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一种高效高通量筛选纳米抗体的方法

阅读：709发布：2020-06-18

专利汇可以提供一种高效高通量筛选纳米抗体的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于抗体筛选技术领域，具体涉及一种高效高通量筛选纳米抗体的方法。本发明利用硒代半胱氨酸特异性延伸因子与mRNA二级结构之间的亲和连接联系纳米抗体基因型和表型，经过筛选，洗脱，富集，将有特异性亲和能力的纳米抗体通过获知其序列信息而将其鉴定出来。本发明方法与传统展示技术的技术相比，在基因型和表型连接稳定的基础上保证了抗体文库的多样性，本发明能够为生物医药领域抗体的快速高效筛选提供有效的方法。，下面是一种高效高通量筛选纳米抗体的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种高效高通量筛选纳米抗体的方法，其特征在于包括：
(1)构建纳米抗体库体外表达的载体结构，基因型-表型连接为硒代半胱氨酸特异性延伸因子-SECIS环，载体结构以Pvex2.3d为骨架，在T7启动子后克隆SEICIS LOOP,核糖体结合位点后克隆连接硒代半胱氨酸特异性延伸因子，之后克隆连接纳米抗体库；
(2)进行一轮淘选，通过无细胞表达体系体外表达纳米抗体库，用DNA酶消化剩余的载体DNA，将表达的纳米抗体文库与特异性抗原互相孵育；
(3)进行多轮淘选洗掉非特异性纳米抗体，富集特异性抗体；
(4)用测序的手段鉴定特异性纳米抗体的序列。
2.根据权利要求1所述的一种高效高通量筛选纳米抗体的方法，其特征在于所述的构建纳米抗体库体外表达的载体结构具体是：将纳米抗体库表达序列克隆进pVEX2.3载体，质粒在无细胞表达混合物中的终浓度为30ng/μL，在37℃条件下震荡1小时,然后在30℃孵育
2h，纳米抗体库体得到表达。
3.根据权利要求1所述的一种高效高通量筛选纳米抗体的方法，其特征在于所述的无细胞表达体系体外表达纳米抗体库是体外用(Promega)S30 High-Yield Protein Expression System 试剂盒，表达含有硒代半胱氨酸特异性延伸因子-SECIS环结构的纳米抗体库。
4.根据权利要求1所述的一种高效高通量筛选纳米抗体的方法，其特征在于所述的淘选具体步骤是：
(1)包被抗原：稀释抗原于抗原稀释液(PBS)中至终浓度5μg/ml,包被于免疫PCR试管中,于室温下孵育2h.然后清空试管，用100μL洗液(PBS-0.05％Tween-20+RNA(50μg/ml)+1μL Rnaseout)洗2次，每次3min；
(2)封闭：将封闭液(PBS+1％BSA+RNA(50μg/ml)+1μL Rnaseout)于室温下封闭两小时；
(3)DNA酶处理：首先按下表准备DNA酶Master Mix，混匀待用；
然后，将无细胞表达体系体外表达的蛋白产物与DNA酶Master Mix按1：10的比例混匀，以消除载体质粒带来的污染干扰，在37℃水浴锅中孵育15分钟，在其中7分钟的时候，再次上下混匀；由此DNA酶的消化处理会效果更好；
(4)纳米抗体孵育：清空试管，用冷的100μL洗液(PBS-0.05％Tween-20+RNA(50μg/ml)+
1μL Rnaseout)洗2次，每次3min；在步骤(1)包被的抗原之上，孵育10μL 10倍由DNA酶master mix稀释的抗体，在4℃孵育1小时；
(5)洗脱：清空试管，在4℃环境下，用冷的100μL洗液(PBS-0.05％Tween-20+RNA(50μg/ml)+1μL Rnaseout)洗8次，每次10min；
(6)cDNA合成：使用试剂(NEB E6300)cDNA Synthesis Kit，按说明书准备cDNA合成以获得淘选后富集得到的特异性抗体模板：
具体是按下表准备cDNA合成master mix，然后在试管中，加10μL master mix，将试管直接放入PCR机器中，在42℃孵育1h,在80℃孵育5min使得酶灭火；
Water 3.7μL
Reaction mixture 5μL
Reverse Primer(10uM) 0.3μL
Enzyme mix 1μL
In Total 10μL
(7)定量qPCR验证：
试剂：(Applied Biosystems)Fast SYBR Green Master Mix，Rnase Free water，首先按下表准备试剂：
Water 3.6μL
Master mix 5μL
Primer(10uM) 0.2μL each
cDNA 1μL
In Total 10μL per reaction
然后按下表准备程序：
95℃ 20s
95℃ 3s(40 cycles)
58℃(UBE2B) 30s(40 cycles)
。

说明书全文

一种高效高通量筛选纳米抗体的方法

技术领域

[0001] 本发明属于抗体筛选技术领域，具体涉及一种高效高通量筛选纳米抗体的方法。

背景技术

[0002] 目前来说，主要有两类方法生产抗体，一种是基于杂交瘤的方法，另一种是体外展示的方法。与基于杂交瘤的方法相比，体外展示方法可以克服免疫耐受，允许选择可识别高度保守的靶标的亲和抗体，可以创建多变体的文库，并重复淘选过程以产生具有优异特异性和亲和力的变体。这使得从抗体库中灵活地选择不同的抗体来对抗许多不同的个体人类靶点成为可能。

[0003] 现有的体外展示技术主要是以下几种：噬菌体展示技术，核糖体展示技术和mRNA展示技术，这几种技术各有优缺点。噬菌体展示技术(phage display technology)是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。这种展示技术利用噬菌体的特性，使得基因型和表型之间的连接非常稳定。但是噬菌体的大小(长度～1μm)可能导致空间位阻使得抗体筛选的有效性降低。另外文库的多样性也受转化效率的限制(109)。而对于核糖体展示技术来说，mRNA-核糖体-蛋白复合体不稳定，使得筛选的错配几率上升，另外对于mRNA展示技术来说,共价连接的mRNA部分可能干扰所展示蛋白质的功能。

[0004] 纳米抗体(Nbs)，是从骆驼的重链抗体中分离出的一种单结构域纳米抗体，它的分子量大小比常规抗体小10倍。这种分子量小的特性使其更容易表达，能够构建更多样性的抗体库，具有很好的结构稳定性。同时它具有快速穿透组织的能力，人同源性，这种特性使得纳米抗体在疾病治疗上有着很大的应用潜力。

[0005] 目前抗体筛选的方法虽然有多种，但是仍需一种稳定，高效，高通量的抗体筛选方法。

发明内容

[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明提供一种高通量高效筛选特异性纳米抗体的方法，目的是通过将展示技术和芯片技术相结合，从而提高纳米抗体筛选的效率，进一步更好地推广应用纳米抗体这一极具治疗前景的抗体。

[0007] 实现本发明目的的高通量高效筛选特异性纳米抗体的方法，包括：

[0008] (1)构建纳米抗体库体外表达的载体结构，基因型-表型连接为硒代半胱氨酸特异性延伸因子-mRNA二级结构(SELB-SECIS Loop)，载体结构以Pvex2.3d为骨架，在T7启动子后克隆mRNA二级结构(SEICIS LOOP),核糖体结合位点后克隆连接硒代半胱氨酸特异性延伸因子(SELB)，之后克隆连接Nbs抗体库；

[0009] (2)进行一轮淘选，通过无细胞表达体系体外表达纳米抗体库，用DNA酶消化剩余的载体DNA，将表达的纳米抗体文库与特异性抗原互相孵育；

[0010] (3)进行多轮淘选洗掉非特异性纳米抗体，富集特异性抗体；

[0011] (4)用测序的手段鉴定特异性纳米抗体的序列。

[0012] 其中，所述的构建纳米抗体库体外表达的载体结构具体是：将纳米抗体库表达序列克隆进pVEX2.3载体，质粒在无细胞表达混合物中的终浓度为30ng/μL，在37℃条件下震荡1小时,然后在30℃孵育2h，纳米抗体库体得到表达。

[0013] 所述的无细胞表达体系体外表达纳米抗体库是体外用(Promega)S30 High-Yield Protein Expression System 试剂盒，表达含有SELB-SECIS Loop结构的纳米抗体库。

[0014] 所述的淘选具体步骤是：

[0015] (1)包被抗原：稀释抗原于抗原稀释液(PBS)中至终浓度5μg/ml,包被于免疫PCR试管中,于室温下孵育2h.然后清空试管，用100μL洗液(PBS-0.05％Tween-20+RNA(50μg/ml)+1μL Rnaseout)洗2次，每次3min；

[0016] (2)封闭：将封闭液(PBS+1％BSA+RNA(50μg/ml)+1μL Rnaseout)于室温下封闭两小时；

[0017] (3)DNA酶处理：首先按下表准备DNA酶Master Mix，混匀待用；

[0018]

[0019] 然后，将无细胞表达体系体外表达的蛋白产物与DNA酶Master Mix按摩尔比1：10的比例混匀，以消除载体质粒带来的污染干扰，在37℃水浴锅中孵育15分钟，在其中7分钟的时候，再次上下混匀；由此DNA酶的消化处理会效果更好；

[0020] (4)纳米抗体孵育：清空试管，用冷的100μL洗液(PBS-0.05％Tween-20+RNA(50μg/ml)+1μL Rnaseout)洗2次，每次3min；在步骤(1)包被的抗原之上，孵育10μL 10倍由DNA酶master mix稀释的抗体，在4℃孵育1小时；

[0021] (5)洗脱：清空试管，在4℃环境下，用冷的100μL洗液(PBS-0.05％Tween-20+RNA(50μg/ml)+1μL Rnaseout)洗8次，每次10min；

[0022] (6)cDNA合成：使用试剂(NEB E6300)cDNA Synthesis Kit，按说明书准备cDNA合成以获得淘选后富集得到的特异性抗体模板。

[0023] 具体是按下表准备cDNA合成master mix，然后在试管中，加10μL master mix，将试管直接放入PCR机器中，在42℃孵育1h,在80℃孵育5min使得酶灭火；

[0024]

[0025] (7)定量qPCR验证：

[0026] 试剂：(Applied Biosystems)Fast SYBR Green Master Mix，Rnase Free water，首先，按下表准备试剂：

[0027]Water 3.6μL
Master mix 5μL
Primer(10uM) 0.2μL each
cDNA 1μL
In Total 10μL per reaction

[0028] 然后，按下表准备程序：

[0029]95℃ 20s
95℃ 3s(40cycles)
58℃(UBE2B) 30s(40cycles)

[0030] 与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：

[0031] 本发明中纳米抗体库的构建，其中基因型与表型的连接：SelB是一个位点特异性的mRNA结合翻译因子，最初发现在细菌中，它与mRNA二级结构SECIS loop有着很高的亲和力，这使得在翻译过程中，在翻译的多肽链中加上selenocysteine，SelB-SECIS连接的亲和力为1nM。这一亲和力使得纳米抗体的基因型接表型能够有着稳定的连接。保证了展示技术的准确性和特异性，这区别于以往的展示技术。

[0032] 本发明中pVEX2.3载体结构是T7启动子，由此使得在细菌表达成为可能，载体结构中的SELB和SECIS Loop结构使得表达后，纳米蛋白和其mRNA之间的连接成为可能[0033] 传统的细菌系统表达，操作繁琐：转化，细菌培养，IPTG诱导，收集，裂解，离心。但是在本发明中纳米抗体库的体外表达方法中，我们应用独立于细菌的表达系统，避免了这一繁琐的表达过程。通过使用细菌的提取物以及所有蛋白表达所需元件，如：ATP，dNTP,amino acids…由此可以保证蛋白表达的多样性，另外使蛋白表达快速且简单。附图说明

[0034] 图1是本发明纳米抗体库体外表达的载体结构示意图；

[0035] 图2是本发明淘选过程流程图；

[0036] 图3为本发明方法中基因型-表型SelB-SECIS连接稳定性的验证测试结果图；

[0037] 其中(A)是指10％天然凝胶电泳(Native-Page)的结果；(B)是指10％SDS变性凝胶电泳(SDS-Page)的结果，随后用抗6His标签的HRP标记的抗体进行western印迹实验；

[0038] 图4为本发明中基因型-表型SelB-SECIS连接功能即时聚合酶连锁反应验证实验；

[0039] 其中(A)是指含SECIS的实验示意图；(B)是指不含SECIS的实验示意图；(C)是指在淘选之前的每个组的拷贝数；(D)是指淘选后的每个组的拷贝数；Ag-是指未被纳米抗体特异性抗原固定的孔表面；Ag+是指用纳米抗体特异性抗原UBE2B固定的孔表面；

[0040] 图5为本发明中淘选模拟实验结果；

[0041] 其中Positive binder-plasmid spiking ratio是指特异性抗体-UBE2B的比率，Input是指在淘选前的比例；Output是指在淘选后比例；该比率通过以下等式计算：比率＝特异性抗体拷贝数或非特异性抗体拷贝数/所有抗体的拷贝数。

具体实施方式

[0042] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0043] 实施例1

[0044] 本实施例以UBE2B特异性纳米抗体的筛选为例进行说明，具体按照以下步骤进行：

[0045] (1)含UBE2B纳米抗体的抗体库的体外表达

[0046] 将含纳米抗体序列在Pivex 2.3d的载体按下表准备体外表达的试剂，所用体外表达试剂盒为(Promega)S30 High-Yield Protein Expression System，其中最后质粒在反应体系中的终浓度为30ng/μL，另外质粒的体积不超过总表达体积的十分之一。

[0047] 本实施例中准备两组实验，第一组实验为验证SECIS loop-SelB连接的稳定性，将含有和不含有SECIS loop结构的UBE2B载体分别表达；基因型-表型稳定连接测试结果如图3所示，说明就缺失mRNA二级结构(SECIS环)的载体而言，在细胞外表达后，mRNA不能锁定硒代半胱氨酸特异性延伸因子(SelB)-纳米抗体(Nb)融合蛋白。当使用含有SECIS环的载体时，在细胞外表达后，形成亲本mRNA-SelB-Nb复合物。

[0048] 第二组实验为模拟真实淘选，按0.1％，0.01％，0.001％三种不同的比例将特异性抗体UBE2B和UCHL3混合，将混好的质粒和表达试剂混合，轻柔上下吹打数次，然后在37℃震荡1小时，30℃静置孵育2小时，结果如图4所示，该实验表明特异性的抗体UBE2B可以通过SECIS loop-SelB连接经由淘选回收回来。

[0049]试剂体积
质粒(over 200ng/μL) ～μL
预混物 20μL
E.coli抽提物 18μL
RNA酶抑制剂 1μL
水 6μL
总体积 50μL

[0050] (2)UBE2B纳米抗体的筛选

[0051] 包被抗原：稀释UBE2B抗原于抗原稀释液(PBS)中至终浓度5μg/ml,包被于免疫PCR试管中,于室温下孵育2h.然后清空试管，用100μL洗液(PBS-0.05％Tween-20+RNA(50μg/ml)+1μL Rnaseout)洗2次，每次3min。

[0052] 封闭：封闭液(PBS+1％BSA+RNA(50μg/ml)+1μL Rnaseout)于室温下封闭两小时。

[0053] DNA酶处理：为排除质粒在后续步骤中的干扰，实施DNA酶实验处理。首先按下表准备DNA酶Master Mix，混匀待用。

[0054]

[0055]

[0056] 将表达好的蛋白产物与DNA酶Master Mix按1：10的比例混匀，以消除质粒带来的污染干扰。在37℃水浴锅中孵育15分钟，在其中7分钟的时候，再次上下混匀。

[0057] 洗脱，纳米抗体孵育：

[0058] 清空试管，用冷的100μL洗液(PBS-0.05％Tween-20+RNA(50μg/ml)+1μL Rnaseout)洗2次，每次3min；

[0059] 然后在之前包被的抗原之上，孵育10μL 10倍由DNA酶master mix稀释的纳米抗体表达产物，在4℃孵育1小时。

[0060] 洗脱：

[0061] 清空试管，用冷的100μL洗液(PBS-0.05％Tween-20+RNA(50μg/ml)+1μL Rnaseout)洗8次，每次10min。洗脱过程在4℃环境下。

[0062] cDNA合成：

[0063] 试剂：(NEB E6300)cDNA Synthesis Kit，无RNA酶水；

[0064] 首先，按下表准备cDNA合成master mix，然后在试管中，加10μL master mix，将试管直接放入PCR机器中，然后在42℃孵育1h,在80℃孵育5min使得酶灭活。

[0065]Water 3.7μL
Reaction mixture 5μL
reverse Primer(10uM) 0.3μL
Enzyme mix 1μL
In Total 10μL

[0066] 定量qPCR验证：

[0067] 试剂：(Applied Biosystems)Fast SYBR Green Master Mix，Rnase Free water；

[0068] 首先，按下表准备试剂：

[0069]Water 3.6μL
Master mix 5μL
Primer(10uM) 0.2μL each
cDNA 1μL
In Total 10μL per reaction

[0070] 然后，按下表准备程序：

[0071]

[0072]

[0073] 其中UBE2B特异性引物序列为：

[0074]UBE2B/for TAGCTACTCCATGGGCTGGT
UBE2B/rev GCCCACTGAAACGAGTTGA

[0075] 其中纳米抗体通用引物序列为：

[0076]

[0077] 由RT-PCR验证的第一轮淘选结果如图5所示，该实验表明在第一轮淘选后，特异性抗体富集约5倍。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

[0078] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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