TRIP－BR功能的调节和治疗增殖性紊乱的方法
阅读：608发布：2020-06-16
专利汇可以提供TRIP－BR功能的调节和治疗增殖性紊乱的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了一种调节增殖的细胞内TRIP－Br功能和活性的方法，以及通过调节增殖的细胞内TRIP－Br的功能来 治疗 增殖性紊乱的方法。，下面是TRIP－BR功能的调节和治疗增殖性紊乱的方法专利的具体信息内容。
1.一种抑制细胞增殖的方法，包括调节TRIP-Br的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的活性是TRIP-Br的转录整合活 性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的TRIP-Br是TRIP-Br1或TRIP- Br2，且细胞是人细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的调节包括将细胞暴露于TRIP-Br 调节剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的调节剂是小分子调节剂或肽调节 剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的肽调节剂包含TRIP-Br的植物同 源域锌指-溴结构域结合区域。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的肽调节剂包含具有式 UTGXLXDXXLZJOLFJDID的序列，其中X是任意氨基酸；U是S、T、A或没 有氨基酸；Z是D或E；J是D、E、A或G；和O是I、L、V、A或没有氨基 酸。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述的肽调节剂进一步包含使得肽调节 剂能够转运至细胞内的序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的肽调节剂包含来源于黑腹果蝇的 触角足同源域蛋白的细胞膜穿透肽序列。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述的肽调节剂基本由SEQ ID NO.：4或SEQ ID NO.：5的氨基酸序列组成。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的调节包含抑制细胞内TRIP- Br基因表达。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的调节包括将细胞暴露于靶向 TRIP-Br基因转录物的DNA酶。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的DNA酶包含SEQ ID NO.：6 或SEQ ID NO.：7的核酸序列。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述的调节包括将细胞暴露于靶向 TRIP-Br基因转录物的小干扰RNA分子。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述的TRIP-Br包含由式 UTGXLXDXXLZJOLFJDID编码的序列，其中X是任意氨基酸；U是S、T、A 或没有氨基酸；Z是D或E；J是D、E、A或G；和O是I、L、V、A或没有氨 基酸。
16.一种治疗患者体内增殖性紊乱的方法，包括给患者施用能调节该患者 增殖的细胞内TRIP-Br活性的分子，其中该增殖的细胞与增殖性紊乱相关。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的活性是TRIP-Br的转录整合 活性。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述的患者是人。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述的增殖性紊乱选自于膀胱癌、 结肠癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、子宫颈癌、皮肤癌、白血病、增殖性皮肤损 伤、生殖疣、牛皮癣、瘢痕瘤、缺血性心脏病、获得性免疫缺陷综合征、脉管炎、 类风湿关节炎、动脉粥样硬化、肾小球肾炎、肾小球硬化、间质炎症、间质纤维 化、肺炎、肺纤维化、宿主对脑梗死、心肌梗死和急性缺血性肾小管损害的免疫 反应。
20.根据权利要求19所述的方法，其中能调节TRIP-Br的转录整合活性的 分子是TRIP-Br的调节剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述的调节剂是小分子调节剂或肽 调节剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述的肽调节剂包含TRIP-Br的植 物同源域锌指/溴结构域结合区域。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的肽调节剂包含具有式 UTGXLXDXXLZJOLFJDID的序列，其中X是任意氨基酸；U是S、T、A或没 有氨基酸；Z是D或E；J是D、E、A或G；和O是I、L、V、A或没有氨基 酸。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述的肽调节剂进一步包含使得该 肽调节剂能够转运至细胞内的序列。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述的肽调节剂包含来源于黑腹果 蝇的触角足同源域蛋白的细胞膜穿透肽序列。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述的肽调节剂基本由SEQ ID NO.：4或SEQ ID NO.：5的氨基酸序列组成。
27.根据权利要求16所述的方法，其中能调节TRIP-Br活性的分子是能抑 制TRIP-Br基因表达的分子。
28.根据权利要求27所述的方法，其中能抑制TRIP-Br基因表达的分子是 靶向TRIP-Br基因转录物的DNA酶。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述的DNA酶包含SEQ ID NO.：6 或SEQ ID NO.：7的核酸序列。
30.根据权利要求27所述的方法，其中能抑制TRIP-Br基因表达的分子是 靶向TRIP-Br基因转录物的小干扰RNA分子。
31.一种能调节TRIP-Br活性的分子。
32.根据权利要求31所述的分子，其中能调节TRIP-Br活性的分子是 TRIP-Br的肽调节剂。
33.根据权利要求32所述的分子，其中所述的肽调节剂包含TRIP-Br的植 物同源域锌指-溴结构域结合区域。
34.根据权利要求33所述的分子，其中所述的肽调节剂包含具有式 UTGXLXDXXLZJOLFJDID的序列，其中X是任意氨基酸；U是S、T、A或没 有氨基酸；Z是D或E；J是D、E、A或G；和O是I、L、V、A或没有氨基 酸。
35.根据权利要求34所述的分子，其中所述的肽调节剂进一步包含使得该 肽调节剂能够转运至细胞内的序列。
36.根据权利要求35所述的分子，其中所述的肽调节剂包含来源于黑腹果 蝇的触角足同源域蛋白的细胞膜穿透肽序列。
37.根据权利要求33所述的分子，其中所述的肽调节剂基本由SEQ ID NO.：4或SEQ ID NO.：5的氨基酸序列组成。
38.根据权利要求31所述的分子，其中能调节TRIP-Br活性的分子是能抑 制TRIP-Br基因表达的分子。
39.根据权利要求31所述的分子，其中能调节TRIP-Br活性的分子是靶向 TRIP-Br基因转录物的DNA酶。
40.根据权利要求39所述的分子，其中所述的DNA酶包含SEQ ID NO.：6 或SEQ ID NO.：7的核酸序列。
41.根据权利要求31所述的分子，其中能调节TRIP-Br活性的分子是靶向 TRIP-Br基因转录物的小干扰RNA。
42.一种包含能调节TRIP-Br活性的分子和药学上可接受的稀释剂的药物 组合物。
43.一种抗TRIP-Br的单克隆抗体。
44.权利要求43所述的单克隆抗体，其抗SEQ ID NO.：10或SEQ ID NO.：11 的氨基酸序列。
45.一种鉴定TRIP-Br的调节剂的方法，包括在测试化合物存在的情况 下，将TRIP-Br的蛋白靶与含有TRIP-Br的植物同源域锌指/溴结构域结合区域的 肽相接触，并确定该测试化合物对TRIP-Br的蛋白靶与含有TRIP-Br的植物同源 域锌指/溴结构域结合区域的肽相结合的作用。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述的测试化合物是小分子或肽。
发明领域
本发明通常涉及治疗包含增殖性紊乱的疾病的方法，包括治疗癌症的方法。
发明背景
一般来说，细胞具有控制生长和增殖的机制，致使细胞仅在确定的环境下， 以一种受控制的方式进行分裂和生长。当支配细胞生长和增殖的正常调节机制被 破坏时，细胞也具有诱导细胞死亡或细胞凋亡的机制。然而，在某些情况下，这 种增殖控制和细胞凋亡机制崩溃，使细胞增殖不受抑制，有可能导致有机体内增 殖紊乱或疾病。这些增殖性紊乱包括癌症和其他细胞过多的损伤，如牛皮癣，疣 和瘢痕瘤。
不受控制的细胞增殖可由基因表达的调节异常引起。细胞具有DNA复制和 分裂的严密控制周期(细胞周期)，其受一系列细胞周期和转录因子所调节。一组 细胞周期转录因子，E2F转录因子，已显示出通过以一种有助于细胞周期进程和 增殖所需基因及时表达的方式整合细胞周期装置的活性与转录装置的活性，在调 节细胞增殖中发挥至关重要的作用(Lam，E.，等人，Curr Opin Cell Biol 6，859- 866(1994)；Dyson，N.(1998)，genes Dev 12：2245-2262；Helin，K，(1998)，Curr Opin Genet Dev 8：28-35；Harbour，J.W.，和Dean，D.C.(2000)，Genes Dev 14：2393-2409； Trimarchi，J.M.和Lees，J.A.(2002)，Nat Rev Mol Cell Bio 3：11-20)。这些E2F转录因 子，特别是E2F-1，与细胞凋亡的调节有关(Muller，H.，等人，Genes Dev 15，267- 285(2001)；Nahle，Z.，等人，Nat Cell Biol，(2002)11：859-64；Philips，C.，和Vousden， K.H.Apoptosis 6,173-182(2001))。
在细胞周期进程期间，细胞周期蛋白E-相关激酶的活性已显示出对于通过限 制点并完成S期进入是必不可少的(Keyomarsi，K.，和Herliczek，T.W.(1997)，Prog Cell Cycle Res 3：171-191)。细胞周期的进入、经过和退出是受依赖细胞周期蛋白的 激酶(Cdks)Cdk4/6，Cdk2和Cdc2的相继激活而精确控制的(Sherr，C.J.，和Roberts， J.M.(1999)，Genes Dev 13：1501-1512)。细胞进入细胞周期的保证受在G1期施加作 用的生长因子(正的和负的)的调节。
G1 D-型细胞周期蛋白，结合依赖细胞周期蛋白的激酶Cdk4和Cdk6，在完 成促细胞分裂原诱导的细胞增殖中起重要的作用。正的(促有丝分裂的)生长因 子传递生长-刺激信号，该信号促进D-型细胞周期蛋白的合成以及它们组装成活性 的Cdk4/6-细胞周期蛋白D复合物，导致其催化激活和底物识别。活化的Cdk4/6- 细胞周期蛋白D复合物有助于细胞周期蛋白-E/Cdk2的激活和磷酸化不足的RB 的产生。结合到转录不活跃的E2F-1/DP-1复合体上的磷酸化不足的RB充当了通 过经活化的细胞周期蛋白-E/Cdk2进行超磷酸化的靶，结果导致RB的解离、E2F- 应答基因的去阻抑/激活以及细胞从G1晚期关卡(checkpoint)的释放 (Sherr，C.J.(1993)，Cell 73：1059-1065；Lam等人.，见上；Dyson，见上；Helin，见上； Harbour，J.W.，等人，(1999)，Cell 98：859-869；Sherr，(1999)，见上；Harbour(2000)，见上； Trimarchi等.，见上)。
作为促有丝分裂信号传导途径的关键调节剂，Cdk4/Cdk6-细胞周期蛋白D的 活性在多重水平被调节，包括细胞周期蛋白D的合成和结合，磷酸化作用过程的 抑制和激活，以及被称作Cdk抑制剂(CKIs)的抑制分子的结合/解离(Sherr (1999)，见上)。Cdk蛋白是不活跃的，除非它们结合到各自的细胞周期蛋白配 偶体上。一旦结合之后，每一个细胞周期蛋白-Cdk复合物通过特定的磷酸化作用 进一步被负调节和正调节。进一步的负调节是通过与特定的破坏活性位点并干扰 ATP结合的Cdk抑制剂(CKI)结合而提供的。哺乳动物的CKIs被分成两个家族， Cip/Kip(Cdk2/激酶抑制剂蛋白)和Ink4(依赖细胞周期蛋白的激酶4的抑制剂) 抑制剂，这两者都通过特异地和协同地结合到控制G1和G1/S期的Cdk复合物上 来限制细胞周期的进程。虽然Cip/Kip家族CKIs的抑制Cdk2、Cdk4和Cdk6活 性特异性较低，但Ink4抑制剂(p16/Ink4a、p15/Ink4b、p18/Ink4c和p19/Ink4d) 却特异地结合到细胞周期蛋白D-Cdk4和-Cdk6复合物上。
施加于Cdk4上的额外水平的调节最近已被证实。p34SEI-1，一种新的表现为拮 抗p16INK4a功能的依赖细胞周期蛋白的激酶4(Cdk4)-结合蛋白，已显示出可以 使细胞周期蛋白D1-Cdk4复合物抵抗通过p16INK4a产生的抑制(Sugimoto，M.，等 人，(1999)，Genes Dev 13：3027-3033)。p34SEI-1是一种血清诱导型蛋白，甚至在低血 清浓度中，它的异位表达也能使成纤维细胞增殖。p34SEI-1被推测在促进细胞周期 蛋白D-Cdk复合物的形成和激活以及介导促细胞分裂原驱动的细胞周期进程中起 着关键功能性作用(Sugimoto等人.，见上)。
为了解决当细胞周期进程的上述途径的调节遭受不正常时所导致的增殖性 紊乱的问题，找到阻断不正常增殖细胞中的细胞周期进程的方法是很重要的。因 此，需要一种新的诱导细胞内增殖阻断的疗法和办法。
发明概述
一方面，提供一种抑制细胞增殖的方法，包括调节TRIP-Br的活性。
另一方面，提供一种治疗患者体内增殖性紊乱的方法，包括给患者施用一种 能调节患者增殖细胞内的TRIP-Br活性的分子，其中该增殖的细胞与增值性紊乱 相关。
进一方面，提供一种能调节TRIP-Br活性的分子。
更进一方面，提供一种药物组合物，包含一种能调节TRIP-Br活性的分子和 一种药学上可接受的稀释剂。
再进一方面，提供一种抗TRIP-Br的单克隆抗体。
进一方面，提供一种鉴定TRIP-Br的调节剂的方法，包括在测试化合物存在 的情况下，将TRIP-Br的蛋白靶与含有TRIP-Br的植物同源域锌指/溴结构域 (bromodomain)结合区域的肽接触，并测定该测试化合物对TRIP-Br的蛋白靶与含 有TRIP-Br的植物同源域锌指/溴结构域结合区域的肽结合的影响。
通过下面的本发明特定实施方案结合相应附图而进行的描述，本领域的技术 人员会清楚本发明的其他方面和特征。
附图简述
在这些图中，仅以实施例的方式阐述了本发明的实施方案。
图1A：KRIP-1/TRIP-Br的免疫沉淀测定的放射自显影图；B：描述用诱饵 肽(decoy peptide)处理的U2OS细胞的萤光素酶测定结果的图表；
图2A：用FITC-标记的*SCR、*Br1和*Br2处理的U2OS细胞的荧光显微 照片；B：通过流式细胞仪测量肽内在化效率；
图3A：用pCMV/β-半乳糖苷酶和指示的萤光素酶报道质粒共转染的U2OS 细胞的β-半乳糖苷酶/萤光素酶测定结果的图表；B：对在暴露于诱饵肽的U2OS 细胞内的dhfr，细胞周期蛋白-E，细胞周期蛋白A2，PCN4，DNA Pola和cdc2的表 达进行的基于总RNA的RT-PCR分析的琼脂糖凝胶；
图4A：暴露于诱饵肽24或48小时的U2OS细胞用ELISA比色测定分析 BrdU整合的结果；B：暴露于各种剂量诱饵肽的U2OS细胞用ELISA比色测定分 析BrdU整合的结果；C：使用Coulter细胞计数器和用锥虫蓝染色的细胞计数的 总细胞数量测定结果；
图5A：暴露于载体(DMSO)或指示诱饵肽的U2OS细胞的非同步的群体 在24小时时的细胞周期分布图；B：用图表示的处理后72小时的细胞周期分布概 况的图像；
图6A：暴露于Eto(足叶乙甙(etoposide))24小时或诱饵肽48小时或72 小时的U2OS细胞内天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3蛋白酶活性测定的结果； B：PARP裂解的蛋白印迹分析；
图7A：用或不用诱饵肽处理的情况下，从洛可哒唑停滞中释放出来的U2OS 细胞的蛋白表达图；B：U2OS细胞中细胞周期蛋白E和Geminin的表达，该细胞 用载体主链(载体)或pRc/细胞周期蛋白E与pCMV/Cdk2转染且通过暴露于洛 可哒唑(75ng/ml)停滞在G2/M边界并随后被释放重新进入细胞周期；C：在不 存在或存在细胞周期蛋白E/Cdk2超表达的情况下(左板)或在不存在或存在诱饵 肽处理的情况下(右板)，显示Geminin表达的蛋白印迹(WB)或考马斯的染色 凝胶；
图8A：从暴露于诱饵肽的U2OS细胞里所得的全细胞提取物中，细胞周 期蛋白A，D和E表达的蛋白印迹分析；B：暴露于诱饵肽的U2OS细胞的半定 量RT-PCR分析；C：在有或没有OHT和/或环己酰亚胺(CHX)时生长的分会合 (sub-confluent)的U2OS ER-E2F-1细胞内细胞周期蛋白-E和Fbxw7表达的半定 量RT-PCR分析；
图9是一个描述在依赖E2F的细胞周期进程中起作用的TRIP-Br整合功能的 示意图；
图10A：证明基因表达被DNA酶转录后抑制的示意图；B：描述靶向 TRIP-Br转录物的DNA酶的序列和环状结构；
图11A：对缺乏血清72小时的分会合的WI-38细胞进行的半定量RT-PCR 分析；B：对缺乏血清72小时的并随后用指定的DNA酶转染的分会合的WI-38 细胞进行的半定量RT-PCR分析；
图12A：缺乏血清72小时后用DNA酶转染，随后用血清再刺激72小时 的分会合的WI-38细胞能生存的细胞计数；B：用结晶紫原位染色的来自A的细 胞照片：
图13A：缺乏血清72小时后用DNA酶转染并用血清再刺激的分会合WI-38 细胞；B：缺乏血清72小时的并用DNA酶以及编码指定的细胞周期调节剂的表 达质粒转染的分会合的WI-38细胞中通过ELISA比色测定所分析的BrdU整合的 图表；
图14A：用以评价缺乏血清72小时后用DNA酶转染并用血清再刺激的的 CCNE在分会合的WI-38细胞内的表达的半定量RT-PCR分析；B：细胞周期蛋 白E，Cdk4，细胞周期蛋白D1和p27KIP1在缺乏血清72小时的分会合的WI-38 细胞内表达的蛋白印迹(WB)分析；
图15A：通过ELISA比色测定确定在分会合的PMEF培养物(TRIP-Br2+/ + 和-/-)中的BrdU整合；B：缺乏血清72小时并随后用血清再刺激的分会合的 PMEFs能生存的细胞计数分析；C：用以评价在野生型(+)或TRIP-Br2无效(-) PMEFs内CCNE表达的半定量RT-PCR分析；
图16通过TRIP-Br调节可血清-诱导的细胞周期进程的示意图；
图17抗原性对人TRIP-Br1残基数目进行的的绘图；
图18亲水性对人TRIP-Br1残基数目进行的绘图；
图19可接近性对人TRIP-Br1残基数目进行的绘图；
图20人和小鼠TRIP-Br蛋白的CLUSTAL W(1.81)多序列比对；
图21TB1-27肽的质谱分光度法谱；
图22与TBI-27或Cyr61肽相竞争的，用pcDNA3/FLAG-TRIP-Br1或载体 转染的U2OS细胞的蛋白印迹分析，；
图23用新的小鼠抗hTRIP-Br1单克隆抗体免疫沉淀的，表达FLAG-TRIP- Br1的U2OS细胞的免疫沉淀反应的蛋白印迹分析；和
图24显示用诱饵肽处理的CNE2肿瘤的肿瘤重量的图。
发明详述
本发明人已确定TRIP-Br蛋白家族成员在促细胞分裂原-诱导的细胞周期进 程中起作用。治疗增殖的细胞以破坏或调节TRIP-Br家族成员的整合功能诱导了 增殖阻断。表现为，这种调节能通过在体内下调生长调节性E2F-应答基因亚型的 转录活性，并通过消除细胞周期蛋白E/Cdk2的细胞周期调节活性，来诱导异常的 细胞周期蛋白E积累而发挥抗增殖效应。这反过来能导致Geminin反常和进行性 的细胞的亚-二倍化(sub-diploidization)。细胞周期蛋白E反常可能归因于Fbxw7的 下调，Fbxw7是编码负责靶向细胞周期蛋白E以进行蛋白酶解的SCFFBW7遍在蛋 白连接酶(E3)的Fbw7受体亚单位的基因。此处将Fbw7鉴定为E2F-应答基因。
本发明人已确定TRIP-Br蛋白似乎参与介导促有丝分裂细胞周期信号传导途径中 细胞周期蛋白E/Cdk2上游的一个或多个调节步骤的正确执行。此外，本发明人证 明TRIP-Br蛋白表达的下调以一种抑制血清诱导的细胞周期蛋白E表达、S期进 入和细胞增殖的方式破坏促有丝分裂信号传导。
因此，本发明方法涉及失控的增殖细胞内TRIP-Br家族蛋白的功能的调节。 这种调节导致了这些细胞内的增殖阻断，使得可用于治疗增殖性紊乱。
TRIP-Br蛋白家族是结构上和功能上相关的哺乳动物的转录调节剂家族，包 括TRIP-Br1和TRIP-Br2。
人的TRIP-Br1(hTRIP-Br1)等同于哺乳动物蛋白p34SEI-1，其最近被确定为一 种依赖细胞周期蛋白的激酶4(Cdk4)-结合蛋白(Sugimoto，M.，等人，Genes Dev 13，3027-3033(1999))。后来基于在结构上和功能上与TRIP-Br1同源，发现TRIP- Br2是TRIP-Br1的同系物(Hsu等人，见上)。另外，发现内源性的TRIP-Br1蛋 白在细胞周期期间被调节，其表达水平在S期期间最高(Hsu等.，见上)。
TRIP-Br1和TRIP-Br2拥有有效的与p53-相关的转录因子MDM2高度同源的 C-末端酸性反式激活(transactivation)结构域(Hsu等人.，见上；Keyomarsi，K.，和 Herliczek，T.W.，(1997)，Prog Cell Cycle Res 3：171-191)。像MDM2一样，TRIP-Br 蛋白表现为功能上与DP-1相互作用，结果导致E2F-1/DP-1转录活性的刺激。 TRIP-Br蛋白的共激活(coactivation)功能可通过直接与DP-1相互作用而产生。 先前已证明hTRIP-Br1是包含E2F-1和DP-1的内源性多蛋白复合物的一个成分。
小鼠TRIP-Br1(m TRIP-Br1)蛋白首先在酵母双杂交筛选中被分离出来，所 述筛选设计用于鉴定与转录辅阻遏物KRIP-1(KAP-1或TIF1β)的复合植物同源域 (PHD)-溴结构域相互作用的蛋白(Hsu，S.I.H.，等人.，EMBO J 20，2273-2285(2001)； Kim，S.-S.，等人.，Proc Natl Acad Sci USA 93，15299-15304(1996)；Le Douarin，B.，等 人.，EMBO J 15，6701-6715(1996)；Moosmann，P.，等人，Nucl Acids Res 24，4859- 4867(1996))。
已显示出TRIP-Br蛋白的功能为E2F-应答启动子转录调节信号的生理学上的 整合者，整合由包含PHD锌指-和/或溴结构域的转录因子，如p300/CBP和KRIP-1 提供的调节信号(Kalkhoven，E.，等人.，Mol Cell Biol 22，1961-1970(2002)；Schultz， D.C.，等人.，Genes Dev 15，428-433(2001))。因此，TRIP-Br蛋白有助于依赖E2F 的细胞周期进程的调节(Hsu，S.I.H.，等人.，EMBO J 20，2273-2285(2001))。
PHD锌指和溴结构域是在染色质-重构蛋白的宿主内发现的进化保守的蛋白 二级结构。这些结构域估计是充当对于依赖染色质的转录调控很重要的蛋白-蛋白 相互作用结构域(Aasland，R.，等人.Trends Biochem Sci 20，56-59(1995)；Capili，A.D.， 等人.EMBO 20，165-177(2001)；Marmorstein，R.B.，等人.Gene 272，1-9(2001))。例 如，KRIP-1的串联的PHD锌指和溴结构域已显示出形成一个协同的单位，该单 位在使组蛋白脱乙酰酶和NuRD复合物的染色质重构活性靶向体内特定基因启动 子的过程中起作用，其中的NuRD复合物是基因沉默所需的。
PHD锌指的特征是半胱氨酸4-组氨酸-半胱氨酸3(Cys4-His-Cys3)锌指基 序(Koken，M.H.M.，等人.，CR Acad Sci III 318，733-739(1995))，而溴结构域是一 个～110个氨基酸的结构组件，其编码四个与乙酰化赖氨酸残基相相互作用的两亲 α螺旋亚域(Haynes，S.，等人.Nucl Acids Res 20，2603(1992)；Zeng，L.，和Zhou，M.- M.FEBS Letters(2002)513(1)：124-8)。TRIP-Br1和TRIP-Br2都显示了有与PHD锌 指和/或溴结构域相互作用的能力。在依赖E2F的转录共调节中涉及到这些蛋白- 蛋白相互作用(Hsu等人，见上)。
因此，提供一种抑制哺乳动物细胞增殖的方法，包括调节TRIP-Br蛋白的转 录整合活性。
如本文中所使用的，TRIP-Br指的是TRIP-Br家族的任一成员，包括TRIP- Br1和TRIP-Br2。TRIP-Br家族成员拥有“PHD溴结构域相互作用区域”，其与参 与细胞功能的蛋白内的PHD锌指和/或溴结构域相互作用，所述细胞功能包括， 但不限于，细胞周期调节、基因转录调节和增殖。该术语包括拥有TRIP-Br的转 录整合活性的TRIP-Br的同系物、片段、衍生物或变体。
如果一多核苷酸序列或多肽序列与另一序列在一特定区域的范围内具有相 当大的同一性，并且这些序列的功能活性是保守的，那么这两个序列相互是“同 系物”或“同源的”(如此处所使用的，术语“同源的”并不意味进化上相关)。 如果，当被最佳比对时(允许有间隙)，两个多核苷酸序列或多肽序列共有至少大 约50％的序列一致性，或者这些序列共有明确的功能基序，那么它们被认为具有 相当大的同一性。在一个可选择的实施方案中，如果被最佳比对的序列在一特定 区域内共有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98 ％、99％的同一性，那么它们可被认为是基本相同的(即，具有相当大的同一性)。 “不相关的”或“不同源的”序列与本发明的多肽或多核苷酸在同源性的特定区 域内共有低于40％的同一性，和可能低于大约25％的同一性。术语“同一性”和 “同一的”指的是两个肽或两个多核苷酸分子之间的序列相似性。可以通过比较 比时的序列内的每个位置来测定同一性。氨基酸序列之间同一性的程度是这些序 列共有的位置处，即，在一特定区域内，同一的或配对的氨基酸数目的函数。可 使用多种运算法则来进行用于同一性对比的序列的最佳比对，如本领域公知的， 包括Clustal W程序，在 http：//clustalw.genome.ad.jp上可获得，Smith和Waterman 的局部同源性运算法则(1981，Adv.Appl.Math 2：482)，Needleman和Wunsch 的同源性比对运算法则(1970，J.Mol.Biol.48：443)，Pearson和Lipman的查找 相似性方法(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)，和这些运算法则的计算机 化实现(如Wisconsin Genetics Software Package内的GAP、BESTFTT、FASTA和 TFASTA，Genetics Computer Group，Madison，WI，美国)。也可使用描述于Altschul 等人.，1990，J.Mol.Biol.215：403-10的BLAST运算法则(使用公开的默认设置) 来测定序列同一性。可通过National Center for Biotechnology Information来获得(通 过国际互联网http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)用于执行BLAST分析的软件。在此使 用的“同源氨基酸序列”包括任何多肽，其全部或部分被核酸序列编码，该核酸 序列在低于临界解链温度25-35℃(Tm)下，与编码哺乳动物TRIP-Br，包括 TRIP-Br1或TRIP-Br2的核酸序列，包括编码SEQ ID NO.12到15的任一氨基酸 序列的核酸的任何部分杂交。
TRIP-Br的变体或衍生物指的是TRIP-Br或它的片段，其保持TRIP-Br的转 录整合活性，或是一个或多个氨基酸被突变的TRIP-Br，包括点突变、插入突变或 缺失突变，但仍保持TRIP-Br的转录整合活性。因此，变体或衍生物包括缺失， 含截短物和片段；插入和添加，例如保守替代，位点特异性突变和等位变体；和 修饰，包括具有一个或多个共价连接到肽上的非氨酰基团(参见(q.v.)，糖、脂类 等)的类肽(peptoid)，以及翻译后修饰。此处使用的术语“保守氨基酸替代”或 “保守替代”指的是在肽内的一指定位置上一种氨基酸用另一种氨基酸替代，这 里的替代可在基本不失去相关功能的情况下进行。在进行这些改变时，相似氨基 酸残基的替代可基于侧链取代基的相对相似性来进行，例如，它们的大小、电荷、 疏水性、亲水性等，并且通过常规试验能测定出这些替代对肽的功能的影响。
TRIP-Br的“转录整合活性”或“整合活性”指的是TRIP-Br与不同的转录 因子和蛋白相互作用的能力，所述蛋白包括但不限于，参与细胞周期调节、基因 转录调节和增殖的蛋白。该转录整合功能至少通过TRIP-Br的PHD-溴结构域相 互作用区域被调节。
术语“细胞”指的是单个细胞，许多细胞或细胞群体，除非本申请中另有所 指。该细胞可以是其内的增殖或分裂被期望受到抑制的任何细胞，包括已失去经 历细胞周期停滞或细胞凋亡的细胞。该细胞可以是培养基中的细胞或者是患者体 内的细胞。正如此处所使用的，细胞增殖指的是DNA复制、生长和分裂的过程， 其导致细胞总数的增加。该细胞可来源于表达TRIP-Br同系物的任何有机体，在 特定的实施方案中是哺乳动物细胞，包括小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞或人细胞。
术语在细胞内“抑制增殖”或细胞“增殖的抑制”包括除通过细胞凋亡或其 他细胞死亡机制诱导细胞死亡外，致使细胞不能复制DNA、生长或分裂，或不能 正确复制DNA、生长或分裂，或降低或延缓DNA复制、细胞生长或分裂。抑制 可在体外或体内进行。
“调节”TRIP-Br的转录整合活性，或TRIP-Br的转录整合活性“的调节”， 指的是任何一种上调、下调、刺激、激活、增强、破坏、中断、降低、限制、阻 断或阻止TRIP-Br实现其生物功能或活性的能力的机制，包括整合参与调节增 殖、复制或细胞周期进程的转录调节信号，从而导致增殖抑制。调节包括TRIP- Br的物理改变，例如通过翻译后修饰，必要的翻译后修饰的损失或缺乏，氨基酸 序列突变，包括缺失、插入和替代突变，或蛋白消化。调节也包括稳定，诱导、 拮抗、抑制、或竞争TRIP-Br与作为TRIP-Br的靶的、且与TRIP-Br相互作用而 影响细胞周期进程的转录调节因子间的相互作用，相互作用包括TRIP-Br的PHD/ 溴结构域相互作用区域与包含PHD锌指和/或溴结构域的转录因子之间的相互作 用。调节也包括可导致具功能的TRIP-Br大大降低表达或不表达的遗传修饰。“大 大降低”和“基本上更少”指的是TRIP-Br或具功能的TRIP-Br的表达水平，该 水平例如，大约是在未受调节的细胞内的所产生的具功能的TRIP-Br表达水平的 50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％或0％。这种遗 传修饰包括编码TRIP-Br的核酸，包括TRIP-Br基因的修饰，从而其部分或全部 可读框被删除、替代或中断，致使基本上更少或没有基因产物，没有稳定的基因 产物，或没有具功能的基因产物被表达。这种遗传修饰也包括编码TRIP-Br的核 酸，包括TRIP-Br基因的修饰，从而其部分或全部TRIP-Br基因调节区域被删除、 替代、中断或抑制，导致基本上更少或没有蛋白从编码TRIP-Br的基因中被表达。 具功能的TRIP-Br蛋白是TRIP-Br，或TRIP-Br的一个片段，其经翻译、折叠、翻 译后修饰被定位于细胞内，而且其拥有TRIP-Br的生物功能或活性，可包括 TRIP-Br的转录整合功能。在任何环境下，其中TRIP-Br蛋白没有，或没有被正确 地翻译、折叠、翻译后修饰或定位于细胞内，即使基因被转录，增殖性阻断也可 能发生。这种遗传修饰进一步包括修饰细胞，使之转录出反义RNA转录物，该反 义RNA转录物与从TRIP-Br基因转录的mRNA分子的至少一个片段互补，导致 TRIP-Br转录物不翻译或翻译降低。这种遗传修饰进一步包括修饰细胞，使之转录 或表达靶向TRIP-Br基因转录物的小干扰RNA(siTNA)分子，导致TRIP-Br转录物 的不翻译，或翻译降低。
在一些实施方案中，TRIP-Br的转录整合功能被调节剂分子所调节。该调节 剂是可以竞争或模拟TRIP-Br的PHD-溴结构域相互作用区域的结合的任何分子， 因而与PHD-溴结构域相互作用区域的靶结合并阻断TRIP-Br结合到其靶上或降低 其结合能力。
调节剂可以被内在地送到细胞，例如通过主动或被动运输进入细胞，或通过 扩散进入细胞。例如，如果该调节剂是小分子，那么其在细胞膜内可能是可溶的 并因此能透过细胞。该调节剂也可被修饰成包含一个将促进其输入细胞的运输标 记物。可使用特定的运输标记物以指导该调节剂被特定的靶细胞吸收。例如该调 节剂可被修饰成包含一个半乳糖残基以增加其被肝细胞的吸收，如US6844319中 所描述的，其在此全文引入作为参考。可选择地，该调节剂可被包括到一种能增 加或诱导该调节剂被细胞吸收的生物材料中，例如通过将调节剂包到脂质体制剂 中做成胶囊。肽和蛋白的脂质体运送至细胞内是公知的，例如在US6372720和 US20030108597中有所描述，其在此引入作为参考。
在一个实施方案中，调节剂是一个编码TRIP-Br的PHD-溴结构域相互作用 区域序列的肽，包括TRIP-Br1或TRIP-Br2的PHD-溴结构域相互作用区域序列。 该肽调节剂可以是含有与TRIP-Br的PHD-溴结构域相互作用区域具有60％、70 ％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的 肽。通常，在没有基本上改变肽的生物活性的情况下，可在多肽的结构内作一些 修饰和变化，以获得一个功能上等同的多肽。因此，本发明扩展到生物上等同的 多肽，其通过保守的氨基酸替代而不同于TRIP-Br及其生物活性或免疫原性的片 段的PHD-溴结构域相互作用区域的氨基酸序列的一部分。比处所使用的术语“保 守的氨基酸替代”指的是在肽的指定位置上将一种氨基酸用另一种氨基酸替代， 这里的替代能在没有失去相关功能的情况下进行。在进行这些变化时，类似氨基 酸残基的替代可基于侧链取代基的相对相似性来进行，例如，它们的大小、电荷、 疏水性、亲水性等，并且通过常规试验可测定出这些替代对肽的功能的影响。在 一个可选择的实施方案中，可进行保守的氨基酸替代，其中氨基酸残基被替代为 同类中的另一个，这里氨基酸被分成非极性的、酸性的、碱性的、和中性的这几 类，如下列各项：非极性的：Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Pro，Met；酸性的：Asp，Glu； 碱性的：Lys，Arg，His；中性的：Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr。保守的氨基酸变化 可包括L-氨基酸被相应的D-氨基酸替代，被保守的D-氨基酸替代，或被天然的， 非遗传编码形式的氨基酸所替代，以及L-氨基酸的保守替代。天然的非遗传编码 的氨基酸包括β-丙氨酸、3-氨基-丙酸、2，3-二氨基-丙酸、α-氨基异丁酸、4-氨基- 丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、羟脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔 丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨 酸、2-萘基丙氨酸(2-napthylalanine)、吡啶丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯 丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1，2，3，4-四氢-异 喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰赖氨酸、2- 氨基丁酸、2-氨基丁酸、2，4-二氨基丁酸、对氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半 胱氨酸、高丝氨酸、半胱磺酸、ε-氨基己酸、δ-氨基戊酸和2，3-二氨基丁酸。
在一些实施方案中，该肽可包含式为UTGXIXDXXLZJOLFJDID(SEQ ID NO.16)的序列，其中X是任一氨基酸；U是S，T，A或没有氨基酸；Z是D或E； J是D，E，A或G；O是I，L，V，A或没有氨基酸。
在一些特定的实施方案中，调节剂是包含来源于人TRIP-Br1的氨基酸序列 ATGCLLDDGLEGLFEDID(SEQ ID NO.1)或来源于人TRIP-Br2的氨基酸序列 TGFLTDLTLDDILFADID(SEQ ID NO.2)的肽。
在进一步的实施方案中，调节肽进一步包含诸如膜-转位序列的序列，该序列 使得包含所述序列的肽转运到细胞内，例如来源于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的触角足同源域蛋白的细胞膜穿透肽(penetratin)序列，例如具有 序列ERQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO.3)。因此，在特定的实施方案中， 调节肽包含序列ERQIKIWFQNRRMKWKKATGCLLDDGLEGLFEDID(SEQ ID NO.4)或ERQIKIWFQNRRMKWKKTGFLTDLTLDDILFADID(SEQ ID NO.5)。
可选择地，肽调节剂可被整合入一个较大的融合蛋白中以增加该蛋白的稳定 性并帮助输送入靶细胞中。该融合蛋白可被设计成整合了一个特定的蛋白酶切位 点以供靶细胞内表达的蛋白酶识别，致使进入到靶细胞后肽调节剂从融合蛋白中 被释放出来。
肽调节剂可使用本领域公知的标准蛋白合成技术来合成，例如使用化学肽连 接方法，包括固相肽合成，从C-末端到N-末端的方向合成该肽，包括使用自动肽 合成仪。可选择地，可使用分子生物学技术设计编码该肽调节剂的表达盒，使用 本领域公知的标准分子生物学技术和例如描述于Sambrook等人((2001)Molecular Cloning：a Laboratory Manual，3rd ed.，Cold Spring Harbour Laboratory Press)中的标准 分子生物学技术。该表达盒可被用于合适的表达系统。例如，该盒可包含于细菌 质粒中并能在细菌细胞中表达，从中可分离和纯化出该肽调节剂。该表达盒将包 含一个编码肽调节剂的可读框，任选地，作为一个完整的的肽或作为嵌合的或融 合肽或蛋白的一部分，从中该肽能被释放出来，例如通过蛋白酶消化。该表达盒 还包括可操作地连接到该可读框上的合适的调节区域，例如启动子区域，它可以 是诱导型启动子区域。
在这个实施方案中，蛋白-蛋白相互作用的调节的完成是通过将细胞暴露给调 节剂，使得该调节剂被细胞吸收，并使该调节剂与TRIP-Br蛋白的包含PHD锌指 的，和/或包含溴结构域的靶相互作用，从而降低或阻断TRIP-Br蛋白实现其活性 的能力，如它在细胞内的转录整合功能。此处该调节剂是一个肽，包含细胞膜穿 透肽序列，或任何能使肽转运至细胞内、促进该调节剂被细胞吸收的序列。
可选择地，在其他实施方案中，利用一种能抑制编码TRIP-Br的核酸，包括 TRIP-Br基因表达的分子完成调节。
能抑制编码TRIP-Br的核酸，包括TRIP-Br基因表达的分子可以是一个靶向 编码TRIP-Br的基因的转录物的DNA酶。DNA酶是一种依赖镁的由DNA组成 的催化性的核酸，它能通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对选择性地结合 到RNA底物上并潜在地在任何嘌呤-嘧啶接点切开该RNA底物主链上的磷酸二酯 键(Santiago，F.S.，等人.，(1999)Nat Med 5：1264-1269)。DNA酶由两个不同的功能 结构域组成：一个15-核苷酸的催化核心，该核心执行磷酸二脂键的切割，以及两 个在催化核心侧面的杂交臂；这两个臂的序列特性是能被裁剪以获得与目标RNA 底物互补的碱基配对。
DNA酶因此将具有能与TRIP-Br基因转录物上的、侧面有嘌呤-嘧啶接点的 区域一起退火的互补区域，这样该DNA酶的催化核心能在接点切割转录物，使 得该转录物不能被翻译来产生功能性TRIP-Br蛋白。在某些实施方案中，该DNA 酶被设计成在AUG起始密码子的A和U残基之间切割TRIP-Br转录物。在特定 的实施方案中，该DNA酶包括序列T TAC CCA ACA GGC TAG CTA CAA CGA ATA TCA CA(SEQ ID NO.：6)或T TGC TCA GCA GGC TAG CTA CAA CGA CTT GCT CA(SEQ ID NO.：7)，其中未划线的内容表示催化核心序列。
可使用本领域公知的标准技术合成这种DNA酶，例如，可使用标准的亚磷 酰胺化学连接方法在固体支持物上从3’到5’方向合成DNA分子，包括使用自动 核酸合成仪。可选择地，DNA酶可通过转录编码该DNA酶的核酸分子而被合成。 该核酸分子可包含于DNA或RNA载体内，例如，病毒载体，以用于送递到细胞 表达系统中。合适的病毒载体包括痘苗病毒载体和腺病毒载体。
在这个实施方案中，可通过将细胞暴露于DNA酶，这样该DNA酶被细胞 吸收，并且能靶向和切割细胞内的TRIP-Br转录物，导致细胞内功能性TRIP-Br 蛋白降低表达或不表达从而达到调节的目的。正如本领域所公知的，暴露可包括 转染技术，或通过微注射技术，其中将DNA直接注射到细胞内。暴露也可包括 将细胞暴露于裸DNA酶中，因为细胞可在体内吸收裸DNA。可选择地，如果DNA 酶包含于核酸载体中，如病毒载体，那么该细胞可被病毒载体感染。
可选择地，能抑制编码TRIP-Br的核酸，包括TRIP-Br基因表达的分子，可 以是反义RNA分子或小的干扰RNA(siRNA)分子。
反义RNA分子将包含一段与TRIP-Br基因的RNA转录物的至少一个片段互 补的序列，并且该序列能结合到TRIP-Br转录物上，因而降低或阻碍体内TRIP-Br 基因的表达。该反义RNA分子将与靶mRNA具有足够的互补程度，以避免在需 要特异性结合的条件下，如在生理学条件下，反义分子与非靶序列非特异性结合。
siRNA分子可以是任何双链RNA分子，包括能折回自身形成双链siRNA的 自身互补的单链分子，它诱导细胞内的基因-特异性RNA干扰，导致体内TRIP- Br基因的表达降低或不表达。一般地，siRNA靶向目标mRNA内19-23碱基的 核苷酸序列，如Elbashir，等人.(2001)EMBO J 20：6877-6888所描述的，其内容在此 引入作为参考。
为了实行调节，将细胞暴露于反义RNA，编码反义RNA的核苷酸，siRNA 或编码siRNA的核苷酸，例如含有允许反义转录物或能形成双链siRNA的单链的 自身互补siRNA分子转录的核酸分子的核酸载体中。这种反义分子、siRNA分子 或载体能使用上面描述的核酸化学合成方法和标准的分子生物学克隆技术来合 成。
目前还提供一种治疗患者体内增殖性紊乱的方法。该方法包括调节患者增殖 的细胞内TRIP-Br1的活性，包括TRIP-Br1的转录整合活性，其中增殖的细胞与 增殖性紊乱相关。
“增殖性紊乱”是一种疾病或紊乱，其中患者的细胞不正常增殖，导致细胞 不受控制地生长和分裂，该细胞在健康个体内不会增殖或以一种被控制的方式增 殖。增殖性紊乱的特征是恶性或非恶性细胞群体的增殖。这种紊乱包括癌，其中 包括膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、子宫颈癌(cervical carcinoma)、 皮肤癌、白血病；增殖性皮肤损伤，其中包括生殖疣、牛皮癣和瘢痕瘤；缺血性 心脏病、获得性免疫缺陷综合征、脉管炎、类风湿关节炎、动脉粥样硬化、导致 肾小球硬化症的肾小球肾炎、导致纤维化的间质炎症、导致纤维化的肺炎。增殖 性紊乱包括不正常的增殖，该不正常的增殖也可在正常的伤口愈合期间发生，潜 在地导致过多的伤疤或瘢痕疙瘩的形成，并且可在任何导致组织伤害的炎症状况 下发生，其间宿主免疫细胞引发成纤维细胞增殖并产生导致纤维化的细胞外基质 成分。后者的例子包括宿主细胞对脑梗死(中风)、心肌梗死(心脏病发作)和急 性缺血性肾小管损害(暂时性肾衰竭)的免疫反应。
如果一种细胞不正常增殖以致导致在患者体内紊乱，或如果该紊乱的特点是 此种细胞的增殖，那么该细胞与增殖性紊乱相关。
术语“治疗”增殖性紊乱指的是一种获得有益的或期望的结果，包括临床结 果的方法。有益的或期望的临床结果可包括，但不限于，一种或多种症状或状况 的缓和或改善，疾病程度的减轻，疾病状态的稳定，疾病发展的防止，疾病扩散 的防止，疾病进程的延迟或减慢，疾病发作的延迟或减慢，疾病状态的改善或减 轻，以及消除(不管是部分还是全部)。“治疗”也可意味着延长患者的存活期限 超过了不存在治疗的预期期限。“治疗”也能意味着抑制疾病的进程，暂时减慢疾 病的进程，尽管更优选，它包括使疾病的进程永久停止。
患者可以是任何需要治疗增殖性紊乱的动物，包括哺乳动物，包括小鼠、大 鼠、兔或人。
通过给患者施用能调节TRIP-Br活性的分子来获得治疗效果。在一个实施方 案中，该分子能调节TRIP-Br的转录整合活性。能调节TRIP-Br活性的分子是任 何可被用于上述的影响细胞内调节的分子，包括模拟TRIP-Br的PHD-溴结构域 相互作用区域的结合的调节剂，因而它结合到PHD-溴结构域相互作用区域的靶上 并阻断或降低TRIP-Br结合到其靶上的能力。如上所述，这种调节剂可以是例如 小分子或肽。如上所述，能调节TRIP-Br1活性的分子可以是DNA酶，包括DNA 酶分子，或编码可转录的DNA酶的核酸分子。可选择地，能调节TRIP-Br活性的 分子可以是编码可转录的反义mRNA的核酸分子，含有与TRIP-Br mRNA转录物 互补的序列，或是编码靶向TRIP-Br mRNA转录物的siRNA分子的分子。
给患者施用有效量的能调节TRIP-Br活性的分子。术语“有效量”用于此处 指的是，例如，以需要达到期望效果的剂量和时间段，来有效治疗特定的增殖性 紊乱的量。
使用本领域公知的标准技术将分子施用给患者。该分子可被全身地施用，或 可被直接施用到与增殖性紊乱相关的增殖的细胞所处的位点。运送到该位点包括 局部施用，注射到该位点，或手术移植，例如，在肿瘤的位点。
要被施用的能调节TRIP-Br活性的分子的浓度和量将根据要被治疗的增殖性 紊乱，与增殖性紊乱相关的细胞的类型，被施用的分子的类型，施用模式，和患 者的年龄和健康状态，而有所变化。
为帮助施用，能调节TRIP-Br活性的分子可被配制成药物组合物内的一种成 分。因此，在进一步的实施方案中，提供一种药物组合物，包含能调节TRIP-Br 活性的分子，和药学上可接受的稀释剂。因此，本发明一方面也包括用于治疗增 殖性紊乱的此种药物组合物。该组合物可常规地包含药学上可接受的浓度的盐， 缓冲剂，防腐剂和各种相容性载体。对于所有的运送方式，能调节TRIP-Br活性 的分子可以配制成生理盐水的形式。由于肽在施用时可能不稳定，其中能调节 TRIP-Br活性的分子是肽或蛋白，因此期望将肽或蛋白包入脂质体或其他的有利于 保护和/或保存该肽或蛋白直到它们被送入靶细胞的生物材料中。
该药物组合物可另外包含其他的对治疗特定的增殖性紊乱有用的治疗剂，例 如，细胞毒性剂，例如化学治疗剂。
药学上可接受的稀释剂的比例和特性依据所选择的施用途径，与活细胞的相 容性，和标准的药学上的惯例来确定。通常，将选用不会杀死或显著削弱能调节 TRIP-Br活性的分子的生物特性的成分来配制该药物组合物。
可通过公知的制备适于给患者施用的药学上可接受的组合物的方法来制备 该药物组合物，这样，有效量的能调节TRIP-Br活性的分子，和任何另外的一种 活性物质或多种活性物质，以及药学上可接受的载体被组合在混合物中。合适的 载体被描述于，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，美国1985)。基于 此，该药物组合物包括，然而并非排他地，能调节TRIP-Br1活性的分子的溶液， 与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂结合，并且该分子被包含在具有合适 pH值的和与生理学流体等渗的缓冲液中。
根据选择的施用途径，可将该药物组合物以多种形式给患者施用，这是本领 域那些技术人员可以理解的。本发明的组合物可被局部地、通过手术或注射施用 到预期位点。
能调节TRIP-Br活性的分子的溶液可以在生理学上合适的缓冲液中制备。在 普通的储存和使用的条件下，这些制剂包含一种防止微生物生长的防腐剂，这将 保持能调节TRIP-Br活性的分子的功能。本领域技术人员应该知道如何配制合适 的制剂。选择和配制合适的制剂的传统的程序和成分被描述于，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences和公开于1999年的The United States Pharmacopeia：The National Formulary(USP 24 NF19)。
在不同的实施方案中，该组合物被局部或通过直接注射(皮下地、静脉内地、 肌内地，等)施用在预期位点上，在该位点患者中存在一种以不受抑制的方式增 殖的细胞。
要应用的药物组合物的剂量取决于被治疗的特殊状况，状况的严重性，患者 个体参数包括年龄、身体条件、大小和重量，治疗的持续时间，并行治疗的特性 (如果有的话)，施用的特定途径和其他类似的在健康从业者的知识和专门技术之 内的因素。这些因素对于本领域那些技术人员是公知的并且使用最小限度的常规 实验即可获得。
现在同样预期的是在此描述的能调节TRIP-Br活性的分子，包括TRIP-Br的 肽调节剂，靶向TRIP-Br转录物的DNA酶，与TRIP-Br转录物的至少一个部分或 片段互补的反义RNA或靶向TRIP-Br转录物的小干扰RNA分子。在特定的实施 方案中，该分子是一个包含具有式UTGXLXDXXLZJOLFJDID(SEQ ID NO：16)序 列的肽，其中X是任意氨基酸；U是S，T，A或没有氨基酸；Z是D或E；J是 D，E，A或G；和O是I，L，V，A或没有氨基酸。在特定的实施方案中，该肽 调节剂是包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的肽，并可进一步包含SEQ ID NO.3。 在特定的实施方案中，该肽包含SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5，或具有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的序列。在某些实施方案中，该分子是包含SEQ ID NO.6 或SEQ ID NO.7序列，或具有SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7序列的DNA酶。目 前同样预期的有这些分子的用途，包括调节TRIP-Br的转录整合活性以治疗患者 体内的增殖性紊乱的用途，制备调节TRIP-Br转录整合活性的药物或制备治疗患 者体内增殖性紊乱的药物的用途。
还提供了鉴定或筛选TRIP-Br调节剂，包括小分子或肽调节剂的方法。测试 分子被用于竞争TRIP-Br的PHD-溴结构域相互作用区域与TRIP-Br的细胞蛋白 靶的结合。TRIP-Br的细胞蛋白靶可以是，例如，含有PHD锌指或溴结构域的蛋 白，包括例如KRIP-1蛋白或p300/CBP蛋白。因此，在测试化合物存在的情况下， 使TRIP-Br的细胞蛋白靶与含有TRIP-Br的PHD-溴结构域相互作用区域的肽相 接触，并且监控该测试化合物对TRIP-Br的细胞蛋白靶和TRIP-Br的溴结构域相 互作用区域之间结合的影响。这些竞争测定，以及测量蛋白-蛋白相互作用中断 的方法是公知的，且包括层析法测定，免疫测定，固定实验，免疫沉淀技术，凝 胶阻滞试验。用于筛选TRIP-Br调节剂的方法也能很好地用于筛选化合物组合文 库。
本发明还预期抗TRIP-Br的抗体，尤其抗TRIP-Br1或TRIP-Br2的抗体。本 发明的抗体或者是多克隆抗体或是单克隆抗体。单特异性抗体可以是重组体，如， 嵌合的(如，通过人恒定区与鼠源可变区结合而成)，人源化的(人免疫球蛋白恒 定主链与动物来源的，如鼠源的高变区结合)，和/或单链。多克隆和单特异性抗 体也可以是免疫球蛋白片段的形式，如F(ab)’2或Fab片段。本发明的抗体是任何 同型，如IgG或IgA，且多克隆抗体是单一同型或同型的混合物。
在特定的实施方案中，该抗体是抗人TRIP-Br的肽序列 DPGHTAAVAQAPPAVAS(SEQ ID NO.：10)或SVADNLLASSDAALS(SEQ ID NO.：11)的小鼠单克隆抗体。
抗TRIP-Br的抗体是通过用含有TRIP-Br的多肽、同系物或片段的组合物免 疫哺乳动物来产生的。生产多克隆抗体或单克隆抗体的方法是本领域公知的。综 述参见“Antibodies，A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，Eds.E. Harlow和D.Lane(1988)，和D.E.Yelton等人.，1981.Ann Rev.Biochem.50：657-680； 对于单克隆抗体，见Kohler&Milstein(1975)Nature 256：495-497。
这些抗体在检测样品，如生物样品，包括正经历或怀疑正经历不受控制的增 殖的细胞样品，或正被治疗或已被治疗以防止增殖的细胞样品里TRIP-Br抗原的 存在的诊断方法中是有用的。这些抗体也被用于纯化TRIP-Br的亲和层析。
简要地说，为制备单克隆抗体，通过传统的实验方案将带有产生抗体潜能 的、来自用抗原免疫的宿主动物的体细胞与骨髓瘤细胞融合，形成两种细胞的杂 交瘤。体细胞可来源于转基因动物的脾、淋巴结和外周血。可被用于生产杂交瘤 的骨髓瘤细胞包括鼠骨髓瘤细胞系，如MPCII-45.6TGI.7，NSI-Ag4/1，SP2/0-Ag14， X63-Ag8.653，P3-NS-1-Ag-4-1，P.sub.3X63Ag8U.sub.1，OF，和S194/5XX0.BU.1； 包括210.RCY3.Ag1.2.3的大鼠细胞系；包括U226AR和GM1500GTGA1.2的细 胞系；和小鼠-人异源骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系(Hammerling，等人.(编者)， Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas IN：J.L.Turk(编者)Research Monographs in Immunology，Vol.3，Elsevier/North Holland Biomedical Press，New York(1981))。
体细胞-骨髓瘤细胞杂交物被放置于带有选择培养基，如HAT培养基的多重 孔中。选择培养基可从其他不期望的融合细胞杂交物中检出产生抗体的杂交瘤。 由于骨髓瘤细胞缺乏产生细胞生长所必需的酶的遗传信息，因此，选择培养基也 防止那些会另行持续无限分裂的未融合的骨髓瘤细胞的生长。来源于体细胞的B 淋巴细胞含有产生细胞生长的酶所必需的遗传信息，但缺乏骨髓瘤细胞的“无限 增殖化”性质，因此，在选择培养基中维持时间很短。因而，只有那些成功融合 骨髓瘤细胞的体细胞才能生长于选择培养基中。那些未融合的细胞将被HAT或选 择培养基杀死。
筛选方法被用于检验来源于生长在多重孔中的杂交瘤的可能的抗-TRIP-Br抗 体。使用多重孔是为了防止个体杂交瘤长得超过其他的。用于检验可能的抗- TRIP-Br抗体的筛选方法包括酶免疫测定、放射免疫测定、空斑测定、细胞毒性测 定、斑点免疫结合试验、荧光激活细胞分类术(FACS)，和其他体外结合测定。
测验为抗-TRIP-Br抗体阳性的杂交瘤被维持在培养基中，并可被克隆以生产 TRIP-Br特异性的单克隆抗体。可选择地，期望的杂交瘤能被注射到用于为最初的 融合提供体细胞和骨髓瘤细胞的类型的组织相容性动物的体内。被注射的动物长 出可分泌由杂交瘤产生的特异的单克隆抗体的肿瘤。
这些被选择的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体适于从细胞培养基或腹水溶液 中通过传统的免疫球蛋白纯化方法而纯化出来，例如，A蛋白-琼脂糖(Sepharose) 羟基磷灰石(hydoxylapatite)层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析。
本申请提及的所有文献在此引入作为参考。
尽管在此披露了本发明的各种实施方案，但根据本领域那些技术人员的常规 知识能在本发明的范围之内作出许多适应和修饰。这些修饰包括本发明任何方面 的公知的等同替换，目的是以基本上相同的方式获得相同的结果。此中所使用的 所有技术和科学术语与本发明技术领域的普通技术人员的普通理解具有相同的意 义，除非另外定义。
实施例
实施例1：利用诱饵肽破坏TRIP-Br与PHD锌指和溴结构域的相互作用
材料和方法
重组DNA和合成肽.pGL3-6xE2F-TATA/萤光素酶报道质粒以及相应的最小 报道分子pGL3-TATA/萤光素酶，均由Kristian Helin博士(European Institute of Oncology)友情赠与。pRcSV/细胞周期蛋白E以及pCMV/Cdk2均由Steve Reed 博士(The Scripps Research Institute，美国)友情赠与。各种用于体外翻译(IVT) 以及转染实验的质粒DNA以及cDNA克隆已经被在先描述(Hsu，S.I.H.，等人. EMBO J 20，2273-2285(2001))。合成的寡核苷酸来自GENSET，新加坡。合成肽以 及N末端荧光素化的肽由Louisiana State University Health Sciences Center (LSUHSC)Core Facilities，美国，合成并纯化。合成了下列羧基末端酰胺化的诱 饵肽(细胞膜穿透肽标记序列标有下划线)：
*Br1： ERQIKIWFQNRRMKWKKATGCLLDDGLEGLFEDID [SEQ ID NO.：4]
*Br2： EROIKIWFQNRRMKWKKTGFLTDLTLDDILFADID [SEQ ID NO.：5]
*SCR： ERQIKIFONRRMKWKKKGLDEDGLLLFCEGDTLAD [SEQ ID NO.：8]
冻干肽制剂在无菌二甲基亚砜(DMSO)重构制成25mM的储液。
组织培养细胞系.所有细胞系均在37℃具有5％二氧化碳(CO2)时维持在 加湿培养箱中。人类骨肉瘤细胞系U2OS被培养在补充了10％胎牛血清(FBS) 以及抗微生物剂(50IU/ml青霉素，50μg/ml链霉素和50μg/ml艮他霉素)的 Dulbecco氏修饰的Eagle氏培养基(DMEM)中。稳定表达ER-E2F-1的U2OS 细胞[由Kristian Helin博士(European Institute of Oncology)友情赠与]被培养在补充 了10％FBS，1.5μg/ml嘌呤霉素以及抗微生物剂的DMEM中。用于实验的细胞 处于2-15次传代之间。在所有诱饵肽实验中，细胞在处理之前以5×104细胞 /10cm2的密度被传代培养(sub-cultured)24小时。
生化试剂.环己酰亚胺(C7698)以及4-羟基三苯氧胺(OHT；H7904)购 自Sigma。用于人PARP(66391A)的小鼠单克隆抗体购自Pharmingen。所有其他抗 体购自Santa Cruz Biotechnology。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3萤光底物 Ac-DEVD-AFC(Bio-rad；170-3178)和细胞凋亡诱导剂足叶乙甙(eto)由Clement M.Veronique博士(National University of Singapore)友情赠送。
通过体外翻译制备蛋白.体外翻译(IVT)产物合成自pcDNA3/TRIP- Br1，pcDNA3/TRIP-Br2以及pBlueScript/GAL4-KRIP-1，使用偶联了TNT T7的网织 红细胞裂解系统(Promega)。体外翻译反应是在50μl的总反应体积中进行的， 其中在[35S]-甲硫氨酸(Met)存在的条件下，使无核酸酶水中1.0μg所示的DNA 模板与30μl TNT Quick master mix于30℃一起温育90分钟。
免疫沉淀测定(IP).用于IP的结合反应的进行是通过：1.5μl[35S]-Met 标记的GAL4或GAI4-KRIP-1IVT产物与3μl[35S]-Met标记的TRIP-Br1或 TRIP-Br2IVT产物在1×IP缓冲液(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273-2285(2001)) 中于4℃温育1个小时。为了分析诱饵肽介导的阻断活性，在加入全长TRIP-Br1 或TRIP-Br2IVT产物之前，将GAL4-KRIP-1IVT产物与25μM诱饵肽在4℃预 温育30分钟。用缀合在琼脂糖上的抗GAL4抗体沉淀的蛋白复合物通过SDS- PAGE分离，然后进行放射自显影。
共焦显微镜术(Confocal microscopy).为了进行共焦显微镜术，分会合的 U2OS细胞被培养在安装于#1.0德国硼硅酸盐盖玻片(Lab-Tek)的8孔小室中， 并且暴露于载体(0.5％DMSO)或20μM的荧光素化的诱饵肽中24小时。紧在 荧光成像之前，被处理的细胞用1×PBS洗涤并被温育在新鲜无肽的培养基中以 使本底噪声最小化。使用一个装有plan-neafluar 40x/0.75Ph2物镜(激光激发波 长＝488nm；发射波长＝500-550nm)的Carl Zeiss 510激光扫描显微镜获取图像。
流式细胞术分析.使用Coulter EPICSELITE ESP流式细胞仪进行分析，其 激光波长为488nm。为了测量肽内在化效率，生长在6-孔皿中的U2OS细胞暴 露于载体(0.5％DMSO)或50μM的荧光素化的诱饵肽中24小时。在收获时， 细胞先用2％多聚甲醛固定，然后再用70％乙醇固定。每一样品中发出加强绿色 荧光的细胞的比例用WinMDI(版本2.7)计算机软件进行确定。用SPSS8.0软件 进行统计分析。
DNA转染以及相继的β-半乳糖苷酶/萤光素酶测定.为进行萤光素酶报道 分析，U2OS细胞被培养在6-孔皿中，24小时之后用各种报道质粒通过如前所 述(Martin，K.，等人.Nature 375，691-694(1995))的钙沉淀法进行转染。除去沉淀物 24小时后，在收获之前，细胞暴露于载体(0.5％DMSO)或50μM的诱饵肽中5 小时。将细胞刮入200μl的裂解缓冲液中，并且立即使用Dual Light System(Tropix) 对单一10μl等分试样的裂解物相继测定β-半乳糖苷酶和萤光素酶活性。为进行 蛋白超表达实验，U2OS细胞以1×105细胞/孔的密度被培养于6-孔平板中，24 小时之后用Superfect试剂(QIAGEN)转染。
半定量RT-PCR.用TRIZOL试剂(Life Technologies)从U2OS细胞或 U2OS-ER-E2F-1细胞(用或不用1.0μM OHT和/或10μg/ml环己酰亚胺培养) 中分离总RNA。总RNA(4μg)用寡脱氧胸苷酸以及M-MLV反转录酶反转录， 其总反应体积为20μl。3μl cDNA样品在25mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 以及40μM特异性引物对存在的情况下在50μl总反应体积中进行聚合酶链反应 (PCR)。PCR的循环特征为：变性(94℃，30秒)，退火(51℃，30秒)以及 延伸(72℃，2分钟)，进行30个循环，包括一个在94℃下2分钟的起始变性步 骤以及一个在72℃下10分钟的末端精加工步骤。基因特异性引物序列可按需提 供。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析。
BrdU测定.生长在96孔平板的U2OS细胞暴露于载体或诱饵肽中。根据厂 商(Boehringer Mannheim)推荐，采用细胞增殖试剂盒，用ELISA比色测定监控溴 脱氧尿苷(BrdU)的整合。
确定细胞数量和生存力.使生长在6孔皿中24小时的U2OS细胞暴露于2ml 含有载体(0.5％DMSO)或50μM诱饵肽的生长培养基中48或72小时。处理 之后，将细胞用1×PBS洗涤两次，用胰蛋白酶消化来收获并重悬于1ml 1×PBS 中。从每个样品中取出10μl细胞悬浮液，并用电子或手工方法计数。对于电子 总细胞计数，将10μl细胞悬浮液稀释于20ml isotonII缓冲液(Coulter)中，用 电子Coulter计数器评估细胞数。对于手工计数活细胞，将每个样品中的10μl 细胞悬浮液与等体积的锥虫蓝染料(Sigma，1×PBS中0.4％w/v)混合。活细胞 (未染色的)的数目用血细胞计数器手工计数。
细胞同步以及细胞周期进程分析.将6-孔皿中的U2OS细胞用洛可哒唑 (75ng/ml)处理22小时。然后，将用洛可哒唑停滞的培养物用1×PBS洗涤释放， 并培养于DMEM中，其中加入了含有载体(0.5％DMSO)或20μM诱饵肽的10 ％的FBS。以4小时间隔收获细胞用于标准蛋白印迹分析。为了分析Geminin蛋 白特征，模拟的-或细胞周期蛋白E/Cdk2-转染的U2OS细胞在转染后3小时被暴 露于洛可哒唑(75ng/ml)中22小时。
蛋白衰减(decay)分析.使转染或肽处理过的细胞暴露于20μg/ml环己酰 亚胺(CHX)中。从CHX处理后0，1，2，3，4或5小时的处理细胞中制得全 细胞裂解物用于蛋白印迹分析。
变性SDS-PAGE以及蛋白印迹.用前述(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273-2285(2001))标准变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自全细胞裂解物以及IP 复合物的蛋白。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶测定.通过在2000rpm于4℃下离心15分 钟收获6-孔皿中贴壁的以及脱附的细胞。获得的细胞沉淀在50μl冷的裂解缓冲 液(Clontech)中于冰上温育10分钟。细胞裂解物在含有10mM HEPES，2.0mM EDTA，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1.0mM PMSF，抑酶肽(aprotinine)，胃酶抑制剂A 以及亮抑蛋白酶肽(leupeptine)(各20μM)，6.0mM DTT以及Ac-DEVD-AFC(4.0 μg/ml)的反应混合液中温育。反应可以在室温下进行。用分光荧光计(激发波长 ＝400nm；发射波长＝505nm)在1小时中每隔15分钟进行一次萤光记录。
图注
图1：TRIP-Br诱饵肽拮抗KRIP-1/TRIP-Br PHD-溴结构域的相互作用.(A) 免疫沉淀(IP)测定的放射自显影图显示了特定KRIP-1/TRIP-Br PHD-溴结构域的 体外相互作用以及诱饵肽的阻断活性。GAL4-KRIP-1被缀合在琼脂糖上的抗- GAL4抗体(泳道3-5&7-10)特异性免疫沉淀，但不能被非特异的对照抗细胞周 期蛋白E的抗体(泳道6)免疫沉淀；(B)体内PHD-溴结构域相互作用的拮抗 作用。用0.4μg所示的GAL4表达构建体以及1.2μg pMT3A/KRIP-1、连同0.4 μg最小萤光素酶报道分子pG5-GL3以及0.1μg对照报道分子pCMV/β-gal 瞬时地转染U2OS细胞。收获之前将转染的细胞暴露于载体(0.5％DMSO)或50 μM所示的诱饵肽中，用于萤光素酶和半乳糖苷酶活性的相继测定。活化倍数(fold activation)是指标准化成β-半乳糖苷酶活性的萤光素酶活性，并相对于单独用 报道分子转染所观察到的活性进行表示。数值代表了至少两个独立试验的平均数 +/-标准差。
图2：被U2OS细胞吸收的肽的分析.(A)用荧光显微术监控肽的内在化。 图片显示了在处理后24小时时FITC标记的*SCR，*Br1以及*Br2内化入U2OS 细胞；(B)用流式细胞仪测量肽内在化效率。用WinMDI软件确定FITC阳性细 胞百分比。数值代表了两个独立试验的平均数+/-标准差。将斯氏t检验用于比较 数值。对于所有肽处理的同时比较，P＝0.454。
图3：对诱饵肽处理应答的U2OS细胞中的E2F-应答转录分析.(A)用0.1 μg pCMV/β-半乳糖苷酶以及7.5μg指示的萤光素酶报道分子质粒共转染的 U2OS细胞的β-半乳糖苷酶/萤光素酶测定。载体处理过的样品的启动子活性被 标准化为100％，且肽处理样品的活性相对于载体处理的对照进行表示。数值代 表了至少两个独立试验的平均数+/-标准差；(B)对暴露于载体(0.5％DMSO) 或50μM指示的诱饵肽16小时的U2OS细胞中的dhf、细胞周期蛋白-E、细胞 周期蛋白A2、PCNA、DNA Pola以及cdc2表达的总RNA的半定量RT-PCR分析。 引入H-肌动蛋白作为内部对照。图形显示了获自两个独立试验的结果。
图4：诱饵肽的依赖时间的以及依赖剂量的抗增殖作用.(A)诱饵肽的依赖 时间的抗增殖作用。用ELISA比色测定分析暴露于载体(0.5％DMSO)或50μ M诱饵肽中24或48小时的U2OS细胞的BrdU整合。数值代表了两个独立试验 的平均数+/-标准差；(B)诱饵肽的依赖剂量的抗增殖作用。用ELISA比色测定 分析暴露于5，10，20或50μM的*SCR(实线以及正方形)，*Br1(虚线以及三角 形)或*Br2(虚线以及圆形)中48小时的U2OS细胞的BrdU整合。数值代表了至少 两个独立试验的平均数+/-标准差；(C)细胞增殖分析。左板：在诱饵肽处理后0， 48以及72小时，用Coulter计数器电子测定总细胞数。右板：在处理后72小时， 收获细胞并用锥虫蓝染色以进行活细胞计数分析。
图5：在用诱饵肽处理后24以及72小时的U2OS细胞非同步群体的流式细 胞仪分析.(A)暴露于载体(DMSO)或所示的诱饵肽中24小时的U2OS细胞 非同步群体的细胞周期分布图。在未处理的对照(无阴影)的图中添加进每个处理样 品(划上阴影线的)的细胞周期图用于可视比较。表显示了细胞周期中各个期的 细胞百分比；(B)处理后72小时细胞周期分布图的图示。数值代表了两个独立试 验的平均数+/-标准差。
图6：天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶分析.(A)用Ac-DEVD-AFC荧光底 物测定暴露于Eto(足叶乙甙)中24小时或50μM诱饵肽中48或72小时的U2OS 细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3蛋白酶的活性。柱状图显示了每μg加 入的全细胞裂解物的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3蛋白酶活性。数值代表了 两个独立试验的平均数+/-标准差。对照：于正常生长培养基中培养细胞；载体： 在0.5％DMSO存在的情况下培养的细胞；(B)PARP切割的蛋白印迹分析。将 U2OS细胞暴露于Eto(足叶乙甙)中24小时或50μM诱饵肽中72小时。泳道1： 载体细胞(在0.5％DMSO存在的情况下培养24小时)；泳道2：25μM Eto；泳 道3：250μM Eto；泳道4：载体(细胞在0.5％DMSO存在的情况下培养72小 时)；泳道5：*SCR；泳道6：*Br1；泳道7：*Br2。
图7：细胞周期蛋白表达图以及蛋白衰减分析.(A)在不存在或存在诱饵肽 处理的情况下，从洛可哒唑停滞中释放出来的U2OS细胞的蛋白表达图。通过蛋 白印迹法用获自释放后4，8，12，16，20以及24小时的同步化的U2OS细胞的 全细胞裂解物对各种细胞周期蛋白以及Cdks的蛋白表达进行估计。考马斯染色蛋 白用作加样对照(loading control)；(B)用载体主链(载体)或pRc/细胞周期蛋白 E以及pCMV/Cdk2(各1μg)转染的U2OS细胞通过暴露于洛可哒唑(75ng/ml) 被停滞在G2/M边界，并随后被释放重新进入细胞周期。使用了获自释放后0，4， 8，12，16以及20小时的同步化的U2OS细胞的全细胞裂解物来估计细胞周期蛋 白E以及Geminin的蛋白表达；(C)在细胞周期蛋白E/Cdk2超表达不存在或存 在的情况下(左板)或在不存在或存在诱饵肽处理情况下(右板)，用蛋白印迹法 (WB)对Geminin表达蛋白进行的衰减分析。考马斯染色蛋白用作加样对照(C)。
图8：在细胞周期蛋白E调节中的TRIP-Br整合功能的作用.(A)在获自暴 露于5，10或20μM诱饵肽中48小时的U2OS细胞的全细胞提取物中，对细胞 周期蛋白A，D和E表达进行的蛋白印迹分析。Cdk2用作加样对照；(B)作用 于Fbxw7表达的诱饵肽的依赖剂量的作用。用半定量RT-PCT分析暴露于5，10 或20μM诱饵肽中的U2OS细胞的Fbxw7 mRNA转录物水平。H-肌动蛋白作为 内部对照被共扩增；(C)如所示，通过半定量RT-PCR应用在有或没有OHT和/ 或环己酰亚胺(CHX)时生长2小时的分会合的U2OS ER-E2F-1细胞内的总RNA 进行细胞周期蛋白-E和Fbxw7表达分析。引入H-肌动蛋白作为内部对照。
图9：在依赖E2F的细胞周期进程中TRIP-Br整合功能的作用.提出了 TRIP-Br蛋白以一种有助于依赖E2F的细胞周期进程的方式整合并转导由各种 PHD-溴结构域蛋白带来的调节信号。
结果
TRIP-Br诱饵肽在体外以及体内拮抗KRIP-1/TRIP-Br PHD-溴结构域相互作 用.设计了相应于TRIP-Br1(*Br1)和TRIP-Br2(*Br2)的PHD-溴结构域相互 作用区域的肽(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273-2285(2001))，以及具有*Br1肽 (见材料和方法)相同氨基酸组成的对照的“拼凑的(scrambled)”(*SCR)肽。 如用基序-开采(motif-mining)运算法则确定的( http：//www.motif.genome.ad.jp/； 未示数据)，*SCR肽序列与任何已知蛋白基序相比，不具有显著同源性。为了促 进诱饵肽转运到培养的细胞中，每个肽的氨基末端都标记上由黑腹果蝇触角足同 源域蛋白的第三螺旋所得的16个氨基酸的细胞膜穿透肽序列(Derossi，D.，等人.J. Biol.Chem.269，10444-10450(1994))。该膜-转位序列已被证实具有将用它标记的无 关肽序列内化的能力(Bandera，L.R.，等人.Nature Biotech.15，896-901(1997))。
我们的结果表明上述诸肽拮抗TRIP-Br/KRIP-1蛋白复合物形成。采用抗- GAL4抗体，体外翻译(IVT)的GAL4-KRIP-1融合蛋白的免疫沉淀(IP)导致 了TRIP-Br1或TRIP-Br2IVT产物的共免疫沉淀(co-IP)(图1A，泳道3&4)。仅 有GAL4不会导致TRIP-Br的共免疫沉淀(图1A，泳道1&2)，而且GAL4-KRIP-1 与对照的萤光素酶IVT产物也不会共免疫沉淀(图1A，泳道5)。当把对照*SCR 肽加入到IP结合反应中时，不影响GAL4-KRIP-1/TRIP-Br复合物的形成(图1A， 泳道7&9)，而加入*Br1或*Br2诱饵肽则显著降低了GALA-KRIP-1与TRIP-Br1 或TRIP-Br2共免疫沉淀的能力(图1A，泳道8&10)。这些发现表明*Br1或*Br2 特异性阻断TRIP-Br蛋白在体外与KRIP-1的PHD-溴结构域相互作用的能力。
在U2OS细胞中使用了在先描述的报道分子系统(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273-2285(2001))，我们发现细胞暴露于*Br1或*Br2而不是*SCR中导致完全消 除了对于GAL4-TRIP-Br转录活性的KRIP-1-相关的共活化功能(图1B，泳道4&5 与泳道3的比较，以及泳道8&9与泳道7的比较)。这些发现表明*Br1和*Br2能 够在体内功能性地拮抗TRIP-Br蛋白的PHD-溴结构域相互作用的功能。
直接荧光成像表明所有三种诱饵肽都被有效地内化进入U2OS细胞(图 2A)。流式细胞仪分析证实了不同肽的内化效率之间没有统计学显著差异(图 2B)。
TRIP-Br蛋白的PHD-溴结构域相互作用功能在体内共调节依赖E2F的转录 活性.我们用*Br1和*Br2拮抗了该功能并改变了作用于E2F-应答报道分子的内 源E2F/DP活性水平。选择U2OS细胞用于该测定是因为它表达功能性的E2F- 1，DP-1，Rb以及具有可检测水平的内源TRIP-Br1(用兔多克隆的抗TRIP-Br1 抗体通过蛋白印迹分析进行估计(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273- 2285(2001))；数据未显示)。在收获细胞用于测量萤光素酶活性之前，将用E2F 应答萤光素酶报道分子(pGL3-TATA-6xE2F-Luc)或者含TATA的最小萤光素 酶报道分子(pGL3-TATA-Luc)转染的U2OS细胞暴露于载体(DMSO)或50 μM的*SCR、*Br1或*Br2中5小时。用*Br1或*Br2但不用*SCR的处理，降低 了E2F应答萤光素酶报道分子的转录活性(图3A，左板)。虽然用*SCR和*Br1 的处理与轻微激活相关，但用*Br2的处理没有显著改变最小报道分子的转录活性 (图3A，右板)。所有三种诱饵肽均不能影响受雄激素-应答的但E2F非应答的人 前列腺特异性抗原(PSA)近端启动子驱动的萤光素酶报道分子的转录活性(数 据未显示)。这些结果显示，观察到的、与细胞暴露于*Br1或*Br2相关的转录抑 制是通过干扰含TRIP-Br的蛋白复合物装配到E2F结合位点上而特异介导的。
用半定量RT-PCR分析法测量由六个代表性E2F调节的基因表达的内源 mRNA水平，这六个基因是：细胞周期蛋白-E(Ohtsubo，M.，等人.Mol Cell Biol 15，2612-2624(1995))，细胞周期蛋白-A2(Rosenblatt，J.等人.Proc Natl Acad Sci USA 89，2824-2828(1992))；Roy，L.M.，等人.J.Cell Biol 113，507-514(1991))，dhfr (Miller，G.P.和Benkovic，S.J.Chem Biol 5，105-113(1998))，PCNA(Warbrick，E. Bioessays 22，997-1006(2000))，DNA Polα(Frick，D.N.和Richardson，C.C.Annu Rev Biochem 70，39-80(2001))以及cdc2(Smits，V.A.以及Medema，R.H.Biochim Biophys Acta 1519，1-12(2001))。这些基因编码的蛋白在细胞周期的不同的期具有关键作 用。将细胞暴露于*Br1或*Br2导致cdc2基因显著下调，正如明显降低的cdc2 mRNA转录物水平所反应出的那样(图3B)。相反，DNA Polα以及dhfr的mRNA 表达水平通过暴露于*Br2而不是*Br1而被下调(图3B)。细胞周期蛋白-E、细胞 周期蛋白-A2以及PCNA基因的转录活性不受暴露于*Br1或*Br2的影响(图 3B)。经调查，相对于载体处理过的对照，拼凑的肽*SCR在基因表达特征上产生 的影响可忽略不计。因此，诱饵肽介导的对TRIP-Br蛋白与内源的含PHD锌指和 /或溴结构域的因子之间相互作用的拮抗反应，导致了U2OS细胞中内源性E2F- 应答基因亚型转录活性有差异的下调。
TRIP-Br整合功能的拮抗作用引起了增殖性阻断.已经表明E2F转录因子在 整合细胞周期装置与转录装置的活性来调节细胞增殖的过程中发挥极其重要的作 用(Lam，E.，等人.Curr Opion Cell Biol 6，859-866(1994))。不同步的U2OS培养物 在载体或诱饵肽(50μM)中暴露24或48小时，然后通过BrdU整合测定增殖 潜力。在处理后24小时到48小时，暴露于*Br1或*Br2的培养物显示出DNA合 成活性被大大降低(图4A)。相反，用*SCR处理的细胞则显示出基本的DNA合 成速率，类似于载体处理过的对照细胞。暴露于不断增加浓度的*Br1或*Br2而非 的*SCR中的U2OS细胞显示出与BrdU整合的能力逐渐减小(图4B)，表明和暴 露于*Br1或*Br2诱饵肽相关的、对DNA合成的抑制作用是特异的并且是依赖剂 量的。与BrdU整合数据相一致，随着时间的推移，虽然*Br1或*Br2处理过的培 养物显示出细胞增殖几乎完全停滞，但载体和*SCR处理过的培养物则显示出几乎 相同的细胞数目增长(图4C，左板)。锥虫蓝染色排除的手工细胞计数分析证实 用*Br1或*Br2处理72小时的U2OS细胞培养物含有的活细胞明显少于载体或 *SCR处理过的对照(图4C，右板)。这些表型是可再现的，已知CNE2(鼻咽癌) 以及Caski(子宫颈癌)，即两种其他的已知表达TRIP-Br1和TRIP-Br2的癌细胞 系，对Br1或*Br2的反应会有类似于U2OS细胞的表现(数据未显示)。
TRIP-Br诱饵肽通过不依赖天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的机理诱导亚 -G1群体的聚集.我们使用流式细胞仪来调查暴露于载体、*SCR、*Br1或*Br2 中24以及72小时的U2OS细胞非同步群体的细胞周期特征。在处理后24小时， 记录显示暴露于*Br1或*Br2中的细胞在亚-G1(亚-二倍体)的群体要比载体和 *SCR处理过的细胞高出1.5-2.5倍(图5A)。处理后72小时的亚-二倍化的数量 甚至更大，在*Br1或*Br2处理过的培养物中超过70％的的细胞表现为基因组 DNA的亚-G1补体(图5B)。
亚-G1细胞群体的诱导经常与伴随细胞凋亡的基因组DNA内切核酸降解相 关。用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3特异性的合成寡肽底物(Ac-DEVD- AFC)来测定由*SCR、*Br1或*Br2处理48或72小时的U2OS细胞的天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶-3蛋白酶活性。由载体、*SCR、*Br1或*Br2处理过的培 养物制得的细胞裂解物中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的蛋白酶活性水平 与从未处理对照中获得的细胞裂解物中探测到的基线活性没有区别，如分光荧光 测定法所确定的(图6A)。未能检测到天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性不 归因于技术失误，因为用诱导细胞调亡的药理学试剂足叶乙甙(eto)处理的细胞 显示出天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性依赖剂量的的激活要高出基线几个 数量级(图6A)。为证实获自天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3测定的结果，平 行进行了PARP(多腺苷二磷酸核糖聚合酶)切割研究(Patel，T.，等人.FASEB 10，587-597(1996))(图6B)。虽然暴露于足叶乙甙24小时的结果是PARP以依赖 剂量的方式切割(图6B，泳道1-3)，但与用载体或*SCR处理过的对照相比， *Br1或*Br2处理与显著的PARP切割无关(图6B，泳道4-7)。*Br1或*Br2不 能刺激天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性和PARP切割强有力地反驳了天冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3以及因此典型的细胞凋亡在TRIP-Br诱饵肽-诱导的 亚-二倍体过程中的介入。
不完全DNA复制：另一种亚-二倍体化机理.对于大多数真核细胞，每个细 胞周期发生一次DNA复制以维持基因组的稳定性。这种严格要求是由细胞周期 蛋白、Cdks以及复制前复合物(pre-PCs)之间的精密调节的相互影响完成的(Diffley， J.F，和Labib，K.J.Cell Sci 115，869-872(2002))。已证明G1期细胞周期蛋白的反常 表达可能会阻止复制前复合物(pre-RC)的形成以及以一种可能减少功能性复制 起点数量的方式来抑制复制的许可(Tanaka，S.和Diffley，J.F.Genes Dev 16，2639- 2649(2002))。在本文中，功能性起点的数量不足的后续复制可能会导致不完全 DNA合成以及由此造成染色体DNA的逐步丧失。细胞不能完成DNA复制会产 生不能维持稳定的2N倍性的子细胞，这在流式细胞仪分析中会记录一个亚-G1峰 值。
为了确定诱饵肽是否通过G1细胞周期蛋白表达的反常来产生预期的基因组 去稳定作用，我们研究了对诱饵肽应答的关键细胞周期蛋白-Cdk复合物的表达特 征。用洛可哒唑获得了U2OS细胞的细胞周期同步化，如用流式细胞仪分析测定 的，洛可哒唑有效地使超过90％的细胞停滞在了具有4N套DNA内含物的G2/M 边界(数据未显示)。随后在载体或一种诱饵肽存在的情况下，细胞从洛可哒唑阻 断中被释放出来。释放后每隔4小时，制备全细胞提取物。蛋白印迹分析表明内 源细胞周期蛋白A2和D1以及依赖细胞周期蛋白的激酶Cdk2的细胞周期表达特 征不受诱饵肽处理的影响(图7A)。在标记的对照中，我们发现在暴露于*Br1或 *Br2后，正常细胞周期-调节的动力学和细胞周期蛋白E蛋白的表达幅度明显紊 乱。在载体以及*SCR处理的U2OS细胞中，细胞周期蛋白E在释放后8小时到 16小时在G1的中期到晚期过程中累积(图7A)。当细胞进入S期后，由于遍在 蛋白介导的蛋白水解，细胞周期蛋白E的水平逐步减少(Koepp，D.M.等人.Cell 97，431-434(1999))。与载体或*SCR处理的细胞相比，*Br1或*Br2处理的细胞在 G1早期(早在释放后4小时)就开始显示细胞周期蛋白E的过早的累积。更进一 步地，在*Br1或*Br2处理的培养物中，细胞周期蛋白E的绝对水平被显著上调并 维持在高水平达到释放后最多24小时。这些发现表明TRIP-Br“整合”功能在阻 止细胞周期蛋白E在细胞周期中的累积中起着生理上重要的作用。用诱饵肽拮抗 该功能可能会通过上调细胞周期蛋白E的表达而影响DNA复制的效率。
通过作用于大量的蛋白靶，Cdks抑制pre-RC的形成及随后的DNA复制的 许可。这些靶中的其中之一是后期促进性复合物/周期小体(APC/C)，即一种E3遍 在蛋白连接酶。APC/C已显示在G1早期通过加速Geminin降解来促进DNA复制 的许可，Geminin是一种25kDa核蛋白，可通过其与Cdt1相互作用阻止MCM蛋白 整合入pre-RC来抑制DNA复制(Diffley，J.F.和Labib，K.J.Cell Sci 115，869- 872(2002)；Wohlschlegel，J.A.等人.Science 290，2309-2312(2000))。Geminin在S、G2 以及M期高度表达，并通常在中期-后期过渡时通过APC/C作为遍在蛋白介导的蛋 白降解的靶，以使DNA复制发生在随后细胞周期的G1早期(McGarry，T.J.和 Kirschner，M.W.Cell 93，1043-1053(1998))。APC/C相关的E3连接酶活性由细胞周 期蛋白B/Cdc2在有丝分裂期打开，并由G1细胞周期蛋白-相关的Cdk活性关闭。 因而，在G1早期的G1细胞周期蛋白表达的反常将使APC/C失活，从而使得 Geminin的异常累积以及阻止pre-RC的装配。
U2OS细胞首先用编码人细胞周期蛋白E以及Cdk2的表达质粒共转染，然 后用洛可哒唑停滞在G2/M边界。在释放后，以4小时间隔由同步周期的细胞制 备全细胞裂解物，以通过免疫印迹法估计Geminin的表达。与前面的报道(McGarry， T.J.和Kirschner，M.W.Cell 93，1043-1053(1998))相一致，在模拟转染(载体)的 对照细胞中，发现Geminin在G2/M边界以及S期被高水平表达，但在G1期间探 测不到(图7B)。相反，在G1期过程中细胞周期蛋白E/Cdk2的超表达的存在 诱导了Geminin的异常累积(图7B)。这些数据提示反常的细胞周期蛋白E/Cdk2 的表达诱导了Geminin蛋白的异常累积。
对Geminin进行了蛋白衰减分析。使对照(载体)或细胞周期蛋白E/Cdk2 超表达的细胞暴露于蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)，然后间隔1小时至最多 5小时从处理过的细胞中制备全细胞裂解物，以通过免疫印迹法分析估计内源 Geminin的水平。在对照细胞中，Geminin保持高水平，直至CHX处理之后3小 时，之后其水平急速下降(图7C，左板)。在标记的对照中，表达细胞周期蛋白 E/Cdk2的细胞中的Geminin水平持续保持较高直至CHX处理后最多5小时(图 7C，左板)。综上所述，这些结果表明反常的细胞周期蛋白E/Cdk2的表达导致了 Geminin的稳定。
将U2OS细胞暴露于载体或诱饵肽中，然后暴露于CHX中以进行蛋白衰减 分析。用载体或*SCR处理的细胞均表现出类似的Geminin蛋白衰减动力学(图 7C，右板)。在标记的对照中，*Br1或*Br2处理过的细胞中Geminin表现出明显 较慢的衰减速率以及维持高水平直至CHX处理后最多5小时的稳定状态的水平 (图7C，右板)。这些数据与模型相一致，模型中TRIP-Br诱饵肽通过涉及细胞 周期蛋白E反常以及Geminin稳定的机理，抑制DNA复制许可从而诱导亚-二倍 性。
TRIP-Br诱饵肽下调Fbxw7转录物水平.所观察的细胞周期蛋白E反常看来 不是由于细胞周期蛋白E转录物水平的改变而引起的(图3B)。细胞周期蛋白E 的特异的和适时的(周期性的)依赖细胞周期的表达模式主要受SCF-型遍在蛋白 连接酶复合物的调节，该复合物靶向细胞周期蛋白E以进行蛋白体-介导的蛋白水 解(Koepp，D.M.等人.Cell 97，431-434(1999))。因此，在*Br1或*Br2处理的细胞 中，所观察的细胞周期蛋白E蛋白水平的上调可能归因于诱饵肽诱导的上述遍在 蛋白-蛋白体途径的改变。由于*Br1或*Br2处理诱导了依赖剂量的细胞周期蛋白E 蛋白的累积而不会影响细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白A2(两种已知受遍在蛋 白介导的蛋白水解调节的蛋白)的蛋白水平(图8A，上板)，我们推论诱饵肽改 变了一个或多个细胞周期蛋白E-特异的遍在蛋白连接酶(E3酶)的表达和/或活 性。我们实施了半-定量RT-PCR以测量诱饵肽处理的细胞中Fbxw7mRNA转录物 的水平。Fbxw7基因产物，FBW7，其作为负责靶向蛋白特异性的SCF复合物的 F-box蛋白组分，近来已被鉴定为重要的细胞周期蛋白E丰度生理调节剂(Koepp， D.M.等人．Science 294，177(2001))。*Br1或*Br2，而非*SCR，以依赖剂量的 模式下调了Fbxw7的表达水平(图8B)。预计不能维持FBW7蛋白正常表达水平将 会消除SCFFBW7复合物特异地使细胞周期蛋白E多遍在蛋白化(poly-ubiquitinate) 的能力。这些结果提示TRIP-Br诱饵肽介导的拮抗通过涉及Fbxw7mRNA表达的 下调的机理，导致了细胞周期蛋白E在细胞周期中反常累积。
Fbxw7是一种新的E2F应答基因.硅上(in silico)分析中揭示了在Fbxw7启 动子区域中存在着几种与共有E2F应答元件明显同源的的顺式作用元件。因此， 可以想到*Br1或*Br2处理会导致直接或间接的对依赖E2F的Fbxw7基因转录的 抑制。我们接下来使用了可稳定表达融合到E2F-1转录因子上的雌激素受体(ER) 嵌合(chimaeric)蛋白的U2OS细胞。以前已经证明ER-E2F-1融合蛋白作为失活 细胞质蛋白在相对较低的水平上表达(Lomazzi，M.，等人.Nat Gen 31，190- 194(2002))。一旦加入雌激素类似物4-羟基三苯氧胺(OHT)，ER-E2F-1就转位到核 中并反式激活E2F应答启动子(Lomazzi，M.，等人.Nat Gen 31，190-194(2002))。 通过检查细胞周期蛋白-E(一种已知的E2F靶基因)的表达，我们确认加入OHT 之后ER-E2F-1被激活。我们的RT-PCR分析表明ER-E2F-1的激括导致细胞周期 蛋白-E的强烈的诱导(图8C)。即使在蛋白合成抑制剂环己酰亚胺存在的情况下， ER-E2F-1的激活同样导致Fbxw7表达的增加，非常类似细胞周期蛋白-E(图8C)。 当中间体因子的从头合成缺失时，会出现推定的E2F-应答基因的ER-E2F-1介导 的转录，这一实例使得我们得出这样的结论：Fbxw7是E2F-1的直接靶。
实施例2：利用DNA酶破坏TRIP-Br的功能
材料和方法
质粒DNA和cDNA克隆.pRcSV/细胞周期蛋白E以及pCMV/Cdk2均由 Steve Reed博士(The Scripps Research Institute，美国)友情赠与。其他用于转染试 验的质粒DNA和cDNA克隆已经在先描述过(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273-2285(2001))。
生化试剂.用于细胞周期蛋白D1(sc-718)，细胞周期蛋白E(sc-481)， Cdk4(sc-601)和p27KIP1(sc-528)的多克隆抗体，以及HRP-缀合的抗-兔(sc-2004) 和抗-小鼠(sc-2005)第二抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
合成的寡核苷酸.商业合成(GENSET SA，Paris)在3’位置具有反向胸腺嘧 啶核苷的DNA酶。合成下列三种DNA酶： E-Br2 5’-T TAC CCA ACA GGC TAG CTA CAA CGA ATA TCA CA-3’ SEQ ID NO.：6 E-Br1 5’-T TGC TCA GCA GGC TAC CTA CAA CGA CTT GCT CA-3’ SEQ ID NO.：7 E-SCR 5’-C AGC TAC TGT GGC TAG CTA CAA CGA GCT GTC AT-3’ SEQ ID NO.：9
对应于每个DNA酶催化中心的残基加了下划线。
组织培养细胞系.人肺成纤维细胞WI-38购自美国典型培养物保藏中心 (American Tissue Culture Collection)(ATCC)，维持在37℃、在含有5％二氧化碳 (CO2)的湿润气氛中的75厘米V/C组织培养烧瓶(NuncTM)中，并在补充了10 ％特性化的胎牛血清(FBS)(Hyclone)以及抗微生物剂(50IU/ml青霉素，50μg/ml 链霉素以及50μg/ml艮他霉素)的Dulbecco氏修饰的Eagle氏培养基(DMEM) (Sigma)中培养。为了在各种平板格式(NuncTM)中进行传代培养，细胞一律以5 ×104细胞/10cm2接种。用于试验的细胞处于3-10次传代之间。
DNA酶转染.在DNA酶(0.1μM)转染前，如在先报道(Santiago，F.S.，等人. Nat Med 5，1264-1269(1999))采用Superfect按照厂商(Qiagen)的推荐，通过将 WI-38细胞培养于无血清培养基中72小时而使其休眠。
细胞增殖测定.为用于BrdU整合测定，将在96-孔皿中的生长休眠的WI-38 细胞用DNA酶和/或100ng的pCMV/E2F1，pCMV/DP1，pRSV/细胞周期蛋白E 或pCMV/Cdk2转染，然后在10％FBS存在或不存在的情况下暴露于溴脱氧尿苷 (BrdU，100μM)20小时。按照厂商的推荐(Boehringer Mannheim)，使用细胞 增殖试剂盒通过ELISA比色测定监控溴脱氧尿苷(BrdU)的整合。为进行手工细 胞计数，将处于24-孔皿中的生长休眠的WI-38细胞用DNA酶转染，然后在10 ％FBS中暴露72小时。细胞用pH7.4的PBS清洗，然后胰蛋白酶消化，从每个 样品中取出10μl细胞悬浮液并与等体积的锥虫蓝染料(Sigma，0.4％w/v溶于1× PBS)混合。未染色的细胞数用血细胞计数器手工数出。为进行菌落形成的测定， 将位于12-孔皿中的生长休眠的WI-38细胞用DNA酶转染，然后暴露于10％FBS 中120小时。细胞用结晶紫(0.75％w/v六甲基氯化对蔷薇苯胺[SIGMA]，50％乙醇， 1.75％w/v多聚甲醛，0.25％w/vNaCl)原位染色10分钟，然后用去离子水彻底清洗 以去除多余的染料。
半-定量RT-PCR.各种处理后，6-孔培养皿中的WI-38细胞用TRIZOL试 剂(Life Technologies)提取总RNA。总RNA(4μg)在20μl的总反应体积中用 寡脱氧胸苷酸以及M-MLV反转录酶进行反转录。用3μl cDNA样品在含有25mM 脱氧核苷三磷酸(dNTPs)以及40μM特异引物对的50μl总反应体积中进行聚 合酶链反应(PCR)。PCR的循环特征为：变性(94℃，30秒)，退火(51℃，30 秒)以及延伸(72℃，2分钟)进行30个循环，包括一个在94℃下2分钟的起始 变性步骤以及一个在72℃下10分钟的末端精加工步骤。基因特异引物可按需提 供。PCR后的样品用琼脂糖凝胶电泳进行分析。
蛋白印迹分析.6-孔培养皿中的细胞在冷的PBS中洗涤，并在样品缓冲液 (50mM Tris-Cl，pH6.8，2％SDS，10％甘油，0.1％溴酚蓝以及100mM DTT) 中裂解。全细胞裂解物在电泳前于100℃加热10分钟。用由积层凝胶以及10％分 离凝胶组成的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统分离复合的蛋白混合物。电泳是在1 ×电泳缓冲液(25mM Tris，pH8.6，0.19M甘氨酸，0.1％SDS)，小型垂直电泳 仪(BIO-RAD)于稳定电压(80V)的条件下进行的。将分离后的蛋白用电印迹 法(30V，4℃过夜)在转移缓冲液(50mM Tris，384M甘氨酸，20％甲醇， 0.01％SDS)中转移到硝化纤维素膜上(ImmobilonTM-P，Millipore)。封闭后(1 ×PBS，0.5％Tween20，4％[w/v]脱脂奶)，靶蛋白用1∶2500稀度的特异第一抗 体检测。利用与辣根过氧化物酶(Santa Cruz)缀合的抗小鼠或抗兔IgG抗体，使 用加强的化学发光(Pierce)显现1∶2500稀度的免疫反应性蛋白。
图注
图10：(A)通过DNA酶的基因表达的转录后抑制.DNA酶通过杂交臂上的 互补碱基对结合到靶mRNA上。这样就将DNA酶催化中心安置在接近mRNA翻 译起始的位点，以促进磷酸二酯键在起始密码子的A和U残基之间断裂。一旦断 裂，产生的mRNA片段不能翻译，因此不能合成多肽。DNA酶释放切割的产物 并继续切割其他mRNA底物。(B)靶向TRIP-Br转录物的DNA酶以一种促进磷 酸二酯键在“AUG”起始密码子的A和U残基之间断裂的方式，设计两个10- 核苷酸的、位于E-Br1或E-Br2 DNA酶的15-核苷酸催化结构域侧面的杂交臂， 以分别选择性结合到hTRIP-Br1或hTRIP-Br2 mRNA上。作为对照，拼接E-Br1 的每个臂的核苷酸序列而产生具有完整催化结构域且该催化结构域侧面是由随机 序列组成的杂交臂的DNA酶E-SCR。为了赋予对3’-至-5’外切核酸酶的抗性， 每个DNA酶的3’末端加上了一个反向的3’-3’-连接的胸腺嘧啶核苷帽子。
图11：(A)hTRIP-Br1和hTRIP-Br2表达是可血清诱导的.使分会合的WI- 38细胞缺乏血清72小时。血清再刺激后24小时，对总RNA进行半定量RT-PCR 分析，以估计hTRIP-Br1和hTRIP-Br2的表达。引入β-肌动蛋白作为内部对照。 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，且在UV下显示溴化乙锭染色的DNA条带。 (B)E-Br1和E-Br2分别下调hTRIP-Br1和hTRIP-Br2的表达.使分会合的WI-38 细胞缺乏血清72小时之后用0.1μM所示DNA酶转染。对总RNA进行半定量 RT-PCR分析以估计hTRIP-Br1和hTRIP-Br2的表达。引入β-肌动蛋白作为内部 对照。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，且在UV下显示溴化乙锭染色的DNA 条带。
图12：(A)E-Br1和E-Br2抑制细胞增殖.使分会合的WI-38细胞缺乏血清 72小时。DNA酶转染后，培养物用血清再刺激以使之增殖。72小时后，收获细 胞用于存活细胞计数分析。使获自每个样品的10μl细胞悬浮液与等体积的0.4％ 锥虫蓝染料混合。未染色的细胞数用血细胞计数器手工数出。数据代表了至少两 个独立试验的平均数。斯氏t检验表明与E-Br1和E-Br2处理相关的细胞数明显比 与E-SCR处理相关的细胞数低(P＜0.05)(在E-Br1对E-SCR处理的情形中 P＝3.25E-02，以及在E-Br2对E-SCR处理的情形中P＝1.44E-02)。(B)E-Br1和 E-Br2抑制菌落形成.使分会合的WI-38细胞缺乏血清72小时。DNA酶转染后， 培养物用血清再刺激以使之增殖。72小时后，细胞用结晶紫原位染色。
图13：(A)E-Br1或E-Br2抑制可血清诱导的S期进入.使分会合的WI-38 细胞缺乏血清72小时。DNA酶转染后，在BrdU标记的培养基中将培养物用血清 再刺激以使之增殖。20小时后，用ELISA比色测定分析细胞的BrdU整合。值代 表了至少两个独立试验的平均数。斯氏t检验表明与E-Br1和E-Br2处理相关的 BrdU整合明显比与E-SCR处理相关的BrdU整合低(P＜0.05)(在E-Br1对E-SCR 处理的情形中P＝1.29E-03，以及在E-Br2对E-SCR处理的情形中P＝8.47E-05)。 (B)E-Br1或E-Br2不影响E2F1/DP1-和/或细胞周期蛋白E/Cdk2-诱导的S期 进入.使分会合的WI-38细胞缺乏血清72小时。用DNA酶以及编码所示细胞周 期调节剂的表达质粒转染后，在BrdU标记的培养基中使培养物增殖。20小时后， 用ELISA比色测定分析细胞的BrdU整合。值代表了至少两个独立试验的平均数。
图14：(A)E-Br1或E-Br2消弱了促细胞分裂原激发的CCNE基因诱导.使 分会合的WI-38细胞缺乏血清72小时。DNA酶转染后，将培养物用血清再刺激 以使之增殖。20小时后，收获细胞并提取总RNA以进行半定量RT-PCR分析， 以估计CCNE的表达。引入β-肌动蛋白作为内部对照。PCR产物用琼脂糖凝胶 电泳分离，且在UV下显示溴化乙锭染色的DNA条带。(B)E-Br1或E-Br2阻止 促细胞分裂原诱导的细胞周期蛋白E的表达而不会改变Cdk4，细胞周期蛋白D1 和p27KIP1的表达.使分会合的WI-38细胞缺乏血清72小时。DNA酶转染后，使 培养物增殖。20小时后，收获细胞用于细胞周期蛋白E、Cdk4、细胞周期蛋白D1 和p27KIP1的表达的蛋白印迹(WB)分析。引入考马斯染色的蛋白作为标准化的 对照。
图15：(A)与TRIP-Br2+/+PMEFs相比TRIP-Br2-/-PMEFs表现出BrdU整合 明显减少.分会合的PMEFs培养物(TRIP-Br2+/+以及-/-)被培养于BrdU标记的 培养基中。20小时后，用ELISA比色测定分析细胞的BrdU整合。值代表了至少 两个独立试验的平均数。(B)与TRIP-Br2+/+PMEFs相比TRIP-Br2-/-PMEFs表现 出明显较低的血清诱导增殖率.使分会合的PMEFs缺乏血清72小时，然后用血清 再刺激。72小时后，收获细胞用于活细胞计数分析。将获自每个样品的10μl细 胞悬浮液与等体积的0.4％锥虫蓝染料混合。未染色的细胞数用血细胞计数器手工 数出。数据代表了至少两个独立试验的平均数。(C)TRIP-Br2失活导致CCNE基 因的下调.提取来自野生型(+)或TRIP-Br2无效(-)PMEFs的总RNA用于 半定量RT-PCR分析以估计CCNE的表达。引入β-肌动蛋白作为内部对照。PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分离，且在UV下显示溴化乙锭染色的DNA条带。
图16：流程图显示了通过TRIP-Br调节可血清-诱导的细胞周期过程。
结果
E-Br1或E-Br2 DNA酶特异“剔除(knock down)”血清诱导的hTRIP-Br1 或hTRIP-Br2基因表达.使用DNA酶剔除在WI-38人二倍体成纤维细胞中的内 源的人TRIP-Br1或TRIP-Br2mRNA转录物的表达。由DNA酶获得对基因表达的 转录后抑制或基因“剔除”的机理用图10A表示。设计两种DNA酶(E-Br1和 E-Br2)分别特异性靶向人TRIP-Br1或TRIP-Br2的信使RNA的翻译起始位点AUG (图10B)。
撤除血清后使WI-38成纤维细胞休眠72小时。在休眠期，休眠的成纤维细 胞表达的hTRIP-Br1和hTRIP-Br2转录物达不到可检测的水平。一旦血清诱导后， 被刺激的WI-38细胞中hTRIP-Br1和hTRIP-Br2mRNA的稳定状态水平都被显著 提升(图11A)，表明TRIP-Br基因的表达是血清-应答的。
为评价E-Br1或E-Br2对内源hTRIP-Br1或hTRIP-Br2mRNA的作用，生长- 休眠的WI-38成纤维细胞被预先暴露于DNA酶中24小时，然后用10％FBS刺激 其再次进入细胞周期。刺激后16小时，收获总RNA并进行半定量RT-PCR以测 量完整TRIP-Br转录物的水平。为了区分完整的和切割的转录物，采用与在DNA 酶切割位点侧面的靶序列碱基配对的基因特异性引物对进行RT-PCR，因此只有 完整转录物才被优先扩增。结果表明，0.1μM E-Br1或E-Br2分别地有效下调了 可血清诱导的稳定态的hTRIP-Br1或hTRIP-Br2mRNA水平，而E-SCR没有作用 (图11B)。这些发现表明E-Br DNA酶能够以序列特异的方式剔除hTRIP-Br基因 转录的血清诱导。
E-Br抑制血清诱导的WI-38细胞增殖.为了确定是否在血清诱导过程中抑 制TRIP-Br基因表达会影响血清刺激的细胞周期进程，将生长-休眠的WI-38细胞 用E-SCR、E-Br1或E-Br2转染，然后用含有10％FBS的培养基温育以刺激细胞 再次进入细胞周期。刺激后72小时，细胞数量用锥虫蓝排除手工细胞计数法估 计。浓度为0.1μM的E-Br1或E-Br2能够抑制50％-60％血清诱导的WI-38成 纤维细胞增殖潜能。相反，对比载体处理的细胞，同样浓度的E-SCR对WI-38生 长没有显著作用(图12A)。为了可视化地评估由DNA酶产生的抗增殖作用，将 WI-38细胞用含或不含DNA酶的血清诱导。72小时后，用结晶紫染色细胞。与 上述发现一致，E-Br1或E-Br2处理的培养物表现出菌落形成能力的显著降低(图 12B)。同样，用E-SCR处理的细胞表现出菌落形成能力类似于正常的以及载体处 理的对照。综上所述，这些结果表明TRIP-Br基因的表达的剔除导致了可血清诱 导的WI-38细胞增殖的减弱。
E-Br DNA酶阻止血清诱导的S期的进入.将血清饥饿的WI-38细胞在0.1μ M DNA酶存在的情况下用血清刺激，用BrdU整合测量其S期的进入。与未被刺 激的细胞相比，载体或E-SCR处理的培养物整合大约两倍多的BrdU(图13A)。 相反，用E-Br1或E-Br2处理的细胞与BrdU整合的能力明显被抑制。这些数据提 示TRIP-Br基因表达的剔除可充分阻断WI-38细胞中可血清诱导的S期的进入。
检测了与细胞周期蛋白E/Cdk2结合的E-BrDNA酶减弱E2F1/DP1能力以诱 导休眠的WI-38细胞中的S期的潜力。与公开的数据相一致(Lomazzi，M.，等人. Nat Gen 31，190-194(2002))，单独的E2F1/DP1或者细胞周期蛋白E/Cdk2的表达 并不能导致BrdU整合的增加(图13B)。相反，E2F1/DP1和细胞周期蛋白E/Cdk2 的共表达使得休眠细胞经过G1/S边界并被诱导进入S期。在浓度0.1μM时，所 有的三种DNA酶均不能阻止由E2F1/DP1和细胞周期蛋白E/Cdk2共表达诱导的S 期的进入。这些数据提示在可血清诱导的细胞周期信号传导途径中，TRIP-Br1和 TRIP-Br2靶向细胞周期蛋白E/Cdk2上游的一个或多个调节步骤。
E-Br DNA酶抑制血清刺激的CCNE基因诱导.我们研究了血清刺激后的 WI-38细胞中E-Br DNA酶对CCNE的诱导的作用。CCNE编码主要的G1/S过渡 调节剂，细胞周期蛋白E(Keyomarsi，K.和Herliczek，T.W.Prog Cell Cycle Res 3， 171-191(1997))。在休眠的WI-38成纤维细胞中，如我们用RT-PCR分析确定的(图 14A，泳道1)，CCNE基因是失活的。血清刺激16小时之后，已经可以易于检 测到CCNE的转录物(图14A，泳道2)，证明CCNE基因由向休眠的WI-38成 纤维细胞中添加血清来诱导。血清诱导的CCNE基因活化作用在E-Br1或E-Br2 (图14A，泳道4&5)而非E-SCR(图14A，泳道3)存在时被抑制，提示对血 清刺激响应的CCNE诱导对TRIP-Br1和TRIP-Br2两者都需要。与RT-PCR数据 相一致，我们的蛋白印迹分析表明剔除TRIP-Br1或TRIP-Br2有效地阻止了细胞 周期蛋白E的表达(图14B)。CCNE诱导和细胞周期蛋白E表达的抑制与在 Cdk4、细胞周期蛋白D1和p27KIP表达模式中的可观测的改变无关(图14B)。
TRIP-Br2-/-初级小鼠胚胎成纤维细胞(PMEFs)重现了E-Br2介导的剔除表型. 我们接下来破坏了小鼠的TRIP-Br2基因并产生了TRIP-Br2-/-PMEFs。在基因组 DNA水平(用PCR)以及mRNA水平(用半定量RT-PCR)上检验了TRIP-Br2 剔除(数据未显示)。为了确定是否TRIP-Br2-/-PMEFs已经取得了改变了的生长 特性，进行了BrdU整合比较和细胞计数分析。如通过BrdU整合确定的，与E- Br2剔除的数据相一致，与野生型对应物相比TRIP-Br2-/-PMEFs表现出明显较低 的增殖潜力(图15A)。当生长休眠的PMEFs用10％FBS刺激以再次进入细胞周 期时，与野生型细胞相比TRIP-Br2-/-PMEFs以明显较低的速率增殖(图15B)。 另外，发现在TRIP-Br2-/-PMEFs中CCNE基因被明显下调(图15C)。因此， TRIP-Br2-/-PMEFs可以重现E-Br2DNA酶诱导的剔除表型。这些数据强烈支持 了TRIP-Br2在细胞增殖中起重要作用的这一观点，而且进一步意味着这一难捉摸 的调节作用在小鼠和人中是保守的。
在我们的研究中发现，TRIP-Br基因在对血清刺激响应时被诱导(图11A)。 剔除WI-38成纤维细胞中的TRIP-Br1和TRIP-Br2有效抑制了血清诱导的细胞增 殖，提示TRIP-Br蛋白在生理上参与血清诱导细胞周期的进程。我们的数据揭示 了E-Br1和E-Br2两者均抑制可血清诱导的CCNE基因诱导和细胞周期蛋白E的 表达。假设细胞周期蛋白E相关的激酶活性是经过限制点以及在细胞周期进程中 执行S期进入所必不可少的(Keyomarsi，K.和Herliczek，T.W.Prog Cell Cycle Res 3， 171-191(1997))，那么我们提示E-Br1和E-Br2可以通过以施加增殖阻断的方式消 除细胞周期蛋白E/Cdk2的细胞周期调节活性来破坏促细胞分裂原驱动的细胞周 期进程。
这一系列包含DNA酶的研究已经表明在进行可血清诱导的细胞增殖中生理 上涉及到TRIP-Br1和TRIP-Br2两者。
实施例3：
抗人TRIP-Br1的单克隆抗体的产生
肽的选择.对于可能的肽的选择，我们使用了Alpha Diagnostic International，Inc.(ADI)在他们的站点http：//www.4adi.com上提供的免费服务。基于抗 原性、亲水性和可接近性，选择了10-25个氨基酸残基长度的肽。将已确定的肽 进行BLAST搜索以证实其特异性。此外，利用ClustalW，ADI对这些分析中的肽 进行蛋白二级结构分析(PSSA)和多序列比对。hTRIP-Br1的抗原性、亲水性和 可接近性的分析分别显示于图17、18和19。从所有3个图表中选择具有高的值 的序列。确定了两个肽：TB1-27和TB1-98。对它们的详细描述如下。TB1-27： 从残基27到42的16个残基。该序列从N末端开始是 DPGHTAAVAQAPPAVAS[SEQ ID NO.：10]。TB1-98：从残基98到112的15个残基。 该序列从N-末端开始是SVADNLLASSDAALS[SEQ ID NO.：11]。
BLAST搜索显示对人TRIP-Br1的特异性和对鼠同系物的不完全特异性。通 过PSSA没有确定有意义的蛋白二级结构。多序列比对的结果显示在图20中。其 中人TRIP-Br2、小鼠TRIP-Br2、人TRIP-Br1和小鼠TRIP-Br1全长序列分别如SEQ ID NOS.12-15所示。两个肽都明显不同于人TRIP-Br2，即TRIP-Br家族蛋白的另 一个成员。然而，它们却与小鼠TRIP-Br1高度同源。TB1-27有4个残基不同于 相应的mTRIP-Br1区域，而TB1-98有2个残基不同于相应的mTRIP-Br1。这可 能是在小鼠体内缺乏抗体诱导的原因。
由Research Biolabs，新加坡获得匙孔血蓝蛋白(KLH)-缀合的TB1-27和 TB1-98。被提供时的浓度是在磷酸缓冲盐水中1mg/ml。TB1-27的质谱分光光度法 谱显示于图21中。
免疫.用每种肽免疫两只BALB/c雌性小鼠。根据ImmunEasyTM Mouse Adjuvant Handbook(Qiagen)中的方案制备免疫原。每只小鼠被施用的肽引发 (priming)剂量为10μg。随后，每2星期施用5μg肽加强剂量。总共进行5次注 射。
杂交瘤克隆.在最后一次加强后三天杀死小鼠。在无菌条件下分离出脾 脏，并与鼠骨髓瘤细胞系X63Ag融合。使用的是ClonaCell-HY Hybridoma Cloning 试剂盒(StemCell Technologies)。严格按照提供的规程进行。但是，用相同肽免疫 的小鼠脾细胞结合用在每个克隆过程中。
在最后的加强之前，用TB1-98注射的两只小鼠中的一只死亡。另一只看起 来是有病的并且从该动物中分离出来的脾细胞不与X93Ag融合，因此未能获得具 有TB1-98的杂交瘤克隆。
杂交瘤克隆分析.用ELISA分析用TB1-27所获得的420个杂交瘤克隆。在 分别覆有TB1-27以及不相关的KLH-缀合肽Cyr61的孔中，通过在余下的培养基 中过夜温育来测试特异性。147个克隆(35％)测试为阳性(也就是与TB1-27涂 覆的孔结合)，其中39(9.3％)是特异性的(不与Cyr61涂覆的孔结合)。
进一步用蛋白印迹法分析39个克隆的特异性。利用Polyfect(Qiagen)，用具有 FLAG-标记的人TRIP-Br1或TRIP-Br2插入片段的pcDNA3载体转染U2OS细胞。 细胞裂解物用10％聚丙烯酰胺凝胶分离之后印迹至Immobilon-P膜(Millipore)上。 余下的培养基用印迹缓冲液1∶1稀释，然后与印迹一起温育过夜。只有6个克隆 表现出对FLAG-TRIP-Br1条带有一些特异性(结果未显示)。其余的没有结合到 条带上或具有高度的非特异性。
然而，进一步克隆扩增后，只有编号2(TB1-27#2)的克隆存活。这可能归 因于Hybridoma Kit的性质，其可以使脾细胞在所供给的培养基中有限增殖一段时 间。
单克隆抗体的制备.TB1-27#2在由ClonaCell-HY Hybridoma Cloning试剂盒 所提供的培养基A中扩增。从汇合培养基中旋转沉淀细胞并将其转移至由 GlutaMaxTMI(Gibco，Invitrogen)提供的CD杂交瘤培养基中。在加入OptiMAb (Gibco，Invitrogen)之前，监控培养物直至得到最大细胞密度。培养基的pH用 氢氧化钠调到pH6.8-7.2的范围。9天后，离心去除细胞并收获余下的培养基。
TB1-27#2的表征：为了进行同型确定，使用了ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Pierce)。结果表明TB1-27#2属于具有kappa轻链的IgG2a亚 类。
收获用pcDNA3、具有TRIP-Br1或TRIP-Br2插入片段的pcDNA3载体转染 的U2OS细胞以进行蛋白印迹分析。细胞裂解物用10％聚丙烯酰胺凝胶分离并印 迹至转移膜上。切割印迹并用小鼠单克隆抗FLAG抗体或TB1-27#2探测。对于其 中2个切片，除了TB1-27#2外，还加入TB1-27以及Cyr61肽作为竞争源。结果 表明TB1-27能够阻断单克隆抗体TB1-27#2间的结合，相反，不相关的Cyr61肽 则不能阻止TB1-27#2间的结合(图22；每一组中，从左数第一泳道含有用pcDNA3 载体转染的U2OS细胞的细胞裂解物；第二泳道，U2OS细胞用pcDNA3/FLAG- TRIP-Br1转染以及第三泳道，U2OS细胞用pcDNA3/FLAG-TRIP-Br2转染；标记 物大小为210kD，125kD，101kD，56kD以及36kD；CDK2条带被用作加样对 照)。
在免疫沉淀测定中，50微升A蛋白琼脂糖(Amersham)与2ml TB1-27#2余下 的培养基温育过夜。洗涤每等分试样的琼脂糖并加入到各种转染的U2OS细胞的 裂解物中。TB1-27以及Cyr61肽被分别加到其中的两个反应中，但是其中一个反 应是用小鼠单克隆抗His抗体而不是用TB1-27#2进行探测。收获琼脂糖并在第二 天洗涤，并用SDS-PAGE分析结合蛋白。印迹凝胶并用抗FLAG抗体检测。结果 如图23所示(左板含有1/10输入的预先澄清的U2OS细胞裂解物，而右板含有 从A蛋白琼脂糖洗脱下的蛋白)。如所示，TB1-27#2能够免疫沉淀FLAG-TRIP- Br1蛋白。该结合也是特异的；由缺乏FLAG-TRIP-Br1带可以证明TB1-27肽消除 了结合，然而Cyr61肽却没有此作用。因为已知TRIP-Br1直接与DP-1相互作用， 所以抗-DP-1被用作免疫沉淀的正对照。
实施例4：鸡胚尿囊绒膜(CAM)模型中诱饵肽的抗肿瘤作用
材料和方法
细胞系.人鼻咽癌细胞系CNE2以及人黑素瘤细胞系Mewo被用作接种肿 瘤。
鸡胚CAM的制备.为了将细胞置于10天大的鸡胚的CAM上，用装有 0.3mm厚×22mm直径的金刚砂(Carborundum)盘的电钻在蛋壳的扁平端开一个 2cm直径大小的窗口。用镊子去除窗口的外壳。内壳膜用精细的无菌镊子小心地 刺破并将其去除以暴露出其下的CAM。随后在CAM的表面放上一条镜头纸(1cm 宽)再迅速将其移开以轻轻地损坏一小部分CAM。
接种、封闭及孵化.接种物(在50μl空白培养基中，对于CNE2细胞系1 ×106细胞/蛋以及对于Mewo细胞系3×106细胞/蛋)被施用在受损CAM的那一 小片上。接种后，窗口用35mm组织培养皿覆盖并用透明胶带密封。将垂直放置 的胚送回孵化器中并使之额外孵化7天，并每天进行监控。
肽处理及生长抑制作用的评估.肿瘤接种后两天开始处理。
鸡蛋被随机分成4个处理组，每组包括至少4个生物学复制品。1组：载体 对照(200μl无菌PBS)；2组：模拟处理对照(50μM*SCR)；3组：*Br1(50 μM)；4组：*Br2(50μM)。
每日一次在CAMs上的肿瘤异种移植物上局部进行各种处理。五天后，通过 降温以终止胚胎并在10％福尔马林中固定。取出被固定的CAM并对肿瘤异种移 植物拍照，随后从膜上将之切下并称重。试验重复进行一次。
结果
局部施用*Br1或*Br2，而非*SCR，明显在7天时间段内抑制CNE2肿瘤的 生长(p＜0.05，ANOVA，LSD，SPSS12)(图24)。
正如本领域技术人员可以理解的，此处描述的作为例证的实施方案可以有很 多修改。本发明更倾向于将所有这些修改包括到如权利要求书所限定的范围中 来。
与相关申请的交叉引用
本申请要求享有2004年3月31日申请的，美国临时专利申请号60/557697 的利益和优先权，该申请在此全文引入作为参考。
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<223>来自人TRIP-Br2的PHD/溴结构域相互作用区域
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<223>来自黑腹果蝇的触角是同源域蛋白的细胞膜穿透肽序列
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<213>人工的
<220>
<223>TRIP-Br的PHD-溴结构域结合区域的共有序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>4、6、8、9位的X是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>1位的X是s、T、A或没有氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>11位的X是D或E
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>13位的X是I、L、V、A或没有氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>12、16位的X是D、E、A或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(9)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(13)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400>16
Xaa Thr Gly Xaa Leu Xaa Asp Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Phe Xaa
1 5 10 15
Asp Ile Asp
不受控制的细胞增殖可由基因表达的调节异常引起。细胞具有DNA复制和 分裂的严密控制周期(细胞周期)，其受一系列细胞周期和转录因子所调节。一组 细胞周期转录因子，E2F转录因子，已显示出通过以一种有助于细胞周期进程和 增殖所需基因及时表达的方式整合细胞周期装置的活性与转录装置的活性，在调 节细胞增殖中发挥至关重要的作用(Lam，E.，等人，Curr Opin Cell Biol 6，859- 866(1994)；Dyson，N.(1998)，genes Dev 12：2245-2262；Helin，K，(1998)，Curr Opin Genet Dev 8：28-35；Harbour，J.W.，和Dean，D.C.(2000)，Genes Dev 14：2393-2409； Trimarchi，J.M.和Lees，J.A.(2002)，Nat Rev Mol Cell Bio 3：11-20)。这些E2F转录因 子，特别是E2F-1，与细胞凋亡的调节有关(Muller，H.，等人，Genes Dev 15，267- 285(2001)；Nahle，Z.，等人，Nat Cell Biol，(2002)11：859-64；Philips，C.，和Vousden， K.H.Apoptosis 6,173-182(2001))。
在细胞周期进程期间，细胞周期蛋白E-相关激酶的活性已显示出对于通过限 制点并完成S期进入是必不可少的(Keyomarsi，K.，和Herliczek，T.W.(1997)，Prog Cell Cycle Res 3：171-191)。细胞周期的进入、经过和退出是受依赖细胞周期蛋白的 激酶(Cdks)Cdk4/6，Cdk2和Cdc2的相继激活而精确控制的(Sherr，C.J.，和Roberts， J.M.(1999)，Genes Dev 13：1501-1512)。细胞进入细胞周期的保证受在G1期施加作 用的生长因子(正的和负的)的调节。
G1 D-型细胞周期蛋白，结合依赖细胞周期蛋白的激酶Cdk4和Cdk6，在完 成促细胞分裂原诱导的细胞增殖中起重要的作用。正的(促有丝分裂的)生长因 子传递生长-刺激信号，该信号促进D-型细胞周期蛋白的合成以及它们组装成活性 的Cdk4/6-细胞周期蛋白D复合物，导致其催化激活和底物识别。活化的Cdk4/6- 细胞周期蛋白D复合物有助于细胞周期蛋白-E/Cdk2的激活和磷酸化不足的RB 的产生。结合到转录不活跃的E2F-1/DP-1复合体上的磷酸化不足的RB充当了通 过经活化的细胞周期蛋白-E/Cdk2进行超磷酸化的靶，结果导致RB的解离、E2F- 应答基因的去阻抑/激活以及细胞从G1晚期关卡(checkpoint)的释放 (Sherr，C.J.(1993)，Cell 73：1059-1065；Lam等人.，见上；Dyson，见上；Helin，见上； Harbour，J.W.，等人，(1999)，Cell 98：859-869；Sherr，(1999)，见上；Harbour(2000)，见上； Trimarchi等.，见上)。
作为促有丝分裂信号传导途径的关键调节剂，Cdk4/Cdk6-细胞周期蛋白D的 活性在多重水平被调节，包括细胞周期蛋白D的合成和结合，磷酸化作用过程的 抑制和激活，以及被称作Cdk抑制剂(CKIs)的抑制分子的结合/解离(Sherr (1999)，见上)。Cdk蛋白是不活跃的，除非它们结合到各自的细胞周期蛋白配 偶体上。一旦结合之后，每一个细胞周期蛋白-Cdk复合物通过特定的磷酸化作用 进一步被负调节和正调节。进一步的负调节是通过与特定的破坏活性位点并干扰 ATP结合的Cdk抑制剂(CKI)结合而提供的。哺乳动物的CKIs被分成两个家族， Cip/Kip(Cdk2/激酶抑制剂蛋白)和Ink4(依赖细胞周期蛋白的激酶4的抑制剂) 抑制剂，这两者都通过特异地和协同地结合到控制G1和G1/S期的Cdk复合物上 来限制细胞周期的进程。虽然Cip/Kip家族CKIs的抑制Cdk2、Cdk4和Cdk6活 性特异性较低，但Ink4抑制剂(p16/Ink4a、p15/Ink4b、p18/Ink4c和p19/Ink4d) 却特异地结合到细胞周期蛋白D-Cdk4和-Cdk6复合物上。
施加于Cdk4上的额外水平的调节最近已被证实。p34SEI-1，一种新的表现为拮 抗p16INK4a功能的依赖细胞周期蛋白的激酶4(Cdk4)-结合蛋白，已显示出可以 使细胞周期蛋白D1-Cdk4复合物抵抗通过p16INK4a产生的抑制(Sugimoto，M.，等 人，(1999)，Genes Dev 13：3027-3033)。p34SEI-1是一种血清诱导型蛋白，甚至在低血 清浓度中，它的异位表达也能使成纤维细胞增殖。p34SEI-1被推测在促进细胞周期 蛋白D-Cdk复合物的形成和激活以及介导促细胞分裂原驱动的细胞周期进程中起 着关键功能性作用(Sugimoto等人.，见上)。
为了解决当细胞周期进程的上述途径的调节遭受不正常时所导致的增殖性 紊乱的问题，找到阻断不正常增殖细胞中的细胞周期进程的方法是很重要的。因 此，需要一种新的诱导细胞内增殖阻断的疗法和办法。
发明概述
一方面，提供一种抑制细胞增殖的方法，包括调节TRIP-Br的活性。
另一方面，提供一种治疗患者体内增殖性紊乱的方法，包括给患者施用一种 能调节患者增殖细胞内的TRIP-Br活性的分子，其中该增殖的细胞与增值性紊乱 相关。
进一方面，提供一种能调节TRIP-Br活性的分子。
更进一方面，提供一种药物组合物，包含一种能调节TRIP-Br活性的分子和 一种药学上可接受的稀释剂。
再进一方面，提供一种抗TRIP-Br的单克隆抗体。
进一方面，提供一种鉴定TRIP-Br的调节剂的方法，包括在测试化合物存在 的情况下，将TRIP-Br的蛋白靶与含有TRIP-Br的植物同源域锌指/溴结构域 (bromodomain)结合区域的肽接触，并测定该测试化合物对TRIP-Br的蛋白靶与含 有TRIP-Br的植物同源域锌指/溴结构域结合区域的肽结合的影响。
通过下面的本发明特定实施方案结合相应附图而进行的描述，本领域的技术 人员会清楚本发明的其他方面和特征。
附图简述
在这些图中，仅以实施例的方式阐述了本发明的实施方案。
图1A：KRIP-1/TRIP-Br的免疫沉淀测定的放射自显影图；B：描述用诱饵 肽(decoy peptide)处理的U2OS细胞的萤光素酶测定结果的图表；
图2A：用FITC-标记的*SCR、*Br1和*Br2处理的U2OS细胞的荧光显微 照片；B：通过流式细胞仪测量肽内在化效率；
图3A：用pCMV/β-半乳糖苷酶和指示的萤光素酶报道质粒共转染的U2OS 细胞的β-半乳糖苷酶/萤光素酶测定结果的图表；B：对在暴露于诱饵肽的U2OS 细胞内的dhfr，细胞周期蛋白-E，细胞周期蛋白A2，PCN4，DNA Pola和cdc2的表 达进行的基于总RNA的RT-PCR分析的琼脂糖凝胶；
图4A：暴露于诱饵肽24或48小时的U2OS细胞用ELISA比色测定分析 BrdU整合的结果；B：暴露于各种剂量诱饵肽的U2OS细胞用ELISA比色测定分 析BrdU整合的结果；C：使用Coulter细胞计数器和用锥虫蓝染色的细胞计数的 总细胞数量测定结果；
图5A：暴露于载体(DMSO)或指示诱饵肽的U2OS细胞的非同步的群体 在24小时时的细胞周期分布图；B：用图表示的处理后72小时的细胞周期分布概 况的图像；
图6A：暴露于Eto(足叶乙甙(etoposide))24小时或诱饵肽48小时或72 小时的U2OS细胞内天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3蛋白酶活性测定的结果； B：PARP裂解的蛋白印迹分析；
图7A：用或不用诱饵肽处理的情况下，从洛可哒唑停滞中释放出来的U2OS 细胞的蛋白表达图；B：U2OS细胞中细胞周期蛋白E和Geminin的表达，该细胞 用载体主链(载体)或pRc/细胞周期蛋白E与pCMV/Cdk2转染且通过暴露于洛 可哒唑(75ng/ml)停滞在G2/M边界并随后被释放重新进入细胞周期；C：在不 存在或存在细胞周期蛋白E/Cdk2超表达的情况下(左板)或在不存在或存在诱饵 肽处理的情况下(右板)，显示Geminin表达的蛋白印迹(WB)或考马斯的染色 凝胶；
图8A：从暴露于诱饵肽的U2OS细胞里所得的全细胞提取物中，细胞周 期蛋白A，D和E表达的蛋白印迹分析；B：暴露于诱饵肽的U2OS细胞的半定 量RT-PCR分析；C：在有或没有OHT和/或环己酰亚胺(CHX)时生长的分会合 (sub-confluent)的U2OS ER-E2F-1细胞内细胞周期蛋白-E和Fbxw7表达的半定 量RT-PCR分析；
图9是一个描述在依赖E2F的细胞周期进程中起作用的TRIP-Br整合功能的 示意图；
图10A：证明基因表达被DNA酶转录后抑制的示意图；B：描述靶向 TRIP-Br转录物的DNA酶的序列和环状结构；
图11A：对缺乏血清72小时的分会合的WI-38细胞进行的半定量RT-PCR 分析；B：对缺乏血清72小时的并随后用指定的DNA酶转染的分会合的WI-38 细胞进行的半定量RT-PCR分析；
图12A：缺乏血清72小时后用DNA酶转染，随后用血清再刺激72小时 的分会合的WI-38细胞能生存的细胞计数；B：用结晶紫原位染色的来自A的细 胞照片：
图13A：缺乏血清72小时后用DNA酶转染并用血清再刺激的分会合WI-38 细胞；B：缺乏血清72小时的并用DNA酶以及编码指定的细胞周期调节剂的表 达质粒转染的分会合的WI-38细胞中通过ELISA比色测定所分析的BrdU整合的 图表；
图14A：用以评价缺乏血清72小时后用DNA酶转染并用血清再刺激的的 CCNE在分会合的WI-38细胞内的表达的半定量RT-PCR分析；B：细胞周期蛋 白E，Cdk4，细胞周期蛋白D1和p27KIP1在缺乏血清72小时的分会合的WI-38 细胞内表达的蛋白印迹(WB)分析；
图15A：通过ELISA比色测定确定在分会合的PMEF培养物(TRIP-Br2+/ + 和-/-)中的BrdU整合；B：缺乏血清72小时并随后用血清再刺激的分会合的 PMEFs能生存的细胞计数分析；C：用以评价在野生型(+)或TRIP-Br2无效(-) PMEFs内CCNE表达的半定量RT-PCR分析；
图16通过TRIP-Br调节可血清-诱导的细胞周期进程的示意图；
图17抗原性对人TRIP-Br1残基数目进行的的绘图；
图18亲水性对人TRIP-Br1残基数目进行的绘图；
图19可接近性对人TRIP-Br1残基数目进行的绘图；
图20人和小鼠TRIP-Br蛋白的CLUSTAL W(1.81)多序列比对；
图21TB1-27肽的质谱分光度法谱；
图22与TBI-27或Cyr61肽相竞争的，用pcDNA3/FLAG-TRIP-Br1或载体 转染的U2OS细胞的蛋白印迹分析，；
图23用新的小鼠抗hTRIP-Br1单克隆抗体免疫沉淀的，表达FLAG-TRIP- Br1的U2OS细胞的免疫沉淀反应的蛋白印迹分析；和
图24显示用诱饵肽处理的CNE2肿瘤的肿瘤重量的图。
发明详述
本发明人已确定TRIP-Br蛋白家族成员在促细胞分裂原-诱导的细胞周期进 程中起作用。治疗增殖的细胞以破坏或调节TRIP-Br家族成员的整合功能诱导了 增殖阻断。表现为，这种调节能通过在体内下调生长调节性E2F-应答基因亚型的 转录活性，并通过消除细胞周期蛋白E/Cdk2的细胞周期调节活性，来诱导异常的 细胞周期蛋白E积累而发挥抗增殖效应。这反过来能导致Geminin反常和进行性 的细胞的亚-二倍化(sub-diploidization)。细胞周期蛋白E反常可能归因于Fbxw7的 下调，Fbxw7是编码负责靶向细胞周期蛋白E以进行蛋白酶解的SCFFBW7遍在蛋 白连接酶(E3)的Fbw7受体亚单位的基因。此处将Fbw7鉴定为E2F-应答基因。
本发明人已确定TRIP-Br蛋白似乎参与介导促有丝分裂细胞周期信号传导途径中 细胞周期蛋白E/Cdk2上游的一个或多个调节步骤的正确执行。此外，本发明人证 明TRIP-Br蛋白表达的下调以一种抑制血清诱导的细胞周期蛋白E表达、S期进 入和细胞增殖的方式破坏促有丝分裂信号传导。
因此，本发明方法涉及失控的增殖细胞内TRIP-Br家族蛋白的功能的调节。 这种调节导致了这些细胞内的增殖阻断，使得可用于治疗增殖性紊乱。
TRIP-Br蛋白家族是结构上和功能上相关的哺乳动物的转录调节剂家族，包 括TRIP-Br1和TRIP-Br2。
人的TRIP-Br1(hTRIP-Br1)等同于哺乳动物蛋白p34SEI-1，其最近被确定为一 种依赖细胞周期蛋白的激酶4(Cdk4)-结合蛋白(Sugimoto，M.，等人，Genes Dev 13，3027-3033(1999))。后来基于在结构上和功能上与TRIP-Br1同源，发现TRIP- Br2是TRIP-Br1的同系物(Hsu等人，见上)。另外，发现内源性的TRIP-Br1蛋 白在细胞周期期间被调节，其表达水平在S期期间最高(Hsu等.，见上)。
TRIP-Br1和TRIP-Br2拥有有效的与p53-相关的转录因子MDM2高度同源的 C-末端酸性反式激活(transactivation)结构域(Hsu等人.，见上；Keyomarsi，K.，和 Herliczek，T.W.，(1997)，Prog Cell Cycle Res 3：171-191)。像MDM2一样，TRIP-Br 蛋白表现为功能上与DP-1相互作用，结果导致E2F-1/DP-1转录活性的刺激。 TRIP-Br蛋白的共激活(coactivation)功能可通过直接与DP-1相互作用而产生。 先前已证明hTRIP-Br1是包含E2F-1和DP-1的内源性多蛋白复合物的一个成分。
小鼠TRIP-Br1(m TRIP-Br1)蛋白首先在酵母双杂交筛选中被分离出来，所 述筛选设计用于鉴定与转录辅阻遏物KRIP-1(KAP-1或TIF1β)的复合植物同源域 (PHD)-溴结构域相互作用的蛋白(Hsu，S.I.H.，等人.，EMBO J 20，2273-2285(2001)； Kim，S.-S.，等人.，Proc Natl Acad Sci USA 93，15299-15304(1996)；Le Douarin，B.，等 人.，EMBO J 15，6701-6715(1996)；Moosmann，P.，等人，Nucl Acids Res 24，4859- 4867(1996))。
已显示出TRIP-Br蛋白的功能为E2F-应答启动子转录调节信号的生理学上的 整合者，整合由包含PHD锌指-和/或溴结构域的转录因子，如p300/CBP和KRIP-1 提供的调节信号(Kalkhoven，E.，等人.，Mol Cell Biol 22，1961-1970(2002)；Schultz， D.C.，等人.，Genes Dev 15，428-433(2001))。因此，TRIP-Br蛋白有助于依赖E2F 的细胞周期进程的调节(Hsu，S.I.H.，等人.，EMBO J 20，2273-2285(2001))。
PHD锌指和溴结构域是在染色质-重构蛋白的宿主内发现的进化保守的蛋白 二级结构。这些结构域估计是充当对于依赖染色质的转录调控很重要的蛋白-蛋白 相互作用结构域(Aasland，R.，等人.Trends Biochem Sci 20，56-59(1995)；Capili，A.D.， 等人.EMBO 20，165-177(2001)；Marmorstein，R.B.，等人.Gene 272，1-9(2001))。例 如，KRIP-1的串联的PHD锌指和溴结构域已显示出形成一个协同的单位，该单 位在使组蛋白脱乙酰酶和NuRD复合物的染色质重构活性靶向体内特定基因启动 子的过程中起作用，其中的NuRD复合物是基因沉默所需的。
PHD锌指的特征是半胱氨酸4-组氨酸-半胱氨酸3(Cys4-His-Cys3)锌指基 序(Koken，M.H.M.，等人.，CR Acad Sci III 318，733-739(1995))，而溴结构域是一 个～110个氨基酸的结构组件，其编码四个与乙酰化赖氨酸残基相相互作用的两亲 α螺旋亚域(Haynes，S.，等人.Nucl Acids Res 20，2603(1992)；Zeng，L.，和Zhou，M.- M.FEBS Letters(2002)513(1)：124-8)。TRIP-Br1和TRIP-Br2都显示了有与PHD锌 指和/或溴结构域相互作用的能力。在依赖E2F的转录共调节中涉及到这些蛋白- 蛋白相互作用(Hsu等人，见上)。
因此，提供一种抑制哺乳动物细胞增殖的方法，包括调节TRIP-Br蛋白的转 录整合活性。
如本文中所使用的，TRIP-Br指的是TRIP-Br家族的任一成员，包括TRIP- Br1和TRIP-Br2。TRIP-Br家族成员拥有“PHD溴结构域相互作用区域”，其与参 与细胞功能的蛋白内的PHD锌指和/或溴结构域相互作用，所述细胞功能包括， 但不限于，细胞周期调节、基因转录调节和增殖。该术语包括拥有TRIP-Br的转 录整合活性的TRIP-Br的同系物、片段、衍生物或变体。
如果一多核苷酸序列或多肽序列与另一序列在一特定区域的范围内具有相 当大的同一性，并且这些序列的功能活性是保守的，那么这两个序列相互是“同 系物”或“同源的”(如此处所使用的，术语“同源的”并不意味进化上相关)。 如果，当被最佳比对时(允许有间隙)，两个多核苷酸序列或多肽序列共有至少大 约50％的序列一致性，或者这些序列共有明确的功能基序，那么它们被认为具有 相当大的同一性。在一个可选择的实施方案中，如果被最佳比对的序列在一特定 区域内共有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98 ％、99％的同一性，那么它们可被认为是基本相同的(即，具有相当大的同一性)。 “不相关的”或“不同源的”序列与本发明的多肽或多核苷酸在同源性的特定区 域内共有低于40％的同一性，和可能低于大约25％的同一性。术语“同一性”和 “同一的”指的是两个肽或两个多核苷酸分子之间的序列相似性。可以通过比较 比时的序列内的每个位置来测定同一性。氨基酸序列之间同一性的程度是这些序 列共有的位置处，即，在一特定区域内，同一的或配对的氨基酸数目的函数。可 使用多种运算法则来进行用于同一性对比的序列的最佳比对，如本领域公知的， 包括Clustal W程序，在 http：//clustalw.genome.ad.jp上可获得，Smith和Waterman 的局部同源性运算法则(1981，Adv.Appl.Math 2：482)，Needleman和Wunsch 的同源性比对运算法则(1970，J.Mol.Biol.48：443)，Pearson和Lipman的查找 相似性方法(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)，和这些运算法则的计算机 化实现(如Wisconsin Genetics Software Package内的GAP、BESTFTT、FASTA和 TFASTA，Genetics Computer Group，Madison，WI，美国)。也可使用描述于Altschul 等人.，1990，J.Mol.Biol.215：403-10的BLAST运算法则(使用公开的默认设置) 来测定序列同一性。可通过National Center for Biotechnology Information来获得(通 过国际互联网http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)用于执行BLAST分析的软件。在此使 用的“同源氨基酸序列”包括任何多肽，其全部或部分被核酸序列编码，该核酸 序列在低于临界解链温度25-35℃(Tm)下，与编码哺乳动物TRIP-Br，包括 TRIP-Br1或TRIP-Br2的核酸序列，包括编码SEQ ID NO.12到15的任一氨基酸 序列的核酸的任何部分杂交。
TRIP-Br的变体或衍生物指的是TRIP-Br或它的片段，其保持TRIP-Br的转 录整合活性，或是一个或多个氨基酸被突变的TRIP-Br，包括点突变、插入突变或 缺失突变，但仍保持TRIP-Br的转录整合活性。因此，变体或衍生物包括缺失， 含截短物和片段；插入和添加，例如保守替代，位点特异性突变和等位变体；和 修饰，包括具有一个或多个共价连接到肽上的非氨酰基团(参见(q.v.)，糖、脂类 等)的类肽(peptoid)，以及翻译后修饰。此处使用的术语“保守氨基酸替代”或 “保守替代”指的是在肽内的一指定位置上一种氨基酸用另一种氨基酸替代，这 里的替代可在基本不失去相关功能的情况下进行。在进行这些改变时，相似氨基 酸残基的替代可基于侧链取代基的相对相似性来进行，例如，它们的大小、电荷、 疏水性、亲水性等，并且通过常规试验能测定出这些替代对肽的功能的影响。
TRIP-Br的“转录整合活性”或“整合活性”指的是TRIP-Br与不同的转录 因子和蛋白相互作用的能力，所述蛋白包括但不限于，参与细胞周期调节、基因 转录调节和增殖的蛋白。该转录整合功能至少通过TRIP-Br的PHD-溴结构域相 互作用区域被调节。
术语“细胞”指的是单个细胞，许多细胞或细胞群体，除非本申请中另有所 指。该细胞可以是其内的增殖或分裂被期望受到抑制的任何细胞，包括已失去经 历细胞周期停滞或细胞凋亡的细胞。该细胞可以是培养基中的细胞或者是患者体 内的细胞。正如此处所使用的，细胞增殖指的是DNA复制、生长和分裂的过程， 其导致细胞总数的增加。该细胞可来源于表达TRIP-Br同系物的任何有机体，在 特定的实施方案中是哺乳动物细胞，包括小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞或人细胞。
术语在细胞内“抑制增殖”或细胞“增殖的抑制”包括除通过细胞凋亡或其 他细胞死亡机制诱导细胞死亡外，致使细胞不能复制DNA、生长或分裂，或不能 正确复制DNA、生长或分裂，或降低或延缓DNA复制、细胞生长或分裂。抑制 可在体外或体内进行。
“调节”TRIP-Br的转录整合活性，或TRIP-Br的转录整合活性“的调节”， 指的是任何一种上调、下调、刺激、激活、增强、破坏、中断、降低、限制、阻 断或阻止TRIP-Br实现其生物功能或活性的能力的机制，包括整合参与调节增 殖、复制或细胞周期进程的转录调节信号，从而导致增殖抑制。调节包括TRIP- Br的物理改变，例如通过翻译后修饰，必要的翻译后修饰的损失或缺乏，氨基酸 序列突变，包括缺失、插入和替代突变，或蛋白消化。调节也包括稳定，诱导、 拮抗、抑制、或竞争TRIP-Br与作为TRIP-Br的靶的、且与TRIP-Br相互作用而 影响细胞周期进程的转录调节因子间的相互作用，相互作用包括TRIP-Br的PHD/ 溴结构域相互作用区域与包含PHD锌指和/或溴结构域的转录因子之间的相互作 用。调节也包括可导致具功能的TRIP-Br大大降低表达或不表达的遗传修饰。“大 大降低”和“基本上更少”指的是TRIP-Br或具功能的TRIP-Br的表达水平，该 水平例如，大约是在未受调节的细胞内的所产生的具功能的TRIP-Br表达水平的 50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％或0％。这种遗 传修饰包括编码TRIP-Br的核酸，包括TRIP-Br基因的修饰，从而其部分或全部 可读框被删除、替代或中断，致使基本上更少或没有基因产物，没有稳定的基因 产物，或没有具功能的基因产物被表达。这种遗传修饰也包括编码TRIP-Br的核 酸，包括TRIP-Br基因的修饰，从而其部分或全部TRIP-Br基因调节区域被删除、 替代、中断或抑制，导致基本上更少或没有蛋白从编码TRIP-Br的基因中被表达。 具功能的TRIP-Br蛋白是TRIP-Br，或TRIP-Br的一个片段，其经翻译、折叠、翻 译后修饰被定位于细胞内，而且其拥有TRIP-Br的生物功能或活性，可包括 TRIP-Br的转录整合功能。在任何环境下，其中TRIP-Br蛋白没有，或没有被正确 地翻译、折叠、翻译后修饰或定位于细胞内，即使基因被转录，增殖性阻断也可 能发生。这种遗传修饰进一步包括修饰细胞，使之转录出反义RNA转录物，该反 义RNA转录物与从TRIP-Br基因转录的mRNA分子的至少一个片段互补，导致 TRIP-Br转录物不翻译或翻译降低。这种遗传修饰进一步包括修饰细胞，使之转录 或表达靶向TRIP-Br基因转录物的小干扰RNA(siTNA)分子，导致TRIP-Br转录物 的不翻译，或翻译降低。
在一些实施方案中，TRIP-Br的转录整合功能被调节剂分子所调节。该调节 剂是可以竞争或模拟TRIP-Br的PHD-溴结构域相互作用区域的结合的任何分子， 因而与PHD-溴结构域相互作用区域的靶结合并阻断TRIP-Br结合到其靶上或降低 其结合能力。
调节剂可以被内在地送到细胞，例如通过主动或被动运输进入细胞，或通过 扩散进入细胞。例如，如果该调节剂是小分子，那么其在细胞膜内可能是可溶的 并因此能透过细胞。该调节剂也可被修饰成包含一个将促进其输入细胞的运输标 记物。可使用特定的运输标记物以指导该调节剂被特定的靶细胞吸收。例如该调 节剂可被修饰成包含一个半乳糖残基以增加其被肝细胞的吸收，如US6844319中 所描述的，其在此全文引入作为参考。可选择地，该调节剂可被包括到一种能增 加或诱导该调节剂被细胞吸收的生物材料中，例如通过将调节剂包到脂质体制剂 中做成胶囊。肽和蛋白的脂质体运送至细胞内是公知的，例如在US6372720和 US20030108597中有所描述，其在此引入作为参考。
在一个实施方案中，调节剂是一个编码TRIP-Br的PHD-溴结构域相互作用 区域序列的肽，包括TRIP-Br1或TRIP-Br2的PHD-溴结构域相互作用区域序列。 该肽调节剂可以是含有与TRIP-Br的PHD-溴结构域相互作用区域具有60％、70 ％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的 肽。通常，在没有基本上改变肽的生物活性的情况下，可在多肽的结构内作一些 修饰和变化，以获得一个功能上等同的多肽。因此，本发明扩展到生物上等同的 多肽，其通过保守的氨基酸替代而不同于TRIP-Br及其生物活性或免疫原性的片 段的PHD-溴结构域相互作用区域的氨基酸序列的一部分。比处所使用的术语“保 守的氨基酸替代”指的是在肽的指定位置上将一种氨基酸用另一种氨基酸替代， 这里的替代能在没有失去相关功能的情况下进行。在进行这些变化时，类似氨基 酸残基的替代可基于侧链取代基的相对相似性来进行，例如，它们的大小、电荷、 疏水性、亲水性等，并且通过常规试验可测定出这些替代对肽的功能的影响。在 一个可选择的实施方案中，可进行保守的氨基酸替代，其中氨基酸残基被替代为 同类中的另一个，这里氨基酸被分成非极性的、酸性的、碱性的、和中性的这几 类，如下列各项：非极性的：Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Pro，Met；酸性的：Asp，Glu； 碱性的：Lys，Arg，His；中性的：Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr。保守的氨基酸变化 可包括L-氨基酸被相应的D-氨基酸替代，被保守的D-氨基酸替代，或被天然的， 非遗传编码形式的氨基酸所替代，以及L-氨基酸的保守替代。天然的非遗传编码 的氨基酸包括β-丙氨酸、3-氨基-丙酸、2，3-二氨基-丙酸、α-氨基异丁酸、4-氨基- 丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、羟脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔 丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨 酸、2-萘基丙氨酸(2-napthylalanine)、吡啶丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯 丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1，2，3，4-四氢-异 喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰赖氨酸、2- 氨基丁酸、2-氨基丁酸、2，4-二氨基丁酸、对氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半 胱氨酸、高丝氨酸、半胱磺酸、ε-氨基己酸、δ-氨基戊酸和2，3-二氨基丁酸。
在一些实施方案中，该肽可包含式为UTGXIXDXXLZJOLFJDID(SEQ ID NO.16)的序列，其中X是任一氨基酸；U是S，T，A或没有氨基酸；Z是D或E； J是D，E，A或G；O是I，L，V，A或没有氨基酸。
在一些特定的实施方案中，调节剂是包含来源于人TRIP-Br1的氨基酸序列 ATGCLLDDGLEGLFEDID(SEQ ID NO.1)或来源于人TRIP-Br2的氨基酸序列 TGFLTDLTLDDILFADID(SEQ ID NO.2)的肽。
在进一步的实施方案中，调节肽进一步包含诸如膜-转位序列的序列，该序列 使得包含所述序列的肽转运到细胞内，例如来源于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的触角足同源域蛋白的细胞膜穿透肽(penetratin)序列，例如具有 序列ERQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO.3)。因此，在特定的实施方案中， 调节肽包含序列ERQIKIWFQNRRMKWKKATGCLLDDGLEGLFEDID(SEQ ID NO.4)或ERQIKIWFQNRRMKWKKTGFLTDLTLDDILFADID(SEQ ID NO.5)。
可选择地，肽调节剂可被整合入一个较大的融合蛋白中以增加该蛋白的稳定 性并帮助输送入靶细胞中。该融合蛋白可被设计成整合了一个特定的蛋白酶切位 点以供靶细胞内表达的蛋白酶识别，致使进入到靶细胞后肽调节剂从融合蛋白中 被释放出来。
肽调节剂可使用本领域公知的标准蛋白合成技术来合成，例如使用化学肽连 接方法，包括固相肽合成，从C-末端到N-末端的方向合成该肽，包括使用自动肽 合成仪。可选择地，可使用分子生物学技术设计编码该肽调节剂的表达盒，使用 本领域公知的标准分子生物学技术和例如描述于Sambrook等人((2001)Molecular Cloning：a Laboratory Manual，3rd ed.，Cold Spring Harbour Laboratory Press)中的标准 分子生物学技术。该表达盒可被用于合适的表达系统。例如，该盒可包含于细菌 质粒中并能在细菌细胞中表达，从中可分离和纯化出该肽调节剂。该表达盒将包 含一个编码肽调节剂的可读框，任选地，作为一个完整的的肽或作为嵌合的或融 合肽或蛋白的一部分，从中该肽能被释放出来，例如通过蛋白酶消化。该表达盒 还包括可操作地连接到该可读框上的合适的调节区域，例如启动子区域，它可以 是诱导型启动子区域。
在这个实施方案中，蛋白-蛋白相互作用的调节的完成是通过将细胞暴露给调 节剂，使得该调节剂被细胞吸收，并使该调节剂与TRIP-Br蛋白的包含PHD锌指 的，和/或包含溴结构域的靶相互作用，从而降低或阻断TRIP-Br蛋白实现其活性 的能力，如它在细胞内的转录整合功能。此处该调节剂是一个肽，包含细胞膜穿 透肽序列，或任何能使肽转运至细胞内、促进该调节剂被细胞吸收的序列。
可选择地，在其他实施方案中，利用一种能抑制编码TRIP-Br的核酸，包括 TRIP-Br基因表达的分子完成调节。
能抑制编码TRIP-Br的核酸，包括TRIP-Br基因表达的分子可以是一个靶向 编码TRIP-Br的基因的转录物的DNA酶。DNA酶是一种依赖镁的由DNA组成 的催化性的核酸，它能通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对选择性地结合 到RNA底物上并潜在地在任何嘌呤-嘧啶接点切开该RNA底物主链上的磷酸二酯 键(Santiago，F.S.，等人.，(1999)Nat Med 5：1264-1269)。DNA酶由两个不同的功能 结构域组成：一个15-核苷酸的催化核心，该核心执行磷酸二脂键的切割，以及两 个在催化核心侧面的杂交臂；这两个臂的序列特性是能被裁剪以获得与目标RNA 底物互补的碱基配对。
DNA酶因此将具有能与TRIP-Br基因转录物上的、侧面有嘌呤-嘧啶接点的 区域一起退火的互补区域，这样该DNA酶的催化核心能在接点切割转录物，使 得该转录物不能被翻译来产生功能性TRIP-Br蛋白。在某些实施方案中，该DNA 酶被设计成在AUG起始密码子的A和U残基之间切割TRIP-Br转录物。在特定 的实施方案中，该DNA酶包括序列T TAC CCA ACA GGC TAG CTA CAA CGA ATA TCA CA(SEQ ID NO.：6)或T TGC TCA GCA GGC TAG CTA CAA CGA CTT GCT CA(SEQ ID NO.：7)，其中未划线的内容表示催化核心序列。
可使用本领域公知的标准技术合成这种DNA酶，例如，可使用标准的亚磷 酰胺化学连接方法在固体支持物上从3’到5’方向合成DNA分子，包括使用自动 核酸合成仪。可选择地，DNA酶可通过转录编码该DNA酶的核酸分子而被合成。 该核酸分子可包含于DNA或RNA载体内，例如，病毒载体，以用于送递到细胞 表达系统中。合适的病毒载体包括痘苗病毒载体和腺病毒载体。
在这个实施方案中，可通过将细胞暴露于DNA酶，这样该DNA酶被细胞 吸收，并且能靶向和切割细胞内的TRIP-Br转录物，导致细胞内功能性TRIP-Br 蛋白降低表达或不表达从而达到调节的目的。正如本领域所公知的，暴露可包括 转染技术，或通过微注射技术，其中将DNA直接注射到细胞内。暴露也可包括 将细胞暴露于裸DNA酶中，因为细胞可在体内吸收裸DNA。可选择地，如果DNA 酶包含于核酸载体中，如病毒载体，那么该细胞可被病毒载体感染。
可选择地，能抑制编码TRIP-Br的核酸，包括TRIP-Br基因表达的分子，可 以是反义RNA分子或小的干扰RNA(siRNA)分子。
反义RNA分子将包含一段与TRIP-Br基因的RNA转录物的至少一个片段互 补的序列，并且该序列能结合到TRIP-Br转录物上，因而降低或阻碍体内TRIP-Br 基因的表达。该反义RNA分子将与靶mRNA具有足够的互补程度，以避免在需 要特异性结合的条件下，如在生理学条件下，反义分子与非靶序列非特异性结合。
siRNA分子可以是任何双链RNA分子，包括能折回自身形成双链siRNA的 自身互补的单链分子，它诱导细胞内的基因-特异性RNA干扰，导致体内TRIP- Br基因的表达降低或不表达。一般地，siRNA靶向目标mRNA内19-23碱基的 核苷酸序列，如Elbashir，等人.(2001)EMBO J 20：6877-6888所描述的，其内容在此 引入作为参考。
为了实行调节，将细胞暴露于反义RNA，编码反义RNA的核苷酸，siRNA 或编码siRNA的核苷酸，例如含有允许反义转录物或能形成双链siRNA的单链的 自身互补siRNA分子转录的核酸分子的核酸载体中。这种反义分子、siRNA分子 或载体能使用上面描述的核酸化学合成方法和标准的分子生物学克隆技术来合 成。
目前还提供一种治疗患者体内增殖性紊乱的方法。该方法包括调节患者增殖 的细胞内TRIP-Br1的活性，包括TRIP-Br1的转录整合活性，其中增殖的细胞与 增殖性紊乱相关。
“增殖性紊乱”是一种疾病或紊乱，其中患者的细胞不正常增殖，导致细胞 不受控制地生长和分裂，该细胞在健康个体内不会增殖或以一种被控制的方式增 殖。增殖性紊乱的特征是恶性或非恶性细胞群体的增殖。这种紊乱包括癌，其中 包括膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、子宫颈癌(cervical carcinoma)、 皮肤癌、白血病；增殖性皮肤损伤，其中包括生殖疣、牛皮癣和瘢痕瘤；缺血性 心脏病、获得性免疫缺陷综合征、脉管炎、类风湿关节炎、动脉粥样硬化、导致 肾小球硬化症的肾小球肾炎、导致纤维化的间质炎症、导致纤维化的肺炎。增殖 性紊乱包括不正常的增殖，该不正常的增殖也可在正常的伤口愈合期间发生，潜 在地导致过多的伤疤或瘢痕疙瘩的形成，并且可在任何导致组织伤害的炎症状况 下发生，其间宿主免疫细胞引发成纤维细胞增殖并产生导致纤维化的细胞外基质 成分。后者的例子包括宿主细胞对脑梗死(中风)、心肌梗死(心脏病发作)和急 性缺血性肾小管损害(暂时性肾衰竭)的免疫反应。
如果一种细胞不正常增殖以致导致在患者体内紊乱，或如果该紊乱的特点是 此种细胞的增殖，那么该细胞与增殖性紊乱相关。
术语“治疗”增殖性紊乱指的是一种获得有益的或期望的结果，包括临床结 果的方法。有益的或期望的临床结果可包括，但不限于，一种或多种症状或状况 的缓和或改善，疾病程度的减轻，疾病状态的稳定，疾病发展的防止，疾病扩散 的防止，疾病进程的延迟或减慢，疾病发作的延迟或减慢，疾病状态的改善或减 轻，以及消除(不管是部分还是全部)。“治疗”也可意味着延长患者的存活期限 超过了不存在治疗的预期期限。“治疗”也能意味着抑制疾病的进程，暂时减慢疾 病的进程，尽管更优选，它包括使疾病的进程永久停止。
患者可以是任何需要治疗增殖性紊乱的动物，包括哺乳动物，包括小鼠、大 鼠、兔或人。
通过给患者施用能调节TRIP-Br活性的分子来获得治疗效果。在一个实施方 案中，该分子能调节TRIP-Br的转录整合活性。能调节TRIP-Br活性的分子是任 何可被用于上述的影响细胞内调节的分子，包括模拟TRIP-Br的PHD-溴结构域 相互作用区域的结合的调节剂，因而它结合到PHD-溴结构域相互作用区域的靶上 并阻断或降低TRIP-Br结合到其靶上的能力。如上所述，这种调节剂可以是例如 小分子或肽。如上所述，能调节TRIP-Br1活性的分子可以是DNA酶，包括DNA 酶分子，或编码可转录的DNA酶的核酸分子。可选择地，能调节TRIP-Br活性的 分子可以是编码可转录的反义mRNA的核酸分子，含有与TRIP-Br mRNA转录物 互补的序列，或是编码靶向TRIP-Br mRNA转录物的siRNA分子的分子。
给患者施用有效量的能调节TRIP-Br活性的分子。术语“有效量”用于此处 指的是，例如，以需要达到期望效果的剂量和时间段，来有效治疗特定的增殖性 紊乱的量。
使用本领域公知的标准技术将分子施用给患者。该分子可被全身地施用，或 可被直接施用到与增殖性紊乱相关的增殖的细胞所处的位点。运送到该位点包括 局部施用，注射到该位点，或手术移植，例如，在肿瘤的位点。
要被施用的能调节TRIP-Br活性的分子的浓度和量将根据要被治疗的增殖性 紊乱，与增殖性紊乱相关的细胞的类型，被施用的分子的类型，施用模式，和患 者的年龄和健康状态，而有所变化。
为帮助施用，能调节TRIP-Br活性的分子可被配制成药物组合物内的一种成 分。因此，在进一步的实施方案中，提供一种药物组合物，包含能调节TRIP-Br 活性的分子，和药学上可接受的稀释剂。因此，本发明一方面也包括用于治疗增 殖性紊乱的此种药物组合物。该组合物可常规地包含药学上可接受的浓度的盐， 缓冲剂，防腐剂和各种相容性载体。对于所有的运送方式，能调节TRIP-Br活性 的分子可以配制成生理盐水的形式。由于肽在施用时可能不稳定，其中能调节 TRIP-Br活性的分子是肽或蛋白，因此期望将肽或蛋白包入脂质体或其他的有利于 保护和/或保存该肽或蛋白直到它们被送入靶细胞的生物材料中。
该药物组合物可另外包含其他的对治疗特定的增殖性紊乱有用的治疗剂，例 如，细胞毒性剂，例如化学治疗剂。
药学上可接受的稀释剂的比例和特性依据所选择的施用途径，与活细胞的相 容性，和标准的药学上的惯例来确定。通常，将选用不会杀死或显著削弱能调节 TRIP-Br活性的分子的生物特性的成分来配制该药物组合物。
可通过公知的制备适于给患者施用的药学上可接受的组合物的方法来制备 该药物组合物，这样，有效量的能调节TRIP-Br活性的分子，和任何另外的一种 活性物质或多种活性物质，以及药学上可接受的载体被组合在混合物中。合适的 载体被描述于，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，美国1985)。基于 此，该药物组合物包括，然而并非排他地，能调节TRIP-Br1活性的分子的溶液， 与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂结合，并且该分子被包含在具有合适 pH值的和与生理学流体等渗的缓冲液中。
根据选择的施用途径，可将该药物组合物以多种形式给患者施用，这是本领 域那些技术人员可以理解的。本发明的组合物可被局部地、通过手术或注射施用 到预期位点。
能调节TRIP-Br活性的分子的溶液可以在生理学上合适的缓冲液中制备。在 普通的储存和使用的条件下，这些制剂包含一种防止微生物生长的防腐剂，这将 保持能调节TRIP-Br活性的分子的功能。本领域技术人员应该知道如何配制合适 的制剂。选择和配制合适的制剂的传统的程序和成分被描述于，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences和公开于1999年的The United States Pharmacopeia：The National Formulary(USP 24 NF19)。
在不同的实施方案中，该组合物被局部或通过直接注射(皮下地、静脉内地、 肌内地，等)施用在预期位点上，在该位点患者中存在一种以不受抑制的方式增 殖的细胞。
要应用的药物组合物的剂量取决于被治疗的特殊状况，状况的严重性，患者 个体参数包括年龄、身体条件、大小和重量，治疗的持续时间，并行治疗的特性 (如果有的话)，施用的特定途径和其他类似的在健康从业者的知识和专门技术之 内的因素。这些因素对于本领域那些技术人员是公知的并且使用最小限度的常规 实验即可获得。
现在同样预期的是在此描述的能调节TRIP-Br活性的分子，包括TRIP-Br的 肽调节剂，靶向TRIP-Br转录物的DNA酶，与TRIP-Br转录物的至少一个部分或 片段互补的反义RNA或靶向TRIP-Br转录物的小干扰RNA分子。在特定的实施 方案中，该分子是一个包含具有式UTGXLXDXXLZJOLFJDID(SEQ ID NO：16)序 列的肽，其中X是任意氨基酸；U是S，T，A或没有氨基酸；Z是D或E；J是 D，E，A或G；和O是I，L，V，A或没有氨基酸。在特定的实施方案中，该肽 调节剂是包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的肽，并可进一步包含SEQ ID NO.3。 在特定的实施方案中，该肽包含SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5，或具有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的序列。在某些实施方案中，该分子是包含SEQ ID NO.6 或SEQ ID NO.7序列，或具有SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7序列的DNA酶。目 前同样预期的有这些分子的用途，包括调节TRIP-Br的转录整合活性以治疗患者 体内的增殖性紊乱的用途，制备调节TRIP-Br转录整合活性的药物或制备治疗患 者体内增殖性紊乱的药物的用途。
还提供了鉴定或筛选TRIP-Br调节剂，包括小分子或肽调节剂的方法。测试 分子被用于竞争TRIP-Br的PHD-溴结构域相互作用区域与TRIP-Br的细胞蛋白 靶的结合。TRIP-Br的细胞蛋白靶可以是，例如，含有PHD锌指或溴结构域的蛋 白，包括例如KRIP-1蛋白或p300/CBP蛋白。因此，在测试化合物存在的情况下， 使TRIP-Br的细胞蛋白靶与含有TRIP-Br的PHD-溴结构域相互作用区域的肽相 接触，并且监控该测试化合物对TRIP-Br的细胞蛋白靶和TRIP-Br的溴结构域相 互作用区域之间结合的影响。这些竞争测定，以及测量蛋白-蛋白相互作用中断 的方法是公知的，且包括层析法测定，免疫测定，固定实验，免疫沉淀技术，凝 胶阻滞试验。用于筛选TRIP-Br调节剂的方法也能很好地用于筛选化合物组合文 库。
本发明还预期抗TRIP-Br的抗体，尤其抗TRIP-Br1或TRIP-Br2的抗体。本 发明的抗体或者是多克隆抗体或是单克隆抗体。单特异性抗体可以是重组体，如， 嵌合的(如，通过人恒定区与鼠源可变区结合而成)，人源化的(人免疫球蛋白恒 定主链与动物来源的，如鼠源的高变区结合)，和/或单链。多克隆和单特异性抗 体也可以是免疫球蛋白片段的形式，如F(ab)’2或Fab片段。本发明的抗体是任何 同型，如IgG或IgA，且多克隆抗体是单一同型或同型的混合物。
在特定的实施方案中，该抗体是抗人TRIP-Br的肽序列 DPGHTAAVAQAPPAVAS(SEQ ID NO.：10)或SVADNLLASSDAALS(SEQ ID NO.：11)的小鼠单克隆抗体。
抗TRIP-Br的抗体是通过用含有TRIP-Br的多肽、同系物或片段的组合物免 疫哺乳动物来产生的。生产多克隆抗体或单克隆抗体的方法是本领域公知的。综 述参见“Antibodies，A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，Eds.E. Harlow和D.Lane(1988)，和D.E.Yelton等人.，1981.Ann Rev.Biochem.50：657-680； 对于单克隆抗体，见Kohler&Milstein(1975)Nature 256：495-497。
这些抗体在检测样品，如生物样品，包括正经历或怀疑正经历不受控制的增 殖的细胞样品，或正被治疗或已被治疗以防止增殖的细胞样品里TRIP-Br抗原的 存在的诊断方法中是有用的。这些抗体也被用于纯化TRIP-Br的亲和层析。
简要地说，为制备单克隆抗体，通过传统的实验方案将带有产生抗体潜能 的、来自用抗原免疫的宿主动物的体细胞与骨髓瘤细胞融合，形成两种细胞的杂 交瘤。体细胞可来源于转基因动物的脾、淋巴结和外周血。可被用于生产杂交瘤 的骨髓瘤细胞包括鼠骨髓瘤细胞系，如MPCII-45.6TGI.7，NSI-Ag4/1，SP2/0-Ag14， X63-Ag8.653，P3-NS-1-Ag-4-1，P.sub.3X63Ag8U.sub.1，OF，和S194/5XX0.BU.1； 包括210.RCY3.Ag1.2.3的大鼠细胞系；包括U226AR和GM1500GTGA1.2的细 胞系；和小鼠-人异源骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系(Hammerling，等人.(编者)， Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas IN：J.L.Turk(编者)Research Monographs in Immunology，Vol.3，Elsevier/North Holland Biomedical Press，New York(1981))。
体细胞-骨髓瘤细胞杂交物被放置于带有选择培养基，如HAT培养基的多重 孔中。选择培养基可从其他不期望的融合细胞杂交物中检出产生抗体的杂交瘤。 由于骨髓瘤细胞缺乏产生细胞生长所必需的酶的遗传信息，因此，选择培养基也 防止那些会另行持续无限分裂的未融合的骨髓瘤细胞的生长。来源于体细胞的B 淋巴细胞含有产生细胞生长的酶所必需的遗传信息，但缺乏骨髓瘤细胞的“无限 增殖化”性质，因此，在选择培养基中维持时间很短。因而，只有那些成功融合 骨髓瘤细胞的体细胞才能生长于选择培养基中。那些未融合的细胞将被HAT或选 择培养基杀死。
筛选方法被用于检验来源于生长在多重孔中的杂交瘤的可能的抗-TRIP-Br抗 体。使用多重孔是为了防止个体杂交瘤长得超过其他的。用于检验可能的抗- TRIP-Br抗体的筛选方法包括酶免疫测定、放射免疫测定、空斑测定、细胞毒性测 定、斑点免疫结合试验、荧光激活细胞分类术(FACS)，和其他体外结合测定。
测验为抗-TRIP-Br抗体阳性的杂交瘤被维持在培养基中，并可被克隆以生产 TRIP-Br特异性的单克隆抗体。可选择地，期望的杂交瘤能被注射到用于为最初的 融合提供体细胞和骨髓瘤细胞的类型的组织相容性动物的体内。被注射的动物长 出可分泌由杂交瘤产生的特异的单克隆抗体的肿瘤。
这些被选择的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体适于从细胞培养基或腹水溶液 中通过传统的免疫球蛋白纯化方法而纯化出来，例如，A蛋白-琼脂糖(Sepharose) 羟基磷灰石(hydoxylapatite)层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析。
本申请提及的所有文献在此引入作为参考。
尽管在此披露了本发明的各种实施方案，但根据本领域那些技术人员的常规 知识能在本发明的范围之内作出许多适应和修饰。这些修饰包括本发明任何方面 的公知的等同替换，目的是以基本上相同的方式获得相同的结果。此中所使用的 所有技术和科学术语与本发明技术领域的普通技术人员的普通理解具有相同的意 义，除非另外定义。
实施例
实施例1：利用诱饵肽破坏TRIP-Br与PHD锌指和溴结构域的相互作用
材料和方法
重组DNA和合成肽.pGL3-6xE2F-TATA/萤光素酶报道质粒以及相应的最小 报道分子pGL3-TATA/萤光素酶，均由Kristian Helin博士(European Institute of Oncology)友情赠与。pRcSV/细胞周期蛋白E以及pCMV/Cdk2均由Steve Reed 博士(The Scripps Research Institute，美国)友情赠与。各种用于体外翻译(IVT) 以及转染实验的质粒DNA以及cDNA克隆已经被在先描述(Hsu，S.I.H.，等人. EMBO J 20，2273-2285(2001))。合成的寡核苷酸来自GENSET，新加坡。合成肽以 及N末端荧光素化的肽由Louisiana State University Health Sciences Center (LSUHSC)Core Facilities，美国，合成并纯化。合成了下列羧基末端酰胺化的诱 饵肽(细胞膜穿透肽标记序列标有下划线)：
*Br1： ERQIKIWFQNRRMKWKKATGCLLDDGLEGLFEDID [SEQ ID NO.：4]
*Br2： EROIKIWFQNRRMKWKKTGFLTDLTLDDILFADID [SEQ ID NO.：5]
*SCR： ERQIKIFONRRMKWKKKGLDEDGLLLFCEGDTLAD [SEQ ID NO.：8]
冻干肽制剂在无菌二甲基亚砜(DMSO)重构制成25mM的储液。
组织培养细胞系.所有细胞系均在37℃具有5％二氧化碳(CO2)时维持在 加湿培养箱中。人类骨肉瘤细胞系U2OS被培养在补充了10％胎牛血清(FBS) 以及抗微生物剂(50IU/ml青霉素，50μg/ml链霉素和50μg/ml艮他霉素)的 Dulbecco氏修饰的Eagle氏培养基(DMEM)中。稳定表达ER-E2F-1的U2OS 细胞[由Kristian Helin博士(European Institute of Oncology)友情赠与]被培养在补充 了10％FBS，1.5μg/ml嘌呤霉素以及抗微生物剂的DMEM中。用于实验的细胞 处于2-15次传代之间。在所有诱饵肽实验中，细胞在处理之前以5×104细胞 /10cm2的密度被传代培养(sub-cultured)24小时。
生化试剂.环己酰亚胺(C7698)以及4-羟基三苯氧胺(OHT；H7904)购 自Sigma。用于人PARP(66391A)的小鼠单克隆抗体购自Pharmingen。所有其他抗 体购自Santa Cruz Biotechnology。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3萤光底物 Ac-DEVD-AFC(Bio-rad；170-3178)和细胞凋亡诱导剂足叶乙甙(eto)由Clement M.Veronique博士(National University of Singapore)友情赠送。
通过体外翻译制备蛋白.体外翻译(IVT)产物合成自pcDNA3/TRIP- Br1，pcDNA3/TRIP-Br2以及pBlueScript/GAL4-KRIP-1，使用偶联了TNT T7的网织 红细胞裂解系统(Promega)。体外翻译反应是在50μl的总反应体积中进行的， 其中在[35S]-甲硫氨酸(Met)存在的条件下，使无核酸酶水中1.0μg所示的DNA 模板与30μl TNT Quick master mix于30℃一起温育90分钟。
免疫沉淀测定(IP).用于IP的结合反应的进行是通过：1.5μl[35S]-Met 标记的GAL4或GAI4-KRIP-1IVT产物与3μl[35S]-Met标记的TRIP-Br1或 TRIP-Br2IVT产物在1×IP缓冲液(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273-2285(2001)) 中于4℃温育1个小时。为了分析诱饵肽介导的阻断活性，在加入全长TRIP-Br1 或TRIP-Br2IVT产物之前，将GAL4-KRIP-1IVT产物与25μM诱饵肽在4℃预 温育30分钟。用缀合在琼脂糖上的抗GAL4抗体沉淀的蛋白复合物通过SDS- PAGE分离，然后进行放射自显影。
共焦显微镜术(Confocal microscopy).为了进行共焦显微镜术，分会合的 U2OS细胞被培养在安装于#1.0德国硼硅酸盐盖玻片(Lab-Tek)的8孔小室中， 并且暴露于载体(0.5％DMSO)或20μM的荧光素化的诱饵肽中24小时。紧在 荧光成像之前，被处理的细胞用1×PBS洗涤并被温育在新鲜无肽的培养基中以 使本底噪声最小化。使用一个装有plan-neafluar 40x/0.75Ph2物镜(激光激发波 长＝488nm；发射波长＝500-550nm)的Carl Zeiss 510激光扫描显微镜获取图像。
流式细胞术分析.使用Coulter EPICSELITE ESP流式细胞仪进行分析，其 激光波长为488nm。为了测量肽内在化效率，生长在6-孔皿中的U2OS细胞暴 露于载体(0.5％DMSO)或50μM的荧光素化的诱饵肽中24小时。在收获时， 细胞先用2％多聚甲醛固定，然后再用70％乙醇固定。每一样品中发出加强绿色 荧光的细胞的比例用WinMDI(版本2.7)计算机软件进行确定。用SPSS8.0软件 进行统计分析。
DNA转染以及相继的β-半乳糖苷酶/萤光素酶测定.为进行萤光素酶报道 分析，U2OS细胞被培养在6-孔皿中，24小时之后用各种报道质粒通过如前所 述(Martin，K.，等人.Nature 375，691-694(1995))的钙沉淀法进行转染。除去沉淀物 24小时后，在收获之前，细胞暴露于载体(0.5％DMSO)或50μM的诱饵肽中5 小时。将细胞刮入200μl的裂解缓冲液中，并且立即使用Dual Light System(Tropix) 对单一10μl等分试样的裂解物相继测定β-半乳糖苷酶和萤光素酶活性。为进行 蛋白超表达实验，U2OS细胞以1×105细胞/孔的密度被培养于6-孔平板中，24 小时之后用Superfect试剂(QIAGEN)转染。
半定量RT-PCR.用TRIZOL试剂(Life Technologies)从U2OS细胞或 U2OS-ER-E2F-1细胞(用或不用1.0μM OHT和/或10μg/ml环己酰亚胺培养) 中分离总RNA。总RNA(4μg)用寡脱氧胸苷酸以及M-MLV反转录酶反转录， 其总反应体积为20μl。3μl cDNA样品在25mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 以及40μM特异性引物对存在的情况下在50μl总反应体积中进行聚合酶链反应 (PCR)。PCR的循环特征为：变性(94℃，30秒)，退火(51℃，30秒)以及 延伸(72℃，2分钟)，进行30个循环，包括一个在94℃下2分钟的起始变性步 骤以及一个在72℃下10分钟的末端精加工步骤。基因特异性引物序列可按需提 供。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析。
BrdU测定.生长在96孔平板的U2OS细胞暴露于载体或诱饵肽中。根据厂 商(Boehringer Mannheim)推荐，采用细胞增殖试剂盒，用ELISA比色测定监控溴 脱氧尿苷(BrdU)的整合。
确定细胞数量和生存力.使生长在6孔皿中24小时的U2OS细胞暴露于2ml 含有载体(0.5％DMSO)或50μM诱饵肽的生长培养基中48或72小时。处理 之后，将细胞用1×PBS洗涤两次，用胰蛋白酶消化来收获并重悬于1ml 1×PBS 中。从每个样品中取出10μl细胞悬浮液，并用电子或手工方法计数。对于电子 总细胞计数，将10μl细胞悬浮液稀释于20ml isotonII缓冲液(Coulter)中，用 电子Coulter计数器评估细胞数。对于手工计数活细胞，将每个样品中的10μl 细胞悬浮液与等体积的锥虫蓝染料(Sigma，1×PBS中0.4％w/v)混合。活细胞 (未染色的)的数目用血细胞计数器手工计数。
细胞同步以及细胞周期进程分析.将6-孔皿中的U2OS细胞用洛可哒唑 (75ng/ml)处理22小时。然后，将用洛可哒唑停滞的培养物用1×PBS洗涤释放， 并培养于DMEM中，其中加入了含有载体(0.5％DMSO)或20μM诱饵肽的10 ％的FBS。以4小时间隔收获细胞用于标准蛋白印迹分析。为了分析Geminin蛋 白特征，模拟的-或细胞周期蛋白E/Cdk2-转染的U2OS细胞在转染后3小时被暴 露于洛可哒唑(75ng/ml)中22小时。
蛋白衰减(decay)分析.使转染或肽处理过的细胞暴露于20μg/ml环己酰 亚胺(CHX)中。从CHX处理后0，1，2，3，4或5小时的处理细胞中制得全 细胞裂解物用于蛋白印迹分析。
变性SDS-PAGE以及蛋白印迹.用前述(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273-2285(2001))标准变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自全细胞裂解物以及IP 复合物的蛋白。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶测定.通过在2000rpm于4℃下离心15分 钟收获6-孔皿中贴壁的以及脱附的细胞。获得的细胞沉淀在50μl冷的裂解缓冲 液(Clontech)中于冰上温育10分钟。细胞裂解物在含有10mM HEPES，2.0mM EDTA，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1.0mM PMSF，抑酶肽(aprotinine)，胃酶抑制剂A 以及亮抑蛋白酶肽(leupeptine)(各20μM)，6.0mM DTT以及Ac-DEVD-AFC(4.0 μg/ml)的反应混合液中温育。反应可以在室温下进行。用分光荧光计(激发波长 ＝400nm；发射波长＝505nm)在1小时中每隔15分钟进行一次萤光记录。
图注
图1：TRIP-Br诱饵肽拮抗KRIP-1/TRIP-Br PHD-溴结构域的相互作用.(A) 免疫沉淀(IP)测定的放射自显影图显示了特定KRIP-1/TRIP-Br PHD-溴结构域的 体外相互作用以及诱饵肽的阻断活性。GAL4-KRIP-1被缀合在琼脂糖上的抗- GAL4抗体(泳道3-5&7-10)特异性免疫沉淀，但不能被非特异的对照抗细胞周 期蛋白E的抗体(泳道6)免疫沉淀；(B)体内PHD-溴结构域相互作用的拮抗 作用。用0.4μg所示的GAL4表达构建体以及1.2μg pMT3A/KRIP-1、连同0.4 μg最小萤光素酶报道分子pG5-GL3以及0.1μg对照报道分子pCMV/β-gal 瞬时地转染U2OS细胞。收获之前将转染的细胞暴露于载体(0.5％DMSO)或50 μM所示的诱饵肽中，用于萤光素酶和半乳糖苷酶活性的相继测定。活化倍数(fold activation)是指标准化成β-半乳糖苷酶活性的萤光素酶活性，并相对于单独用 报道分子转染所观察到的活性进行表示。数值代表了至少两个独立试验的平均数 +/-标准差。
图2：被U2OS细胞吸收的肽的分析.(A)用荧光显微术监控肽的内在化。 图片显示了在处理后24小时时FITC标记的*SCR，*Br1以及*Br2内化入U2OS 细胞；(B)用流式细胞仪测量肽内在化效率。用WinMDI软件确定FITC阳性细 胞百分比。数值代表了两个独立试验的平均数+/-标准差。将斯氏t检验用于比较 数值。对于所有肽处理的同时比较，P＝0.454。
图3：对诱饵肽处理应答的U2OS细胞中的E2F-应答转录分析.(A)用0.1 μg pCMV/β-半乳糖苷酶以及7.5μg指示的萤光素酶报道分子质粒共转染的 U2OS细胞的β-半乳糖苷酶/萤光素酶测定。载体处理过的样品的启动子活性被 标准化为100％，且肽处理样品的活性相对于载体处理的对照进行表示。数值代 表了至少两个独立试验的平均数+/-标准差；(B)对暴露于载体(0.5％DMSO) 或50μM指示的诱饵肽16小时的U2OS细胞中的dhf、细胞周期蛋白-E、细胞 周期蛋白A2、PCNA、DNA Pola以及cdc2表达的总RNA的半定量RT-PCR分析。 引入H-肌动蛋白作为内部对照。图形显示了获自两个独立试验的结果。
图4：诱饵肽的依赖时间的以及依赖剂量的抗增殖作用.(A)诱饵肽的依赖 时间的抗增殖作用。用ELISA比色测定分析暴露于载体(0.5％DMSO)或50μ M诱饵肽中24或48小时的U2OS细胞的BrdU整合。数值代表了两个独立试验 的平均数+/-标准差；(B)诱饵肽的依赖剂量的抗增殖作用。用ELISA比色测定 分析暴露于5，10，20或50μM的*SCR(实线以及正方形)，*Br1(虚线以及三角 形)或*Br2(虚线以及圆形)中48小时的U2OS细胞的BrdU整合。数值代表了至少 两个独立试验的平均数+/-标准差；(C)细胞增殖分析。左板：在诱饵肽处理后0， 48以及72小时，用Coulter计数器电子测定总细胞数。右板：在处理后72小时， 收获细胞并用锥虫蓝染色以进行活细胞计数分析。
图5：在用诱饵肽处理后24以及72小时的U2OS细胞非同步群体的流式细 胞仪分析.(A)暴露于载体(DMSO)或所示的诱饵肽中24小时的U2OS细胞 非同步群体的细胞周期分布图。在未处理的对照(无阴影)的图中添加进每个处理样 品(划上阴影线的)的细胞周期图用于可视比较。表显示了细胞周期中各个期的 细胞百分比；(B)处理后72小时细胞周期分布图的图示。数值代表了两个独立试 验的平均数+/-标准差。
图6：天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶分析.(A)用Ac-DEVD-AFC荧光底 物测定暴露于Eto(足叶乙甙)中24小时或50μM诱饵肽中48或72小时的U2OS 细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3蛋白酶的活性。柱状图显示了每μg加 入的全细胞裂解物的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3蛋白酶活性。数值代表了 两个独立试验的平均数+/-标准差。对照：于正常生长培养基中培养细胞；载体： 在0.5％DMSO存在的情况下培养的细胞；(B)PARP切割的蛋白印迹分析。将 U2OS细胞暴露于Eto(足叶乙甙)中24小时或50μM诱饵肽中72小时。泳道1： 载体细胞(在0.5％DMSO存在的情况下培养24小时)；泳道2：25μM Eto；泳 道3：250μM Eto；泳道4：载体(细胞在0.5％DMSO存在的情况下培养72小 时)；泳道5：*SCR；泳道6：*Br1；泳道7：*Br2。
图7：细胞周期蛋白表达图以及蛋白衰减分析.(A)在不存在或存在诱饵肽 处理的情况下，从洛可哒唑停滞中释放出来的U2OS细胞的蛋白表达图。通过蛋 白印迹法用获自释放后4，8，12，16，20以及24小时的同步化的U2OS细胞的 全细胞裂解物对各种细胞周期蛋白以及Cdks的蛋白表达进行估计。考马斯染色蛋 白用作加样对照(loading control)；(B)用载体主链(载体)或pRc/细胞周期蛋白 E以及pCMV/Cdk2(各1μg)转染的U2OS细胞通过暴露于洛可哒唑(75ng/ml) 被停滞在G2/M边界，并随后被释放重新进入细胞周期。使用了获自释放后0，4， 8，12，16以及20小时的同步化的U2OS细胞的全细胞裂解物来估计细胞周期蛋 白E以及Geminin的蛋白表达；(C)在细胞周期蛋白E/Cdk2超表达不存在或存 在的情况下(左板)或在不存在或存在诱饵肽处理情况下(右板)，用蛋白印迹法 (WB)对Geminin表达蛋白进行的衰减分析。考马斯染色蛋白用作加样对照(C)。
图8：在细胞周期蛋白E调节中的TRIP-Br整合功能的作用.(A)在获自暴 露于5，10或20μM诱饵肽中48小时的U2OS细胞的全细胞提取物中，对细胞 周期蛋白A，D和E表达进行的蛋白印迹分析。Cdk2用作加样对照；(B)作用 于Fbxw7表达的诱饵肽的依赖剂量的作用。用半定量RT-PCT分析暴露于5，10 或20μM诱饵肽中的U2OS细胞的Fbxw7 mRNA转录物水平。H-肌动蛋白作为 内部对照被共扩增；(C)如所示，通过半定量RT-PCR应用在有或没有OHT和/ 或环己酰亚胺(CHX)时生长2小时的分会合的U2OS ER-E2F-1细胞内的总RNA 进行细胞周期蛋白-E和Fbxw7表达分析。引入H-肌动蛋白作为内部对照。
图9：在依赖E2F的细胞周期进程中TRIP-Br整合功能的作用.提出了 TRIP-Br蛋白以一种有助于依赖E2F的细胞周期进程的方式整合并转导由各种 PHD-溴结构域蛋白带来的调节信号。
结果
TRIP-Br诱饵肽在体外以及体内拮抗KRIP-1/TRIP-Br PHD-溴结构域相互作 用.设计了相应于TRIP-Br1(*Br1)和TRIP-Br2(*Br2)的PHD-溴结构域相互 作用区域的肽(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273-2285(2001))，以及具有*Br1肽 (见材料和方法)相同氨基酸组成的对照的“拼凑的(scrambled)”(*SCR)肽。 如用基序-开采(motif-mining)运算法则确定的( http：//www.motif.genome.ad.jp/； 未示数据)，*SCR肽序列与任何已知蛋白基序相比，不具有显著同源性。为了促 进诱饵肽转运到培养的细胞中，每个肽的氨基末端都标记上由黑腹果蝇触角足同 源域蛋白的第三螺旋所得的16个氨基酸的细胞膜穿透肽序列(Derossi，D.，等人.J. Biol.Chem.269，10444-10450(1994))。该膜-转位序列已被证实具有将用它标记的无 关肽序列内化的能力(Bandera，L.R.，等人.Nature Biotech.15，896-901(1997))。
我们的结果表明上述诸肽拮抗TRIP-Br/KRIP-1蛋白复合物形成。采用抗- GAL4抗体，体外翻译(IVT)的GAL4-KRIP-1融合蛋白的免疫沉淀(IP)导致 了TRIP-Br1或TRIP-Br2IVT产物的共免疫沉淀(co-IP)(图1A，泳道3&4)。仅 有GAL4不会导致TRIP-Br的共免疫沉淀(图1A，泳道1&2)，而且GAL4-KRIP-1 与对照的萤光素酶IVT产物也不会共免疫沉淀(图1A，泳道5)。当把对照*SCR 肽加入到IP结合反应中时，不影响GAL4-KRIP-1/TRIP-Br复合物的形成(图1A， 泳道7&9)，而加入*Br1或*Br2诱饵肽则显著降低了GALA-KRIP-1与TRIP-Br1 或TRIP-Br2共免疫沉淀的能力(图1A，泳道8&10)。这些发现表明*Br1或*Br2 特异性阻断TRIP-Br蛋白在体外与KRIP-1的PHD-溴结构域相互作用的能力。
在U2OS细胞中使用了在先描述的报道分子系统(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273-2285(2001))，我们发现细胞暴露于*Br1或*Br2而不是*SCR中导致完全消 除了对于GAL4-TRIP-Br转录活性的KRIP-1-相关的共活化功能(图1B，泳道4&5 与泳道3的比较，以及泳道8&9与泳道7的比较)。这些发现表明*Br1和*Br2能 够在体内功能性地拮抗TRIP-Br蛋白的PHD-溴结构域相互作用的功能。
直接荧光成像表明所有三种诱饵肽都被有效地内化进入U2OS细胞(图 2A)。流式细胞仪分析证实了不同肽的内化效率之间没有统计学显著差异(图 2B)。
TRIP-Br蛋白的PHD-溴结构域相互作用功能在体内共调节依赖E2F的转录 活性.我们用*Br1和*Br2拮抗了该功能并改变了作用于E2F-应答报道分子的内 源E2F/DP活性水平。选择U2OS细胞用于该测定是因为它表达功能性的E2F- 1，DP-1，Rb以及具有可检测水平的内源TRIP-Br1(用兔多克隆的抗TRIP-Br1 抗体通过蛋白印迹分析进行估计(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273- 2285(2001))；数据未显示)。在收获细胞用于测量萤光素酶活性之前，将用E2F 应答萤光素酶报道分子(pGL3-TATA-6xE2F-Luc)或者含TATA的最小萤光素 酶报道分子(pGL3-TATA-Luc)转染的U2OS细胞暴露于载体(DMSO)或50 μM的*SCR、*Br1或*Br2中5小时。用*Br1或*Br2但不用*SCR的处理，降低 了E2F应答萤光素酶报道分子的转录活性(图3A，左板)。虽然用*SCR和*Br1 的处理与轻微激活相关，但用*Br2的处理没有显著改变最小报道分子的转录活性 (图3A，右板)。所有三种诱饵肽均不能影响受雄激素-应答的但E2F非应答的人 前列腺特异性抗原(PSA)近端启动子驱动的萤光素酶报道分子的转录活性(数 据未显示)。这些结果显示，观察到的、与细胞暴露于*Br1或*Br2相关的转录抑 制是通过干扰含TRIP-Br的蛋白复合物装配到E2F结合位点上而特异介导的。
用半定量RT-PCR分析法测量由六个代表性E2F调节的基因表达的内源 mRNA水平，这六个基因是：细胞周期蛋白-E(Ohtsubo，M.，等人.Mol Cell Biol 15，2612-2624(1995))，细胞周期蛋白-A2(Rosenblatt，J.等人.Proc Natl Acad Sci USA 89，2824-2828(1992))；Roy，L.M.，等人.J.Cell Biol 113，507-514(1991))，dhfr (Miller，G.P.和Benkovic，S.J.Chem Biol 5，105-113(1998))，PCNA(Warbrick，E. Bioessays 22，997-1006(2000))，DNA Polα(Frick，D.N.和Richardson，C.C.Annu Rev Biochem 70，39-80(2001))以及cdc2(Smits，V.A.以及Medema，R.H.Biochim Biophys Acta 1519，1-12(2001))。这些基因编码的蛋白在细胞周期的不同的期具有关键作 用。将细胞暴露于*Br1或*Br2导致cdc2基因显著下调，正如明显降低的cdc2 mRNA转录物水平所反应出的那样(图3B)。相反，DNA Polα以及dhfr的mRNA 表达水平通过暴露于*Br2而不是*Br1而被下调(图3B)。细胞周期蛋白-E、细胞 周期蛋白-A2以及PCNA基因的转录活性不受暴露于*Br1或*Br2的影响(图 3B)。经调查，相对于载体处理过的对照，拼凑的肽*SCR在基因表达特征上产生 的影响可忽略不计。因此，诱饵肽介导的对TRIP-Br蛋白与内源的含PHD锌指和 /或溴结构域的因子之间相互作用的拮抗反应，导致了U2OS细胞中内源性E2F- 应答基因亚型转录活性有差异的下调。
TRIP-Br整合功能的拮抗作用引起了增殖性阻断.已经表明E2F转录因子在 整合细胞周期装置与转录装置的活性来调节细胞增殖的过程中发挥极其重要的作 用(Lam，E.，等人.Curr Opion Cell Biol 6，859-866(1994))。不同步的U2OS培养物 在载体或诱饵肽(50μM)中暴露24或48小时，然后通过BrdU整合测定增殖 潜力。在处理后24小时到48小时，暴露于*Br1或*Br2的培养物显示出DNA合 成活性被大大降低(图4A)。相反，用*SCR处理的细胞则显示出基本的DNA合 成速率，类似于载体处理过的对照细胞。暴露于不断增加浓度的*Br1或*Br2而非 的*SCR中的U2OS细胞显示出与BrdU整合的能力逐渐减小(图4B)，表明和暴 露于*Br1或*Br2诱饵肽相关的、对DNA合成的抑制作用是特异的并且是依赖剂 量的。与BrdU整合数据相一致，随着时间的推移，虽然*Br1或*Br2处理过的培 养物显示出细胞增殖几乎完全停滞，但载体和*SCR处理过的培养物则显示出几乎 相同的细胞数目增长(图4C，左板)。锥虫蓝染色排除的手工细胞计数分析证实 用*Br1或*Br2处理72小时的U2OS细胞培养物含有的活细胞明显少于载体或 *SCR处理过的对照(图4C，右板)。这些表型是可再现的，已知CNE2(鼻咽癌) 以及Caski(子宫颈癌)，即两种其他的已知表达TRIP-Br1和TRIP-Br2的癌细胞 系，对Br1或*Br2的反应会有类似于U2OS细胞的表现(数据未显示)。
TRIP-Br诱饵肽通过不依赖天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的机理诱导亚 -G1群体的聚集.我们使用流式细胞仪来调查暴露于载体、*SCR、*Br1或*Br2 中24以及72小时的U2OS细胞非同步群体的细胞周期特征。在处理后24小时， 记录显示暴露于*Br1或*Br2中的细胞在亚-G1(亚-二倍体)的群体要比载体和 *SCR处理过的细胞高出1.5-2.5倍(图5A)。处理后72小时的亚-二倍化的数量 甚至更大，在*Br1或*Br2处理过的培养物中超过70％的的细胞表现为基因组 DNA的亚-G1补体(图5B)。
亚-G1细胞群体的诱导经常与伴随细胞凋亡的基因组DNA内切核酸降解相 关。用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3特异性的合成寡肽底物(Ac-DEVD- AFC)来测定由*SCR、*Br1或*Br2处理48或72小时的U2OS细胞的天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶-3蛋白酶活性。由载体、*SCR、*Br1或*Br2处理过的培 养物制得的细胞裂解物中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的蛋白酶活性水平 与从未处理对照中获得的细胞裂解物中探测到的基线活性没有区别，如分光荧光 测定法所确定的(图6A)。未能检测到天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性不 归因于技术失误，因为用诱导细胞调亡的药理学试剂足叶乙甙(eto)处理的细胞 显示出天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性依赖剂量的的激活要高出基线几个 数量级(图6A)。为证实获自天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3测定的结果，平 行进行了PARP(多腺苷二磷酸核糖聚合酶)切割研究(Patel，T.，等人.FASEB 10，587-597(1996))(图6B)。虽然暴露于足叶乙甙24小时的结果是PARP以依赖 剂量的方式切割(图6B，泳道1-3)，但与用载体或*SCR处理过的对照相比， *Br1或*Br2处理与显著的PARP切割无关(图6B，泳道4-7)。*Br1或*Br2不 能刺激天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性和PARP切割强有力地反驳了天冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3以及因此典型的细胞凋亡在TRIP-Br诱饵肽-诱导的 亚-二倍体过程中的介入。
不完全DNA复制：另一种亚-二倍体化机理.对于大多数真核细胞，每个细 胞周期发生一次DNA复制以维持基因组的稳定性。这种严格要求是由细胞周期 蛋白、Cdks以及复制前复合物(pre-PCs)之间的精密调节的相互影响完成的(Diffley， J.F，和Labib，K.J.Cell Sci 115，869-872(2002))。已证明G1期细胞周期蛋白的反常 表达可能会阻止复制前复合物(pre-RC)的形成以及以一种可能减少功能性复制 起点数量的方式来抑制复制的许可(Tanaka，S.和Diffley，J.F.Genes Dev 16，2639- 2649(2002))。在本文中，功能性起点的数量不足的后续复制可能会导致不完全 DNA合成以及由此造成染色体DNA的逐步丧失。细胞不能完成DNA复制会产 生不能维持稳定的2N倍性的子细胞，这在流式细胞仪分析中会记录一个亚-G1峰 值。
为了确定诱饵肽是否通过G1细胞周期蛋白表达的反常来产生预期的基因组 去稳定作用，我们研究了对诱饵肽应答的关键细胞周期蛋白-Cdk复合物的表达特 征。用洛可哒唑获得了U2OS细胞的细胞周期同步化，如用流式细胞仪分析测定 的，洛可哒唑有效地使超过90％的细胞停滞在了具有4N套DNA内含物的G2/M 边界(数据未显示)。随后在载体或一种诱饵肽存在的情况下，细胞从洛可哒唑阻 断中被释放出来。释放后每隔4小时，制备全细胞提取物。蛋白印迹分析表明内 源细胞周期蛋白A2和D1以及依赖细胞周期蛋白的激酶Cdk2的细胞周期表达特 征不受诱饵肽处理的影响(图7A)。在标记的对照中，我们发现在暴露于*Br1或 *Br2后，正常细胞周期-调节的动力学和细胞周期蛋白E蛋白的表达幅度明显紊 乱。在载体以及*SCR处理的U2OS细胞中，细胞周期蛋白E在释放后8小时到 16小时在G1的中期到晚期过程中累积(图7A)。当细胞进入S期后，由于遍在 蛋白介导的蛋白水解，细胞周期蛋白E的水平逐步减少(Koepp，D.M.等人.Cell 97，431-434(1999))。与载体或*SCR处理的细胞相比，*Br1或*Br2处理的细胞在 G1早期(早在释放后4小时)就开始显示细胞周期蛋白E的过早的累积。更进一 步地，在*Br1或*Br2处理的培养物中，细胞周期蛋白E的绝对水平被显著上调并 维持在高水平达到释放后最多24小时。这些发现表明TRIP-Br“整合”功能在阻 止细胞周期蛋白E在细胞周期中的累积中起着生理上重要的作用。用诱饵肽拮抗 该功能可能会通过上调细胞周期蛋白E的表达而影响DNA复制的效率。
通过作用于大量的蛋白靶，Cdks抑制pre-RC的形成及随后的DNA复制的 许可。这些靶中的其中之一是后期促进性复合物/周期小体(APC/C)，即一种E3遍 在蛋白连接酶。APC/C已显示在G1早期通过加速Geminin降解来促进DNA复制 的许可，Geminin是一种25kDa核蛋白，可通过其与Cdt1相互作用阻止MCM蛋白 整合入pre-RC来抑制DNA复制(Diffley，J.F.和Labib，K.J.Cell Sci 115，869- 872(2002)；Wohlschlegel，J.A.等人.Science 290，2309-2312(2000))。Geminin在S、G2 以及M期高度表达，并通常在中期-后期过渡时通过APC/C作为遍在蛋白介导的蛋 白降解的靶，以使DNA复制发生在随后细胞周期的G1早期(McGarry，T.J.和 Kirschner，M.W.Cell 93，1043-1053(1998))。APC/C相关的E3连接酶活性由细胞周 期蛋白B/Cdc2在有丝分裂期打开，并由G1细胞周期蛋白-相关的Cdk活性关闭。 因而，在G1早期的G1细胞周期蛋白表达的反常将使APC/C失活，从而使得 Geminin的异常累积以及阻止pre-RC的装配。
U2OS细胞首先用编码人细胞周期蛋白E以及Cdk2的表达质粒共转染，然 后用洛可哒唑停滞在G2/M边界。在释放后，以4小时间隔由同步周期的细胞制 备全细胞裂解物，以通过免疫印迹法估计Geminin的表达。与前面的报道(McGarry， T.J.和Kirschner，M.W.Cell 93，1043-1053(1998))相一致，在模拟转染(载体)的 对照细胞中，发现Geminin在G2/M边界以及S期被高水平表达，但在G1期间探 测不到(图7B)。相反，在G1期过程中细胞周期蛋白E/Cdk2的超表达的存在 诱导了Geminin的异常累积(图7B)。这些数据提示反常的细胞周期蛋白E/Cdk2 的表达诱导了Geminin蛋白的异常累积。
对Geminin进行了蛋白衰减分析。使对照(载体)或细胞周期蛋白E/Cdk2 超表达的细胞暴露于蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)，然后间隔1小时至最多 5小时从处理过的细胞中制备全细胞裂解物，以通过免疫印迹法分析估计内源 Geminin的水平。在对照细胞中，Geminin保持高水平，直至CHX处理之后3小 时，之后其水平急速下降(图7C，左板)。在标记的对照中，表达细胞周期蛋白 E/Cdk2的细胞中的Geminin水平持续保持较高直至CHX处理后最多5小时(图 7C，左板)。综上所述，这些结果表明反常的细胞周期蛋白E/Cdk2的表达导致了 Geminin的稳定。
将U2OS细胞暴露于载体或诱饵肽中，然后暴露于CHX中以进行蛋白衰减 分析。用载体或*SCR处理的细胞均表现出类似的Geminin蛋白衰减动力学(图 7C，右板)。在标记的对照中，*Br1或*Br2处理过的细胞中Geminin表现出明显 较慢的衰减速率以及维持高水平直至CHX处理后最多5小时的稳定状态的水平 (图7C，右板)。这些数据与模型相一致，模型中TRIP-Br诱饵肽通过涉及细胞 周期蛋白E反常以及Geminin稳定的机理，抑制DNA复制许可从而诱导亚-二倍 性。
TRIP-Br诱饵肽下调Fbxw7转录物水平.所观察的细胞周期蛋白E反常看来 不是由于细胞周期蛋白E转录物水平的改变而引起的(图3B)。细胞周期蛋白E 的特异的和适时的(周期性的)依赖细胞周期的表达模式主要受SCF-型遍在蛋白 连接酶复合物的调节，该复合物靶向细胞周期蛋白E以进行蛋白体-介导的蛋白水 解(Koepp，D.M.等人.Cell 97，431-434(1999))。因此，在*Br1或*Br2处理的细胞 中，所观察的细胞周期蛋白E蛋白水平的上调可能归因于诱饵肽诱导的上述遍在 蛋白-蛋白体途径的改变。由于*Br1或*Br2处理诱导了依赖剂量的细胞周期蛋白E 蛋白的累积而不会影响细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白A2(两种已知受遍在蛋 白介导的蛋白水解调节的蛋白)的蛋白水平(图8A，上板)，我们推论诱饵肽改 变了一个或多个细胞周期蛋白E-特异的遍在蛋白连接酶(E3酶)的表达和/或活 性。我们实施了半-定量RT-PCR以测量诱饵肽处理的细胞中Fbxw7mRNA转录物 的水平。Fbxw7基因产物，FBW7，其作为负责靶向蛋白特异性的SCF复合物的 F-box蛋白组分，近来已被鉴定为重要的细胞周期蛋白E丰度生理调节剂(Koepp， D.M.等人．Science 294，177(2001))。*Br1或*Br2，而非*SCR，以依赖剂量的 模式下调了Fbxw7的表达水平(图8B)。预计不能维持FBW7蛋白正常表达水平将 会消除SCFFBW7复合物特异地使细胞周期蛋白E多遍在蛋白化(poly-ubiquitinate) 的能力。这些结果提示TRIP-Br诱饵肽介导的拮抗通过涉及Fbxw7mRNA表达的 下调的机理，导致了细胞周期蛋白E在细胞周期中反常累积。
Fbxw7是一种新的E2F应答基因.硅上(in silico)分析中揭示了在Fbxw7启 动子区域中存在着几种与共有E2F应答元件明显同源的的顺式作用元件。因此， 可以想到*Br1或*Br2处理会导致直接或间接的对依赖E2F的Fbxw7基因转录的 抑制。我们接下来使用了可稳定表达融合到E2F-1转录因子上的雌激素受体(ER) 嵌合(chimaeric)蛋白的U2OS细胞。以前已经证明ER-E2F-1融合蛋白作为失活 细胞质蛋白在相对较低的水平上表达(Lomazzi，M.，等人.Nat Gen 31，190- 194(2002))。一旦加入雌激素类似物4-羟基三苯氧胺(OHT)，ER-E2F-1就转位到核 中并反式激活E2F应答启动子(Lomazzi，M.，等人.Nat Gen 31，190-194(2002))。 通过检查细胞周期蛋白-E(一种已知的E2F靶基因)的表达，我们确认加入OHT 之后ER-E2F-1被激活。我们的RT-PCR分析表明ER-E2F-1的激括导致细胞周期 蛋白-E的强烈的诱导(图8C)。即使在蛋白合成抑制剂环己酰亚胺存在的情况下， ER-E2F-1的激活同样导致Fbxw7表达的增加，非常类似细胞周期蛋白-E(图8C)。 当中间体因子的从头合成缺失时，会出现推定的E2F-应答基因的ER-E2F-1介导 的转录，这一实例使得我们得出这样的结论：Fbxw7是E2F-1的直接靶。
实施例2：利用DNA酶破坏TRIP-Br的功能
材料和方法
质粒DNA和cDNA克隆.pRcSV/细胞周期蛋白E以及pCMV/Cdk2均由 Steve Reed博士(The Scripps Research Institute，美国)友情赠与。其他用于转染试 验的质粒DNA和cDNA克隆已经在先描述过(Hsu，S.I.H.，等人.EMBO J 20，2273-2285(2001))。
生化试剂.用于细胞周期蛋白D1(sc-718)，细胞周期蛋白E(sc-481)， Cdk4(sc-601)和p27KIP1(sc-528)的多克隆抗体，以及HRP-缀合的抗-兔(sc-2004) 和抗-小鼠(sc-2005)第二抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
合成的寡核苷酸.商业合成(GENSET SA，Paris)在3’位置具有反向胸腺嘧 啶核苷的DNA酶。合成下列三种DNA酶： E-Br2 5’-T TAC CCA ACA GGC TAG CTA CAA CGA ATA TCA CA-3’ SEQ ID NO.：6 E-Br1 5’-T TGC TCA GCA GGC TAC CTA CAA CGA CTT GCT CA-3’ SEQ ID NO.：7 E-SCR 5’-C AGC TAC TGT GGC TAG CTA CAA CGA GCT GTC AT-3’ SEQ ID NO.：9
对应于每个DNA酶催化中心的残基加了下划线。
组织培养细胞系.人肺成纤维细胞WI-38购自美国典型培养物保藏中心 (American Tissue Culture Collection)(ATCC)，维持在37℃、在含有5％二氧化碳 (CO2)的湿润气氛中的75厘米V/C组织培养烧瓶(NuncTM)中，并在补充了10 ％特性化的胎牛血清(FBS)(Hyclone)以及抗微生物剂(50IU/ml青霉素，50μg/ml 链霉素以及50μg/ml艮他霉素)的Dulbecco氏修饰的Eagle氏培养基(DMEM) (Sigma)中培养。为了在各种平板格式(NuncTM)中进行传代培养，细胞一律以5 ×104细胞/10cm2接种。用于试验的细胞处于3-10次传代之间。
DNA酶转染.在DNA酶(0.1μM)转染前，如在先报道(Santiago，F.S.，等人. Nat Med 5，1264-1269(1999))采用Superfect按照厂商(Qiagen)的推荐，通过将 WI-38细胞培养于无血清培养基中72小时而使其休眠。
细胞增殖测定.为用于BrdU整合测定，将在96-孔皿中的生长休眠的WI-38 细胞用DNA酶和/或100ng的pCMV/E2F1，pCMV/DP1，pRSV/细胞周期蛋白E 或pCMV/Cdk2转染，然后在10％FBS存在或不存在的情况下暴露于溴脱氧尿苷 (BrdU，100μM)20小时。按照厂商的推荐(Boehringer Mannheim)，使用细胞 增殖试剂盒通过ELISA比色测定监控溴脱氧尿苷(BrdU)的整合。为进行手工细 胞计数，将处于24-孔皿中的生长休眠的WI-38细胞用DNA酶转染，然后在10 ％FBS中暴露72小时。细胞用pH7.4的PBS清洗，然后胰蛋白酶消化，从每个 样品中取出10μl细胞悬浮液并与等体积的锥虫蓝染料(Sigma，0.4％w/v溶于1× PBS)混合。未染色的细胞数用血细胞计数器手工数出。为进行菌落形成的测定， 将位于12-孔皿中的生长休眠的WI-38细胞用DNA酶转染，然后暴露于10％FBS 中120小时。细胞用结晶紫(0.75％w/v六甲基氯化对蔷薇苯胺[SIGMA]，50％乙醇， 1.75％w/v多聚甲醛，0.25％w/vNaCl)原位染色10分钟，然后用去离子水彻底清洗 以去除多余的染料。
半-定量RT-PCR.各种处理后，6-孔培养皿中的WI-38细胞用TRIZOL试 剂(Life Technologies)提取总RNA。总RNA(4μg)在20μl的总反应体积中用 寡脱氧胸苷酸以及M-MLV反转录酶进行反转录。用3μl cDNA样品在含有25mM 脱氧核苷三磷酸(dNTPs)以及40μM特异引物对的50μl总反应体积中进行聚 合酶链反应(PCR)。PCR的循环特征为：变性(94℃，30秒)，退火(51℃，30 秒)以及延伸(72℃，2分钟)进行30个循环，包括一个在94℃下2分钟的起始 变性步骤以及一个在72℃下10分钟的末端精加工步骤。基因特异引物可按需提 供。PCR后的样品用琼脂糖凝胶电泳进行分析。
蛋白印迹分析.6-孔培养皿中的细胞在冷的PBS中洗涤，并在样品缓冲液 (50mM Tris-Cl，pH6.8，2％SDS，10％甘油，0.1％溴酚蓝以及100mM DTT) 中裂解。全细胞裂解物在电泳前于100℃加热10分钟。用由积层凝胶以及10％分 离凝胶组成的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统分离复合的蛋白混合物。电泳是在1 ×电泳缓冲液(25mM Tris，pH8.6，0.19M甘氨酸，0.1％SDS)，小型垂直电泳 仪(BIO-RAD)于稳定电压(80V)的条件下进行的。将分离后的蛋白用电印迹 法(30V，4℃过夜)在转移缓冲液(50mM Tris，384M甘氨酸，20％甲醇， 0.01％SDS)中转移到硝化纤维素膜上(ImmobilonTM-P，Millipore)。封闭后(1 ×PBS，0.5％Tween20，4％[w/v]脱脂奶)，靶蛋白用1∶2500稀度的特异第一抗 体检测。利用与辣根过氧化物酶(Santa Cruz)缀合的抗小鼠或抗兔IgG抗体，使 用加强的化学发光(Pierce)显现1∶2500稀度的免疫反应性蛋白。
图注
图10：(A)通过DNA酶的基因表达的转录后抑制.DNA酶通过杂交臂上的 互补碱基对结合到靶mRNA上。这样就将DNA酶催化中心安置在接近mRNA翻 译起始的位点，以促进磷酸二酯键在起始密码子的A和U残基之间断裂。一旦断 裂，产生的mRNA片段不能翻译，因此不能合成多肽。DNA酶释放切割的产物 并继续切割其他mRNA底物。(B)靶向TRIP-Br转录物的DNA酶以一种促进磷 酸二酯键在“AUG”起始密码子的A和U残基之间断裂的方式，设计两个10- 核苷酸的、位于E-Br1或E-Br2 DNA酶的15-核苷酸催化结构域侧面的杂交臂， 以分别选择性结合到hTRIP-Br1或hTRIP-Br2 mRNA上。作为对照，拼接E-Br1 的每个臂的核苷酸序列而产生具有完整催化结构域且该催化结构域侧面是由随机 序列组成的杂交臂的DNA酶E-SCR。为了赋予对3’-至-5’外切核酸酶的抗性， 每个DNA酶的3’末端加上了一个反向的3’-3’-连接的胸腺嘧啶核苷帽子。
图11：(A)hTRIP-Br1和hTRIP-Br2表达是可血清诱导的.使分会合的WI- 38细胞缺乏血清72小时。血清再刺激后24小时，对总RNA进行半定量RT-PCR 分析，以估计hTRIP-Br1和hTRIP-Br2的表达。引入β-肌动蛋白作为内部对照。 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，且在UV下显示溴化乙锭染色的DNA条带。 (B)E-Br1和E-Br2分别下调hTRIP-Br1和hTRIP-Br2的表达.使分会合的WI-38 细胞缺乏血清72小时之后用0.1μM所示DNA酶转染。对总RNA进行半定量 RT-PCR分析以估计hTRIP-Br1和hTRIP-Br2的表达。引入β-肌动蛋白作为内部 对照。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，且在UV下显示溴化乙锭染色的DNA 条带。
图12：(A)E-Br1和E-Br2抑制细胞增殖.使分会合的WI-38细胞缺乏血清 72小时。DNA酶转染后，培养物用血清再刺激以使之增殖。72小时后，收获细 胞用于存活细胞计数分析。使获自每个样品的10μl细胞悬浮液与等体积的0.4％ 锥虫蓝染料混合。未染色的细胞数用血细胞计数器手工数出。数据代表了至少两 个独立试验的平均数。斯氏t检验表明与E-Br1和E-Br2处理相关的细胞数明显比 与E-SCR处理相关的细胞数低(P＜0.05)(在E-Br1对E-SCR处理的情形中 P＝3.25E-02，以及在E-Br2对E-SCR处理的情形中P＝1.44E-02)。(B)E-Br1和 E-Br2抑制菌落形成.使分会合的WI-38细胞缺乏血清72小时。DNA酶转染后， 培养物用血清再刺激以使之增殖。72小时后，细胞用结晶紫原位染色。
图13：(A)E-Br1或E-Br2抑制可血清诱导的S期进入.使分会合的WI-38 细胞缺乏血清72小时。DNA酶转染后，在BrdU标记的培养基中将培养物用血清 再刺激以使之增殖。20小时后，用ELISA比色测定分析细胞的BrdU整合。值代 表了至少两个独立试验的平均数。斯氏t检验表明与E-Br1和E-Br2处理相关的 BrdU整合明显比与E-SCR处理相关的BrdU整合低(P＜0.05)(在E-Br1对E-SCR 处理的情形中P＝1.29E-03，以及在E-Br2对E-SCR处理的情形中P＝8.47E-05)。 (B)E-Br1或E-Br2不影响E2F1/DP1-和/或细胞周期蛋白E/Cdk2-诱导的S期 进入.使分会合的WI-38细胞缺乏血清72小时。用DNA酶以及编码所示细胞周 期调节剂的表达质粒转染后，在BrdU标记的培养基中使培养物增殖。20小时后， 用ELISA比色测定分析细胞的BrdU整合。值代表了至少两个独立试验的平均数。
图14：(A)E-Br1或E-Br2消弱了促细胞分裂原激发的CCNE基因诱导.使 分会合的WI-38细胞缺乏血清72小时。DNA酶转染后，将培养物用血清再刺激 以使之增殖。20小时后，收获细胞并提取总RNA以进行半定量RT-PCR分析， 以估计CCNE的表达。引入β-肌动蛋白作为内部对照。PCR产物用琼脂糖凝胶 电泳分离，且在UV下显示溴化乙锭染色的DNA条带。(B)E-Br1或E-Br2阻止 促细胞分裂原诱导的细胞周期蛋白E的表达而不会改变Cdk4，细胞周期蛋白D1 和p27KIP1的表达.使分会合的WI-38细胞缺乏血清72小时。DNA酶转染后，使 培养物增殖。20小时后，收获细胞用于细胞周期蛋白E、Cdk4、细胞周期蛋白D1 和p27KIP1的表达的蛋白印迹(WB)分析。引入考马斯染色的蛋白作为标准化的 对照。
图15：(A)与TRIP-Br2+/+PMEFs相比TRIP-Br2-/-PMEFs表现出BrdU整合 明显减少.分会合的PMEFs培养物(TRIP-Br2+/+以及-/-)被培养于BrdU标记的 培养基中。20小时后，用ELISA比色测定分析细胞的BrdU整合。值代表了至少 两个独立试验的平均数。(B)与TRIP-Br2+/+PMEFs相比TRIP-Br2-/-PMEFs表现 出明显较低的血清诱导增殖率.使分会合的PMEFs缺乏血清72小时，然后用血清 再刺激。72小时后，收获细胞用于活细胞计数分析。将获自每个样品的10μl细 胞悬浮液与等体积的0.4％锥虫蓝染料混合。未染色的细胞数用血细胞计数器手工 数出。数据代表了至少两个独立试验的平均数。(C)TRIP-Br2失活导致CCNE基 因的下调.提取来自野生型(+)或TRIP-Br2无效(-)PMEFs的总RNA用于 半定量RT-PCR分析以估计CCNE的表达。引入β-肌动蛋白作为内部对照。PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分离，且在UV下显示溴化乙锭染色的DNA条带。
图16：流程图显示了通过TRIP-Br调节可血清-诱导的细胞周期过程。
结果
E-Br1或E-Br2 DNA酶特异“剔除(knock down)”血清诱导的hTRIP-Br1 或hTRIP-Br2基因表达.使用DNA酶剔除在WI-38人二倍体成纤维细胞中的内 源的人TRIP-Br1或TRIP-Br2mRNA转录物的表达。由DNA酶获得对基因表达的 转录后抑制或基因“剔除”的机理用图10A表示。设计两种DNA酶(E-Br1和 E-Br2)分别特异性靶向人TRIP-Br1或TRIP-Br2的信使RNA的翻译起始位点AUG (图10B)。
撤除血清后使WI-38成纤维细胞休眠72小时。在休眠期，休眠的成纤维细 胞表达的hTRIP-Br1和hTRIP-Br2转录物达不到可检测的水平。一旦血清诱导后， 被刺激的WI-38细胞中hTRIP-Br1和hTRIP-Br2mRNA的稳定状态水平都被显著 提升(图11A)，表明TRIP-Br基因的表达是血清-应答的。
为评价E-Br1或E-Br2对内源hTRIP-Br1或hTRIP-Br2mRNA的作用，生长- 休眠的WI-38成纤维细胞被预先暴露于DNA酶中24小时，然后用10％FBS刺激 其再次进入细胞周期。刺激后16小时，收获总RNA并进行半定量RT-PCR以测 量完整TRIP-Br转录物的水平。为了区分完整的和切割的转录物，采用与在DNA 酶切割位点侧面的靶序列碱基配对的基因特异性引物对进行RT-PCR，因此只有 完整转录物才被优先扩增。结果表明，0.1μM E-Br1或E-Br2分别地有效下调了 可血清诱导的稳定态的hTRIP-Br1或hTRIP-Br2mRNA水平，而E-SCR没有作用 (图11B)。这些发现表明E-Br DNA酶能够以序列特异的方式剔除hTRIP-Br基因 转录的血清诱导。
E-Br抑制血清诱导的WI-38细胞增殖.为了确定是否在血清诱导过程中抑 制TRIP-Br基因表达会影响血清刺激的细胞周期进程，将生长-休眠的WI-38细胞 用E-SCR、E-Br1或E-Br2转染，然后用含有10％FBS的培养基温育以刺激细胞 再次进入细胞周期。刺激后72小时，细胞数量用锥虫蓝排除手工细胞计数法估 计。浓度为0.1μM的E-Br1或E-Br2能够抑制50％-60％血清诱导的WI-38成 纤维细胞增殖潜能。相反，对比载体处理的细胞，同样浓度的E-SCR对WI-38生 长没有显著作用(图12A)。为了可视化地评估由DNA酶产生的抗增殖作用，将 WI-38细胞用含或不含DNA酶的血清诱导。72小时后，用结晶紫染色细胞。与 上述发现一致，E-Br1或E-Br2处理的培养物表现出菌落形成能力的显著降低(图 12B)。同样，用E-SCR处理的细胞表现出菌落形成能力类似于正常的以及载体处 理的对照。综上所述，这些结果表明TRIP-Br基因的表达的剔除导致了可血清诱 导的WI-38细胞增殖的减弱。
E-Br DNA酶阻止血清诱导的S期的进入.将血清饥饿的WI-38细胞在0.1μ M DNA酶存在的情况下用血清刺激，用BrdU整合测量其S期的进入。与未被刺 激的细胞相比，载体或E-SCR处理的培养物整合大约两倍多的BrdU(图13A)。 相反，用E-Br1或E-Br2处理的细胞与BrdU整合的能力明显被抑制。这些数据提 示TRIP-Br基因表达的剔除可充分阻断WI-38细胞中可血清诱导的S期的进入。
检测了与细胞周期蛋白E/Cdk2结合的E-BrDNA酶减弱E2F1/DP1能力以诱 导休眠的WI-38细胞中的S期的潜力。与公开的数据相一致(Lomazzi，M.，等人. Nat Gen 31，190-194(2002))，单独的E2F1/DP1或者细胞周期蛋白E/Cdk2的表达 并不能导致BrdU整合的增加(图13B)。相反，E2F1/DP1和细胞周期蛋白E/Cdk2 的共表达使得休眠细胞经过G1/S边界并被诱导进入S期。在浓度0.1μM时，所 有的三种DNA酶均不能阻止由E2F1/DP1和细胞周期蛋白E/Cdk2共表达诱导的S 期的进入。这些数据提示在可血清诱导的细胞周期信号传导途径中，TRIP-Br1和 TRIP-Br2靶向细胞周期蛋白E/Cdk2上游的一个或多个调节步骤。
E-Br DNA酶抑制血清刺激的CCNE基因诱导.我们研究了血清刺激后的 WI-38细胞中E-Br DNA酶对CCNE的诱导的作用。CCNE编码主要的G1/S过渡 调节剂，细胞周期蛋白E(Keyomarsi，K.和Herliczek，T.W.Prog Cell Cycle Res 3， 171-191(1997))。在休眠的WI-38成纤维细胞中，如我们用RT-PCR分析确定的(图 14A，泳道1)，CCNE基因是失活的。血清刺激16小时之后，已经可以易于检 测到CCNE的转录物(图14A，泳道2)，证明CCNE基因由向休眠的WI-38成 纤维细胞中添加血清来诱导。血清诱导的CCNE基因活化作用在E-Br1或E-Br2 (图14A，泳道4&5)而非E-SCR(图14A，泳道3)存在时被抑制，提示对血 清刺激响应的CCNE诱导对TRIP-Br1和TRIP-Br2两者都需要。与RT-PCR数据 相一致，我们的蛋白印迹分析表明剔除TRIP-Br1或TRIP-Br2有效地阻止了细胞 周期蛋白E的表达(图14B)。CCNE诱导和细胞周期蛋白E表达的抑制与在 Cdk4、细胞周期蛋白D1和p27KIP表达模式中的可观测的改变无关(图14B)。
TRIP-Br2-/-初级小鼠胚胎成纤维细胞(PMEFs)重现了E-Br2介导的剔除表型. 我们接下来破坏了小鼠的TRIP-Br2基因并产生了TRIP-Br2-/-PMEFs。在基因组 DNA水平(用PCR)以及mRNA水平(用半定量RT-PCR)上检验了TRIP-Br2 剔除(数据未显示)。为了确定是否TRIP-Br2-/-PMEFs已经取得了改变了的生长 特性，进行了BrdU整合比较和细胞计数分析。如通过BrdU整合确定的，与E- Br2剔除的数据相一致，与野生型对应物相比TRIP-Br2-/-PMEFs表现出明显较低 的增殖潜力(图15A)。当生长休眠的PMEFs用10％FBS刺激以再次进入细胞周 期时，与野生型细胞相比TRIP-Br2-/-PMEFs以明显较低的速率增殖(图15B)。 另外，发现在TRIP-Br2-/-PMEFs中CCNE基因被明显下调(图15C)。因此， TRIP-Br2-/-PMEFs可以重现E-Br2DNA酶诱导的剔除表型。这些数据强烈支持 了TRIP-Br2在细胞增殖中起重要作用的这一观点，而且进一步意味着这一难捉摸 的调节作用在小鼠和人中是保守的。
在我们的研究中发现，TRIP-Br基因在对血清刺激响应时被诱导(图11A)。 剔除WI-38成纤维细胞中的TRIP-Br1和TRIP-Br2有效抑制了血清诱导的细胞增 殖，提示TRIP-Br蛋白在生理上参与血清诱导细胞周期的进程。我们的数据揭示 了E-Br1和E-Br2两者均抑制可血清诱导的CCNE基因诱导和细胞周期蛋白E的 表达。假设细胞周期蛋白E相关的激酶活性是经过限制点以及在细胞周期进程中 执行S期进入所必不可少的(Keyomarsi，K.和Herliczek，T.W.Prog Cell Cycle Res 3， 171-191(1997))，那么我们提示E-Br1和E-Br2可以通过以施加增殖阻断的方式消 除细胞周期蛋白E/Cdk2的细胞周期调节活性来破坏促细胞分裂原驱动的细胞周 期进程。
这一系列包含DNA酶的研究已经表明在进行可血清诱导的细胞增殖中生理 上涉及到TRIP-Br1和TRIP-Br2两者。
实施例3：
抗人TRIP-Br1的单克隆抗体的产生
肽的选择.对于可能的肽的选择，我们使用了Alpha Diagnostic International，Inc.(ADI)在他们的站点http：//www.4adi.com上提供的免费服务。基于抗 原性、亲水性和可接近性，选择了10-25个氨基酸残基长度的肽。将已确定的肽 进行BLAST搜索以证实其特异性。此外，利用ClustalW，ADI对这些分析中的肽 进行蛋白二级结构分析(PSSA)和多序列比对。hTRIP-Br1的抗原性、亲水性和 可接近性的分析分别显示于图17、18和19。从所有3个图表中选择具有高的值 的序列。确定了两个肽：TB1-27和TB1-98。对它们的详细描述如下。TB1-27： 从残基27到42的16个残基。该序列从N末端开始是 DPGHTAAVAQAPPAVAS[SEQ ID NO.：10]。TB1-98：从残基98到112的15个残基。 该序列从N-末端开始是SVADNLLASSDAALS[SEQ ID NO.：11]。
BLAST搜索显示对人TRIP-Br1的特异性和对鼠同系物的不完全特异性。通 过PSSA没有确定有意义的蛋白二级结构。多序列比对的结果显示在图20中。其 中人TRIP-Br2、小鼠TRIP-Br2、人TRIP-Br1和小鼠TRIP-Br1全长序列分别如SEQ ID NOS.12-15所示。两个肽都明显不同于人TRIP-Br2，即TRIP-Br家族蛋白的另 一个成员。然而，它们却与小鼠TRIP-Br1高度同源。TB1-27有4个残基不同于 相应的mTRIP-Br1区域，而TB1-98有2个残基不同于相应的mTRIP-Br1。这可 能是在小鼠体内缺乏抗体诱导的原因。
由Research Biolabs，新加坡获得匙孔血蓝蛋白(KLH)-缀合的TB1-27和 TB1-98。被提供时的浓度是在磷酸缓冲盐水中1mg/ml。TB1-27的质谱分光光度法 谱显示于图21中。
免疫.用每种肽免疫两只BALB/c雌性小鼠。根据ImmunEasyTM Mouse Adjuvant Handbook(Qiagen)中的方案制备免疫原。每只小鼠被施用的肽引发 (priming)剂量为10μg。随后，每2星期施用5μg肽加强剂量。总共进行5次注 射。
杂交瘤克隆.在最后一次加强后三天杀死小鼠。在无菌条件下分离出脾 脏，并与鼠骨髓瘤细胞系X63Ag融合。使用的是ClonaCell-HY Hybridoma Cloning 试剂盒(StemCell Technologies)。严格按照提供的规程进行。但是，用相同肽免疫 的小鼠脾细胞结合用在每个克隆过程中。
在最后的加强之前，用TB1-98注射的两只小鼠中的一只死亡。另一只看起 来是有病的并且从该动物中分离出来的脾细胞不与X93Ag融合，因此未能获得具 有TB1-98的杂交瘤克隆。
杂交瘤克隆分析.用ELISA分析用TB1-27所获得的420个杂交瘤克隆。在 分别覆有TB1-27以及不相关的KLH-缀合肽Cyr61的孔中，通过在余下的培养基 中过夜温育来测试特异性。147个克隆(35％)测试为阳性(也就是与TB1-27涂 覆的孔结合)，其中39(9.3％)是特异性的(不与Cyr61涂覆的孔结合)。
进一步用蛋白印迹法分析39个克隆的特异性。利用Polyfect(Qiagen)，用具有 FLAG-标记的人TRIP-Br1或TRIP-Br2插入片段的pcDNA3载体转染U2OS细胞。 细胞裂解物用10％聚丙烯酰胺凝胶分离之后印迹至Immobilon-P膜(Millipore)上。 余下的培养基用印迹缓冲液1∶1稀释，然后与印迹一起温育过夜。只有6个克隆 表现出对FLAG-TRIP-Br1条带有一些特异性(结果未显示)。其余的没有结合到 条带上或具有高度的非特异性。
然而，进一步克隆扩增后，只有编号2(TB1-27#2)的克隆存活。这可能归 因于Hybridoma Kit的性质，其可以使脾细胞在所供给的培养基中有限增殖一段时 间。
单克隆抗体的制备.TB1-27#2在由ClonaCell-HY Hybridoma Cloning试剂盒 所提供的培养基A中扩增。从汇合培养基中旋转沉淀细胞并将其转移至由 GlutaMaxTMI(Gibco，Invitrogen)提供的CD杂交瘤培养基中。在加入OptiMAb (Gibco，Invitrogen)之前，监控培养物直至得到最大细胞密度。培养基的pH用 氢氧化钠调到pH6.8-7.2的范围。9天后，离心去除细胞并收获余下的培养基。
TB1-27#2的表征：为了进行同型确定，使用了ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Pierce)。结果表明TB1-27#2属于具有kappa轻链的IgG2a亚 类。
收获用pcDNA3、具有TRIP-Br1或TRIP-Br2插入片段的pcDNA3载体转染 的U2OS细胞以进行蛋白印迹分析。细胞裂解物用10％聚丙烯酰胺凝胶分离并印 迹至转移膜上。切割印迹并用小鼠单克隆抗FLAG抗体或TB1-27#2探测。对于其 中2个切片，除了TB1-27#2外，还加入TB1-27以及Cyr61肽作为竞争源。结果 表明TB1-27能够阻断单克隆抗体TB1-27#2间的结合，相反，不相关的Cyr61肽 则不能阻止TB1-27#2间的结合(图22；每一组中，从左数第一泳道含有用pcDNA3 载体转染的U2OS细胞的细胞裂解物；第二泳道，U2OS细胞用pcDNA3/FLAG- TRIP-Br1转染以及第三泳道，U2OS细胞用pcDNA3/FLAG-TRIP-Br2转染；标记 物大小为210kD，125kD，101kD，56kD以及36kD；CDK2条带被用作加样对 照)。
在免疫沉淀测定中，50微升A蛋白琼脂糖(Amersham)与2ml TB1-27#2余下 的培养基温育过夜。洗涤每等分试样的琼脂糖并加入到各种转染的U2OS细胞的 裂解物中。TB1-27以及Cyr61肽被分别加到其中的两个反应中，但是其中一个反 应是用小鼠单克隆抗His抗体而不是用TB1-27#2进行探测。收获琼脂糖并在第二 天洗涤，并用SDS-PAGE分析结合蛋白。印迹凝胶并用抗FLAG抗体检测。结果 如图23所示(左板含有1/10输入的预先澄清的U2OS细胞裂解物，而右板含有 从A蛋白琼脂糖洗脱下的蛋白)。如所示，TB1-27#2能够免疫沉淀FLAG-TRIP- Br1蛋白。该结合也是特异的；由缺乏FLAG-TRIP-Br1带可以证明TB1-27肽消除 了结合，然而Cyr61肽却没有此作用。因为已知TRIP-Br1直接与DP-1相互作用， 所以抗-DP-1被用作免疫沉淀的正对照。
实施例4：鸡胚尿囊绒膜(CAM)模型中诱饵肽的抗肿瘤作用
材料和方法
细胞系.人鼻咽癌细胞系CNE2以及人黑素瘤细胞系Mewo被用作接种肿 瘤。
鸡胚CAM的制备.为了将细胞置于10天大的鸡胚的CAM上，用装有 0.3mm厚×22mm直径的金刚砂(Carborundum)盘的电钻在蛋壳的扁平端开一个 2cm直径大小的窗口。用镊子去除窗口的外壳。内壳膜用精细的无菌镊子小心地 刺破并将其去除以暴露出其下的CAM。随后在CAM的表面放上一条镜头纸(1cm 宽)再迅速将其移开以轻轻地损坏一小部分CAM。
接种、封闭及孵化.接种物(在50μl空白培养基中，对于CNE2细胞系1 ×106细胞/蛋以及对于Mewo细胞系3×106细胞/蛋)被施用在受损CAM的那一 小片上。接种后，窗口用35mm组织培养皿覆盖并用透明胶带密封。将垂直放置 的胚送回孵化器中并使之额外孵化7天，并每天进行监控。
肽处理及生长抑制作用的评估.肿瘤接种后两天开始处理。
鸡蛋被随机分成4个处理组，每组包括至少4个生物学复制品。1组：载体 对照(200μl无菌PBS)；2组：模拟处理对照(50μM*SCR)；3组：*Br1(50 μM)；4组：*Br2(50μM)。
每日一次在CAMs上的肿瘤异种移植物上局部进行各种处理。五天后，通过 降温以终止胚胎并在10％福尔马林中固定。取出被固定的CAM并对肿瘤异种移 植物拍照，随后从膜上将之切下并称重。试验重复进行一次。
结果
局部施用*Br1或*Br2，而非*SCR，明显在7天时间段内抑制CNE2肿瘤的 生长(p＜0.05，ANOVA，LSD，SPSS12)(图24)。
正如本领域技术人员可以理解的，此处描述的作为例证的实施方案可以有很 多修改。本发明更倾向于将所有这些修改包括到如权利要求书所限定的范围中 来。
与相关申请的交叉引用
本申请要求享有2004年3月31日申请的，美国临时专利申请号60/557697 的利益和优先权，该申请在此全文引入作为参考。
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<150>US 60/557,697
<151>2004-03-31
<160>16
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>18
<212>PRT
<213>人
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Ala Thr Gly Cys Leu Leu Asp Asp Gly Leu Glu Gly Leu Phe Glu Asp
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Ile Asp
<210>2
<211>18
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>来自人TRIP-Br2的PHD/溴结构域相互作用区域
<400>2
Thr Gly Phe Leu Thr Asp Leu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Phe Ala Asp
1 5 10 15
Ile Asp
<210>3
<211>17
<212>PRT
<213>黑腹果蝇
<220>
<221>misc_feature
<223>来自黑腹果蝇的触角是同源域蛋白的细胞膜穿透肽序列
<400>3
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Lys
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<220>
<223>含有来自果蝇的细胞膜穿透肽序列和来自人TRIP-Br1的PHD/
溴结构域相互作用区域的肽
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<223>含有来自果蝇的细胞膜穿透肽序列和来自人TRIP-Br2的PHD/
溴结构域相互作用区域的肽
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Lys Thr Gly Phe Leu Thr Asp Leu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Phe Ala
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<223>直接针对人TRIP-Br2转录物的DNA酶
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<223>含有来自果蝇的细胞膜穿透肽和随机肽序列的肽
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<223>直接针对随机转录物序列的DNA酶
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<223>来自人TRIP-Br1的免疫原性肽
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Ser
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<223>来自人TRIP-Br2的免疫原性肽
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<220>
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<223>TRIP-Br2
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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<223>TRIP-Br1
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<212>PRT
<213>人工的
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<223>TRIP-Br的PHD-溴结构域结合区域的共有序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>4、6、8、9位的X是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>1位的X是s、T、A或没有氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>11位的X是D或E
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>13位的X是I、L、V、A或没有氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>12、16位的X是D、E、A或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
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<222>(6)..(6)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
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<221>misc_feature
<222>(8)..(9)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
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<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
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<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
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Xaa Thr Gly Xaa Leu Xaa Asp Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Phe Xaa
1 5 10 15
Asp Ile Asp
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