0121] 251 AATTTGACTG GAGTTATTAT AAGACATATG CTGATACCGT ACGCGCTGCG0122] 301 GGATTGAAGT GGGTTCCAAT AATGTCAACG CATGCCTGTG GAGGTAATGT0123] 351 TGGTGATACA GTAAATATAC CTATTCCGTC ATGGGTATGG ACAAAAGATA0124] 401 CCCAAGATAA TATGCAGTAT AAGGATGAAG CCGGAAATTG GGATAATGAA0125] 451 GCAGTAAGTC CATGGTATTC TGGCTTAACC CAACTCTATA ATGAATTTTA0126] 501 TTCATCTTTT GCATCAAATT TTAGCAGCTA TAAAGATATA ATTACTAAAA0127] 551 TATATATATC TGGAGGCCCT TCTGGAGAAT TAAGATATCC TTCATATAAT0128] 601 CCTTCGCATG GATGGACATA TCCTGGACGT GGCTCGCTGC AGTGCTATAG0129] 651 TAAAGCGGCT ATAACAAGTT TTCAAAATGC TATGAAGTCT AAATATGGAA0130] 701 CTATAGCAGC AGTTAATAGT GCATGGGGTA CAAGCCTAAC TGATTTTTCT0131] 751 CAAATTAGTC CACCTACAGA TGGTGATAAT TTCTTTACAA ATGGTTATAA0132] 801 AACTACTTAT GGTAATGACT TTTTGACATG GTATCAAAGT GTTTTGACTA0133] 851 ATGAGTTAGC CAATATTGCT TCTGTAGCTC ATAGCTGCTT TGATCCAGTA0134] 901 TTTAATGTTC CAATAGGAGC AAAAATAGCT GGAGTGCATT GGCTATATAA0135] 951 TAGTCCGACA ATGCCACATG CTGCAGAATA TTGTGCCGGT ΤΑΤΤΑΤΑΑΤΤ0136] 1001 ATAGCACGCT ACTCGATCAA TTTAAGGCAT CTAATCTTGC TATGACATTT0137] 1051 ACATGTCTTG AAATGGATGA TTCTAATGCA TATGTAAGTC CATATTATTC0138] 1101 TGCACCTATG ACGTTAGTCC ATTATGTAGC TAATCTTGCT AATAATAAAG0139] 1151 GTATAGTCCA CAATGGAGAA AATGCTTTGG CTATATCCAA CAACAATCAG0140] 1201 GCTTATGTGA ATTGTGCAAA TGAATTAACA GGATATAATT TTTCTGGATT0141] 1251 TACACTTTTA AGACTTTCGA ATATTGTAAA TAGTGATGGA TCTGTGACAT
0142] 1301 CAGAGATGGC TCCTTTTGTA ATTAATATAG TTACACTAAC GCCTAACGGT
0143] 1351 ACGATACCAG TTACATTTAC AATAAACAAT GCGACAACTT ATTATGGACA
0144] 1401 AAATGTATAT ATTGTTGGTA GTACATCTGA TCTTGGAAAT TGGAATACAA
0145] 1451 CCTATGCCCG TGGTCCTGCA TCATGCCCTA ATTATCCTAC TTGGACAATA
0146] 1501 ACGCTTAATC TATTACCTGG TGAGCAGATA CAGTTTAAAG CTGTAAAAAT
0147] 1551 TGATAGTTCA GGAAATGTAA CTTGGGAAGG TGGCTCGAAT CATACTTATA
0148] 1601 CTGTGCCGAC ATCTGGGACT GGTAGTGTCA CCATTACATG GCAAAATTAA[0149] 1651 TCAATAAAAT GTTACACATA GAACAAATTG TAAACACTGG AATATATTCC
[0150] 1701 GGTGTTTTTT TGTATATTAT GGGCGTTTAA TGAATTC
[0151] 将合成的β -淀粉酶基因DNA片段和质粒PDG364-P43用限制性内切酶HindIII 和EcoR I进行双酶切后用Τ4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，经筛 选鉴定获得重组质粒PDG364-P43-CTBA。
[0152] 2.质粒pDG364-P43-CTBA同源双交换整合到枯草芽孢杆菌1Α751染色体基因组
[0153] 如实施例1的方法制备枯草芽孢杆菌1Α751感受态细胞。将1Α751感受态细胞分 装成 0. 5ml 每管，加入 5ul 质粒？06364-?43-0^々(501^/111)，再于 37°C，250rpm 培养 90 分 钟，取菌液涂布氯霉素（5ug/ml)LB平板。用PCR方法筛选α -淀粉酶基因被破坏的转化子 即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌株lA751[CTBA]Cat+。筛选α -淀粉酶基因被破坏的转化 子的PCR方法如下：
[0154] 合成如下弓I 物:aaml :5，ggtctgatcgatgggatgtc 3，；aam2 ： 5‘ tcatcatcgctcatccatgt3' ；w2p ：5‘ actgacgattaccttgcg 3‘ ；baci-pl ： 5’ cttccaatcacccgctctt 3’ .将转化子在LB培养基中过夜培养后，提取总DNA.然后分别 用引物对aaml/aam2和w2p/baci_pl进行PCR. PCR反应条件分别如下：
[0155] aaml/aam2 :PCR 反应体系 20ul :DNA 模板(转化子总 DNA) Iul (约 20ng)，10 X Taq Buffer 2ul, 10pmol/ul dNTP 0. 4ul, lOpmol/ul 正反向引物各为 0. 5ul，2. 5U/ul Taq DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 20ul。PCR 反应程序-M°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s，72°C 30s, 30 个循环；72°C IOmin ；4°C保存；
[0156] w2p/baci-pl :PCR反应体系 20ul :DNA模板（转化子总 DNA) Iul (约 20ng)，IOXTaq Buffer 2ul, 10pmol/ul dNTP 0. 4ul，10pmol/ul 正反向引物各为 0. 5ul，2. 5U/ul Taq DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 20ul。PCR 反应程序-M°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s，72°C 70s, 30 个循环；72°C IOmin ；4°C保存；
[0157] 如果某一转化子用W2pAaCi-pl引物对做PCR得到大约1. Ikb的产物，而用aaml/ aam2引物对做PCR得不到大约450bp的产物，则这个转化子是α -淀粉酶缺失的转化子 1A751[CTBA]Cat+。
[0158] 3.用质粒JM103(pCm::Er)替换氯霉素抗性基因
[0159] 质粒JM103(pCm: :Er)与制备好的枯草芽孢杆菌1A751 [CTBA]Cat+感受态细胞混 合，220rpm，37°C摇床培养90min，涂布到含红霉素lug/ml的LB固体培养基中，长出的菌落 再接种到含氯霉素5ug/ml的LB固体培养基验证，筛选出红霉素抗性而氯霉素抗性失活的 菌株 1A751[CTBA] Cat-Erm+。
[0160] 4.质粒pDG364-P43-CTBA同源单交换整合到枯草芽孢杆菌1A751 [CTBA] CatTrm+ 染色体基因组
[0161] 质粒pDG364-P43-CTBA转化制备好的枯草芽孢杆菌1A751 [CTBAjCatTrm+感受态 细胞，在含氯霉素5ug/ml，红霉素lug/ml的LB固体培养基挑选重组菌，可筛选得到两个拷 贝β -淀粉酶表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的菌株1Α751 [CTBA2]Cat+Erm+。
[0162] 5.用质粒JM103(pCm::Nm)替换氯霉素抗性基因
[0163] 质粒JM103 (pCm: :Nm)转化制备好的枯草芽孢杆菌1A751 [CTBA2] Cat+Erm+感受态 细胞，在含新霉素20ug/ml，红霉素lug/ml的LB固体培养基中挑选重组菌，长出的菌落再接种到含氯霉素5ug/ml的LB固体培养基验证，筛选出新霉素抗性而氯霉素抗性失活的菌株 1A751 [CTBA2] Cat-Neo+Erm+。
[0164] 6.质粒pDG364-P43-CTBA同源单交换整合到枯草芽孢杆菌1A751 [CTBA2] CatTrm+Neo+染色体基因组
[0165] 质粒pDG364-P43-CTBA转化制备好的枯草芽孢杆菌1A751 [CTBA2] Cat^Neo+Erm+感 受态细胞，在含氯霉素5ug/ml、红霉素lug/ml和新霉素20ug/ml的LB固体培养基中挑选重 组菌，可筛选得到三个拷贝β-淀粉酶表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的菌株 1Α751 [CTBA3] Cat+Neo+Erm+。
[0166] 7.用质粒JM103(pCm::Sp)替换氯霉素抗性基因
[0167] 质粒JM103(pCm: :Sp)转化枯草芽孢杆菌1A751 [CTBA3] Cat+Neo+Erm+，在含状观霉 素60ug/ml，红霉素lug/ml和新霉素20ug/ml的LB固体培养基中挑选重组菌，长出的菌落 再接种到含氯霉素5ug/ml的LB固体培养基验证，筛选出状观霉素抗性而氯霉素抗性失活 的菌株 1A751 [CTBA3] Cat-Spe^teo+Erm+。
[0168] 8.质粒pDG364-P43-CTBA同源单交换整合到枯草芽孢杆菌1A751 [CTBA3] Cat^Spe+Neo+Erm+染色体基因组
[0169]质粒 pDG364-P43-CTBA 转化枯草芽孢杆菌 1A751 [CTBA3] Cat-Spe+Neo+Erm+,在含氯 霉素5ug/ml、红霉素lug/ml、新霉素20ug/ml和状观霉素60ug/ml的LB固体培养基中挑选 重组菌，可筛选得到四个拷贝β-淀粉酶表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的菌 株 1Α751 [CTBA4] Cat+Spe+Neo+Erm+。
[0170] 9.枯草芽孢杆菌β -淀粉酶的表达
[0171]枯草芽孢杆菌 1Α751 [CTBA4]Cat+Spe+Neo+Erm+在含氯霉素5ug/ml、红霉素 lug/ml、 新霉素20ug/ml、状观霉素60ug/ml的LB平板上活化，接种到LB液体培养基培养过夜，离 心，上清液即为β-淀粉酶粗酶液。
[0172] 10.重组枯草芽孢杆菌表达的淀粉酶的酶活测定
[0173] 如实施例1的方法测定重组枯草芽孢杆菌表达的β -淀粉酶的酶活。经测定，单 拷贝表达单元整合菌株lA751[CTBA]Cat+的粗酶液酶活为400U/ml左右，双拷贝表达单元 整合菌株1A751[CTBA2]Cat+Erm+的粗酶液酶活为700U/ml左右，三拷贝表达单元整合菌 株1A751[CTBA3]Cat+Neo+Erm+的粗酶液酶活为1000U/ml左右，四拷贝表达单元整合菌株 1A751 [CTBA4]Cat+Spe+Neo+Erm+的β -淀粉酶酶活为1200U/ml左右，四拷贝表达单元整合 菌株是单拷贝的3倍左右。
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