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一种高性能M‑MLV逆转录酶的制备方法

阅读：810发布：2020-06-16

专利汇可以提供一种高性能M‑MLV逆转录酶的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明是一种高性能M‑MLV逆转录酶的制备方法，包括突变体克隆构建，所构建的突变体质粒序列均经过测序确认，得到17个突变体质粒；然后进行突变体的筛选：将野生型pET28b‑M‑MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞中，培养、诱导突变酶表达；收集菌体获得突变酶粗提液；选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选：将活性筛选结果阳性的突变体在液体培养基中培养、诱导蛋白表达；收集菌体纯化得到M‑MLV逆转录酶。本发明方法采用分子理性设计与功能筛选相结合，在较小范围内筛选即获得高热稳定性 M‑MLV逆转录酶，其热稳定性达到耐热能力 65°C。，下面是一种高性能M‑MLV逆转录酶的制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）突变体克隆构建：野生型M-MLV逆转录酶的基因序列CCA64130.1通过基因合成获得，合成至克隆载体pUC57上，产生pUC57-M-MLV质粒；合成序列包括5’端添加的NheI酶切位点和3’端添加的TAA终止密码子以及EcoRI酶切位点；pUC57-M-MLV质粒经NheI和EcoRI双酶切后，带有M-MLV逆转录酶基因的片段以T4 DNA Ligase连接至相同限制性内切酶酶切后的pET-28b载体上，使M-MLV逆转录酶基因的表达框与载体上的组胺纯化标签6xHis的表达框一致；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行质粒扩增，然后提取获得重组质粒pET28b-M-MLV，并经测序确认序列正确；该质粒诱导表达后产生N端融合6xHis纯化标签的M-MLV逆转录酶；逆转录酶突变体的构建以质粒pET28b-M-MLV为原始模板，在突变位点设计特异性引物，使用点突变试剂盒KOD Site-Directed Mutagenesis Kit定向引入点突变；每轮定向突变只能引入1个单点突变，多点突变的构建经过多轮单点定向突变完成；所构建的突变体质粒序列均经过测序确认，得到17个突变体质粒；
（2）突变体的筛选：将编号分别为1-18的野生型pET28b-M-MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌BL21 (DE3) RIPL感受态细胞中，并在含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的平板上以30℃－40℃条件培养过夜；挑取平板上的单克隆接种到含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的LB液体培养基中，在30℃ -40℃、150rpm－250 rpm的摇床中活化培养至OD值为
0.4－0.6，再加入终浓度为0.1－0.3 mM的诱导剂IPTG在16℃下以150rpm－250 rpm摇动培养，诱导突变酶表达；IPTG诱导后的发酵液离心收集菌体；菌体以B-PER细菌蛋白提取试剂充分重悬后，静置，涡旋后低温离心取上清，获得突变酶粗提液；对不同突变酶粗提液进行SDS-PAGE电泳检测，观察有无目的蛋白的表达；选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选：以番茄总RNA为模板，进行逆转录反应；向含1 µg RNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：1 µl oligo(dT)20引物、4 µl 5X M-MLV First Strand Buffer、1 µl 0.1 M DTT、1 µl Ribonuclease Inhibitor、1 µl dNTP Mix，以及
0.5 µl突变酶粗提液，用Nuclease-free Water将总体积补至20 µl，在37℃－60℃不同反应温度下反应；反应结束后，于80℃－90℃孵育5s－15 s以终止反应，使用0.5 µl逆转录产物作为PCR模板，并使用高保真KOD DNA聚合酶以及1对β-Actin基因的特异性引物进行PCR扩增，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况；观察到PCR扩增条带则认为突变酶粗提液具有逆转录活性；
（3）逆转录酶突变体的表达与纯化：将活性筛选结果阳性的突变体在液体培养基中培养至OD值为0.6-0.8，加入终浓度为0.15mM－0.25 mM的IPTG，在15℃－17℃，180rpm－
220rpm培养10－20小时，诱导蛋白表达；将IPTG诱导后的发酵液以8000g离心15－25min收集菌体；菌体以Ni柱结合缓冲液充分重悬后，以细胞高压破碎仪破碎，再以43000g低温离心
20－40 min，取上清以Ni亲和层析纯化柱纯化并分步收集，将单管收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测；Ni亲和层析过程中使用的缓冲液包括：平衡缓冲液、漂洗缓冲液和梯度洗脱缓冲液；Ni亲和层析的洗脱峰以AKTA系统配套Superdex200层析柱进行分子筛层析，收集洗脱峰并透析至贮存缓冲液，储存于-80°C；整个纯化过程在冰上或4°C进行；得到M-MLV逆转录酶。
2.根据权利要求1所述的高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）突变体的筛选：将编号分别为1-18的野生型pET28b-M-MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌BL21 (DE3) RIPL感受态细胞中，并在含75 µg/ml卡那霉素和35 µg/ml氯霉素两种抗生素的平板上以37°C条件培养过夜；挑取平板上的单克隆接种到含75 µg/ml卡那霉素和35 µg/ml氯霉素两种抗生素的10 ml LB液体培养基中，在37°C，200 rpm的摇床中活化培养至OD值为0.4-0.6，再加入终浓度为0.2 mM的诱导剂IPTG在16°C下以200 rpm摇动培养16小时，诱导突变酶表达；IPTG诱导后的发酵液以8000g离心5 min收集菌体；菌体以2 ml B-PER细菌蛋白提取试剂充分重悬后，22°C静置15 min，涡旋1 min后以18000g低温离心5 min取上清，获得突变酶粗提液；对不同突变酶粗提液进行SDS-PAGE电泳检测，观察有无目的蛋白的表达；
选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选：以番茄总RNA为模板，进行逆转录反应；向含1 µg RNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：50 µM 的1 µl oligo(dT)20引物；组成为250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2的4 µl 5X M-MLV First Strand Buffer；1 µl 0.1 M DTT；40 U/µl 的1 µl Ribonuclease Inhibitor；10 mM each 的1 µl dNTP Mix，以及0.5 µl突变酶粗提液，用Nuclease-free Water将总体积补至20 µl，在37°C－60°C不同反应温度下反应20 min；反应结束后，于85°C孵育10 s以终止反应，使用0.5 µl逆转录产物作为PCR模板，并使用高保真KOD DNA聚合酶以及1对β-Actin基因的特异性引物进行PCR扩增，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况；观察到PCR扩增条带则认为突变酶粗提液具有逆转录活性。
3.根据权利要求1所述的高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）逆转录酶突变体的表达与纯化中：将活性筛选结果阳性的突变体在液体培养基中培养至OD值为
0.6-0.8，加入终浓度为0.2 mM的IPTG，在16°C，200 rpm培养16小时，诱导蛋白表达；将IPTG诱导后的发酵液以8000g离心20 min收集菌体；菌体以Ni柱结合缓冲液充分重悬后，所述的Ni柱结合缓冲液为20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.05% (v/v) NP-40, 5% glycerol；然后以细胞高压破碎仪破碎，再以43000g低温离心30 min，取上清以Ni亲和层析纯化柱纯化并分步收集，将单管收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测；Ni亲和层析过程中使用的缓冲液包括：平衡缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.05% (v/v) NP-40, 5% glycerol；漂洗缓冲液：20 mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.01% (v/v) NP-40, 5% glycerol；梯度洗脱缓冲液：50-200 mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.01% (v/v) NP-40, 5% glycerol；
Ni亲和层析的洗脱峰以AKTA系统配套Superdex200层析柱进行分子筛层析，洗脱缓冲液为40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.02% (v/v) NP-40, 10% glycerol；收集洗脱峰并透析至贮存缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01% (v/v) NP-40, 50% glycerol；储存于-80°C；
整个纯化过程在冰上或4°C进行；得到M-MLV逆转录酶。
4.根据权利要求1所述的高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其特征在于：采用以下方法进行M-MLV逆转录酶活性检测：采用同位素法测定逆转录酶的活性；实验体系如下：50 mM Tris-HCl, pH8.0, 20 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 8 mM DTT, 50 μM [3H] dTTP，1 μM模板-引物混合物，模板引物混合物由poly(A)和16单位的寡聚T组成, 1 pmol酶；加水补至30 μl并于37°C孵育10分钟，加入20 μl 0.5 M EDTA终止反应；然后通过酸性沉淀法测定多聚脱氧核糖核酸的含量，并以多聚脱氧核糖核酸的含量来确定酶活；将37°C条件下，以Poly(A)-Oligo(dT)为模板/引物，在10分钟内掺入1 nmol [3H] dTTP进入酸不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位。
5.根据权利要求1所述的高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其特征在于：采用以下方法进行M-MLV逆转录酶热稳定性检测：以番茄总RNA为模板，在不同温度下进行逆转录反应；
向含RNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：50 µM的 1 µl oligo(dT)20引物；
组份为250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2的4µl 5X M-MLV First Strand Buffer；1 µl 0.1 M DTT；40 U/µl 的1 µl Ribonuclease Inhibitor；10 mM each 的1 µl dNTP Mix，以及200 U纯化的逆转录酶，用Nuclease-free Water将总体积补至20 µl，在不同反应温度下37°C、42°C、45°C、50°C、55°C和65°C反应20 min；反应结束后，于85°C孵育10 s以终止反应；以1 µl逆转录产物作为qPCR模板，使用Taq-HS Probe qPCR Premix和针对β-Actin基因的探针进行TaqMan法荧光定量PCR，根据扩增曲线判断逆转录合成cDNATM
的情况；以商业化逆转录酶Invitrogen M-MLV作为对照。
6.根据权利要求1所述的高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其特征在于：采用以下方法进行M-MLV逆转录酶cDNA合成长度检测：以人血提取的总RNA为模板进行逆转录，向含RNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：50 µM 的1 µl oligo(dT)20引物、组份为
250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2的4µl 5X M-MLV First Strand Buffer；1 µl 0.1 M DTT；40 U/µl 的1 µl Ribonuclease Inhibitor；10 mM each 的1 µl dNTP Mix，以及200 U纯化的逆转录酶，用Nuclease-free Water将总体积补至20 µl，在37°C反应30 min；反应结束后，于85°C孵育10 s以终止反应；根据人HERC1基因序列，在其cDNA上距离5’端3 kb、6 kb、12 kb的位置分别设计3对特异性引物，扩增片段的理论长度均为1 kb；以逆转录产物为模板，使用高保真KOD DNA聚合酶和以上3对引物进行PCR扩增，然后以
1%琼脂糖凝胶电泳检测，根据扩增情况判断cDNA的合成长度；以商业化逆转录酶InvitrogenTM M-MLV作为对照。

说明书全文

一种高性能M-MLV逆转录酶的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物催化剂的制备方法，特别是一种高性能M-MLV逆转录酶的制备方法。

背景技术

[0002] 现代生物医学建立在分子生物学“中心法则”的基础之上。通过基因表达研究基因功能是现代生物医学的核心问题之一。由于基因表达产物RNA极易降解，因此绝大多数关于基因表达的研究都需要将RNA逆转录为cDNA来作为研究对象。特别是近年来，伴随着高通量测序技术的飞速发展，RNA测序在生物医学前沿研究中得到了广泛的应用，在真核生物的基因表达调控研究、疾病发生机制研究和精准医疗方案确定、动植物遗传育种等众多方面都具有不可估量的潜力。而RNA测序同样需要首先将模板RNA转变为cDNA来构建测序文库。在这些过程中，都需要一种极为重要的生物催化剂——逆转录酶。

[0003] 逆转录酶（Reverse Transcriptase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成cDNA的酶。逆转录酶具有3种活性：RNA指导的DNA聚合酶活性，DNA指导的DNA聚合酶活性（这2种活性共用同一个活性中心），以及降解RNA-DNA杂合链中RNA的RNase H活性。在生物医学领域，逆转录酶被广泛用于合成第一链cDNA、制备cDNA文库、RNA测序等。为此，最早发现逆转录酶的美国科学家特明（H. M. Temin）和巴尔的摩（D. Baltimore）共同获得了1970年诺贝尔生理学或医学奖。

[0004] 合成cDNA的最大挑战在于，在较低的温度下单链RNA容易自身配对形成发夹等复杂二级结构，阻碍逆转录反应的进行；同时，逆转录酶自身具有的RNase H活性会降解模板RNA，导致合成的cDNA被截短。而较高的温度能够打开RNA的二级结构，有利于cDNA的合成。目前，人们仍然缺乏高效率热稳定性逆转录酶作为工具，因此，寻找热稳定性更高的逆转录酶，或者改造提升现在已经发现的逆转录酶的热稳定性十分重要。

[0005] 最常用于生物医学工具酶的逆转录酶包括莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney Murine Leukemia virus，M-MLV）逆转录酶和禽骨髓母细胞瘤病毒（Avian Myeloblastosis Virus，AMV）逆转录酶。M-MLV逆转录酶由一条多肽链构成，包括N端聚合酶结构域和C端RNase H结构域，一般在37°C -42°C下工作，在高温下会很快失活。AMV逆转录酶具有更高的最适反应温度（45°C -50°C），但由于和M-MLV逆转录酶相比，其cDNA合成效率较低、RNase H活性较强，所以应用范围较小。由于野生型M-MLV逆转录酶和AMV逆转录酶在反应温度方面受限，科研人员对于它们的热稳定性和cDNA合成效率的提升改造从未间断。其中一个有效的改造是通过点突变将它们的RNase H活性去除。去除RNase H活性后，它们对于全长cDNA的合成有了很大改善，热稳定性也有了一定提高。M-MLV逆转录酶由单体构成，结构比AMV逆转录酶（由2个亚基构成）更为简单，因此也得到更多的改造尝试。通过分子设计结合高通量筛选的方法，目前已获得了热稳定性高达60°C的M-MLV逆转录酶突变体。

[0006] 在野生型M-MLV逆转录酶中引入大量随机突变，并使用compartmentalized ribosome display (CRD) evolution in vitro technique技术进行高通量筛选，选出热稳定性提升的突变体。现有报道的最高热稳定性M-MLV逆转录酶耐热能力为60°C。其缺陷在于：由于突变是随机引入的，导致无效突变或失活突变过多，后期筛选工作量大且命中率低。筛选使用的compartmentalized ribosome display (CRD) evolution in vitro technique技术要使用无细胞表达体系，价格昂贵。现有报道的最高热稳定性M-MLV逆转录酶耐热能力为60°C，耐热能力较低。

发明内容

[0007] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分子理性设计与功能筛选相结合从而获取高热稳定性的M-MLV逆转录酶的制备方法。

[0008] 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其特点是，其步骤如下：（1）突变体克隆构建：野生型M-MLV逆转录酶的基因序列CCA64130.1通过基因合成获得，合成至克隆载体pUC57上，产生pUC57-M-MLV质粒；合成序列包括5’端添加的NheI酶切位点和3’端添加的TAA终止密码子以及EcoRI酶切位点；pUC57-M-MLV质粒经NheI和EcoRI双酶切后，带有M-MLV逆转录酶基因的片段以T4 DNA Ligase连接至相同限制性内切酶酶切后的pET-28b载体上，使M-MLV逆转录酶基因的表达框与载体上的组胺纯化标签6xHis的表达框一致；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行质粒扩增，然后提取获得重组质粒pET28b-M-MLV，并经测序确认序列正确；该质粒诱导表达后产生N端融合6xHis纯化标签的M-MLV逆转录酶；逆转录酶突变体的构建以质粒pET28b-M-MLV为原始模板，在突变位点设计特异性引物，使用点突变试剂盒KOD Site-Directed Mutagenesis Kit定向引入点突变；每轮定向突变只能引入1个单点突变，多点突变的构建经过多轮单点定向突变完成；所构建的突变体质粒序列均经过测序确认，得到17个突变体质粒；
（2）突变体的筛选：将编号分别为1-18的野生型pET28b-M-MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌BL21 (DE3) RIPL感受态细胞中，并在含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的平板上以30℃－40℃条件培养过夜；挑取平板上的单克隆接种到含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的LB液体培养基中，在30℃ -40℃、150rpm－250 rpm的摇床中活化培养至OD值为
0.4－0.6，再加入终浓度为0.1－0.3 mM的诱导剂IPTG在16℃下以150rpm－250 rpm摇动培养，诱导突变酶表达；IPTG诱导后的发酵液离心收集菌体；菌体以B-PER细菌蛋白提取试剂充分重悬后，静置，涡旋后低温离心取上清，获得突变酶粗提液；对不同突变酶粗提液进行SDS-PAGE电泳检测，观察有无目的蛋白的表达；选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选：以番茄总RNA为模板，进行逆转录反应；向含1 µg RNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：1 µl oligo(dT)20引物、4 µl 5X M-MLV First Strand Buffer、1 µl 0.1 M DTT、1 µl Ribonuclease Inhibitor、1 µl dNTP Mix，以及
0.5 µl突变酶粗提液，用Nuclease-free Water将总体积补至20 µl，在37℃－60℃不同反应温度下反应；反应结束后，于80℃－90℃孵育5s－15 s以终止反应，使用0.5 µl逆转录产物作为PCR模板，并使用高保真KOD DNA聚合酶以及1对β-Actin基因的特异性引物进行PCR扩增，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况；观察到PCR扩增条带则认为突变酶粗提液具有逆转录活性；
（3）逆转录酶突变体的表达与纯化：将活性筛选结果阳性的突变体在液体培养基中培养至OD值为0.6-0.8，加入终浓度为0.15mM－0.25 mM的IPTG，在15℃－17℃，180rpm－
220rpm培养10－20小时，诱导蛋白表达；将IPTG诱导后的发酵液以8000g离心15－25min收集菌体；菌体以Ni柱结合缓冲液充分重悬后，以细胞高压破碎仪破碎，再以43000g低温离心
20－40 min，取上清以Ni亲和层析纯化柱纯化并分步收集，将单管收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测；Ni亲和层析过程中使用的缓冲液包括：平衡缓冲液、漂洗缓冲液和梯度洗脱缓冲液；Ni亲和层析的洗脱峰以AKTA系统配套Superdex200层析柱进行分子筛层析，收集洗脱峰并透析至贮存缓冲液，储存于-80°C；整个纯化过程在冰上或4°C进行；得到M-MLV逆转录酶。

[0009] 本发明所述的高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其进一步优选的技术方案是，步骤（2）突变体的筛选：将编号分别为1-18的野生型pET28b-M-MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌BL21 (DE3) RIPL感受态细胞中，并在含75 µg/ml卡那霉素和35 µg/ml氯霉素两种抗生素的平板上以37°C条件培养过夜；挑取平板上的单克隆接种到含75 µg/ml卡那霉素和35 µg/ml氯霉素两种抗生素的10 ml LB液体培养基中，在37°C，200 rpm的摇床中活化培养至OD值为0.4-0.6，再加入终浓度为0.2 mM的诱导剂IPTG在16°C下以200 rpm摇动培养16小时，诱导突变酶表达；IPTG诱导后的发酵液以8000g离心5 min收集菌体；菌体以2 ml B-PER细菌蛋白提取试剂充分重悬后，22°C静置15 min，涡旋1 min后以18000g低温离心5 min取上清，获得突变酶粗提液；对不同突变酶粗提液进行SDS-PAGE电泳检测，观察有无目的蛋白的表达；
选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选：以番茄总RNA为模板，进行逆转录反应；向含1 µg RNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分： 1 µl oligo(dT)20引物（50 µM）； 4 µl 5X M-MLV First Strand Buffer（250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2）；1 µl 0.1 M DTT；1 µl Ribonuclease Inhibitor（40 U/µl ）； 1 µl dNTP Mix（10 mM each ），以及0.5 µl突变酶粗提液，用Nuclease-free Water将总体积补至20 µl，在37°C－60°C不同反应温度下反应20 min；反应结束后，于85°C孵育10 s以终止反应，使用0.5 µl逆转录产物作为PCR模板，并使用高保真KOD DNA聚合酶以及1对β-Actin基因的特异性引物进行PCR扩增，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况；观察到PCR扩增条带则认为突变酶粗提液具有逆转录活性。

[0010] 本发明所述的高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其进一步优选的技术方案是，步骤（3）逆转录酶突变体的表达与纯化中：将活性筛选结果阳性的突变体在液体培养基中培养至OD值为0.6-0.8，加入终浓度为0.2 mM的IPTG，在16°C，200 rpm培养16小时，诱导蛋白表达；将IPTG诱导后的发酵液以8000g离心20 min收集菌体；菌体以Ni柱结合缓冲液充分重悬后，所述的Ni柱结合缓冲液为20 mM Tris-HCl，pH 7.5， 500 mM NaCl, 0.05% (v/v) NP-40, 5% glycerol；然后以细胞高压破碎仪破碎，再以43000g低温离心30 min，取上清以Ni亲和层析纯化柱纯化并分步收集，将单管收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测；Ni亲和层析过程中使用的缓冲液包括：平衡缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.05% (v/v) NP-40, 5% glycerol；漂洗缓冲液：20 mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH
7.5, 500 mM NaCl, 0.01% (v/v) NP-40, 5% glycerol；梯度洗脱缓冲液：50-200 mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.01% (v/v) NP-40, 5% glycerol；
Ni亲和层析的洗脱峰以AKTA系统配套Superdex200层析柱进行分子筛层析，洗脱缓冲液为40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.02% (v/v) NP-40, 10% glycerol；收集洗脱峰并透析至贮存缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01% (v/v) NP-40, 50% glycerol；储存于-80°C；
整个纯化过程在冰上或4°C进行；得到M-MLV逆转录酶。

[0011] 本发明所述的高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其进一步优选的技术方案是，采用以下方法进行M-MLV逆转录酶活性检测：采用同位素法测定逆转录酶的活性；实验体系如3
下：50 mM Tris-HCl, pH8.0, 20 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 8 mM DTT, 50 μM [H] dTTP，1 μM模板-引物混合物，模板引物混合物由poly(A)和16单位的寡聚T组成, 1 pmol酶；加水补至30 μl并于37°C孵育10分钟，加入20 μl 0.5 M EDTA终止反应；然后通过酸性沉淀法测定多聚脱氧核糖核酸的含量，并以多聚脱氧核糖核酸的含量来确定酶活；将37°C条件下，以
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Poly(A)-Oligo(dT)为模板/引物，在10分钟内掺入1 nmol [H] dTTP进入酸不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位。

[0012] 本发明所述的高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其进一步优选的技术方案是，采用以下方法进行M-MLV逆转录酶热稳定性检测：以番茄总RNA为模板，在不同温度下进行逆转录反应；向含RNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：1 µl oligo(dT)20引物（50 µM）； 4 µl 5X M-MLV First Strand Buffer（250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2）；1 µl 0.1 M DTT； 1 µl Ribonuclease Inhibitor（40 U/µl ）； 1 µl dNTP Mix（10 mM each ）以及200 U纯化的逆转录酶，用Nuclease-free Water将总体积补至20 µl，在不同反应温度下37°C、42°C、45°C、50°C、55°C和65°C反应20 min；反应结束后，于85°C孵育10 s以终止反应；以1 µl逆转录产物作为qPCR模板，使用Taq-HS Probe qPCR Premix和针对β-Actin基因的探针进行TaqMan法荧光定量PCR，根据扩增曲线判断逆转录合成cDNA的情况；以商业化逆转录酶InvitrogenTM M-MLV作为对照。

[0013] 本发明所述的高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其进一步优选的技术方案是，采用以下方法进行M-MLV逆转录酶cDNA合成长度检测：以人血提取的总RNA为模板进行逆转录，向含RNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：1 µl oligo(dT)20引物（50 µM）； 4 µl 5X M-MLV First Strand Buffer（250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2）；1 µl 0.1 M DTT； 1 µl Ribonuclease Inhibitor（40 U/µl ）； 1 µl dNTP Mix（10 mM each ）以及200 U纯化的逆转录酶，用Nuclease-free Water将总体积补至20 µl，在37°C反应30 min；反应结束后，于85°C孵育10 s以终止反应；根据人HERC1基因序列，在其cDNA上距离5’端3 kb、6 kb、12 kb的位置分别设计3对特异性引物，扩增片段的理论长度均为1 kb；以逆转录产物为模板，使用高保真KOD DNA聚合酶和以上3对引物进行PCR扩增，然后以1%琼脂糖凝胶电泳检测，根据扩增情况判断cDNA的合成长度；以商业化逆转录酶InvitrogenTM M-MLV作为对照。

[0014] 本发明方法采用分子理性设计与功能筛选相结合，在较小范围内筛选即获得高热稳定性M-MLV逆转录酶，其热稳定性达到耐热能力65°C，高于现有报道的M-MLV逆转录酶。性能优良具有潜在应用价值。

[0015] 本发明M-MLV逆转录酶热稳定性改造的大量实验数据显示，提高酶与底物的结合力能够提升酶的热稳定性。这一机理为进一步通过分子设计和理性改造提升M-MLV逆转录酶的性能提供了理论基础。在本发明研究中，通过M-MLV逆转录酶的同源序列比对和蛋白三维结构分析，针对直接参与底物结合的区域进行点突变设计，并结合RNase H活性灭失突变，构建了一系列突变体。通过活性筛选，获得热稳定性提升的11号突变体（T197M, T330Q, D524G），并成功大量制备。功能检测结果显示，11号突变体热稳定性高达65°C，并能合成长达12 kb的cDNA，性能优良，具有较好的应用前景。同时，本发明成功突变了十多种组合位点的M-MLV逆转录酶，为后续研究逆转录酶的活性区域、进一步改造更高效的逆转录酶提供了理论和实验依据。附图说明

[0016] 图1－2为本发明M-MLV逆转录酶的生物信息学分析图；其中：图1为M-MLV逆转录酶活性核心区域序列比对。野生型M-MLV逆转录酶肽链序列根据GenBank号CCA64130.1生成；其它序列的GenBank号标于每个序列的前端；保守序列、相似序列、不保守序列分别以黑色、灰色、白色显示；氨基酸代号上方的数字代表该氨基酸在野生型M-MLV逆转录酶肽链序列中的对应位置；突变位点以红色方框标出。图2为M-MLV逆转录酶三维结构分析。野生型M-MLV逆转录酶的三维结构模型（PDB ID：5DMQ）以缎带形式显示；青色部分为逆转录活性结构域，红色部分为RNase H活性结构域；结合于活性位点的一段多聚核苷酸（来自逆转录活性结构域与多聚核苷酸共结晶的结构模型；PDB ID：4HKQ）以棍型图显示；突变位点以棍型黄色显示侧链；T197、T330和T332残基的临近区域放大显示于插入框中。

[0017] 图3－5为M-MLV逆转录酶突变体克隆构建图；其中：图3为M-MLV逆转录酶突变体列表；图4为M-MLV逆转录酶突变体表达载体示意图。表达载体全长7360 bp；紫色箭头标注出T197、T330、T332和D524四个突变位点；His Tag及M-MLV逆转录酶基因为图中绿色片段；卡纳霉素抗性基因（黄色）、lac I基因（青色）、T7启动子和终止子以及ColE1质粒复制原点分别标出。图5为突变体克隆构建过程中使用的引物列表。

[0018] 图6为M-MLV突变体逆转录活性筛选的琼脂糖凝胶电泳结果图。逆转录温度标于每组条带左侧；数字代表突变体的序号。有明显电泳条带表明逆转录反应成功获得β-Actin的cDNA；条带的亮度可半定量反映逆转录活性的强弱。

[0019] 图7为M-MLV逆转录酶突变体诱导及纯化流程示意图;图8为不同纯化步骤M-MLV逆转录酶突变体蛋白样品的SDS-PAGE电泳检测。泳道1-2为诱导步骤的样品；泳道3-9为Ni亲和层析步骤的样品；泳道11-21为分子筛层析步骤的样品；
泳道10和22为蛋白分子量标准；M-MLV逆转录酶突变体的条带位置以箭头指示。

[0020] 图9为M-MLV逆转录酶突变体的分子筛层析UV280吸收峰值曲线图；其中：横坐标为洗脱体积，纵坐标为UV280吸收值；2个洗脱吸收峰（峰1和峰2）以数字标出。

[0021] 图10为11号突变体（T197M, T330Q, D524G）逆转录酶在不同温度下逆转录获得的cDNA的qPCR扩增曲线；图11为商业化对照品InvitrogenTM M-MLV逆转录酶在不同温度下逆转录获得的cDNA的qPCR扩增曲线。

[0022] 图12为针对人源HERC1基因mRNA设计PCR引物示意图。引物对1、2和3分别设计在距离逆转录起始位（Poly(A)）3 kb、6 kb和12 kb处，每对引物的扩增长度均为1 kb；图13为11号突变体的cDNA合成长度检测。使用引物对1、2和3对11号突变体及商业化逆转录酶InvitrogenTM M-MLV的逆转录产物进行PCR扩增，扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测。

具体实施方式

[0023] 以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

[0024] 实施例1，一种高性能M-MLV逆转录酶的制备方法实验：1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种、质粒与其它生物材料大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）RIPL购自美国菌种保藏中心（ATCC）；质粒pET-28b由本实验室提供；番茄总RNA以叶片组织经北京全式金公司EasyPure Plant RNA Kit提取获得；人血总RNA以人血经北京全式金公司EasyPure Blood RNA Kit提取获得。

[0025] 1.1.2 仪器与试剂 JN-02C低温超高压连续流细胞破碎仪购自广州聚能纳米生物科技股份有限公司；ÄKTA pure蛋白纯化系统及其配套Ni亲和层析预装柱和Superdex200凝胶过滤层析预装柱购自美国GE公司；Clinx凝胶成像仪购自上海勤翔科学仪器有限公司；荧光定量PCR仪购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；Axygen质粒提取试剂盒购自美国Corning公司；限制性内切酶、T4 DNA Ligase、KOD Site-Directed Mutagenesis Kit、Nuclease-free water、高保真KOD DNA聚合酶、Taq-HS Probe qPCR Premix、抗生素、IPTG等购自江苏愚公生命科技有限公司；B-PER Reagent (in Phosphate Buffer)、InvitrogenTM M-MLV逆转录酶购自美国Thermo Fisher Scientific公司；DNA Marker、蛋白分子量标准购自金斯瑞生物科技有限公司；其余试剂为国产分析纯；引物合成、探针合成、基因合成及测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成；生物信息学分析软件包括新西兰Biomatters公司开发的Geneious Pro 4.8.5和美国Schrödinger公司开发的PyMOL Molecular Graphics System。

[0026] 1.2 实验方法1.2.1 生物信息学分析野生型M-MLV逆转录酶基因序列（GenBank：CCA64130.1）的同源序列搜索使用了美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的BLAST功能。序列分析与比对使用了Geneious Pro 4.8.5软件。M-MLV逆转录酶的三维结构图来源于RCSB Protein Data Bank（PDB ID：5DMQ、4HKQ），三维结构分析使用了PyMOL Molecular Graphics System软件（version 1.7.2.1）。

[0027] 1.2.2 突变体克隆构建野生型M-MLV逆转录酶的基因序列（GenBank：CCA64130.1）通过基因合成获得，合成至克隆载体pUC57上，产生pUC57-M-MLV质粒。合成序列包括5’端添加的NheI酶切位点和3’端添加的TAA终止密码子以及EcoRI酶切位点。pUC57-M-MLV质粒经NheI和EcoRI双酶切后，带有M-MLV逆转录酶基因的片段以T4 DNA Ligase连接至相同限制性内切酶酶切后的pET-28b载体上，使M-MLV逆转录酶基因的表达框与载体上的组胺纯化标签6xHis的表达框一致。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行质粒扩增，然后提取获得重组质粒pET28b-M-MLV，并经测序确认序列正确。该质粒诱导表达后产生N端融合6xHis纯化标签的M-MLV逆转录酶。逆转录酶突变体的构建以质粒pET28b-M-MLV为原始模板，在突变位点设计特异性引物，使用点突变试剂盒KOD Site-Directed Mutagenesis Kit定向引入点突变。每轮定向突变只能引入1个单点突变，多点突变的构建经过多轮单点定向突变完成。所构建的突变体质粒序列均经过测序确认。

[0028] 1.2.3 突变体的筛选将野生型pET28b-M-MLV和17个突变体质粒（编号1-18）转化进入大肠杆菌BL21 (DE3) RIPL感受态细胞中，并在含75 µg/ml卡那霉素和35 µg/ml氯霉素两种抗生素的平板上以37°C条件培养过夜。挑取平板上的单克隆接种到含75 µg/ml卡那霉素和35 µg/ml氯霉素两种抗生素的10 ml LB液体培养基中，在37°C，200 rpm的摇床中活化培养至OD值为0.4-0.6，再加入终浓度为0.2 mM的诱导剂IPTG在16°C下以200 rpm摇动培养16小时，诱导突变酶表达。IPTG诱导后的发酵液以8,000g离心5 min收集菌体。菌体以2 ml B-PER细菌蛋白提取试剂充分重悬后，22°C静置15 min，涡旋1 min后以18,000g低温离心5 min取上清，获得突变酶粗提液。对不同突变酶粗提液进行SDS-PAGE电泳检测，观察有无目的蛋白的表达。

[0029] 选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选。以番茄总RNA为模板，进行逆转录反应。向含RNA模板（1 µg）的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：1 µl oligo(dT)20引物（50 µM）、4 µl 5X M-MLV First Strand Buffer（250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2）、1 µl 0.1 M DTT、1 µl Ribonuclease Inhibitor（40 U/µl）、1 µl dNTP Mix（10 mM each），以及0.5 µl突变酶粗提液，用Nuclease-free Water将总体积补至20 µl，在不同反应温度下（37°C，60°C）反应20 min。反应结束后，于85°C孵育10 s以终止反应，使用0.5 µl逆转录产物作为PCR模板，并使用高保真KOD DNA聚合酶以及1对β-Actin基因的特异性引物（理论扩增产物长度为1 kb）进行PCR扩增，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况。观察到PCR扩增条带则认为突变酶粗提液具有逆转录活性。

[0030] 1.2.4 逆转录酶突变体的表达与纯化将活性筛选结果阳性的突变体在液体培养基中培养至OD值为0.6-0.8，加入终浓度为0.2 mM的IPTG，在16°C，200 rpm培养16小时，诱导蛋白表达。将IPTG诱导后的发酵液以8,000g离心20 min收集菌体。菌体以Ni柱结合缓冲液（20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.05% (v/v) NP-40, 5% glycerol）充分重悬后，以细胞高压破碎仪破碎，再以43,000g低温离心30 min，取上清以Ni亲和层析纯化柱纯化并分步收集，将单管收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。Ni亲和层析过程中使用的缓冲液包括：平衡缓冲液（20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.05% (v/v) NP-40, 5% glycerol）、漂洗缓冲液（20 mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl,
0.01% (v/v) NP-40, 5% glycerol）和梯度洗脱缓冲液（50-200 mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.01% (v/v) NP-40, 5% glycerol）。

[0031] Ni亲和层析的洗脱峰以AKTA系统配套Superdex200层析柱进行分子筛层析，洗脱缓冲液为40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.02% (v/v) NP-40, 10% glycerol。收集洗脱峰并透析至贮存缓冲液（20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01% (v/v) NP-40, 50% glycerol），储存于-
80°C。整个纯化过程在冰上或4°C进行。所有缓冲液的配制均使用了DEPC处理过的水，操作均使用了无菌实验台面或无菌间，以及专门处理的设备和耗材，防止RNase污染。

[0032] 1.2.5 逆转录酶活性检测采用同位素法测定逆转录酶的活性[11-12]。实验体系如下：50 mM Tris-HCl, pH8.0, 20 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 8 mM DTT, 50 μM [3H] dTTP (6-8 μCi/ml, 120-160 Ci/mol), 1 μM模板-引物混合物（模板引物混合物由poly(A)和16单位的寡聚T组成）, 1 pmol酶。加水补至30 μl并于37°C孵育10分钟，加入20 μl 0.5 M EDTA终止反应。然后通过酸性沉淀法测定多聚脱氧核糖核酸的含量，并以多聚脱氧核糖核酸的含量来确定酶活。将37°C条件下，以Poly(A)-Oligo(dT)为模板/引物，在10分钟内掺入1 nmol [3H] dTTP进入酸不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位（U）。

[0033] 1.2.6 逆转录酶热稳定性检测以番茄总RNA为模板，在不同温度下进行逆转录反应。向含RNA模板（200 ng）的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：1 µl oligo(dT)20引~物（50 µM）、4 µl 5X M-MLV First Strand Buffer（250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2）、1 µl 0.1 M DTT、1 µl Ribonuclease Inhibitor（40 U/µl）、1 µl dNTP Mix（10 mM each），以及200 U纯化的逆转录酶，用Nuclease-free Water将总体积补至20 µl，在不同反应温度下（37°C、42°C、45°C、50°C、55°C和65°C）反应20 min。反应结束后，于85°C孵育10 s以终止反应。以1 µl逆转录产物作为qPCR模板，使用Taq-HS Probe qPCR Premix和针对β-Actin基因的探针进行TaqMan法荧光定量PCR，根据扩增曲线判断逆转录合成cDNA的情况。以商业化逆转录酶InvitrogenTM M-MLV作为对照。

[0034] 1.2.7 逆转录酶cDNA合成长度检测以人血提取的总RNA为模板进行逆转录，向含RNA模板（~200 ng）的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：1 µl oligo(dT)20引物（50 µM）、4 µl 5X M-MLV First Strand Buffer（250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2）、1 µl 0.1 M DTT、1 µl Ribonuclease Inhibitor（40 U/µl）、1 µl dNTP Mix（10 mM each），以及200 U纯化的逆转录酶，用Nuclease-free Water将总体积补至20 µl，在37°C反应30 min。反应结束后，于85°C孵育10 s以终止反应。根据人HERC1基因序列，在其cDNA上距离5’端3 kb、6 kb、12 kb的位置分别设计3对特异性引物，扩增片段的理论长度均为1 kb。以逆转录产物为模板，使用高保真KOD DNA聚合酶和以上3对引物进行PCR扩增，然后以1%琼脂糖凝胶电泳检测，根据扩增情况判断cDNA的合成长度。以商业化逆转录酶InvitrogenTM M-MLV作为对照。

[0035] 2 实验结果2.1 M-MLV逆转录酶的结构分析与分子设计
M-MLV逆转录酶的热稳定性与其底物结合力关系密切。通过对M-MLV逆转录酶的三维结构分析，找到与底物结合相关的位点，并在这些位点引入突变，有可能提高底物结合力，从而提升酶的热稳定性。对于如何选择突变位点，有2条原则可以遵循：1）根据三维结构选择参与底物结合的位点；2）避开对活性功能至关重要的高度保守位点。据此原则，首先将野生型M-MLV逆转录酶肽链序列在NCBI网站上进行BLAST检索。结果显示，M-MLV逆转录酶的同源序列均高度保守，检索获得的100条同源序列中，前90条的相似度均在90%以上，而最后10条的相似度也达到70%。选取相似度最低的10条序列进一步对参与底物结合的区域（a.a.
184-345）进行序列比对，发现这一区域序列仍然高度保守，仅有包括T197、T330和T332在内的10个氨基酸位点的序列相对活跃（图1）。对M-MLV逆转录酶的三维结构进行分析，发现在这10个保守性较低的氨基酸位点中，仅有T197、T330和T332在空间上直接参与底物结合（图
2）。因此，T197、T330和T332被选为突变位点。由于这3个位点处于活性中心区域，对其进行突变极有可能导致活性丧失或蛋白折叠过程崩溃，因此谨慎选择自然界中已存在的序列作为这些位点的突变后序列：T197突变为M或A；T330突变为P或Q；T332突变为V（图1）。

[0036] M-MLV逆转录酶具有的RNase H活性对于该酶的逆转录产率和cDNA合成长度有较大影响，并且去除该活性也会提升M-MLV逆转录酶的热稳定性[16]。D524为RNase H活性区域的高度保守位点，引入D524G突变能够完全去除RNase H活性。因此，D524也被选为突变位点，并定向突变为甘氨酸（G）（图2）。

[0037] 2.2 M-MLV逆转录酶突变体的克隆构建将T197、T330和T332位点的突变进行组合，并加上D524G突变，形成17种突变体以及1个野生型（Wild Type）（图3）。M-MLV逆转录酶的原核表达体系已研究得较为成熟，选择基于T7启动子和乳糖操纵子调控表达的pET-28b原核表达载体进行这一系列突变体的克隆构建（图4）。野生型M-MLV逆转录酶的序列以基因合成获得，并通过酶切-连接的方式从亚克隆中转移至表达载体pET-28b的多克隆位点。所得重组质粒pET28b-M-MLV经诱导表达后会产生N端带有6xHis亲和纯化标签（His Tag）的融合蛋白。每个M-MLV逆转录酶突变体的序列突变依据定点突变的原理通过相应的突变引物逐个引入（图5）。构建顺序为首先引入D524G点突变，然后逐个引入底物结合区域的单点突变。3点突变和4点突变以2点突变的质粒为模板顺次引入，最终成功获得17种突变体的表达质粒。这些突变体质粒经诱导表达，均会产生N端带有6xHis标签的融合蛋白。

[0038] 2.3 M-MLV逆转录酶突变体的筛选以蛋白是否表达、是否具有逆转录活性、热稳定性是否提升为标准，对野生型M-MLV逆转录酶和17种突变体进行筛选。结果表明，野生型和8种突变体成功表达出M-MLV逆转录酶蛋白；在37°C，野生型和3、4、5、10、11号突变体表现出逆转录活性；而在60°C，3、5、10号突变体表现出微弱的逆转录活性，11号突变体表现出相对良好的逆转录活性（表1，图6）。根据结果，选择11号突变体（T197M, T330Q, D524G）进行大量表达、纯化和功能检测。

[0039] 表1 M-MLV逆转录酶突变体筛选结果2.4 M-MLV逆转录酶突变体的大量表达及纯化
M-MLV逆转录酶11号突变体表达菌株经大量诱导后，收集菌体进行高压物理破碎，蛋白液经Ni亲和层析和分子筛层析后，获得11号突变体酶液，其流程见图7。对各个纯化步骤的样品进行SDS-PAGE电泳检测（参图8），表明11号突变体蛋白诱导明显（泳道1、2），Ni亲和层析柱结合有效（泳道3、4）；经亲和层析洗脱和分部收集获得50-70%纯度的突变体酶液（泳道
8、9）；经分子筛层析进一步纯化，洗脱获得 85%纯度的突变体酶液（泳道12-16）。对比分子~
筛洗脱吸收峰值曲线图可知，突变体蛋白集中于主峰（峰区1）洗脱下来，而更早出现的小吸收峰（峰区2）中蛋白量很低（参照图9）。经检测，纯化所得11号突变体的比活力为86,000 U/mg，纯化产率为617,000 U/L，与文献报道的M-MLV逆转录酶重组表达数据相当。

[0040] 2.5 M-MLV逆转录酶突变体的性能检测首先对纯化的11号突变体的热稳定性进行检测。在不同温度下，使用11号突变体进行番茄总RNA的逆转录，然后对逆转录产物进行qPCR检测，根据扩增曲线判断逆转录情况。结果显示，在55-65°C条件下，11号突变体逆转录获得的cDNA量没有明显变化，qPCR扩增曲线十分接近，Ct值均在18-22之间（图10）。作为对照，商业化逆转录酶InvitrogenTM M-MLV在
55°C和65°C条件下，逆转录得到的cDNA量明显减少，qPCR扩增曲线位置相差较大，Ct值明显升高（图11）。此结果表明，11号突变体在温度高达65°C时仍具有良好活性，而商业化对照在温度高于55°C时酶活受到明显影响。

[0041] 然后对11号突变体进行cDNA合成长度检测。以人血总RNA为模板进行逆转录，并对逆转录获得的人源HERC1基因的cDNA进行分析。以cDNA为模板，使用距离逆转录起始位3 kb、6 kb和12 kb的3对引物进行PCR扩增，以扩增结果判断合成的cDNA是否达到了3 kb、6 kb或12 kb长度（图12）。结果表明，11号突变体逆转录获得的cDNA长度达到了12 kb，而商业化逆转录酶InvitrogenTM M-MLV的合成长度仅达到6-7 kb（图13）。对M-MLV逆转录酶改造的11号突变体能合成更长的cDNA。

[0042] 3 讨论对M-MLV逆转录酶热稳定性的改造已积累大量实验数据，并表明提高酶与底物的结合力能够提升酶的热稳定性。依据这一机理，本研究结合蛋白序列分析、三维结构分析理性设计了一系列点突变，并通过筛选获得了热稳定性获得极大提高、cDNA合成长度满意的M-MLV逆转录酶突变体。

[0043] 对突变位点的理性选择对于本研究获得满意结果十分关键。针对酶的底物结合区域，首先避开高度保守的序列，因为对这些序列的突变往往会导致酶活丧失或蛋白折叠失败。然后选择在空间位置上直接参与底物结合的氨基酸残基；很明显，对这些氨基酸残基的改变会直接影响底物结合力。最后，对这些位点的突变选择了自然界已存在的序列，以免突变后的残基性质改变过大而影响蛋白整体结构。结果证明，这样的理性设计确保了合理突变的概率，最终通过筛选获得了性能提升的逆转录酶。

[0044] M-MLV逆转录酶的重组表达与制备工艺已经十分成熟。本研究借鉴文献报道的方法，选择Ni亲和层析和分子筛层析2步洗脱纯化，所得逆转录酶突变体的产率和比活力均正常。

[0045] 进一步对纯化的突变体进行功能验证，表明11号突变体（T197M, T330Q, D524G）在热稳定性上获得了极大提升，在65°C仍能保持活力，超过了之前文献报道的任何基于M-MLV逆转录酶的改造效果。而对RNase H活性区域的改造提高了酶的cDNA合成长度，并不意外。

[0046] 综上所述，本研究的结果显示，基于序列与三维结构分析的分子理性设计十分有效，所获得的M-MLV逆转录酶突变体性能优良，超过了一般的商业化逆转录酶，在生物医学研究中有广泛的应用。十多种组合位点突变的M-MLV逆转录酶为后续研究逆转录酶的活性区域、进一步改造更高效的逆转录酶提供了理论和实验依据。

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