伯克霍尔德氏菌属的分离细菌菌株及其农药代谢物
阅读：1030发布：2020-09-22
专利汇可以提供伯克霍尔德氏菌属的分离细菌菌株及其农药代谢物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及伯克霍尔德氏菌属的分离细菌菌株及其 农药 代谢物 。本发明提供一种伯克霍尔德氏菌的物种，其对 脊椎动物 无已知的致病性，但具有农药活性(如 植物 、昆虫、 真菌 、 杂草 和 线虫 )。本发明还提供源自所述物种的培养物的天然产物，以及使用所述天然产物来控制 有害 生物 的方法。，下面是伯克霍尔德氏菌属的分离细菌菌株及其农药代谢物专利的具体信息内容。
1.一种除草组合物，其包括伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)A396、NRRL登录号B-50319的全细胞培养液、滤液或上清液。
2.如权利要求1所述的组合物，其进一步包括载体、稀释剂、表面活性剂、辅助剂或第二除草剂中的至少一种。
3.一种调节单子叶杂草、苔草杂草或双子叶杂草的出苗和/或生长的方法，所述方法包括向所述杂草施用有效地调节所述杂草的出苗和/或生长的量的如权利要求1或2所述的组合物。
4.一种种子包衣材料，其包含如权利要求1或2所述的组合物。
5.一种调节单子叶杂草、苔草杂草、或双子叶杂草的出苗和/或生长的方法，所述方法包括：
向所述杂草施用有效地调节所述杂草的出苗和/或生长的量的选在由以下组成的群组的任一物质：
(1)一种选自由以下组成的群组的分离的除草化合物：由伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)A396(NRRL 登 录 号 B-50319) 得 到 的 templazoleA，templazole B，templamideA，templamide B，FR901228和FR901465；
(2)一种组合物，其包含(a)选自由以下组成的群组的第一物质：由伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)A396(NRRL登录号B-50319)得到的纯培养物、细胞部分、全细胞培养液或上清液或其提取物，以及(b)第二物质，其为化学或生物农药；
(3)(2)中组合物进一步包含载体、稀释剂、表面活性剂、或辅助剂中的至少一者；以及(4)(2)中组合物，其中所述第二物质为选自由以下组成的群组的农药：杀线虫剂、除草剂、杀真菌剂和杀虫剂。
伯克霍尔德氏菌属的分离细菌菌株及其农药代谢物
技术领域
[0002] 本发明提供一种伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp)的物种，其对脊椎动物如哺乳动物、鱼类和鸟类无已知的致病性，但对植物、昆虫、真菌和线虫具有农药活性。本发明还提供源自所述物种的培养物的天然产物，以及利用所述天然产物来控制双子叶、单子叶和苔草杂草的萌发和生长，调节真菌的生长以及控制诸如昆虫和线虫的有害生物(pest)的方法。
背景技术
[0003] 天然产物为微生物、植物或其他生物体产生的物质。微生物天然产物提供了丰富的化学多样性来源，而且将天然产物用于药用目的历史悠久。一种这样的化合物为FR901228，其分离自色杆菌属(Chromobacterium)，并且据发现可以用作抗菌剂和抗肿瘤剂(参见，例如Ueda et al.,美国专利第7,396,665号)。
[0004] 但微生物产生的次生代谢物据发现也可成功用于农业上的杂草和有害生物控制(参见，例如Nakajima et al.1991；Duke et al.,2000；Lydon&Duke,1999；Gerwick et al.,美国专利第7,393,812号)。微生物天然产物已成功开发为农业杀虫剂(参见，例如Salama et al.1981；Thompson et al.,2000；Krieg et al.1983)。有时候，这样的天然产物与化学农药组合使用(参见，例如Gottlieb,美国专利第4,808,207号)。
[0005] 伯克霍尔德氏菌
[0006] 伯克霍尔德氏菌属是蛋白菌(proteobacteria)的β-分支，包括生存于多种生态位的多于40种物种(Compant et al.,2008)。伯克霍尔德氏菌属的细菌物种是广泛分布于土壤和根际的生物体(Coenye and Vandamme,2003；Parke and Gurian-Sherman,2001)。传统上，它们已知为植物病原体。洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia)是第一种发现并鉴定导致洋葱疾病的病原体(Burkholder,1950)。一些伯克霍尔德氏菌物种已经发展与其植物宿主有益的相互作用(参见，例如Cabballero-Mellado et al.,2004,Chen et al.,2007)。还发现一些伯克霍尔德氏菌物种是可能的人病原体(参见，例如Cheng and Currie,2005和Nierman et al.,2004)。此外，还发现一些伯克霍尔德氏菌物种具有作为生物控制产品的潜力(参见，例如Burkhead et al.,1994；Knudsen et al.,1987；
Jansiewicz et al.,1988；Gouge et al.,美国专利申请第2003/0082147号；Parke et al.,美国专利第6,077,505号；Casida et al.,美国专利第6,689,357号；Jeddeloh et al.,WO2001055398；Zhang et al.,美国专利第7,141,407号)。该属的一些物种有效地用于生物修复以净化污染的土壤或地下水(参见，例如Leahy et al.1996)。此外，还发现一些伯克霍尔德氏菌物种分泌各种具有蛋白水解、脂质分解和溶血活性的胞外酶以及毒素、抗生素和铁载体(参见，例如Ludovic et al.,2007；Nagamatsu,2001)。
Jansiewicz et al.,1988；Gouge et al.,美国专利申请第2003/0082147号；Parke et al.,美国专利第6,077,505号；Casida et al.,美国专利第6,689,357号；Jeddeloh et al.,WO2001055398；Zhang et al.,美国专利第7,141,407号)。该属的一些物种有效地用于生物修复以净化污染的土壤或地下水(参见，例如Leahy et al.1996)。此外，还发现一些伯克霍尔德氏菌物种分泌各种具有蛋白水解、脂质分解和溶血活性的胞外酶以及毒素、抗生素和铁载体(参见，例如Ludovic et al.,2007；Nagamatsu,2001)。
[0007] 噁唑、噻唑和吲哚
[0008] 噁唑、噻唑和吲哚广泛分布于植物、藻类、海绵和微生物中。大量的天然产物包含一个或多个五元噁唑、噻唑和吲哚核心/部分。这些天然产物表现出广谱的可证实的治疗价值的生物活性。例如，博来霉素A(Tomohisa et al.)是广泛使用抗癌药物，其引起DNA的氧化降解，并且使用二噻唑部分以结合其靶DNA序列(Vanderwall et al.,1997)。枯草菌肽(Ming et al.,2002)是含噻唑啉的肽抗生素，通过与C55-细菌萜醇焦磷酸酯的复合来抑制细菌细胞壁新生物合成。Thiangazole(Kunze et al.,1993)包含一个噁唑和三个噻唑啉的串联排列，并且表现出抗病毒活性(Jansen et al.,1992)。不过，其他含噁唑/噻唑的天然产物如硫链丝菌肽(Anderson et al.,1970)和GE2270A(Selva et al.,1997)抑制细菌蛋白合成的翻译步骤。已经报导了多于1000种的来自微生物的具有吲哚骨架的生物碱。三分之一的这些化合物是肽，质量超过500Da，其中吲哚是色氨酸衍生的。其余三分之二的结构多样性更高，并且其生物活性似乎涵盖更大的范围，包括抗微生物、抗病毒、细胞毒性、杀虫、抗血栓形成或酶抑制活性。
发明内容
[0009] 本文提供一种非洋葱伯克霍尔德氏菌(non-Burkholderia cepacia)、非植物伯克霍尔德氏菌(non-Burkholderia plantari)、非唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(non-Burkholderia gladioli)、伯克霍尔德氏菌的分离菌株，其具有以下特征：
[0010] a.具有16S rRNA基因序列，其包含正向序列和反向序列，所述正向序列与SEQ ID NO:8、11和12所示的序列具有至少99.0％的相同性，所述反向序列与SEQ ID NO:9、10、13-15所示的序列具有至少99.0％的相同性；
[0011] b.具有农药活性，尤其是除草、杀虫、杀真菌和杀线虫活性；
[0012] c.产生至少一种选自以下的化合物：
[0013] (i)化合物，所述化合物具有以下性质：(a)通过液相色谱/质谱(LC/MS)测定的1
分子量为约525-555；(b)H NMR值为6.22,5.81,5.69,5.66,5.65,4.64,4.31,3.93,3.22,
13
3.21,3.15,3.10,2.69,2.62,2.26,2.23.1.74,1.15,1.12,1.05,1.02；(c) C NMR值为172.99,172.93,169.57,169.23,167.59,130.74,130.12,129.93,128.32,73.49,62.95,59.42,57.73,38.39,38.00,35.49,30.90,30.36,29.26,18.59,18.38,18.09,17.93,12.51；并且(c)利用水：乙腈(CH3CN)梯度，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约10-15分钟；
分子量为约525-555；(b)H NMR值为6.22,5.81,5.69,5.66,5.65,4.64,4.31,3.93,3.22,
13
3.21,3.15,3.10,2.69,2.62,2.26,2.23.1.74,1.15,1.12,1.05,1.02；(c) C NMR值为172.99,172.93,169.57,169.23,167.59,130.74,130.12,129.93,128.32,73.49,62.95,59.42,57.73,38.39,38.00,35.49,30.90,30.36,29.26,18.59,18.38,18.09,17.93,12.51；并且(c)利用水：乙腈(CH3CN)梯度，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约10-15分钟；
[0015] (iii)化合物，所述化合物具有噁唑基-苄基结构，其包含至少1个苄基部分、至少1个噁唑部分、至少1个取代的烷基和至少1个酰胺基团；至少15个碳以及至少2个氧和2个氮；
[0016] (iv)化合物，所述化合物具有至少1个酯、至少1个酰胺、至少3个亚甲基、至少1个四氢吡喃糖部分和至少3个烯烃双键、至少6个甲基、至少3个羟基、至少25个碳以及至少8个氧和1个氮；
[0017] 以及
[0018] d.对脊椎动物动物如哺乳动物、鸟类和鱼类是非致病性(非感染性)的；
[0019] e.对卡那霉素、氯霉素、环丙沙星、哌拉西林、伊米配能以及磺胺甲基异噁唑与甲氧苄氨嘧啶的组合是易感的；以及
[0021] 在具体实施方案中，所述菌株具有与伯克霍尔德氏菌A396菌株(NRRL登录号B-50319)相同(identifying)的特征。
[0022] 本文公开分离的化合物，其任选地可获得自或源自伯克霍尔德氏菌物种，或者能够产生这些化合物的生物体，所述化合物可以用来控制各种有害生物，尤其是导致植物病的有害生物，其实例包括但不限于昆虫、线虫、细菌、真菌。这些化合物也可以用作除草剂。
[0023] 特别地，分离的农药化合物可以包括但不限于：
[0024] (A)化合物，所述化合物具有以下性质：(i)通过液相色谱/质谱(LC/MS)测定1
的分子量为约525-555；(ii)H NMRδ值为6.22,5.81,5.69,5.66,5.65,4.64,4.31,3.
13
93,3.22,3.21,3.15,3.10,2.69,2.62,2.26,2.23.1.74,1.15,1.12,1.05,1.02；(iii) C NMRδ值为172.99,172.93,169.57,169.23,167.59,130.74,130.12,129.93,128.32,73.4
9,62.95,59.42,57.73,38.39,38.00,35.49,30.90,30.36,29.26,18.59,18.38,18.09,17.93,12.51，并且(iv)利用水：乙腈(CH3CN)梯度，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约10-15分钟；
的分子量为约525-555；(ii)H NMRδ值为6.22,5.81,5.69,5.66,5.65,4.64,4.31,3.
13
93,3.22,3.21,3.15,3.10,2.69,2.62,2.26,2.23.1.74,1.15,1.12,1.05,1.02；(iii) C NMRδ值为172.99,172.93,169.57,169.23,167.59,130.74,130.12,129.93,128.32,73.4
9,62.95,59.42,57.73,38.39,38.00,35.49,30.90,30.36,29.26,18.59,18.38,18.09,17.93,12.51，并且(iv)利用水：乙腈(CH3CN)梯度，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约10-15分钟；
[0025] (B)化合物，所述化合物具有噁唑基-吲哚结构，其包含至少1个吲哚部分、至少1个噁唑部分、至少1个取代的烷基和至少1个羧酸酯基团；至少17个碳以及至少3个氧和2个氮；
[0026] (C)化合物，所述化合物具有噁唑基-苄基结构，其包含至少1个苄基部分、至少1个噁唑部分、至少1个取代的烷基和至少1个酰胺基团；至少15个碳以及至少2个氧和2个氮；
[0027] (D)化合物，所述化合物具有至少1个酯、至少1个酰胺、至少3个亚甲基、至少1个四氢吡喃糖部分和至少3个烯烃双键、至少6个甲基、至少3个羟基、至少25个碳以及至少8个氧和1个氮；以及
[0028] (E)化合物，所述化合物具有至少1个酯、至少1个酰胺、环氧亚甲基(epoxide methylene)、至少1个四氢吡喃糖部分、至少3个烯烃双键、至少6个甲基、至少3个羟基、至少25个碳、至少8个氧和至少1个氮。
[0029] 在一具体实施方案中，分离的化合物可以包括但不限于：
[0030] (A)化合物，所述化合物具有噁唑基-吲哚结构，其包含至少1个吲哚部分、至少1个噁唑部分、至少1个取代的烷基、至少1个羧酸酯基团、至少17个碳、至少3个氧和至
1
少2个氮；并且所述化合物具有以下特性中的至少一种：(i)分子量为约275-435；(ii)H
13
NMRδ值为8.44,8.74,8.19,7.47,7.31,3.98,2.82,2.33,1.08；(iii) C NMRδ值为δ16
3.7,161.2,154.8,136.1,129.4,125.4,123.5,123.3,121.8,121.5,111.8,104.7,52.2,37.3,28.1,22.7,22.7；(iv)利用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统和210nm的UV检测，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约10-20分钟；(v)UV吸收带为约
226、275、327nm；
1
少2个氮；并且所述化合物具有以下特性中的至少一种：(i)分子量为约275-435；(ii)H
13
NMRδ值为8.44,8.74,8.19,7.47,7.31,3.98,2.82,2.33,1.08；(iii) C NMRδ值为δ16
3.7,161.2,154.8,136.1,129.4,125.4,123.5,123.3,121.8,121.5,111.8,104.7,52.2,37.3,28.1,22.7,22.7；(iv)利用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统和210nm的UV检测，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约10-20分钟；(v)UV吸收带为约
226、275、327nm；
[0031] (B)化合物，所述化合物具有噁唑基-苄基结构，其包含至少1个苄基部分、至少1个噁唑部分、至少1个取代的烷基和至少1个酰胺基团；至少15个碳和至少2个氧、至少
2个氮；并且所述化合物具有以下特性中的至少一种：(i)通过液相色谱/质谱(LC/MS)测
1
定的分子量为约240-290；(ii)H NMRδ值为约7.08,7.06,6.75,3.75,2.56,2.15,0.93,0
13
.93；(iii) C NMRδ值为158.2,156.3,155.5,132.6,129.5,129.5,127.3,121.8,115.2,1
15.2,41.2,35.3,26.7,21.5,21.5；(iv)利用水：乙腈(CH3CN)梯度，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约6-15分钟；以及(v)UV吸收带为约230、285、
323nm；
2个氮；并且所述化合物具有以下特性中的至少一种：(i)通过液相色谱/质谱(LC/MS)测
1
定的分子量为约240-290；(ii)H NMRδ值为约7.08,7.06,6.75,3.75,2.56,2.15,0.93,0
13
.93；(iii) C NMRδ值为158.2,156.3,155.5,132.6,129.5,129.5,127.3,121.8,115.2,1
15.2,41.2,35.3,26.7,21.5,21.5；(iv)利用水：乙腈(CH3CN)梯度，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约6-15分钟；以及(v)UV吸收带为约230、285、
323nm；
[0032] (C)非环氧化合物，所述化合物包含至少1个酯、至少1个酰胺、至少3个亚甲基、至少1个四氢吡喃糖部分和至少3个烯烃双键、至少6个甲基、至少3个羟基、至少25个碳、至少8个氧和1个氮；并且所述化合物具有以下特性中的至少一种：(i)通过液相色谱/质1
谱(LC/MS)测定的分子量为约530-580；(ii)H NMRδ值为6.40,6.39,6.00,5.97,5.67,5.
54,4.33,3.77,3.73,3.70,3.59,3.47,3.41,2.44,2.35,2.26,1.97,1.81,1.76,1.42,1.37
13
,1.16,1.12,1.04；(iii) C NMRδ值为173.92,166.06,145.06,138.76,135.71,129.99,12
6.20,123.35,99.75,82.20,78.22,76.69,71.23,70.79,70.48,69.84,60.98,48.84,36.89,33.09,30.63,28.55,25.88,20.37,18.11,14.90,12.81,9.41；(iv)利用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统和210nm的UV检测，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约7-12分钟；(v)通过ESIMS和NMR数据分析的解读确定的分子式为C28H45NO10；
(vi)UV吸收带为约210-450nm；
谱(LC/MS)测定的分子量为约530-580；(ii)H NMRδ值为6.40,6.39,6.00,5.97,5.67,5.
54,4.33,3.77,3.73,3.70,3.59,3.47,3.41,2.44,2.35,2.26,1.97,1.81,1.76,1.42,1.37
13
,1.16,1.12,1.04；(iii) C NMRδ值为173.92,166.06,145.06,138.76,135.71,129.99,12
6.20,123.35,99.75,82.20,78.22,76.69,71.23,70.79,70.48,69.84,60.98,48.84,36.89,33.09,30.63,28.55,25.88,20.37,18.11,14.90,12.81,9.41；(iv)利用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统和210nm的UV检测，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约7-12分钟；(v)通过ESIMS和NMR数据分析的解读确定的分子式为C28H45NO10；
(vi)UV吸收带为约210-450nm；
[0033] (D)化合物，所述化合物包含(i)至少1个酯、至少1个酰胺、环氧亚甲基、至少1个四氢吡喃糖部分和至少3个烯烃双键、至少6个甲基、至少3个羟基、至少25个碳、至少813
个氧和至少1个氮；(ii) C NMRδ值为174.03,166.12,143.63,137.50,134.39,128.70,1
26.68,124.41,98.09,80.75,76.84,75.23,69.87,69.08,68.69,68.60,48.83,41.07,35.4
5,31.67,29.19,27.12,24.55,19.20,18.95,13.48,11.39,8.04；(iii)分子式为C28H43NO9；
l
并且所述化合物具有以下特性中的至少一种：(i)H NMRδ值为约6.41,6.40,6.01,5.97,
5.67,5.55,4.33,3.77,3.75,3.72,3.64,3.59,3.54,3.52,2.44,2.34,2.25,1.96,1.81,1.
76,1.42,1.38,1.17,1.12,1.04；(ii)利用水：乙腈(CH3CN)梯度，在反相C-18HPLC柱上进行高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约6-15分钟；(iii)UV吸收带为约210-450nm，最具体为约234nm。
个氧和至少1个氮；(ii) C NMRδ值为174.03,166.12,143.63,137.50,134.39,128.70,1
26.68,124.41,98.09,80.75,76.84,75.23,69.87,69.08,68.69,68.60,48.83,41.07,35.4
5,31.67,29.19,27.12,24.55,19.20,18.95,13.48,11.39,8.04；(iii)分子式为C28H43NO9；
l
并且所述化合物具有以下特性中的至少一种：(i)H NMRδ值为约6.41,6.40,6.01,5.97,
5.67,5.55,4.33,3.77,3.75,3.72,3.64,3.59,3.54,3.52,2.44,2.34,2.25,1.96,1.81,1.
76,1.42,1.38,1.17,1.12,1.04；(ii)利用水：乙腈(CH3CN)梯度，在反相C-18HPLC柱上进行高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约6-15分钟；(iii)UV吸收带为约210-450nm，最具体为约234nm。
[0034] 在更具体的实施方案中，本文提供的化合物包括但不限于：
[0035] (A)具有结构##STR001##的化合物或其农药可接受的盐或立体异构体
[0036]
[0037] 其中M为1、2、3或4；N为0、1、2或3；p和q独立地为1或2；X为O、NH或NR；R1、R2和R3相同或不同，并且独立地为氨基酸侧链部分或氨基酸侧链衍生物，并且R为低级(lower)链烷基、芳基或芳基烷基部分；
[0038] (B)具有结构##STR002##的化合物
[0039]
[0040] 其中X、Y和Z各自独立地为--O、--NR1或--S，其中R1为--H或C1-C10烷基；R1、R2和m各自独立地为--H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、--C(O)H、酰基、氧酰基(oxyacyl)、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基，并且“m”可以位于噁唑环上的任何位置；
[0041] (C)具有结构##STR002a##的化合物
[0042]
[0043] 其中R1为--H或C1-C10烷基；R2为烷基酯；
[0044] (D)具有结构##STR003##的化合物
[0045]
[0046] 其中X和Y各自独立地为--OH、--NR1或--S，其中R1为--H或C1-C10烷基；R1、R2和m为噁唑环上的取代基，各自独立地为--H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、--C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基；
[0047] (E)具有结构##STR003a##的化合物
[0048]
[0049] 其中R1为--H或C1-C10烷基；
[0050] (F)具有结构##STR004a##的化合物
[0051]
[0052] 其中X、Y和Z各自独立地为-O、-NR或-S，其中R为H或C1-C10烷基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自独立地为H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基；
[0053] (G)具有结构##STR004b##的化合物
[0054]
[0055] 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自独立地为H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基；
[0056] (H)具有结构##STR004c##的化合物
[0057]
[0058] 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R11各自独立地为H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基；
[0059] (I)具有结构##STR005##的化合物
[0060]
[0061] 其中X和Y各自独立地为--OH、--NR1或--S，其中Rl、R2各自独立地为--H、烷基(如C1-C10烷基)、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、--C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基；
[0062] (J)具有结构##STR006a##的化合物
[0063]
[0064] 其中X、Y和Z各自独立地为-O、-NR或-S，其中R为H或C1-C10烷基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12和R13各自独立地为H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基。
[0065] 在最具体的实施方案中，所述化合物可以包括但不限于：
[0066] (i)templazole A；
[0067] (ii)templazole B；
[0068] (iii)templamide A；
[0069] (iv)templamide B；
[0070] (v)FR90128；
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075]
[0076] (XL)FR901465
[0077] 本文还提供获得上述化合物的方法。特别地，所述方法包括培养本文公开的伯克霍尔德氏菌菌株并产生所述化合物。本文还提供通过分离伯克霍尔德氏菌菌株产生的化合物来分离这些化合物的方法，所述方法包括从所述伯克霍尔德氏菌菌株的培养物的上清分离产生的化合物。
[0078] 本文还提供一种组合，其包含：
[0079] (a)选自以下组中的第一物质：(i)源自上文所述的伯克霍尔德氏菌菌株的纯培养物、细胞部分(fraction)或上清或其提取物，其任选地用作农药；(ii)一种或多种上文所述的化合物；
[0080] (b)任选存在的第二物质，其中所述第二物质为化学或生物农药；以及
[0081] (c)任选存在的载体、稀释剂、表面活性剂、辅助剂(adjuvant)或农药中的至少一种。
[0083] 在相关的方面，本文公开一种调节植物中的有害生物侵害的方法，所述方法包括向所述植物和/或其种子和/或用于使所述植物生长的基质施用一定量的以下物质；和/或公开一种调节单子叶苔草或双子叶杂草的出苗和/或生长的方法，所述方法包括向所述杂草或土壤施用一定量的以下物质：
[0085] (II)上文所述的组合物或组合；
[0086] 所述量有效地调节有害生物侵害和/或单子叶苔草或双子叶杂草的出苗或生长。
[0087] 在另一相关方面，本文提供上文所述的菌株、培养物、提取物、上清、组合、化合物用于调节植物中的有害生物侵害的用途，其包括向所述植物和/或其种子和/或用于使所述植物生长的基质施用；和/或提供一种调节单子叶苔草或双子叶杂草的出苗和/或生长的方法。附图说明
[0088] 图1显示伯克霍尔德氏菌A396与多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamultivorans)ATCC 17616的生长速率的比较。
[0089] 图2显示伯克霍尔德氏菌A396提取物对旋花的影响。
[0090] 图3显示伯克霍尔德氏菌A396提取物对藜草(pigweed)的影响。
[0091] 图4显示伯克霍尔德氏菌A396提取物对粉纹夜蛾(Tricoplusia ni)的影响。
[0092] 图5显示伯克霍尔德氏菌A396培养液对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的影响。
[0093] 图6显示伯克霍尔德氏菌A396培养液对幼年根结线虫(Meloidogyne incognita)的活动力的影响。
[0094] 图7是为获得templazole和templamide化合物的纯化方案的示意图。
[0095] 图8显 示 测 试FR90128 对 灰 霉 菌(Botrytis cinerea)(左) 和 根 腐 菌(Phytophtora sp.)(右)的杀真菌效果的体外测定的结果。
[0096] 图9显示伯克霍尔德氏菌A396培养液在接种和施用14天后对用3000个根结线虫(Meloidogyne sp.)的卵接种的黄瓜根cv.Toschka的平均虫瘿(gall)指数的影响(％控制)。
[0097] 图10为伯克霍尔德氏菌A396培养液在接种和施用14天后对用3000个根结线虫的卵接种的黄瓜根cv.Toschka的平均虫瘿指数的影响。
具体实施方式
[0098] 虽然上述组合物和方法容易进行各种修改和存在替代形式，但是本文会详细说明示例性实施方案。但是应当了解，并不意图将本发明限于公开的特定形式，相反的是，本发明意图涵盖落在所附权利要求限定的本发明精神和范围内的所有修改、等同和替代物。
[0099] 当提供数值范围时，应当理解为，在该范围的上限与下限以及该指定范围中任何其他确定值或中间值之间的，除非上下文另有明确规定，至下限的单位的十分之一的中间值均包括在其中。也包括较小的范围。其中还包括这些较小的范围的上下限，受指定范围中任何具体排除的限制。
[0100] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。虽然在实施或测试本发明中还可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。
[0101] 应当注意到，除非上下文明确指出，如本文和所附的权利要求所用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复数含义。
[0102] 如本文所定义，“源自”表示直接分离或获得自特定来源，或者具有与分离或获得自特定来源的物质或生物体相同的特征。
[0103] 如本文所定义，“分离的化合物”基本上不含其他化合物或物质，如通过包括色谱法、电泳法在内的分析方法所测定的，例如，至少约20％纯、优选至少约40％纯、更优选约60％纯、甚至更优选约80％纯、最优选约90％纯、并且甚至最优选约95％纯。
[0104] 本文所用的术语“烷基”是指单价直链或支链的烃基团，其具有1-约12个碳原子，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基等。
[0105] 本文所用的“取代的烷基”是指烷基，其还带有一个或多个取代基，所述取代基选自羟基、烷氧基、巯基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、芳氧基、取代的芳氧基、卤素、氰基、硝基、氨基、酰氨基、--C(O)H、酰基、氧酰基、羧基、磺酰基、磺酰胺、砜基等。
[0106] 本文所用的“烯基”是指直链或支链的烃基团，其具有一个或多个碳-碳双键，并具有约2-12个碳原子，并且“取代的烯基”是指烯基，其还带有一个或多个上述的取代基。
[0107] 本文所用的“炔基”是指直链或支链的烃基团，其具有至少一个碳-碳三键，并具有约2-12个碳原子，并且“取代的炔基”是指炔基，其还带有一个或多个上述的取代基。
[0108] 本文所用的“芳基”是指芳香基团，其具有6-14个碳原子，并且“取代的芳基”是指芳基，其还带有一个或多个上述的取代基。
[0109] 本文所用的“杂芳基”是指芳香环，其包含一个或多个杂原子(如N、O、S等)作为环结构的一部分，并具有3-14个碳原子，并且“取代的杂芳基”是指杂芳基，其还带有一个或多个上述的取代基。
[0110] 本文所用的“烷氧基”是指部分--O-烷基-，其中烷基如上文定义，并且“取代的烷氧基”是指烷氧基，其还带有一个或多个上述的取代基。
[0111] 本文所用的“硫代烷基”是指部分--S-烷基-，其中烷基如上文定义，并且“取代的硫代烷基”是指硫代烷基，其还带有一个或多个上述的取代基。
[0112] 本文所用的“环烷基”是指包含环的烷基，其包含约3-8个碳原子，并且“取代的环烷基”指环烷基，其还带有一个或多个上述的取代基。
[0113] 本文所用的“杂环基”是指环状(即包含环)的基团，其包含一个或多个杂原子(如N、O、S等)作为环结构的一部分，并具有3-14个碳原子，并且“取代的杂环基”是指杂环基，其还带有一个或多个上述的取代基。
[0114] 伯克霍尔德氏菌菌株
[0115] 本文的伯克霍尔德氏菌菌株是一种非洋葱伯克霍尔德氏菌复合群(complex)、非植物伯克霍尔德氏菌、非唐菖蒲伯克霍尔德氏菌、伯克霍尔德氏菌，并且对脊椎动物如鸟类、哺乳动物和鱼类是非致病性的。这种菌株可以利用本领域已知并由Lorch et al.,1995描述的方法分离自土壤样品。伯克霍尔德氏菌菌株可以分离自许多不同类型的土壤或生长培养基。然后将样品接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)。所述细菌是革兰氏阴性的，并且其形成圆形、不透明的乳白色菌落，其随时间变为粉红色和粉红褐色以及粘液或糊状。
[0116] 从马铃薯葡萄糖琼脂平板分离菌落，并筛选具有本发明下文的实施例所示的生物学、遗传学、生化和/或酶特征的伯克霍尔德氏菌菌株。特别地，如通过clustal分析所确定的，所述伯克霍尔德氏菌菌株具有16S rRNA基因，所述基因包含正向序列，其与SEQ ID NO:8、11和12所示的序列至少约99.0％、优选约99.5％、更优选约99.9％、并且最优选100％相同；以及正向序列，其与SEQ ID NO:9、10、13、14和15所示的序列至少约99.0％、优选约99.5％、更优选约99.9％、并且最优选100％相同。此外，如下文所述，这种伯克霍尔德氏菌菌株可以具有农药活性，尤其是杀病毒、除草、杀菌(germicidal)、杀真菌、杀线虫、杀细菌(bactericidal)和杀虫活性，更特别的是除草、杀虫、杀真菌和杀线虫活性。其对脊椎动物如哺乳动物、鸟类和鱼类是非致病性的。
[0117] 此外，所述伯克霍尔德氏菌菌株产生至少本公开所述的农药化合物。
[0118] 所述伯克霍尔德氏菌菌株对卡那霉素、氯霉素、环丙沙星、呱拉西林、伊米配能以及磺胺甲基异噁唑与甲氧苄氨嘧啶的组合是易感的，并且包含脂肪酸16:0,cyclo17:0,16:03-OH,14:0,cyclo 19:0,18:0。
[0119] 这种伯克霍尔德氏菌菌株可以通过在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上或者在包含确定的碳源(如葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖)以及未确定的氮源(如蛋白胨、胰蛋白胨、大豆胨和NZ胺)的发酵培养基中，培养具有与伯克霍尔德氏菌A396(NRRL登录号B-50319)相同特征的微生物而获得。
[0120] 农药化合物
[0121] 本文所公开的农药化合物可以具有以下性质：(a)可获得自新的伯克霍尔德氏菌物种，如A396；(b)特别地，对最常见的农业昆虫有害生物具有毒性；(c)通过液相色谱/质1
谱(LC/MS)测定的分子量为约525-555，并且更特别地为540；(d)H NMR值为6.22,5.81,5.69,5.66,5.65,4.64,4.31,3.93,3.22,3.21,3.15,3.10,2.69,2.62,2.26,2.23.1.74,1.1
13
5,1.12,1.05,1.02；(d) C NMR值为172.99,172.93,169.57,169.23,167.59,130.74,130.1
2,129.93,128.32,73.49,62.95,59.42,57.73,38.39,38.00,35.49,30.90,30.36,29.26,1
8.59,18.38,18.09,17.93,12.51；(e)利用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min90-0％CH3CN水溶液,20-24min 100％CH3CN,24-27min,0-90％CH3CN水溶液,27-30min 90％CH3CN水溶液)以0.5mL/min的流速和210nm的UV检测，在反相C-18HPLC(Phenomenex,Luna
5μC18(2)100A,100x 4.60mm)柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约10-15分
1 13
钟，更具体约12分钟，并且甚至更具体为约12.14min；(f)通过 H、C NMR和LC/MS数据的
13
解读确定的分子式为C24H36N4O6S2；(g) C NMR谱具有所有24个碳的信号，包括5个甲基、4个
1
亚甲基、9个次甲基和6个季碳；以及(g)H NMR谱表现出典型的缩酚酸肽(depsipeptide)的特征，表明3个氨基质子[4.63,4.31,3.93]和1个酯甲醇质子[5.69]。在一具体实施方案中，所述化合物的具有结构##STR001##，或其农药可接受的盐或立体异构体：
谱(LC/MS)测定的分子量为约525-555，并且更特别地为540；(d)H NMR值为6.22,5.81,5.69,5.66,5.65,4.64,4.31,3.93,3.22,3.21,3.15,3.10,2.69,2.62,2.26,2.23.1.74,1.1
13
5,1.12,1.05,1.02；(d) C NMR值为172.99,172.93,169.57,169.23,167.59,130.74,130.1
2,129.93,128.32,73.49,62.95,59.42,57.73,38.39,38.00,35.49,30.90,30.36,29.26,1
8.59,18.38,18.09,17.93,12.51；(e)利用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min90-0％CH3CN水溶液,20-24min 100％CH3CN,24-27min,0-90％CH3CN水溶液,27-30min 90％CH3CN水溶液)以0.5mL/min的流速和210nm的UV检测，在反相C-18HPLC(Phenomenex,Luna
5μC18(2)100A,100x 4.60mm)柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约10-15分
1 13
钟，更具体约12分钟，并且甚至更具体为约12.14min；(f)通过 H、C NMR和LC/MS数据的
13
解读确定的分子式为C24H36N4O6S2；(g) C NMR谱具有所有24个碳的信号，包括5个甲基、4个
1
亚甲基、9个次甲基和6个季碳；以及(g)H NMR谱表现出典型的缩酚酸肽(depsipeptide)的特征，表明3个氨基质子[4.63,4.31,3.93]和1个酯甲醇质子[5.69]。在一具体实施方案中，所述化合物的具有结构##STR001##，或其农药可接受的盐或立体异构体：
[0122]
[0123] 其中M为1、2、3或4；n为0、1、2或3；p和q独立地为1或2；X为O、NH或NR；R1、R2和R3相同或不同，并且独立地为氨基酸侧链部分或氨基酸侧链衍生物，并且R为低级链烷基、芳基或芳基烷基部分。
[0124] 在一更具体的实施方案中，所述化合物具有FR90128的结构：
[0125]
[0126] 本文提供##STR002##所示的化合物：
[0127]
[0128] 其中X、Y和Z各自独立地为--O、--NR1或--S，其中R1为--H或C1-C10烷基；R1、R2和m各自独立地为--H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、--C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基。
[0129] 在另一更具体的实施方案中，家族##STR002##化合物可以为(vi)-(xix)所示的化合物。
[0130]
[0131]
[0132]
[0133]
[0134] 这些化合物来自天然物质，或者为获得自商业来源或通过化学合成获得的化合物。家族##STR002##化合物的天然来源包括但不限于微生物、藻类及海绵。在更具体的实施方案中，包含家族##STR002##化合物的微生物包括但不限于以下物种，或者家族##STR002##化合物可以源自以下物种：如瓦氏链轮丝菌(Streptoverticillium waksmanii)(化 合 物 vi)(Umehara,et al.,1984)、平 普 里 链 霉 菌 (Streptomyces pimprina)(化合物vii)(Naiket al.,2001)、橄榄网状链轮丝菌(Streptoverticillium olivoreticuli)(化合物viii、ix、x)(Koyama Y.,et al.,1981)、链霉菌(Streptomyces sp)(化合物xi、xii)(Watabe et al.,1988)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(化合物xiii、xiv)(Pettit et al.,2002)。家族##STR002##化合物还可以源自藻类，包括但不限于红藻(化合物xv)(N’Diaye,et al.,1996)、红藻脆红网藻(Martensia fragilis)(化合物xvi)(Takahashi S.et al.,1998)、海鞘(Diazona chinensis)(化合物xvii&xviii)(Lindquist N.et al.,1991)、Rhodophycota haraldiophyllum sp(化合物xix)(Guella et al.,1994)。
[0135] 本文还提供##STR003##：
[0136]
[0137] 其中X和Y各自独立地为--OH、--NR1或--S，其中R1为--H或C1-C10烷基；R1、R2和m为噁唑环上的取代基，各自独立地为--H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、--C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基。
[0138] 本文还提供##STR005##：
[0139]
[0140] 其中X和Y各自独立地为--OH、--NR1或--S，其中R1、R2各自独立地为--H、烷基(如C1-C10烷基)、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、--C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基。
[0141] 在一具体实施方案中，家族##STR005##化合物如以下xx-xxiii所示的化合物可以源自天然或商业来源或者通过化学合成获得：
[0142]
[0143]
[0144] 家族##STR005##化合物的天然来源包括但不限于植物、珊瑚、微生物及海绵。微生物包括但不限于灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(化合物xx)(Hirota et al.,1978)、白色链霉菌(Streptomyces albus)(化合物xxi)(Werner et al.,1980)。家族STR004化合物也可以源自藻类，包括但不限于Haraldiophyllum sp(化合物xxii)(Guella et al.,2006)及红藻(化合物xxiii)(N’Diaye et al.,1994)。
[0145] 在一实施方案中，所述化合物可以源自或者可以获得自微生物，特别是伯克霍尔德氏菌物种，并且特征在于具有这样的结构，其包含至少1个酯、至少1个酰胺、至少3个亚甲基、至少1个四氢吡喃糖部分和至少3个烯烃双键、至少6个甲基、至少3个羟基、至少25个碳以及至少8个氧和1个氮。所述化合物还包括以下特征中的至少一种：
[0146] (a)农药性质，尤其是杀线虫、杀真菌、杀虫和除草性质；
[0147] (b)通过液相色谱/质谱(LC/MS)测定的分子量为约530-580，特别是555；1
[0148] (c)H NMR值为δ6.40,6.39,6.00,5.97,5.67,5.54,4.33,3.77,3.73,3.70,3.59,3.47,3.41,2.44,2.35,2.26,1.97,1.81,1.76,1.42,1.37,1.16,1.12,1.04；13
[0149] (d) C NMR值为δ173.92,166.06,145.06,138.76,135.71,129.99,126.20,123.35,99.75,82.20,78.22,76.69,71.23,70.79,70.48,69.84,60.98,48.84,36.89,33.09,30.63,28.55,25.88,20.37,18.11,14.90,12.81,9.41；
[0150] (e)利 用水：乙腈(CH3CN)梯 度溶 剂 系 统(0-20min；90-0 ％CH3CN水 溶液,20-24min；100％CH3CN,24-27min；0-90％CH3CN水溶液,27-30min；90％CH3CN水溶液)以0.5mL/min的流速和210nm的UV检测，在反相C-18HPLC(Phenomenex,Luna5μC18(2)100A,100x4.60mm)柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约7-12分钟，更具体约10分钟，并且甚至更具体为约10.98min；
[0151] (f)13C NMR谱显示28个离散的碳信号，其可以归因于6个甲基、4个亚甲基碳和132
个次甲基，包括5个sp，4个季碳；
个次甲基，包括5个sp，4个季碳；
[0152] (g)通过ESIMS和NMR数据分析的解读确定的分子式为C28H45NO10；
[0153] (h)UV吸收带为约210-450nm，并且最特别是约234nm。
[0154] 本文还提供具有##STR004a##结构的化合物：
[0155]
[0156] 其中X、Y和Z各自独立地为-O、-NR或-S，其中R为H或C1-C10烷基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自独立地为H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基。
[0157] 在一具体实施方案中，所述化合物具有##STR004b##所示的结构：
[0158]
[0159] 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13如上文对##STR004a##所定义。
[0160] 在一更具体的实施方案中，所述化合物为Templamide A，具有以下结构：
[0161]
[0162] 在另一具体实施方案中，提供具有式##STR004c##的化合物：
[0163]
[0164] 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R11如上文对##STR004a##所定义。
[0165] 在另一实施方案中，提供这样的化合物，其可以源自伯克霍尔德氏菌物种，并且特征在于具有这样的结构，其包含至少1个酯、至少1个酰胺、环氧亚甲基、至少1个四氢吡喃糖部分和至少3个烯烃双键、至少6个甲基、至少3个羟基、至少25个碳以及至少8个氧和1个氮，并且具有农药活性。所述化合物还包括以下特征中的至少一种：
[0166] (a)农药性质，特别是杀虫、杀真菌、杀线虫和除草性质；
[0167] (b)通过液相色谱/质谱(LC/MS)测定的分子量为约520-560，特别是537；1
[0168] (c)H NMRδ值为约6.41,6.40,6.01,5.97,5.67,5.55,4.33,3.77,3.75,3.72,3.64,3.59,3.54,3.52,2.44,2.34,2.25,1.96,1.81,1.76,1.42,1.38,1.17,1.12,1.04；
13
13
[0169] (d) C NMR值为δ174.03,166.12,143.63,137.50,134.39,128.70,126.68,124.41,98.09,80.75,76.84,75.23,69.87,69.08,68.69,68.60,48.83,41.07,35.45,31.67,29.19,27.12,24.55,19.20,18.95,13.48,11.39,8.04；
[0170] (e)利用水：乙腈(CH3CN)梯度，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约6-15分钟，更具体约8分钟；特别地，利用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％CH3CN水溶液,20-24min；100％CH3CN,24-27min；0-90％CH3CN水溶液,27-30min；90％CH3CN水溶液)以0.5mL/min的流速和210nm的UV检测，在反
相C-18HPLC(Phenomenex,Luna 5μC18(2)100A,100x4.60mm)柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约8-15分钟，更具体约11分钟，并且甚至更具体为约11.73min；
相C-18HPLC(Phenomenex,Luna 5μC18(2)100A,100x4.60mm)柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约8-15分钟，更具体约11分钟，并且甚至更具体为约11.73min；
[0171] (f)通过ESIMS和NMR数据分析的解读确定的分子式为C28H43NO9；
[0172] (g)UV吸收带为约210-450nm，并且最具体为约234nm。
[0173] 在一具体实施方案中，所述化合物具有结构##STR006a##：
[0174]
[0175] 其中X、Y和Z各自独立地为-O、-NR或-S，其中R为H或C1-C10烷基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12和R13各自独立地为H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基。
[0176] 在一具体实施方案中，所述化合物具有以下结构：
[0177]
[0178] 在另一具体实施方案中，提供具有式##STR006b##的化合物：
[0179]
[0180] 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R11如上文对##STR006a##所定义。
[0181] 在更具体的实施方案中，所述化合物为Templamide B，具有以下结构：
[0182]
[0183] 在另一具体实施方案中，所述化合物可以源自伯克霍尔德氏菌物种，并且特征在于具有这样的结构，其包含至少1个酯、至少1个酰胺、环氧亚甲基、至少1个四氢吡喃糖部分和至少3个烯烃双键、至少6个甲基、至少3个羟基、至少25个碳以及至少8个氧和至少1个氮。所述化合物还包含以下特征中的至少一种：
[0184] (a)农药性质，特别是杀虫、杀真菌、杀线虫和除草性质；
[0185] (b)通过液相色谱/质谱(LC/MS)测定的分子量为约510-550，特别是约523；
[0186] (c)1H NMRδ值为约6.41,6.40,6.01,5.98,5.68,5.56,4.33,3.77,3.75,3.72,3.65,3.59,3.55,3.50,2.44,2.26,2.04,1.96,1.81,1.75,1.37,1.17,1.04；
[0187] (d)13C NMRδ值为172.22,167.55,144.98,138.94,135.84,130.14,125.85,123.37,99.54,82.19,78.28,76.69,71.31,70.13,69.68,48.83,42.52,36.89,33.11,30.63,25.99,21.20,20.38,18.14,14.93,12.84；
[0188] (e)利用水：乙腈(CH3CN)梯度，在反相C-18HPLC柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约6-15分钟，更具体约8分钟，特别地，利用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％CH3CN水溶液,20-24min；100％CH3CN,24-27min；0-90％CH3CN水溶液,27-30min；90％CH3CN水溶液)以0.5mL/min的流速和210nm的UV检测，在反
相C-18HPLC(Phenomenex,Luna 5μC18(2)100A,100x4.60mm)柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约8-15分钟，更具体约10分钟，并且甚至更具体为约10.98min；
相C-18HPLC(Phenomenex,Luna 5μC18(2)100A,100x4.60mm)柱上进行的高压液相色谱(HPLC)的保留时间为约8-15分钟，更具体约10分钟，并且甚至更具体为约10.98min；
[0189] (f)通过ESIMS和NMR数据分析的解读确定的分子式为C27H41NO9；
[0190] (g)UV吸收带为约210-450nm，并且最具体为约234nm。
[0191] 在更具体的实施方案中，所述化合物为已知化合物FR901465，其更早地分离自假单胞菌(Pseudomonas sp.)No.2663的细菌培养液(Nakajima et al.1996)，并且据报导具有抗癌活性，其结构如下：
[0192]
[0193] 在另一具体实施方案中，家族##STR006a##化合物可以为xxiv-xxxix所示的化合物。这些化合物来自天然物质，或者为获得自商业来源或通过化学合成获得的化合物。家族##STR006a##化合物的天然来源包括但不限于微生物、藻类和海绵。在更具体的实施方案中，包含家族##STR006a##化合物的微生物可以来自这样的物种，如假单胞菌No.2663(化合物xxiv-xxvi)(Nakajima et al.1996)。已经合成FR901464的合成类似物(xxvii-xxxix)，并且作为抗癌化合物申请专利(参见Koide et al.,US专利申请No.2008/0096879 A1)。
[0194]
[0195] 组合物
[0196] 可以将通过本发明的伯克霍尔德氏菌菌株制备的基本上纯的培养物、细胞部分或上清以及化合物配制成农药组合物。
[0197] 上述物质可以用任何方式配制。非限制性制剂实例包括但不限于可乳化浓缩物(EC)、可湿性粉末(WP)、可溶性液体(SL)、气溶胶、超低容量浓缩液(ULV)、可溶性粉末(SP)、微胶囊、水分散颗粒、流动剂(flowable,FL)、微乳液(ME)、纳米乳液(NE)等。特别地，本文所述的浓缩物、粉末、颗粒和乳液可以是冷冻干燥的。在本文所述的任何制剂中，活性成分的百分比范围为0.01％-99.99％。
[0198] 所述组合物可以为液体、凝胶或固体的形式。液体组合物包含源自所述伯克霍尔德氏菌菌株(如具有与伯克霍尔德氏菌A396(NRRL登录号B-50319)相同特征的菌株)的农药化合物。
[0200] 本发明的组合物可以包含凝胶封装的源自本发明的伯克霍尔德氏菌菌株的化合物。这样的凝胶封装的材料可以通过将凝胶形成剂(如明胶、纤维素或木质素)与本发明方法中所用的农药化合物的溶液混合，并诱导所述物质的凝胶形成而制备。
[0201] 所述组合物可以额外地包含表面活性剂以用于乳化、分散、湿润、铺展、整合、崩解控制、稳定活性成分，并且改善流动性或抑制锈蚀。在一具体实施方案中，表面活性剂为对植物无毒的无毒表面活性剂，其优选属于EPA List 4B。在另一具体实施方案中，非离子型表面活性剂为聚氧乙烯(20)单月桂酸酯。表面活性剂的浓度可以为总制剂的0.1-35％，优选5-25％。分散剂和乳化剂的选择如非离子型、阴离子、两性和阳离子分散剂和乳化剂以及用量由组合物和所述物质促进这些组合物分散的能力决定。
[0202] 所述组合物还可以包含其他微生物和/或农药(如杀线虫剂、杀真菌剂、杀虫剂)。所述微生物可以包括但不限于源自芽孢杆菌(Bacillus sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、短芽孢杆菌(Brevabacillus sp.)、轮枝菌(Lecanicillium sp.)、非白粉寄生菌(non-Ampelomyces sp.)、二形性酵母菌(Pseudozyma sp.)、链霉菌(Streptomyces sp)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp)、木霉菌(Trichoderma sp)、粘帚霉(Gliocladium sp.)的物质(agent)。或者，所述物质可以为具有杀真菌和/或杀虫活性的天然油或油产物(如石蜡油、茶树油、香茅油、丁香油、肉桂油、柑橘油、迷迭香油)。
[0203] 特别地，所述组合物还可以包含杀虫剂。所述杀虫剂可以包括但不限于阿维菌素、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、印楝油(neem oil)和印楝
素(azadiractin)、多杀菌素、Chromobacterium subtsugae、桉树提取物、昆虫病原性细菌或真菌(如球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和金龟子绿僵菌(Metarrhizium
anisopliae))以及化学杀虫剂，其包括但不限于有机氯化合物、有机磷化合物、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯和新烟碱类。
素(azadiractin)、多杀菌素、Chromobacterium subtsugae、桉树提取物、昆虫病原性细菌或真菌(如球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和金龟子绿僵菌(Metarrhizium
anisopliae))以及化学杀虫剂，其包括但不限于有机氯化合物、有机磷化合物、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯和新烟碱类。
[0204] 所述组合物还可以包含杀线虫剂。所述杀线虫剂包括但不限于化学杀线虫剂，如苯线磷、涕灭威、杀线威、克百威、天然产物杀线虫剂、阿维菌素、真菌淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinas)和产气霉(Muscodor spp.)、细菌坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)和其他芽孢杆菌以及侵入巴斯德氏芽菌(Pasteuria penetrans)。
[0205] 所述组合物还可以包含生物杀真菌剂，例如库页悬钩子(R.sachalinensis)的提取物(Regalia)或杀真菌剂。这样的杀真菌剂包括但不限于单位点抗真菌剂，其可以包括但不限于苯并咪唑、脱甲基化抑制剂(DMI)(如咪唑、哌嗪、嘧啶、三唑)、吗啉、羟基嘧啶、苯胺基嘧啶、硫代磷酸酯(phosphorothiolate)、醌外部抑制剂(quinone outside inhibitor)、喹啉、二羧酰亚胺、羧酰亚胺、苯基酰胺、苯胺基嘧啶、苯基吡咯、芳香烃、肉桂酸、N-羟基酰苯胺(hydroxyanilide)、抗生素、多氧菌素、酰胺(acylamine)、苯邻二甲酰亚胺、苯型化合物(benzenoid)(二甲苯基丙氨酸)。在另一具体实施方案中，所述抗真菌剂为选自以下的脱甲基化抑制剂：咪唑(如氟菌唑)、哌嗪、嘧啶和三唑(如联苯三唑醇、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、三唑酮、糠菌唑、环丙唑醇、烯唑醇、腈苯唑、己唑醇、戊唑醇、四氟醚唑、丙环唑)。
[0206] 抗微生物剂还可以为多位点非无机化学杀真菌剂，其选自腈(如氯腈(chloronitrile)或咯菌腈)、喹喔啉、硫酰胺、膦酸酯、亚磷酸酯、二硫代氨基甲酸酯、chloralkythios、苯基吡啶胺、氰基乙酰胺肟。
[0207] 所述组合物可以利用本领域已知的方法施用。特别地，这些组合物可以施用于植物或植物部分。植物在本发明的上下文中应当理解为表示所有的植物和植物群体，例如期望和不期望的野生植物或作物(包括天然存在的作物)。作物可以是可以通过常规植物育种和优化方法或者通过生物技术和遗传工程方法或者通过这些方法的组合获得的植物，包括转基因植物并且包括可以被植物育种者的权利保护或不被保护的植物品种。植物部分应当理解为表示植物的地上和地下的所有部分和器官，例如枝条、叶、花和根，其实例可以描述为叶、针叶、秆、茎、花、子实体、果实、种子、根、块状茎和根状茎。植物部分还包括收获的材料以及营养和生殖繁殖材料，例如插条、块状茎、根状茎、蘖枝和种子。
[0208] 用上述组合物处理植物和植物部分可以直接进行，或者通过使所述组合物作用于它们的周围环境、栖生地或存储空间进行，例如通过浸泡、喷洒、蒸发、喷雾、散布、涂抹、注射。在将组合物施用于种子的情况下，所述组合物可以作为一种或多种包衣施用于所述种子，然后将所述种子通过本领域已知的方法利用一种或多种包衣进行种植。
[0209] 如上文所述，所述组合物可以为除草组合物。所述组合物还可以包含一种或多种除草剂。这些除草剂可以包括但不限于生物除草剂和/或化学除草剂。生物除草剂可以选自丁香、肉桂、香茅、柑橘油、橙皮油、腾毒素、cornexistin、AAL-毒素、纤精酮(leptospermone)、thaxtomin、假蒟亭碱(sarmentine)、稻壳酮B(momilactone B)、高粱醌(sorgoleone)、ascaulatoxin和ascaulatoxin糖苷配基。化学除草剂可以包括但不限于氟吡草腙及其盐、麦草畏及其盐、苯吡唑草酮(topramezone)、环磺酮(tembotrione)、S-异丙甲草胺、莠去津、甲基磺草酮、氟嘧磺隆、2,4-二氯苯氧基乙酸、烟嘧磺隆、噻吩磺隆、磺草灵、嗪草酮、禾草灵、吡氟禾草灵、精噁唑禾草灵、磺草灵、乙氧氟草醚、砜嘧磺隆、二甲四氯丙酸和二氯喹啉酸、杀草丹、异恶草酮、氰氟草酯(cyhalofop)、敌稗、苄嘧磺隆、五氟磺草胺(penoxsulam)、三氯吡氧乙酸、咪唑乙烟酸、氯吡嘧磺隆、二甲戊灵、双草醚、唑草酯、灭草松(sodium bentazon)/三氟羧草醚、草甘膦、草铵膦(glufosinate)以及嘧苯胺磺隆(orthosulfamuron)。
[0210] 除草组合物可以液体或固体形式作为出苗前或出苗后制剂施用。
[0211] 对于出苗前干燥制剂，载体的颗粒大小通常为1-2mm(直径)，但是颗粒可以更小或更大，这取决于所需的土地覆盖率。颗粒可以包括多孔或无孔颗粒。
[0212] 对于出苗后制剂，所用的制剂组分可以包含蒙脱石粘土、绿坡缕石粘土和类似的溶胀粘土、增稠剂(如黄原胶、阿拉伯树胶和其他多糖增稠剂)以及分散稳定剂(如非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(20)单月桂酸酯))。
[0213] 用途
[0214] 源自本文所示的伯克霍尔德氏菌菌株的组合物和农药化合物可以用作农药，特别是杀虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂和除草剂。
[0215] 特别地，可以利用上述方法控制的线虫包括但不限于寄生线虫，如根结、环、刺、矛(lance)、胞囊和病变的线虫，包括但不限于根结线虫、胞囊线虫(Heterodera and Globodera spp)；尤其是南方根结线虫(Meloidogyne incognita)(根结线虫)，以及马铃薯黄金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯胞囊线虫(globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫)；大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)(甜菜胞囊线虫)；和燕麦胞囊线虫(Heterodera avenae)(谷胞囊线虫)。
[0216] 通过本发明方法控制的植物致病性昆虫包括但不限于以下目的昆虫：
[0217] (a)鳞翅目，如卷蛾(Acleris spp.)、茶姬卷叶蛾(Adoxophyes spp.)、透翅蛾(Aegeria spp.)、地老虎(Agrotis spp.)、棉树叶虫(Alabama argillaceae)、Amylois spp.、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、卷叶蛾(Archips spp.)、卷蛾(Argyrotaenia spp.)、夜蛾(Autographa spp.)、玉米楷夜蛾(Busseola fusca)、粉斑螟蛾(Cadra cautella)、桃小食心虫(Carposina nipponensis)、水稻螟虫(Chilo spp.)、色卷蛾(Choristoneura spp.)、葡萄果蠹蛾(Clysia ambiguella)、野螟蛾(Cnaphalocrocis spp.)、Cnephasia spp.、Cochylis spp.、落叶 松鞘蛾 (Coleophora spp.)、大菜 螟(Crocidolomia binotalis)、苹果异形小卷蛾(Cryptophlebia leucotreta)、蠹蛾(Cydia spp.)、蔗螟(Diatraea spp.)、苏丹棉铃虫(Diparopsis castanea)、金刚钻(Earias spp.)、粉斑螟(Ephestia spp.)、卷叶蛾(Eucosma spp.)、环针单纹蛾(Eupoecilia ambiguella)、毒蛾(Euproctis spp.)、夜蛾(Euxoa spp.)、食心虫(Grapholita spp.)、Hedya nubiferana、棉花实夜蛾(Heliothis spp.)、菜螟(Hellula undalis)、美国白蛾(Hyphantria cunea)、番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella)、旋纹潜叶蛾(Leucoptera scitella)、细蛾(Lithocollethis spp.)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、毒蛾(Lymantria spp.)、潜叶蛾(Lyonetia spp.)、天幕毛虫(Malacosoma spp.)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、烟草天蛾(Manduca sexta)、尺蛾(Operophtera spp.)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、银杏超小卷叶蛾(Pammene spp.)、卷叶蛾(Pandemis spp.)、冬夜蛾(Panolis flammea)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、马铃薯块茎蛾(Phthorimaea operculella)、菜粉蝶(Pieris rapae)、马醉木(Pieris spp.)、小菜蛾(Plutella xylostella)、巢蛾(Prays spp.)、白禾螟(Scirpophaga spp.)、紫螟(Sesamia spp.)、卷叶蛾(Sparganothis spp.)、夜蛾(Spodoptera spp.)、透翅蛾(Synanthedon spp.)、异舟蛾(Thaumetopoea spp.)、Tortrix spp.、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)和巢蛾(Yponomeuta spp.)；
[0218] (b)鞘翅目，如叩甲(Agriotes spp.)、花象(Anthonomus spp.)、谷类蚜虫(Atomaria linearis)、凹胫跳甲(Chaetocnema tibialis)、球茎象鼻虫(Cosmopolites spp.)、麻栎果实象鼻虫(Curculio spp.)、皮蠹(Dermestes spp.)、叶甲(Diabrotica spp.)、食植瓢虫(Epilachna spp.)、Eremnus spp.、科罗拉多金花虫(Leptinotarsa decemlineata)、象甲 (Lissorhoptrus spp.)、鳃 角 金 龟(Melolontha spp.)、谷 盗(Orycaephilus spp.)、葡萄黑耳喙鼻(Otiorhynchus spp.)、Phlyctinus spp.、丽金龟(Popillia spp.)、跳甲(Psylliodes spp.)、谷蠹(Rhizopertha spp-)、金龟子科(Scarabeidae)、米象(Sitophilus spp.)、麦蛾(Sitotroga spp.)、拟步虫(Tenebrio spp.)、面象虫(Tribolium spp.)和褐拟谷盗(Trogoderma spp.)；
[0219] (c)直翅目，如蜚蠊(Blatta spp.)、姬蠊(Blattella spp.)、蝼蛄(Gryllotalpa spp.)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、飞蝗(Locusta spp.)、大蠊(Periplaneta spp.)和沙漠蝗(Schistocerca spp.)；
[0220] (d)等翅目，如堆沙白蚁(Reticulitermes spp.)；
[0221] (e)啮虫目、如书虱(Liposcelis spp.)；
[0222] (f)虱目，如吸血虱(Haematopinus spp.)、颚虱(Linognathus spp.)、体虱(Pediculus spp.)、瘿绵蚜(Pemphigus spp.)和根瘤蚜(Phylloxera spp.)；
[0223] (g)食毛目，如叮咬虱(Damalinea spp.)和啮毛虱(Trichodectes spp.)；
[0224] (h)缨翅目，如蓟马(Frankliniella spp.)、蓟马(Hercinotnrips spp.)、带蓟马(Taeniothrips spp.)、南黄蓟马(Thrips palmi)、烟蓟马(Thrips tabaci)和非洲橘硬蓟马(Scirtothrips aurantii)；
[0225] (i)异翅亚目，如臭虫(Cimex spp.)、可可瘤盲蝽(Distantiella theobroma)、棉 红 蝽(Dysdercus spp.)、Euchistus spp.、扁 盾 蝽(Eurygaster spp.)、稻 緣 椿(Leptocorisa spp.)、蛛缘蝽(Nezara spp.)、皮蝽(Piesma spp.)、锥蝽(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergella singularis)、黑椿(Scotinophara spp.)和锥蝽(Tniatoma spp.)；
[0226] (j)同翅目，如丝绒粉虱(Aleurothrixus floccosus)、菜粉虱(Aleyrodes brassicae)、盾蚧(Aonidiella spp.)、蚜虫科(Aphididae)、蚜虫(Aphis spp.)、圆蚧(Aspidiotus spp.)、烟粉虱(Bemisia tabaci)、蜡蚧(Ceroplaster spp.)、黑褐圆盾蚧(Chrysomphalus aonidium)、网籽草叶圆蚧(Chrysomphalus dictyospermi)、扁坚介壳虫(Coccus hesperidum)、叶蝉(Empoasca spp.)、绵蚜(Eriosoma larigerum)、叶蝉(Erythroneura spp.)、Gascardia spp.、灰飞虱(Laodelphax spp.)、介壳虫(Lecanium corni)、蛎盾蚧(Lepidosaphes spp.)、长管蚜(Macrosiphus spp.)、蚜虫(Myzus spp.)、黑尾叶蝉(Nephotettix spp.)、褐飞虱(Nilaparvata spp.)、Paratoria spp.、瘿绵蚜(Pemphigus spp.)、动球菌(Planococcus spp.)、白盾蚧(Pseudaulacaspis spp.)、粉蚧(Pseudococcus spp.)、梨 木虱(Psylla spp.)、Pulvinaria aethiopica、圆 蚧(Quadraspidiotus spp.)、缢管蚜(Rhopalosiphum spp.)、硬介壳虫(Saissetia spp.)、带叶蝉(Scaphoideus spp.)、二叉蚜(Schizaphis spp.)、蚜(Sitobion spp.)、温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、非洲木虱(Trioza erytreae)和桔矢尖蚧(Unaspis citri)；
[0227] (k)膜翅目，如切叶蚁(Acromyrmex)、切叶蚁(Atta spp.)、麦茎蜂(Cephus spp.)、松叶蜂(Diprion spp.)、松叶蜂科(Diprionidae)、Gilpinia polytoma、李实蜂(Hoplocampa spp.)、Lasius spp.、小家 蚁(Monomorium pharaonis)、新 松 叶 蜂(Neodiprion spp.)、红火蚁(Solenopsis spp.)和胡蜂(Vespa spp.)；
[0228] (l)双翅目，如伊蚊(Aedes spp.)、高粱芒蝇(Antherigona soccata)、全北毛蚊(Bibio hortulanus)、红头丽蝇(Calliphora erythrocephala)、蜡实蝇(Ceratitis spp.)、丽蝇(Chrysomyia spp.)、库蚊(Culex spp.)、黄蝇(Cuterebra spp.)、寡毛实蝇(Dacus spp.)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、厕蝇(Fannia spp.)、胃蝇(Gastrophilus spp.)、舌 蝇 (Glossina spp.)、牛 蝇 (Hypoderma spp.)、Hyppobosca spp.、斑潜蝇(Liriomyza spp.)、绿蝇(Lucilia spp.)、根潜蝇(Melanagromyza spp.)、家蝇(Musca spp.)、牛虻(Oestrus spp.)、瘿蚊(Orseolia spp.)、黑麦秆蝇(Oscinella frit)、甜菜潜叶蝇(Pegomyia hyoscyami)、草种蝇(Phorbia spp.)、苹果实蝇(Rhagoletis pomonella)、菇蚋(Sciara spp.)、螫蝇(Stomoxys spp.)、虻(Tabanus spp.)、Tannia spp.和大蚊(Tipula spp.)；
[0229] (m)蚤目，如角叶蚤(Ceratophyllus spp.)和印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis)；以及
[0230] (n)缨尾目，如衣鱼(Lepisma saccharina)。
[0231] 本发明的活性成分还可以用于控制含油种子作物如油菜(油菜(rape))、芥菜籽及其杂交种以及稻和玉米中的十字花科跳甲(黄条跳甲(Phyllotreta spp.))、根蛆(Delia spp.)、卷心菜象鼻虫(seedpod weevil)(Ceutorhynchus spp.)和蚜虫。
[0232] 在一具体实施方案中，所述昆虫可以为夜蛾(Spodoptera)的成员，更特别是甜菜夜蛾、桃蚜(Myzus persicae)、小菜蛾或椿象(Euschistus sp.)。
[0233] 所述物质和组合物也可以用于在单子叶苔草或双子叶杂草出苗前制剂或出苗后制剂中调节出苗。在一具体实施方案中，所述杂草可以是藜(Chenopodium album)、苘 麻 (Abutilon theophrasti)、向 日 葵 (Helianthus annuus)、豚 草 (Ambrosia artemesifolia)、反枝苋(Amaranthus retroflexus)、田旋花(Convolvulus arvensis)、田芥菜(Brassica kaber)、药用蒲公英(Taraxacum officinale)、龙葵(Solanum nigrum)、圆叶锦葵(Malva neglect)、金狗尾草(Setaria lutescens)、旱雀麦(Bromus tectorum)、早熟禾(Poa annua)、草地早熟禾(Poa pratensis)、黑麦草(Lolium perenne L.)变种Pace、高羊茅(Festuca arundinaceae Schreb.)变种Aztec II,Anthem II,LS1100、稗草(Echinochloa crus-galli)、莴笋(Lactuca sativa)。上文所述的伯克霍尔德氏菌菌株、化合物和组合物还可以用作杀真菌剂。所靶向的真菌可以为镰胞菌(Fusarium sp.)、葡萄孢(Botrytis sp.)、链核盘菌(Monilinia sp.)、炭疽菌(Colletotrichum sp)、轮枝孢霉(Verticillium sp.)、Microphomina sp.、根腐菌(Phytophtora sp)、毛霉(Mucor sp.)、叉丝单囊壳(Podosphaera sp.)、纹枯病菌(Rhizoctonia sp.)、霜霉菌(Peronospora sp.)、地丝菌(Geotrichum sp.)、茎点霉(Phoma)和青霉菌(Penicillium)。在另一最具体的实施方案中，细菌为黄单胞菌(Xanthomonas)。
[0234] 参照以下非限制性实施例来更详细地描述本发明。
[0235] 实施例
[0236] 在以下的非限制性实施例中进一步示例上文所述的组合物和方法。所述实施例对于本文所述的材料、条件、重量比、工艺参数等仅示例各种实施方案，并不限制所要求保护的发明。
[0237] 1.实施例1微生物的分离和鉴定
[0238] 1.1微生物的分离
[0239] 利用本领域确定的技术，从Rinnoji Temple,Nikko,Japan的常绿树下收集的土壤分离微生物。分离利用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)通过Lorch et al.,1995详细描述的方法进行。在该方法中，首先将土壤样品稀释于无菌水中，然后将其平板接种于诸如马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)的土壤琼脂培养基中。使平板在25℃下生长5天，然后将单个微生物菌落分离入分别的PDA平板。分离的细菌为革兰氏阴性的，并且其形成圆形、不透明的乳白色菌落，其随时间变为粉红色和粉红褐色以及粘液或糊状
[0240] 1.2微生物的鉴定
[0241] 微生物基于基因测序来鉴定，其使用通用细菌引物以扩增16S rRNA区域。使用如下方案：将伯克霍尔德氏菌A396培养于马铃薯葡萄糖琼脂平板上。用无菌环从24小时的平板刮取生长物，并重悬浮于DNA提取缓冲液。DNA利用MoBio Ultra Clean Microbial DNA提取试剂盒进行提取。通过在1％琼脂糖凝胶上跑5μl来检查DNA提取物的质量/数量。
[0242] PCR反应设定如下：2μl DNA提取物、5μl PCR缓冲液、1μl dNTP(各10mM)、1.25μl正向引物(27F；5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:1)、1.25μl反向引物(907R；5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’(SEQ ID NO:2))和0.25μl Taq酶。反应体积利用无核酸酶的无菌水补齐至50μl。PCR反应包括初始变性步骤95℃下10分钟，然后
94℃/30sec、57℃/20sec、72℃/30sec的30个循环，以及最终延伸步骤72℃下10分钟。
94℃/30sec、57℃/20sec、72℃/30sec的30个循环，以及最终延伸步骤72℃下10分钟。
[0243] 产物的大体浓度和大小通过在1％琼脂糖凝胶上跑5μl体积并比较产物带与mass ladder来计算。
[0244] 过量的引物、dNTP和酶通过MoBio PCR清理试剂盒从PCR产物除去。将清理的PCR产物利用以下引物直接测序：27F(与上文相同)、530F(5’-GTGCCAGCCGCCGCGG-3’(SEQ ID NO:3))、1114F(5’-GCAACGAGCGCAACCC(SEQ ID NO:4))和1525R(5’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3’(SEQ ID NO:5))、1100R(5’-GGGTTGCGCTCGTTG-3’(SEQ ID NO:6))、519R(5’-GWATTACCGCGGCKGCTG-3’(SEQ ID NO:7)。
[0245] 利用BLAST，将菌株A396的16S rRNA基因序列与代表性的β-蛋白菌可得的16s rRNA基因序列比较。菌株A395 A396与洋葱伯克霍尔德氏菌复合群的成员紧密相关，与多噬伯克霍尔德氏菌、越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamensis)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)的几种分离物具有99％或更高的相似性。BLAST检索排除洋葱伯克霍尔德氏菌复合群，显示与植物伯克霍尔德氏菌(B.plantarii)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(B.gladioli)和伯克霍尔德氏菌分离物98％的相似性。
[0246] 利用邻接法(neighbor joining method)的距离树表明，A396与多噬伯克霍尔德氏菌和其他洋葱伯克霍尔德氏菌复合群相关。植物伯克霍尔德氏菌(Burkholderia plantarii)和荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderia glumae)分组于树的不同分枝中。
[0247] 发现分离的伯克霍尔德氏菌菌株包含以下序列：
[0248] 正向序列，27F引物DNA测序，815个核苷酸(SEQ ID NO:8)；
[0249] 反向序列，1453bp，利用引物1525R、1100R、519R(SEQ ID NO:9)；
[0250] 反向序列，824bp，利用引物907R(SEQ NO:10)；
[0251] 正向序列，1152bp，利用引物530F(SEQ ID NO:11)；
[0252] 正向序列，1067bp，利用1114F引物(SEQ ID NO:12)；
[0253] 反向序列，1223bp，利用1525R引物(SEQ NO:13)；
[0254] 反向序列，1216bp，利用1100R引物(SEQ ID NO:14)；
[0255] 反向序列，1194bp，利用519R引物(SEQ ID NO:15)。
[0256] 1.3证明伯克霍尔德氏菌A396不属于洋葱伯克霍尔德氏菌复合群
[0257] 1.3.1利用特异性PCR引物的分子生物学研究工作
[0258] 为了证实伯克霍尔德氏菌A396鉴定为多噬伯克霍尔德氏菌，进行持家基因基因的额外测序。多噬伯克霍尔德氏菌为洋葱伯克霍尔德氏菌复合群的已知成员。如Mahenthiralingam et al.,2000所述，工作集中于recA基因的PCR。使用如下引物：(a)Mahenthiralingam et al.,2000所示的BCR1和BCR2以证实洋葱伯克霍尔德氏菌复合群匹配，以及(b)Mahenthiralingam et al,2000所示的BCRBM1和BCRBM2以证实多噬伯克霍尔德氏菌(B.multivorans)匹配。第一引物组的产物收获(product-yielding)PCR反应证实所述微生物属于洋葱伯克霍尔德氏菌复合群。第二引物组的产物收获PCR反应证实所述微生物确实为多噬伯克霍尔德氏菌。
[0259] 对于任何引物对没有获得PCR产物。PCR反应和引物的性能利用多噬伯克霍尔德氏菌ATCC 17616(阳性对照)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(阴性对照)来测试。利用两个引物组，对多噬伯克霍尔德氏菌均观察到强条带。对于荧光假单胞菌则未观察到条带。结果表明，A396为伯克霍尔德氏菌，但是不是洋葱伯克霍尔德氏菌复合群的成员，并且也不是多噬伯克霍尔德氏菌。这还在比较培养实验中得到证实，其中使A396和多噬伯克霍尔德氏菌的典型培养物在振荡培养中并排生长，并且每天利用600nm的光密度测量来监测生长。在设定的条件下，新的物种A396比多噬伯克霍尔德氏菌典型菌株生长快得多(图1)。
[0260] 1.3.2 DNA-DNA杂交
[0261] 为了证实分离物A396是伯克霍尔德氏菌的新物种，用多噬伯克霍尔德氏菌(最接近的16S rRNA序列匹配)进行DNA-DNA杂交实验。在ISP2培养液中，在Fernbach烧瓶于200rpm/25℃下生长48小时产生A396和多噬伯克霍尔德氏菌的生物量。通过离心无菌地收集生物量。将培养液倒出，并将细胞沉淀重悬浮于水：异丙醇的1:1溶液中。DNA-DNA杂交实验由DSMZ(位于德国的德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures))进行。如Cashion et al.,1977所述，利用弗氏压碎器(French pressure cell)(Thermo Spectronic)分离DNA，并通过羟基磷灰石上的色谱进行纯化。如De Ley et al.,1970所述进行DNA-DNA杂交，考虑Huss et al.,1983所述的修改，利用模型Cary 100 Bio UV/VIS分光光度计，其配备有Peltier恒温6x6自动多槽架(multicell changer)和具有原位温度探头的的温度控制器(Varian)。DSMZ报道A396与多噬伯克霍尔德氏菌之间的％DNA-DNA相似性为37.4％。当考虑特别委员会(ad hoc committee)对细菌物种定义的70％DNA-DNA相似性的阈值推荐(Wayne et al.,1987)时，结果表明伯克霍尔德氏菌菌株A396不属于物种多噬伯克霍尔德氏菌。
[0262] 1.4使用Biolog GN2平板确定生化特性(profile)
[0263] 对于碳源利用特性，使A396在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)中过夜生长。如制造商的推荐(Biolog,Hayward,CA)，将培养物转移至BUG琼脂以产生足够的用于Biolog的培养物。
[0264] 微生物的生化特性通过接种于Biolog GN2，并且在24小时培养后利用MicroLog4-自动microstation系统读取平板来确定。未知细菌的鉴定通过将其碳利用模式与
Microlog 4革兰氏阴性数据库比较来进行。
Microlog 4革兰氏阴性数据库比较来进行。
[0265] Biolog特性未发现明显确定的匹配。最接近的匹配均具有与A396小于35％的相似性：多刺假单胞菌(Pseudomonas spinosa)(伯克霍尔德氏菌)、洋葱伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)。结果示于表I。
[0266] 表1：A396的生化特性
[0267]
[0268]
[0269] 1.5脂肪酸组成
[0270] 如(Vandamme et al.,1992)所述，在28℃下培养24小时后，收获一菌环(loopful)良好生长的细胞，并利用Sherlock微生物鉴定系统(MIDI)制备、分离和鉴定脂肪酸甲酯。伯克霍尔德氏菌A396中存在的主要脂肪酸如下：16:0(24.4％),cyclo
17:0(7.1％),16:03-OH(4.4％),14:0(3.6％),19:0ω8c(2.6％)cyclo,18:0(1.0％)。总结特征(Summed feature)8(包含18:1ω7c)和总结特征3(包含16:1ω7c和16:1ω6c)
分别对应于总峰面积的26.2％和20.2％。总结特征2包含12:0ALDE,16:1iso I,和
14:03-OH)，对应于总峰面积的5.8％；而总结特征5包含18:0ANTE和18:2ω6,9c，对应于
0.4％。A396中检测到的少量其他脂肪酸包括：13:1在12-13(0.2％),14:1ω5c(0.2％),1
5:03-OH(0.13％),17:1ω7c(0.14％),17:0(0.15％),16:0iso 3-OH(0.2％),16:02-OH(0.8％),18:1ω7c 11-甲基(0.15％)和18:12-OH(0.4％)。
17:0(7.1％),16:03-OH(4.4％),14:0(3.6％),19:0ω8c(2.6％)cyclo,18:0(1.0％)。总结特征(Summed feature)8(包含18:1ω7c)和总结特征3(包含16:1ω7c和16:1ω6c)
分别对应于总峰面积的26.2％和20.2％。总结特征2包含12:0ALDE,16:1iso I,和
14:03-OH)，对应于总峰面积的5.8％；而总结特征5包含18:0ANTE和18:2ω6,9c，对应于
0.4％。A396中检测到的少量其他脂肪酸包括：13:1在12-13(0.2％),14:1ω5c(0.2％),1
5:03-OH(0.13％),17:1ω7c(0.14％),17:0(0.15％),16:0iso 3-OH(0.2％),16:02-OH(0.8％),18:1ω7c 11-甲基(0.15％)和18:12-OH(0.4％)。
[0271] A396与MIDI数据库中已知的微生物菌株脂肪酸组成的比较表明，新菌株A396中的脂肪酸与新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)最相似。
[0272] 1.6对抗生素的抗性
[0273] 如PML微生物技术数据表#535所述，利用Muller-Hinton培养基上的抗生素盘测试伯克霍尔德氏菌A396的抗生素易感性。25℃下72小时培养后获得的结果如下表2所示。
[0274] 表2：MBI-206对各种抗生素的易感性。
[0275] +++非常易感，++易感，-抗性
[0276]浓度(ug) 易感性
四环素 30 -
卡那霉素 30 +++
红霉素 15 -
链霉素 10 -
青霉素 10 -
氨苄青霉素 10 -
土霉素 30 -
氯霉素 30 ++
环丙沙星 5 ++
庆大霉素 10 -
哌拉西林 100 +++
头孢呋辛 30 -
伊米配能 10 +++
磺胺甲基异噁唑-甲氧苄氨嘧啶 23.75/25 ++
四环素 30 -
卡那霉素 30 +++
红霉素 15 -
链霉素 10 -
青霉素 10 -
氨苄青霉素 10 -
土霉素 30 -
氯霉素 30 ++
环丙沙星 5 ++
庆大霉素 10 -
哌拉西林 100 +++
头孢呋辛 30 -
伊米配能 10 +++
磺胺甲基异噁唑-甲氧苄氨嘧啶 23.75/25 ++
[0277] 结果表明伯克霍尔德氏菌A396的抗生素易感性谱与致病性洋葱伯克霍尔德氏菌复合群菌株明显不同。伯克霍尔德氏菌A396对卡那霉素、氯霉素、环丙沙星、哌拉西林、伊米配能以及磺胺甲基异噁唑与甲氧苄氨嘧啶的组合是易感的。作为比较，Zhou et al.,2007测试了分离自囊性纤维化患者的洋葱伯克霍尔德氏菌复合群中2,621种不同菌株的易感性，并发现所有的菌株中仅7％和5％分别对伊米配能或环丙沙星是易感的。他们还发现所有的菌株中85％对氯霉素是抗性的(15％易感)，并且95％对磺胺甲基异噁唑与甲氧苄氨嘧啶的组合是抗性的(5％易感)。Zhou et al.,2007的结果与Pitt et al.,1996类似，其在366种洋葱伯克霍尔德氏菌分离物中确定抗生素抗性，并且报导它们大部分对环丙沙星、头孢呋辛、伊米配能、氯霉素、四环素和磺胺甲基异噁唑(sulphametoxacole)是抗性的。
[0278] 2.实施例2作为除草剂的伯克霍尔德氏菌
[0279] 2.1研究#1
[0280] 为了证实在初始除草剂筛选中发现的活性，利用源自新的伯克霍尔德氏菌物种的5天的全细胞培养液的Amberlite 7 XAD树脂提取物进行体内研究。将干燥的粗提取物以
10mg/mL的浓度重悬浮于4％乙醇和0.2％非离子型表面活性剂(glycosperse)，并且进一步稀释至5.0mg/mL的浓度。将两个样品喷洒于4周龄的旋花(田旋花)植物上，并将该植物于25℃下保持在生长光照下2周，在该点时进行植物毒性评价。在相同的天，将2周龄的红根藜草植物喷洒渐增浓度的源自细菌培养物的粗提取物。测试浓度为1.25、2.5、5.0和
10.0mg/mL，并且将植物在植物毒性评价之前如上文所述进行培养。
10mg/mL的浓度重悬浮于4％乙醇和0.2％非离子型表面活性剂(glycosperse)，并且进一步稀释至5.0mg/mL的浓度。将两个样品喷洒于4周龄的旋花(田旋花)植物上，并将该植物于25℃下保持在生长光照下2周，在该点时进行植物毒性评价。在相同的天，将2周龄的红根藜草植物喷洒渐增浓度的源自细菌培养物的粗提取物。测试浓度为1.25、2.5、5.0和
10.0mg/mL，并且将植物在植物毒性评价之前如上文所述进行培养。
[0281] 图2(旋花)和3(藜草)所示的结果证实不同浓度的伯克霍尔德氏菌粗提取物的植物毒性效果，并且它们甚至在低处理浓度下也对藜草表现出良好的除草效果。两种提取物处理(5和10mg/mL)导致旋花的矮化。
[0282] 2.2研究#2
[0283] 使伯克霍尔德氏菌A396的新菌株在不确定的矿质培养基中生长5天(25℃,200rpm)。将全细胞培养液利用XAD7树脂提取。将干燥的粗提取物以10mg/mL的浓度重悬浮于4％乙醇和0.2％非离子型表面活性剂，并且进一步稀释至5.0、2.5和1.25mg/mL的浓度。然后在以下表3所列的阔叶和草本(grass)杂草物种上进行测试。
[0284] 表3 测试的阔叶和草本杂草物种
[0285]
[0286] 6fl oz/加仑比率的0.2％的glycosperse和草甘膦(Roundup)溶液分别用作阴性和阳性对照。
[0287] 将所有植物物种在4”x4”塑料盆中测试，重复3次。将未处理的对照植物用载体溶液(4％乙醇、0.2％的glycosperse)喷洒，并且将阳性植物用对应于6fl.oz/英亩比率的草甘膦喷洒。将处理的植物保持在12h光照/12h黑暗条件下的温室中。物种#1-8的处理后22天采集的植物毒性数据以及物种#9-12的处理后12天采集的植物毒性数据分别如表5和6所示。这两个表的评定量表如表4所示：
[0288] 表4.评定量表
[0289]评定量表 ％控制
0 0
1 ＜10
2 25
3 50
4 75
5 100
0 0
1 ＜10
2 25
3 50
4 75
5 100
[0290] 表5.物种#1-8的植物毒性数据
[0291]处理 小蓬草 藜 蒲公英 皱叶酸模马唐 芥菜 龙葵 早熟禾
UTC 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.7 0.0 0.0
1.25mg/mL 0.0 4.7 0.0 0.0 0.0 4.3 0.0 0.0
2.5mg/mL 0.7 4.5 0.0 0.0 0.0 4.7 0.0 0.0
5.0mg/mL 4.3 5.0 0.0 0.0 0.0 5.0 0.0 0.0
10.0mg/mL 4.7 5.0 0.0 0.0* 0.0 5.0 1.5 0.0
草甘膦 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
UTC 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.7 0.0 0.0
1.25mg/mL 0.0 4.7 0.0 0.0 0.0 4.3 0.0 0.0
2.5mg/mL 0.7 4.5 0.0 0.0 0.0 4.7 0.0 0.0
5.0mg/mL 4.3 5.0 0.0 0.0 0.0 5.0 0.0 0.0
10.0mg/mL 4.7 5.0 0.0 0.0* 0.0 5.0 1.5 0.0
草甘膦 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
[0292] *植物中导致的矮化约为未处理的植物大小的一半
[0293] 表6.物种#9-12的植物毒性数据
[0294]处理 苍耳 狐尾草 狗牙根 苦苣菜 锦葵
UTC 0.0 0.7 0.0 0.0 2.8
1.25mg/mL 0.5 0.3 0.3 0.0 2.0
2.5mg/mL 0.5 0.7 0.5 0.0 2.7
5.0mg/mL 0.8 0.3 0.2 0.0 2.2
10.0mg/mL 0.7 0.7 0.3 0.2 1.7
草甘膦 4.7 4.8 4.7 5.0 5.0
UTC 0.0 0.7 0.0 0.0 2.8
1.25mg/mL 0.5 0.3 0.3 0.0 2.0
2.5mg/mL 0.5 0.7 0.5 0.0 2.7
5.0mg/mL 0.8 0.3 0.2 0.0 2.2
10.0mg/mL 0.7 0.7 0.3 0.2 1.7
草甘膦 4.7 4.8 4.7 5.0 5.0
[0295] 基于这些研究中获得的结果，测试提取自分离的伯克霍尔德氏菌物种的发酵培养液的、具有针对几种杂草物种的除草活性的化合物。在测试的12个物种中，藜和芥菜最敏感，然后是锦葵和小蓬草。低达1.25mg/mL的提取物浓度能够提供藜和芥菜的几乎完全的控制，而锦葵和小蓬草则需要更高的浓度。
[0296] 在另一实验中，利用如上文所述相同的设计测试全身活性。将10mg/ml的伯克霍尔德氏菌A396的粗提取物上清涂在豚草、芥菜、龙葵、马唐、小麦和稗草的第一片真叶上。处理后7天评价幼苗。观察的症状包括：枯萎、翘曲、变白。在豚草、芥菜和龙葵的处理的叶上的后一片叶中观察到除草活性。在测试的草中未观察到全身活性。在第二实验中，利用如上文所述相同的实验设计评价相同粗提取物的5个部分(10mg/ml)。处理芥菜、小麦和马唐的幼苗。处理后7天和20天，从利用C-18柱(Phenomenex Sepra C18-E,50μm, )
的5个部分中的4个(091113B4F6、091113B4F7、091113B4F8和091113B4F9)在芥菜中观察到除草活性的症状。在处理的叶上的后一片叶中观察到症状。在测试的草中未观察到全身活性。
的5个部分中的4个(091113B4F6、091113B4F7、091113B4F8和091113B4F9)在芥菜中观察到除草活性的症状。在处理的叶上的后一片叶中观察到症状。在测试的草中未观察到全身活性。
[0297] 3.实施例3.作为杀虫剂的伯克霍尔德氏菌
[0298] 3.1.接触活性研究
[0299] 以下测定用于初步筛选阶段以确定源自新的伯克霍尔德氏菌物种的培养物的化合物是否具有针对鳞翅目有害生物(幼虫)的接触活性。其进一步用作活性追踪分离(bioassay-guided fractionation)的工具以确定源自全细胞培养液提取物的活性部分和峰。该测试在单独的1.25oz塑料杯中利用粉纹夜蛾(Tricoplusia ni)晚期第三龄幼虫或甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)早期第三龄幼虫进行。将1cm x 1cm片的固体甜菜夜蛾饲料与一只幼虫一起放置在每个杯的中间。利用Hamilton精密注射器将1μl等份的每种处理(来自5日龄伯克霍尔德氏菌A396培养物的全细胞培养液或提取物)注射在每只幼虫的胸部(背侧)上。每种处理重复10次。水用作阴性对照处理，并且马拉硫磷用作阳性对照处理。注射之后，将每个杯用具有气孔的石蜡膜(parafilm)覆盖，并且将杯在26℃下温育3天。处理后24小时开始，每天进行死亡率评价。
[0300] 图4和5示出接触活性测试的结果。根据该结果，来自伯克霍尔德氏菌培养物的过滤灭菌培养液在3天内杀死所有测试昆虫的约40％。稀释的培养液(50％)具有较低活性，在测试的两种昆虫中导致约10％的控制。
[0301] 3.2.通过喂养的针对幼虫的活性
[0302] 测试通过喂养的直接毒性，利用饲料覆盖测试，按照使用微量滴定板的96-孔板测定形式，每孔中有200μl固体的人工甜菜夜蛾饲料。将一百(100)微升的各测试样品滴在饲料的顶部(每孔中一种样品)，并且使样品在流动空气下干燥直至表面干燥。将每种样品(通过0.2微米滤器过滤灭菌)重复6次测试，并且将水和商业Bt(苏云金芽孢杆菌)产品分别用作阴性和阳性对照。每个孔中放置一只测试昆虫(粉纹夜蛾-Trichoplusia ni；甜菜夜蛾-Spodoptera exiqua；小菜蛾-Plutella xylostella)的第三龄幼虫，并且将板用具有气孔的塑料盖覆盖。将具有昆虫的平板在26℃下温育6天，每天评价死亡率。
[0303] 图5示出来自饲料覆盖研究的数据，其中在四个不同培养液浓度：1x(100％)、1/4x(25％)、1/8x(12.5％)、1/16x(6.125％)下测试甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)早期第三龄幼虫。数据显示未稀释的过滤灭菌的培养液能够在7天温育期结束时产生100％控制。培养液的4倍稀释获得相似的控制，并且在研究结束时，未稀释和4倍稀释的培养液均与用作阳性对照的Bt相当。然而，Bt的效果显著快于伯克霍尔德氏菌培养液的效果。针对夜蛾幼虫的效力依赖于培养液浓度，并且两个最低的培养液浓度(12.5％和6.125％)提供比两个最高的培养液浓度少的控制。然而，12.5％稀释液的性能并不比25％稀释液低很多。
培养液的16倍稀释显然不够有效，并且在这个7天研究中仅提供夜蛾幼虫的部分(33％)控制。用于粉纹夜蛾和小菜蛾幼虫的相同培养液稀释液的相应死亡率略高，6.125％培养液分别杀死80％和50％的幼虫。
培养液的16倍稀释显然不够有效，并且在这个7天研究中仅提供夜蛾幼虫的部分(33％)控制。用于粉纹夜蛾和小菜蛾幼虫的相同培养液稀释液的相应死亡率略高，6.125％培养液分别杀死80％和50％的幼虫。
[0304] 3.3.针对吸吮性昆虫的体外活性
[0305] 将5只椿象(Euschistus sp.)成虫放置在用一片纸巾内衬的各16oz塑料容器中。将包含2mL的各测试样品(过滤灭菌的全培养液)的离心管用棉球塞住，并且放倒(laid down)在塑料容器的底部上。将一颗葵花籽放置在管旁作为诱饵。水以及推荐比例的除虫菊酯与PBO的混合物的商业产品分别用作阴性和阳性对照。将每个容器用盖子盖上，并且将它们在25℃下温育7天，每天检测死亡率。
[0306] 结果在下文表7中示出，并且它们显示在这个体外系统中用50％稀释的培养液，到第7天时对吸吮性昆虫(椿象)约80％的控制。在这个研究中，伯克霍尔德氏菌A396稀释的发酵培养液在控制椿象中比用作阳性对照的商业产品更有效。有趣的是，未稀释的培养液导致较低的昆虫控制，这可能是这种伯克霍尔德氏菌的新物种产生的活性次生代谢物的拒食(摄食抑制)特性的指征。
[0307] 表7.A396对椿象的效果
[0308]
[0309] 4.实施例4.体内的吸吮性昆虫测试
[0310] 在植物测定中测试过滤的全细胞培养液的体内效力，使用芥菜植物，并且将桃蚜(Myzus persicae)用作测试昆虫。利用Paasche喷枪，用两种不同浓度(1x和0.5x)的过滤灭菌的伯克霍尔德氏菌的全细胞培养液喷洒约1月龄的佛罗里达阔叶芥菜(Brassica sp.)植物。水和阿维菌素(Avid)的商业产品分别用作阴性和阳性对照。使植物在台面上干燥，然后将它们放置在有盖(具有气孔)的6-杯塑料容器中。将10只不同发育阶段的蚜虫放置在每株测试植物上，并且将植物在生长灯和25℃下温育7天。每天进行每株植物上的蚜虫数量的评价(总结于下文表8中)并在笔记本中记录。
[0311] 表8.A396对桃蚜的体内效力
[0312]
[0313] 根据结果，源自伯克霍尔德氏菌的新物种的培养物的过滤灭菌的培养液的两种浓度均能够控制吸吮性昆虫桃蚜(M.persicae)的群体生长。
[0314] 5.实施例5杀线虫活性
[0315] 5.1研究#1
[0316] 为了评价过滤灭菌的伯克霍尔德氏菌A396培养液对幼年(J2)根结线虫(Meloidogyne incognita VW6)的活动力(以及随后的恢复)的影响，在24-孔塑料细胞培养板上进行以下测试：
[0317] 将300-ul等份的每种测试溶液(1x或0.5x过滤灭菌的培养液)加入适当的孔，然后将分配于10μl的DI水中的15只线虫加入每个孔，将板用盖子盖上，并且在25℃下温育24小时。水和20,000x稀释的Avid分别用作阴性和阳性对照。24小时后通过用针探测每只线虫来检查每种化合物对线虫活动力的影响，并且将每个处理中不动的线虫的比例以％标度记录在笔记本中。为了评价每种处理中活动力的恢复，从每个孔移除200μl的体积，并且通过加入2mL的DI水来稀释每个孔中的剩余溶液。将平板如上文所述再温育24小时，然后进行第二次活动力评价。
[0318] 图6所示的结果显示两种测试浓度的过滤灭菌的培养液均可以固定自由生活的幼年根结线虫。这种效果持续至少24小时，这表明伯克霍尔德氏菌A396培养液可以用来防止植物的线虫感染。
[0319] 5.2研究#2
[0320] 材料和方法
[0321] 小型雨淋(Drench)测试：在45ml盆中进行的温室测定中测试伯克霍尔德氏菌A396全细胞培养液。将黄瓜种子cv.Toshka直接播种在装有砂壤土的盆中。10天后，将盆各自用5ml悬浮液处理。使用的具体量如表9所示：
[0322] 表9
[0323]
[0324] 如表9所示，将盆用根结线虫(M.incognita)的3000个卵接种。每种处理和比例准备4个重复。试验施用和接种后14天收获试验。根据Zeck虫瘿指数(Zeck,1971)评价根瘿(root galling)。植物毒性测量为与对照相比的根瘿减少。结果如图9和10所示。
[0325] 在1号小型雨淋测试中(参见图9)，处理的活性非常高，并且当以100ml/L伯克霍尔德氏菌A396的浓度施用时观察到几乎100％的减少。噻唑磷表现照常(在20ppm下100％控制)。
[0326] 在2号小型雨淋测试中(参见图10)，在100ml/L的最高浓度下实现根瘿的100％减少，在1.5ml/L下降至约50％。噻唑磷表现照常(在20ppm下100％控制)。
[0327] 5.3研究#3
[0328] 为了证实伯克霍尔德氏菌A396的杀线虫活性，进行对黄瓜(Cucumis sativus)的温室研究，利用伯克霍尔德氏菌A396的全细胞培养液作为测试产物以控制根结线虫(Meloidogyne incognita)。将一株黄瓜植物/盆种植在土壤中，并且使其在人工光照和28℃下于温室中生长。将具有一株植物的各盆用等份(约80mL)的未稀释的测试产物或用水稀释至5％的测试产物处理。每个伯克霍尔德氏菌A396处理以及Temik(以标记比率)的阳性对照处理和无添加的阴性对照由5个重复组成。使植物在温室中生长60天，然后将每株植物收获并评价新鲜枝重和根重。记录每个盆中线虫卵的数量，并且计算表明每克根质量的卵数量的参数。进行统计学分析(ANOVA)，计算p<0.1的处理平均值之间的统计学差异。下文表10所示的数据显示，虽然与未处理的对照没有统计学差异，但是用A396全细胞培养液处理的盆包含比未处理的对照盆更少的线虫卵。当未稀释的培养液用作处理时，计算为每个根质量的卵数量的效果更明显。
[0329] 表10.A396全细胞培养液对黄瓜枝重和根重、每盆的根结线虫(M.incognita)卵总数量以及每克根质量的卵数量的影响。
[0330]
[0331] 6.实施例6Templazole A和Templazole B的分离
[0332] 材料和方法
[0333] 以下方法用于纯化从伯克霍尔德氏菌的细胞培养物提取的Templazole A和TemplazoleB(见图7)：
[0334] 通过在室温下将细胞悬浮液与树脂以225rpm振荡2小时来用Amberlite XAD-7树脂(Asolkar et al.,2006)提取源自10-L伯克霍尔德氏菌(A396)在Hy大豆(soy)生长培养基中发酵的培养液。通过粗棉布(cheesecloth)过滤来收集树脂与细胞物质，并用DI水洗涤以除去盐。然后将树脂、细胞物质和粗棉布在丙酮中浸泡2h，然后将丙酮过滤并利用旋转蒸发仪真空干燥以获得粗提取物。然后将粗提取物利用反相C18真空液相色谱(H2O/CH3OH；梯度90:20-0:100％)分级分离以获得10个部分。然后将这些部分利用旋转蒸发仪浓缩至干燥，并将所得的干燥残留物利用96孔板莴苣接种(lettuce seeding)测定来筛选生物学活性。然后将活性部分进行反相HPLC(Spectra System P4000(Thermo Scientific)以获得纯化合物，然后将其在上述生物测定中筛选以定位/鉴定活性化合物。为了证实化合物的性质，记录额外的光谱数据，如LC/MS和NMR。
[0335] 利用HPLC C-18柱(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100A,250x 30)，水：乙腈梯度溶剂系统(0-10min；80％CH3CN水溶液,10-25min；80-65％CH3CN水溶液,25-50min；65-50 ％ CH3CN 水 溶 液 ,50-60min；50-70 ％ CH3CN,60-80min；70–0 ％ CH3CN 水 溶液,80-85min；0–20％CH3CN水溶液)，以8mL/min的流速和210nm的UV检测，进一
步纯化活性部分4以获得templazole B，保留时间为46.65min。还利用HPLC C-18
柱(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100A,250x 30)，水：乙腈梯度溶剂系统(0-10min；
80％CH3CN水溶液,10-25min；80-60％CH3CN水溶液,25-50min；60-40％CH3CN水溶
液,50-60min；40％CH3CN,60-80min；40–0％CH3CN水溶液,80-85min；0-20％CH3CN水溶液)，以8mL/min的流速和210nm的UV检测，纯化其他活性部分6以获得templazole A，保留时间为70.82min。
步纯化活性部分4以获得templazole B，保留时间为46.65min。还利用HPLC C-18
柱(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100A,250x 30)，水：乙腈梯度溶剂系统(0-10min；
80％CH3CN水溶液,10-25min；80-60％CH3CN水溶液,25-50min；60-40％CH3CN水溶
液,50-60min；40％CH3CN,60-80min；40–0％CH3CN水溶液,80-85min；0-20％CH3CN水溶液)，以8mL/min的流速和210nm的UV检测，纯化其他活性部分6以获得templazole A，保留时间为70.82min。
[0336] 在LCQ DECA XPplus质谱仪(Thermo Electron Corp.,San Jose,CA)上，利用全扫描模式的正和负电离模式(m/z 100-1500Da)，在Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus电喷射(ESI)装置上，进行纯化合物的质谱分析。热高效液相色谱(HPLC)装置配有Finnigan Surveyor PDA plus检测器、自动进样器plus、MS泵和4.6mm x 100mm Luna C185μm柱(Phenomenex)。溶剂系统由水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成。流动相以10％溶剂B开始，在20min内线性增加至100％溶剂B，并保持4min，最后在3min内返回10％溶剂B，并保持3min。流速为0.5mL/min。进样体积为10μL，并且在室温下将样品保持在自动进样器中。
利用LC和反相色谱，通过LC-MS来分析化合物。本发明的化合物的质谱分析在如下条件下进行：对于夹套气(sheath)和辅助/吹扫气(aux/sweep)流速，氮气的流速分别固定为30和15arb。电喷射电离用设定为5000V的喷射电压和35.0V的毛细管电压进行。毛细管温度设定为400℃。数据用Xcalibur软件分析。活性化合物templazole A的分子量为298，并且在负电离模式中表现出297.34的m/z离子。templazole B的LC-MS色谱表明258的分子量，并且在负电离模式中表现出257.74的m/z离子。
利用LC和反相色谱，通过LC-MS来分析化合物。本发明的化合物的质谱分析在如下条件下进行：对于夹套气(sheath)和辅助/吹扫气(aux/sweep)流速，氮气的流速分别固定为30和15arb。电喷射电离用设定为5000V的喷射电压和35.0V的毛细管电压进行。毛细管温度设定为400℃。数据用Xcalibur软件分析。活性化合物templazole A的分子量为298，并且在负电离模式中表现出297.34的m/z离子。templazole B的LC-MS色谱表明258的分子量，并且在负电离模式中表现出257.74的m/z离子。
[0338] 对于templazole A的结构鉴定，将分子量为298的纯化合物利用500MHz NMR装1
置进一步分析，其 H NMRδ值为8.44,8.74,8.19,7.47,7.31,3.98,2.82,2.33,1.08，并且
13
C NMRδ值为163.7,161.2,154.8,136.1,129.4,125.4,123.5,123.3,121.8,121.5,111.
8,104.7,52.2,37.3,28.1,22.7,22.7。Templazole A的UV吸收带为226、275、327nm，这表
1 13 +
明存在吲哚和噁唑环。通过 H、C NMR和HRESI MS数据m/z 299.1396(M+H)的解读确定的分子式为C17H18N2O3(计算值C17H19N2O3,299.1397)，这产生10个双键等同物所显示的高度
13
不饱和。 C NMR谱揭示所有17个碳的信号，包括2个甲基、甲氧基、亚甲基碳、脂肪族次甲
1 1
基、酯羰基以及11个芳香族碳。由 H-H COSY和HMBC谱数据揭示存在3’-未取代的吲哚。
1 1 1 1 13
H-H COSY和HMBC还表明存在羧酸甲酯基团和-CH2-CH-(CH3)2侧链。从 H-H COSY、C和HMBC数据的详细分析可知，该化合物包含噁唑核心。从2D分析发现，异丁基侧链连接在C-2位置，羧酸甲酯连接在C-4位置，并且吲哚单元连接在C-5位置以给出templazole A。
置进一步分析，其 H NMRδ值为8.44,8.74,8.19,7.47,7.31,3.98,2.82,2.33,1.08，并且
13
C NMRδ值为163.7,161.2,154.8,136.1,129.4,125.4,123.5,123.3,121.8,121.5,111.
8,104.7,52.2,37.3,28.1,22.7,22.7。Templazole A的UV吸收带为226、275、327nm，这表
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明存在吲哚和噁唑环。通过 H、C NMR和HRESI MS数据m/z 299.1396(M+H)的解读确定的分子式为C17H18N2O3(计算值C17H19N2O3,299.1397)，这产生10个双键等同物所显示的高度
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不饱和。 C NMR谱揭示所有17个碳的信号，包括2个甲基、甲氧基、亚甲基碳、脂肪族次甲
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基、酯羰基以及11个芳香族碳。由 H-H COSY和HMBC谱数据揭示存在3’-未取代的吲哚。
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H-H COSY和HMBC还表明存在羧酸甲酯基团和-CH2-CH-(CH3)2侧链。从 H-H COSY、C和HMBC数据的详细分析可知，该化合物包含噁唑核心。从2D分析发现，异丁基侧链连接在C-2位置，羧酸甲酯连接在C-4位置，并且吲哚单元连接在C-5位置以给出templazole A。
[0339] 第二种除草活性化合物templazole B的分子量为258，其利用500MHz NMR装置1 13
进一步分析，其 H NMRδ值为7.08,7.06,6.75,3.75,2.56,2.15,0.93,0.93，并且 C NMR值 为 δ158.2,156.3,155.5,132.6,129.5,129.5,127.3,121.8,115.2,115.2,41.2,35.3
1 13 13
,26.7,21.5,21.5。通过 H、C NMR和质量数据的解读确定的分子式指定为C15H18N2O2。 C NMR谱揭示所有15个碳的信号，包括2个甲基、2个亚甲基碳、1个脂肪族次甲基、1个酰胺
1 13
羰基以及9个芳香族碳。从 H和 C NMR谱推断的结构的一般特征显示对位取代的芳香环[δ7.08(2H,d,J＝8.8Hz),6.75(2H,d,J＝8.8Hz)和132.7,129.5,115.2,127.3,115.
1 1 1
2,129.5]。这种结构的 H NMR谱以及 H-H COSY和HSQC谱显示了异丁基部分的特征信号[δ0.93(6H,d,J＝6.9Hz),2.15(1H,sept.,J＝6.9Hz),2.57(2H,d,J＝6.9Hz)。此外，在
1 13
H和 C NMR谱中还发现了(δ7.06,s)的烯烃/芳香族质子以及羰基碳基团(δ158.9)。
检查HMBC谱时，异丁基部分中的H-1’信号与烯烃碳(C-2,δ156.3)相关，并且烯烃质子H-4与(C-5,δ155.5；C-2,156.3&C-1”,41.2)相关。δ3.75的亚甲基与对位取代的芳香族部分的C-5、C-4以及C-2”相关。所有这些观察到的相关性表明所示的结构骨架的异丁基和对位取代的苄基部分之间的连接。此外，基于H-4”&H-6”位置的芳香族质子的HMBC相关性，羧酰胺基团分配在苄基部分的对位。因此，基于以上数据，结构指定为templazole B。
进一步分析，其 H NMRδ值为7.08,7.06,6.75,3.75,2.56,2.15,0.93,0.93，并且 C NMR值 为 δ158.2,156.3,155.5,132.6,129.5,129.5,127.3,121.8,115.2,115.2,41.2,35.3
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,26.7,21.5,21.5。通过 H、C NMR和质量数据的解读确定的分子式指定为C15H18N2O2。 C NMR谱揭示所有15个碳的信号，包括2个甲基、2个亚甲基碳、1个脂肪族次甲基、1个酰胺
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羰基以及9个芳香族碳。从 H和 C NMR谱推断的结构的一般特征显示对位取代的芳香环[δ7.08(2H,d,J＝8.8Hz),6.75(2H,d,J＝8.8Hz)和132.7,129.5,115.2,127.3,115.
1 1 1
2,129.5]。这种结构的 H NMR谱以及 H-H COSY和HSQC谱显示了异丁基部分的特征信号[δ0.93(6H,d,J＝6.9Hz),2.15(1H,sept.,J＝6.9Hz),2.57(2H,d,J＝6.9Hz)。此外，在
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H和 C NMR谱中还发现了(δ7.06,s)的烯烃/芳香族质子以及羰基碳基团(δ158.9)。
检查HMBC谱时，异丁基部分中的H-1’信号与烯烃碳(C-2,δ156.3)相关，并且烯烃质子H-4与(C-5,δ155.5；C-2,156.3&C-1”,41.2)相关。δ3.75的亚甲基与对位取代的芳香族部分的C-5、C-4以及C-2”相关。所有这些观察到的相关性表明所示的结构骨架的异丁基和对位取代的苄基部分之间的连接。此外，基于H-4”&H-6”位置的芳香族质子的HMBC相关性，羧酰胺基团分配在苄基部分的对位。因此，基于以上数据，结构指定为templazole B。
[0340] 7.实施例7FR90128的分离
[0341] 通过在室温下将细胞悬浮液与树脂以225rpm振荡2小时来用Amberlite XAD-7树脂(Asolkar et al.,2006)提取伯克霍尔德氏菌在未确定的生长培养基中发酵的全细胞培养液。通过粗棉布过滤来收集树脂与细胞物质，并用DI水洗涤以除去盐。然后将树脂、细胞物质和粗棉布在丙酮中浸泡2h，然后将丙酮过滤并利用旋转蒸发仪真空干燥以获得粗提取物。然后将粗提取物利用反相C18真空液相色谱(H2O/CH3OH；梯度90:20-0:100％)分级分离以获得10个部分。然后将这些部分利用旋转蒸发仪浓缩至干燥，并将所得的干燥残留物利用昆虫生物测定以及除草生物测定来筛选生物学活性。然后将活性部分进行反相/正相HPLC(Spectra System P4000；Thermo Scientific)以获得纯化合物，然后将其在下述除草、杀虫和杀线虫生物测定中筛选以定位/鉴定活性化合物。为了证实化合物的性质，记录额外的光谱数据，如LC/MS和NMR。
[0342] 在LCQ DECA XPplus质谱仪(Thermo Electron Corp.,San Jose,CA)上，利用全扫描模式的正和负电离模式(m/z 100-1500Da)，在Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus电喷射(ESI)装置上，进行活性峰的质谱分析。热高效液相色谱(HPLC)装置配有Finnigan Surveyor PDA plus检测器、自动进样器plus、MS泵和4.6mm x 100mm Luna C185μm柱(Phenomenex)。溶剂系统由水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成。流动相以10％溶剂B开始，在20min内线性增加至100％溶剂B，并保持4min，最后在3min内返回10％溶剂B，并保持3min。流速为0.5mL/min。进样体积为10μL，并且在室温下将样品保持在自动进样器中。
利用LC和反相色谱，通过LC-MS来分析化合物。本发明的化合物的质谱分析在如下条件下进行：对于夹套气和辅助/吹扫气流速，氮气的流速分别固定为30和15arb。电喷射电离用设定为5000V的喷射电压和35.0V的毛细管电压进行。毛细管温度设定为400℃。数据用Xcalibur软件分析。基于LC-MS分析，部分5的活性杀虫化合物负电离模式中的分子量为540。
利用LC和反相色谱，通过LC-MS来分析化合物。本发明的化合物的质谱分析在如下条件下进行：对于夹套气和辅助/吹扫气流速，氮气的流速分别固定为30和15arb。电喷射电离用设定为5000V的喷射电压和35.0V的毛细管电压进行。毛细管温度设定为400℃。数据用Xcalibur软件分析。基于LC-MS分析，部分5的活性杀虫化合物负电离模式中的分子量为540。
[0343] 对于结构鉴定，将分子量540的部分5的纯杀虫化合物利用500MHz NMR装置进行1
进一步分析，其 H NMR值为6.22,5.81,5.69,5.66,5.65,4.64,4.31,3.93,3.22,3.21,3.15
13
,3.10,2.69,2.62,2.26,2.23.1.74,1.15,1.12,1.05,1.02；并且 C NMR值为172.99,172.
93,169.57,169.23,167.59,130.74,130.12,129.93,128.32,73.49,62.95,59.42,57.73,3
8.39,38.00,35.49,30.90,30.36,29.26,18.59,18.38,18.09,17.93,12.51。NMR数据表明该化合物包含氨基、酯、羧酸、脂肪族甲基、乙基、亚甲基、氧化亚甲基(oxymethylene)、次甲基、氧化次甲基(oxymethine)和硫基团。详细的1D和2D NMR分析证实化合物FR90128的结构为已知化合物。
进一步分析，其 H NMR值为6.22,5.81,5.69,5.66,5.65,4.64,4.31,3.93,3.22,3.21,3.15
13
,3.10,2.69,2.62,2.26,2.23.1.74,1.15,1.12,1.05,1.02；并且 C NMR值为172.99,172.
93,169.57,169.23,167.59,130.74,130.12,129.93,128.32,73.49,62.95,59.42,57.73,3
8.39,38.00,35.49,30.90,30.36,29.26,18.59,18.38,18.09,17.93,12.51。NMR数据表明该化合物包含氨基、酯、羧酸、脂肪族甲基、乙基、亚甲基、氧化亚甲基(oxymethylene)、次甲基、氧化次甲基(oxymethine)和硫基团。详细的1D和2D NMR分析证实化合物FR90128的结构为已知化合物。
[0344] 8.实施例8FR90128的除草活性
[0345] 在实验室测定中，利用96孔板平台中的一周龄的稗草幼苗测试活性化合物FR90128(MW 540)的除草活性。将一株草幼苗置于包含99微升DI水的每个孔中。将1微升等份的乙醇中的纯化合物(10mg/mL)加入每孔，并将平板用盖子密封。将99微升水中的
1微升乙醇用作阴性对照。处理重复进行8次，并将密封的平板于人工光照(12hr光照/黑暗循环)下在温室中温育。5天后读取结果。接受活性化合物的所有8个孔中的草幼苗均死亡，没有绿色组织留下，而阴性对照孔中的幼苗则生长活跃。
1微升乙醇用作阴性对照。处理重复进行8次，并将密封的平板于人工光照(12hr光照/黑暗循环)下在温室中温育。5天后读取结果。接受活性化合物的所有8个孔中的草幼苗均死亡，没有绿色组织留下，而阴性对照孔中的幼苗则生长活跃。
[0346] 9.实施例9FR90128的杀虫活性
[0347] 在实验室测定中，利用接触生物测定系统测试活性化合物FR90128(MW 540)的杀虫活性。将化合物溶于100％乙醇，浓度为0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25和rd 20.5μg/μL。将单独的早期3 龄甜菜夜蛾幼虫置于具有1cm 片的人工饲料(Bio-Serv)的1.25盎司塑料杯中。用Hamilton微量移液管将1μL的化合物施用至每个幼虫的胸部。
将杯子用拉伸的石蜡膜覆盖，并在石蜡膜上剪开一个孔以通气。每个浓度处理10只幼虫。
测定在25℃，12h光照/12h黑暗下进行。将幼虫在施用后48和72小时后评分。进行概率单位(Probit)分析以评价LC50值，对于化合物(MW 540)为0.213。
将杯子用拉伸的石蜡膜覆盖，并在石蜡膜上剪开一个孔以通气。每个浓度处理10只幼虫。
测定在25℃，12h光照/12h黑暗下进行。将幼虫在施用后48和72小时后评分。进行概率单位(Probit)分析以评价LC50值，对于化合物(MW 540)为0.213。
[0348] 10.实施例10Templamide A、Templamide B、FR901465和FR90128的分离
[0349] 材料和方法
[0350] 以下方法用于纯化从伯克霍尔德氏菌的细胞培养物提取的化合物(见图7)：
[0351] 通过在室温下将细胞悬浮液与树脂以225rpm振荡2小时来用Amberlite XAD-7树脂(Asolkar et al.,2006)提取源自10-L伯克霍尔德氏菌(A396)在Hy大豆生长培养基中发酵的培养液。通过粗棉布过滤来收集树脂与细胞物质，并用DI水洗涤以除去盐。然后将树脂、细胞物质和粗棉布在丙酮中浸泡2h，然后将丙酮过滤并利用旋转蒸发仪真空干燥以获得粗提取物。然后将粗提取物利用反相C18真空液相色谱(H2O/CH3OH；梯度
90:20-0:100％)分级分离以获得10个部分。然后将这些部分利用旋转蒸发仪浓缩至干燥，rd
并将所得的干燥残留物利用96孔板莴苣接种(除草)和早期3 龄甜菜夜蛾(杀虫)测定来筛选生物学活性。然后将活性部分反复进行反相HPLC分离(Spectra System P4000(Thermo Scientific)以获得纯化合物，然后将其在上述生物测定中筛选以定位/鉴定活性化合物。
为了证实化合物的性质，记录额外的光谱数据，如LC/MS、HRMS和NMR。
90:20-0:100％)分级分离以获得10个部分。然后将这些部分利用旋转蒸发仪浓缩至干燥，rd
并将所得的干燥残留物利用96孔板莴苣接种(除草)和早期3 龄甜菜夜蛾(杀虫)测定来筛选生物学活性。然后将活性部分反复进行反相HPLC分离(Spectra System P4000(Thermo Scientific)以获得纯化合物，然后将其在上述生物测定中筛选以定位/鉴定活性化合物。
为了证实化合物的性质，记录额外的光谱数据，如LC/MS、HRMS和NMR。
[0352] 利用HPLC C-18柱(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100A,250x 30)，水：乙腈梯度溶剂系统(0-10min；80％CH3CN水溶液,10-25min；80-65％CH3CN水溶液,25-50min；65-50％CH3CN水溶液,50-60min；50-70％CH3CN水溶液,60-80min；70-0％CH3CN水溶液,80-85min；0-20％CH3CN水溶液)，以8mL/min的流速和210nm的UV检测，将活性部分
5进一步纯化以分别获得templamide A(保留时间为55.64min)和FR901465(保留时间为
63.59min)以及FR90128(保留时间为66.65min)。还利用HPLC C-18柱(Phenomenex,Luna
10u C18(2)100A,250x 30)，水：乙腈梯度溶剂系统(0-10min；70-60％CH3CN水溶
液,10-20min；60-40％CH3CN水溶液,20-50min；40-15％CH3CN水溶液,50-75min；15-0％CH3CN,75-85min；0–70％CH3CN水溶液)，以8mL/min的流速和210nm的UV检测，纯化其他活性部分6以获得templamide B，保留时间为38.55min。
5进一步纯化以分别获得templamide A(保留时间为55.64min)和FR901465(保留时间为
63.59min)以及FR90128(保留时间为66.65min)。还利用HPLC C-18柱(Phenomenex,Luna
10u C18(2)100A,250x 30)，水：乙腈梯度溶剂系统(0-10min；70-60％CH3CN水溶
液,10-20min；60-40％CH3CN水溶液,20-50min；40-15％CH3CN水溶液,50-75min；15-0％CH3CN,75-85min；0–70％CH3CN水溶液)，以8mL/min的流速和210nm的UV检测，纯化其他活性部分6以获得templamide B，保留时间为38.55min。
[0353] 在LCQ DECA XPplus质谱仪(Thermo Electron Corp.,San Jose,CA)上，利用全扫描模式的正和负电离模式(m/z 100-1500Da)，在Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus电喷射(ESI)装置上，进行纯化合物的质谱分析。使用热高效液相色谱(HPLC)装置，配有Finnigan Surveyor PDA plus检测器、自动进样器plus、MS泵和4.6mm x 100mm Luna C18 5μm柱(Phenomenex)。溶剂系统由水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成。流动相以10％溶剂B开始，在20min内线性增加至100％溶剂B，并保持4min，最后在3min内返回10％溶剂B，并保持3min。流速为0.5mL/min。进样体积为10μL，并且在室温下将样品保持在自动进样器中。用LC和反相色谱，通过LC-MS来分析化合物。本发明的化合物的质谱分析在如下条件下进行：对于夹套气和辅助/吹扫气流速，氮气的流速分别固定为30和15arb。电喷射电离用设定为5000V的喷射电压和45.0V的毛细管电压进行。毛细管温度设定为300℃。数+ +
据用Xcalibur软件分析。基于正电离模式的556.41[M+H]和578.34[M+Na] 的m/z峰，活+ +
性化合物templamide A的分子量为555。基于538.47[M+H]和560.65[M+Na] 的m/z离
子，templamide B的正模式电离的LC-MS分析表明分子量为537。基于LCMS分析，化合物FR901465和FR90128的分子量分别指定为523和540。
据用Xcalibur软件分析。基于正电离模式的556.41[M+H]和578.34[M+Na] 的m/z峰，活+ +
性化合物templamide A的分子量为555。基于538.47[M+H]和560.65[M+Na] 的m/z离
子，templamide B的正模式电离的LC-MS分析表明分子量为537。基于LCMS分析，化合物FR901465和FR90128的分子量分别指定为523和540。
[0354] 1H、13C和2D NMR谱在Bruker 600MHz梯度场分光计中测量。在内标四甲基硅烷上设定参照(TMS,0.00ppm)。
[0355] 对于templamide A的结构鉴定，将分子量为555的纯化的化合物利用600MHz NMR1
装置进一步分析，其 H NMRδ值为6.40,6.39,6.00,5.97,5.67,5.54,4.33,3.77,3.73,3.
70,3.59,3.47,3.41,2.44,2.35,2.26,1.97,1.81,1.76,1.42,1.37,1.16,1.12,1.04，并且
13
C NMR值为δ173.92,166.06,145.06,138.76,135.71,129.99,126.20,123.35,99.75,82.20,78.22,76.69,71.23,70.79,70.48,69.84,60.98,48.84,36.89,33.09,30.63,28.55,2
13
5.88,20.37,18.11,14.90,12.81,9.41。 C NMR谱表现出28个离散的碳信号，其归因于6
2 1 13
个甲基、4个亚甲基碳和13个次甲基，包括5个sp，4个季碳。通过 H、C NMR和HRESI MS
1 1
数据的解读确定的分子式为C28H45NO10。H-H COSY、HMBC和HMQC谱数据的详细分析揭示以下亚结构(I-IV)以及2个分离的亚甲基和单峰(singlet)甲基。这些亚结构随后利用关键HMBC相关性连接以获得化合物的平面结构，其尚未在文献中报导，并指定为templamide A。这种聚酮分子包含2个四氢吡喃糖环和1个共轭的酰胺。
装置进一步分析，其 H NMRδ值为6.40,6.39,6.00,5.97,5.67,5.54,4.33,3.77,3.73,3.
70,3.59,3.47,3.41,2.44,2.35,2.26,1.97,1.81,1.76,1.42,1.37,1.16,1.12,1.04，并且
13
C NMR值为δ173.92,166.06,145.06,138.76,135.71,129.99,126.20,123.35,99.75,82.20,78.22,76.69,71.23,70.79,70.48,69.84,60.98,48.84,36.89,33.09,30.63,28.55,2
13
5.88,20.37,18.11,14.90,12.81,9.41。 C NMR谱表现出28个离散的碳信号，其归因于6
2 1 13
个甲基、4个亚甲基碳和13个次甲基，包括5个sp，4个季碳。通过 H、C NMR和HRESI MS
1 1
数据的解读确定的分子式为C28H45NO10。H-H COSY、HMBC和HMQC谱数据的详细分析揭示以下亚结构(I-IV)以及2个分离的亚甲基和单峰(singlet)甲基。这些亚结构随后利用关键HMBC相关性连接以获得化合物的平面结构，其尚未在文献中报导，并指定为templamide A。这种聚酮分子包含2个四氢吡喃糖环和1个共轭的酰胺。
[0356]
[0357] 亚结构I-IV通过分析1D&2D NMR光谱数据来指定。
[0358] 第二除草化合物的(+)ESIMS分析显示538.47[M+H]+和560.65[M+Na]+的m/z离子，对应于537的分子量。通过ESIMS和NMR数据分析的解读而确定分子式C28H43NO9。这种化合物的1H和13C NMR类似于templamide A，除了存在新的分离的–CH2-，而不是templamide A中非偶联的亚甲基。4.3Hz的小原始偶联常数(germinal coupling constant)表明存在环氧亚甲基。这种环氧化物的存在通过13C NMR从templamide A中的60.98变为MW 537的化合物中的41.07进一步证实。这两种化合物之间分子式的差异由形成环氧化物而消除了水分子得到合理的解释。因此，基于NMR和MS分析而确定新化合物的结构，并指定为templamide B。
[0359] 对于结构鉴定，将分子量为523的从部分5纯化的化合物利用600MHz NMR装置进一步分析，其1H NMRδ值为6.41,6.40,6.01,5.98,5.68,5.56,4.33,3.77,3.75,3.
72,3.65,3.59,3.55,3.50,2.44,2.26,2.04,1.96,1.81,1.75,1.37,1.17,1.04，并 且 13C NMRδ值为172.22,167.55,144.98,138.94,135.84,130.14,125.85,123.37,99.54,82.19,78.28,76.69,71.31,70.13,69.68,48.83,42.52,36.89,33.11,30.63,25.99,21.20,20.
1 13
38,18.14,14.93,12.84。化合物的详细 H和 C NMR分析表明这种化合物非常类似于化合物templamide B，唯一的差异在于酯侧链中；在侧链中存在乙酸酯部分而不是丙酸酯部分。
详细的1D和2D NMR分析证实化合物FR901465的结构为已知化合物。
72,3.65,3.59,3.55,3.50,2.44,2.26,2.04,1.96,1.81,1.75,1.37,1.17,1.04，并 且 13C NMRδ值为172.22,167.55,144.98,138.94,135.84,130.14,125.85,123.37,99.54,82.19,78.28,76.69,71.31,70.13,69.68,48.83,42.52,36.89,33.11,30.63,25.99,21.20,20.
1 13
38,18.14,14.93,12.84。化合物的详细 H和 C NMR分析表明这种化合物非常类似于化合物templamide B，唯一的差异在于酯侧链中；在侧链中存在乙酸酯部分而不是丙酸酯部分。
详细的1D和2D NMR分析证实化合物FR901465的结构为已知化合物。
[0360] 基于LC-MS分析，部分5的其他化合物在负电离模式中的分子量为540。对于结1
构鉴定，将分子量为540的从部分5纯化的化合物利用500MHz NMR装置进一步分析，其 H NMRδ值为6.22,5.81,5.69,5.66,5.65,4.64,4.31,3.93,3.22,3.21,3.15,3.10,2.69,2.
13
62,2.26,2.23.1.74,1.15,1.12,1.05,1.02，并且 C NMR值为172.99,172.93,169.57,169.23,167.59,130.74,130.12,129.93,128.32,73.49,62.95,59.42,57.73,38.39,38.00,35.49,30.90,30.36,29.26,18.59,18.38,18.09,17.93,12.51。NMR数据表明，该化合物包含氨基、酯、羧酸、脂肪族甲基、乙基、亚甲基、氧化亚甲基、次甲基、氧化次甲基和硫基团。详细的1D和2D NMR分析证实化合物FR90128的结构为已知化合物。
构鉴定，将分子量为540的从部分5纯化的化合物利用500MHz NMR装置进一步分析，其 H NMRδ值为6.22,5.81,5.69,5.66,5.65,4.64,4.31,3.93,3.22,3.21,3.15,3.10,2.69,2.
13
62,2.26,2.23.1.74,1.15,1.12,1.05,1.02，并且 C NMR值为172.99,172.93,169.57,169.23,167.59,130.74,130.12,129.93,128.32,73.49,62.95,59.42,57.73,38.39,38.00,35.49,30.90,30.36,29.26,18.59,18.38,18.09,17.93,12.51。NMR数据表明，该化合物包含氨基、酯、羧酸、脂肪族甲基、乙基、亚甲基、氧化亚甲基、次甲基、氧化次甲基和硫基团。详细的1D和2D NMR分析证实化合物FR90128的结构为已知化合物。
[0361] 11.实施例11Templamide A、Templamide B、FR901465和FR90128除草活性
[0362] 在96孔板平台中，利用一周龄的稗草和莴苣(Lactuca sativa L.)幼苗测试templamide A、templamide B、FR901465和FR90128的除草活性。将一株幼苗置于包含99微升DI水的每个孔中。将1微升等份的乙醇中的纯化合物(10mg/mL)加入每孔，并将平板用盖子密封。将99微升水中的1微升乙醇用作阴性对照。处理重复进行8次，并将密封的平板于人工光照(12hr光照/黑暗循环)下在温室中温育。5天后读取结果。接受活性化合物的所有8个孔中的草幼苗均死亡，没有绿色组织留下，而阴性对照孔中的幼苗则生长活跃。templamide A对莴苣幼苗的除草活性稍微低于对于所述草的除草活性。在另一方面，templamide B提供了比templamide A更好(100％)的莴苣幼苗(用作阔叶杂草的模型系统)的控制(表11)。
[0363] 表11：Templamide A、Templamide B、FR901465和FR90128的除草生物测定数据[0364]
[0365] 110μg/mL浓度/孔
[0366] 12.实施例12活性化合物的杀虫活性
[0367] 在实验室测定中，通过96孔饲料覆盖测定，用1st龄甜菜夜蛾幼虫测试templamide A、templamide B、FR901465和FR90128的杀虫活性，利用每孔中具有200μl固体的人工甜菜夜蛾饲料的微量滴定板。将一百(100)μl的每种测试样品(每孔一种样品)滴在饲料的顶部，并将所述样品在流动空气下干燥直至表面干燥。每个样品测试重复6次，并将水和商业Bt(苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis))产品分别用作阴性和阳性对照。将一只测试昆虫(甜菜夜蛾–Spodoptera exiqua)的第一龄幼虫置于每孔中，并将平板用具有气孔的塑料盖覆盖。将具有昆虫的平板在26℃下温育6天，每天评价死亡率。基于表12所示的结果，templamide A和templamide B分别导致40％和80％的死亡率。
[0368] 表12：Templamide A、Templamide B、FR901465和FR90128针对1st龄甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的杀虫生物测定数据
[0369]1
[0370] 10μg/mL浓度/孔
[0371] 实施例11 FR90128(MW 540)的杀真菌活性
[0372] 在体外PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板测定中测试FR90128(MW 540)针对三种植物病原性真菌(灰霉菌、根腐菌、桃褐腐菌(Monilinia fructicola))的杀真菌活性。利用栓塞法(plug method)将平板用真菌接种。在真菌已经在生长培养基上建立并开始生长后，将8个无菌滤纸盘以环形置于距离每个平板边缘约1cm处。将10微升包含20、15、10、7.5、5、2.5、1.25mg FR90128/mL的乙醇溶液加入滤纸盘，并使溶液蒸发。将一个加入10μL纯乙醇的盘用作阴性对照。测定重复进行3次。将平板在室温下温育5天，然后通过测量对应于不同FR90128浓度的每个滤纸盘周围的抑制区域来记录杀真菌活性。根据结果，FR90128对褐腐菌(Monilinia)的生长没有影响，但是其有效地控制灰霉菌(Botrytis)和根腐菌(Phytophtora)的菌丝生长。看起来对于灰霉菌和根腐菌在用10mg/mL和1.25mg/mL的阈值浓度抑制中分别存在明显的剂量-反应(图8)。
[0373] 生物材料的保藏
[0374] 以下生物材料依据布达佩斯条约保藏于美国北方农业研究所培养物保藏中心(Agricultural Research Culture Collection,NRRL)，美国伊利诺伊州61604皮奥里亚北大学街1815号(1815N.University Street,Peoria,Illinois 61604 USA)，保藏号为：
[0375]
[0376] 该菌株已经保藏，以保证在本专利申请存续期间由专利商标局官员认定的依据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122有权使用该培养物的人可以获得该培养物。该保藏物表示所保藏的菌株基本上纯的培养物。在提交了本申请的关联申请或其后续申请的国家中，申请人依据外国专利法要求可提供该培养物。然而，应当理解获得保藏物并不构成实施本发明的许可，以至于侵犯由政府行为所授予的专利权。
[0377] 本文所描述和要求保护的发明并不限于本文公开的具体方面，因为这些方面意图示例本发明的一些方面。任何等同的方面也在本发明的范围内。实际上，根据前述说明书，除了本文所示和描述的以外，本发明的各种变化对本领域技术人员是显而易见的。这样的变化也在所附的权利要求书的范围之内。在冲突的情况下，以包括定义在内的本发明的公开为准。
[0378] 本文所引用的各种参考文献整体援引加入本文。
[0379] 参考文献
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