一种黑腹果蝇肿瘤模型及其应用
专利汇可以提供一种黑腹果蝇肿瘤模型及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 黑腹果蝇 肿瘤 模型在研究环境污染物单世代及多世代致癌毒性方面的应用，利用黑腹果蝇肿瘤模型对确认致癌物或有潜在致癌效应的环境污染物质进行单世代或持续多世代暴露，从而检测该污染物对 生物 体的致癌效应变化的方法。本发明确定了环境污染物应用于果蝇模型以评价致癌效应的可行性，在暴露剂量上更接近实际环境浓度，并且比较单世代暴露与多世代暴露的世代间致癌效应差异，获得该污染物对果蝇致癌毒性的强弱、毒性传递能 力 等效应。本发明弥补了现有对致癌毒性评价方法的单一性和伦理学限制，拓展了对污染物传统毒性评价的指标，具有可操作性，对模拟污染物低浓度、长期暴露于生物体的毒性评价进行了创新和补充。，下面是一种黑腹果蝇肿瘤模型及其应用专利的具体信息内容。
1.一种黑腹果蝇肿瘤模型在研究环境污染物单世代及多世代致癌毒性方面的应用，其特征在于具体步骤如下：
(1)黑腹果蝇肿瘤模型品系单世代在含有污染物的培养基体系内暴露后杂交，观察其杂交后代幼虫在污染物作用下肿瘤迁移率的变化，指示和评价污染物单世代暴露的生物致癌毒性效应；
(2)连续暴露条件下，将果蝇肿瘤模型亲本品系各自在含有污染物的培养基体系内暴露，将其子代也同样连续暴露在相同的暴露体系下；多世代连续暴露后的黑腹果蝇肿瘤模型在污染物环境中杂交，进行同步骤(1)的观察操作，指示和评价污染物多世代暴露的生物致癌毒性效应；
(3)固定黑腹果蝇肿瘤模型中一种品系的雌蝇进行单世代和多世代暴露于含有污染物的培养基体系中，另一品系的雄蝇在无污染物培养基中完成单世代及多世代的培养；将同一代的两品系果蝇在无污染物培养基内杂交，对杂交后代进行同步骤(1)的观察；
而后交换两品系的培养环境，即交换含有污染物的培养基与无污染物培养基，进行同样的后续操作；通过比较不同性别生物暴露于污染物后得到的致癌指标变化，指示和评价污染物对不同性别生物的单世代和多世代致癌毒性效应；
所述黑腹果蝇肿瘤模型包含两类品系，分别为：yw，ey-Flp；tub-Gal80，FRT40A；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP(185)和w；lgl4FRT40A UAS-Rasv12/Cyo；Sb/TM6B Tb(186)，分别将其编号为185和186；
将185与186分别培养于含有污染物的培养基体系内以及无污染物培育基内；第一代投入含有污染物的培养基体系中或者无污染物培育基内暴露的185和186各自的亲本果蝇记为F0代。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤所述185和186均来自Bloomington Drosophila Stock Centre USA实验室。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述含有污染物的培养基体系是指污染物梯度浓度组，其配制方法为：
首先配制无污染物培养基，其包含红糖、玉米粉、酵母、琼脂和丙酸；然后在无污染物培养基配制完成但尚未凝固前，在每100g无污染物培养基中加入2mL暴露液，分装至10个玻璃管；而后冷却凝固于灭菌后的玻璃管内，加塞备用；
在观察时需同时观察空白对照组的培育情况，所述空白对照组的配制方法为：在无污染物培养基配制完成但尚未凝固前，在每100g无污染物培养基中加入2mL加入纯水或污染物稀释液。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(1)的操作方法为：
用CO2气体使果蝇被麻醉，而后转移至持续通CO2的果蝇麻醉盒上；分别挑选185的F0代处女蝇和186的F0代雄蝇各五只为一组，将其转移至同一个含有污染物的培养基中，在其表面洒少许活酵母，放置于25℃恒温，60％恒湿的培养箱内，每隔24h转管一次，使两品系果蝇在24h内进行杂交，保证每个污染物浓度有10个以上平行组，F0代185和F0代186成虫杂交后产下的后代幼虫记为T0代，其中携带肿瘤的个体仅能生长至幼虫，无法进一步发育；
在25℃下培养3-4天，待T0代长至三龄幼虫后，用镊子挑取污染物暴露后的或对照组的三龄幼虫放置于添加了PBS的解剖墨盘上，剥离幼虫眼部、脑部和脑腹神经索VNC；若形成了肿瘤组织，则组织分化不明显，将整团肿瘤组织单独剥离即可；
在荧光显微镜GFP下，观察肿瘤组织发生绿色荧光的位置与强度，进行实时拍摄；在荧光显微镜下进一步将VNC与其他组织分离，单独拍摄；肿瘤迁移率作为致癌毒性的评价指标，以VNC组织中出现绿色荧光标记为迁移标志，统计发生迁移的个数，迁移率计算公式为：
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(2)的具体操作方法为：
将培养于含有污染物的培养基体系内的F0代185和F0代186分别转入含同浓度污染物的培养基中，待产下的后代发育为成虫后，为第二代185或186成虫，记为F1；
将185或186品系的F1代成虫继续分品系放入含同浓度污染物的培养基内，同上述的培养方式，得到其子代，即第三代，记为F2；以此类推，得到185或186的F3、F4......Fn成虫，以此完成果蝇肿瘤模型亲本品系的多世代连续污染物暴露；
选取185品系的F1代处女蝇与186品系的F1代雄蝇各五只为一组在含同浓度污染物的培养基中，按照权利要求1的方法进行暴露并杂交，其产生的子代幼虫记为T1F2、F3、F4......Fn多世代185雌蝇及其同代186雄蝇交配产生的后代幼虫依次记为T2、T3、T4......Tn；T1-Tn代幼虫重复步骤(1)的方法解剖、观察、拍摄和统计，即完成了污染物连续暴露的多世代致癌毒性效应检测。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(3)的具体操作方法为：
挑取经污染物暴露的F0代185品系处女蝇和未经污染物暴露的F0代186品系雄蝇各五只，将其培养于无污染物的培养体系中进行杂交，杂交操作与条件同步骤(1)所述，收取后代T0幼虫进行肿瘤迁移率的观察统计；
而后挑选连续暴露于污染物体系中的F1-Fn代185品系处女蝇和相同代际的未经暴露的186品系雄蝇分别杂交于无污染物体系中，完成雌性个体连续暴露于污染物、但雄性个体始终未经暴露的单世代与多世代杂交；对每一代的杂交后代幼虫进行同步骤(1)的指标检测；
挑取未经污染物暴露的F0代185品系处女蝇和经污染物暴露的F0代186品系雄蝇各五只，将其培养于无污染物的培养体系中进行杂交，杂交操作与条件同步骤(1)所述，收取后代T0幼虫进行肿瘤迁移率的观察统计；
而后挑选始终未暴露于污染物体系中的F1-Fn代185品系处女蝇和相同代际的连续暴露的186品系雄蝇分别杂交于无污染物体系中，完成雄性个体连续暴露于污染物、但雌性个体始终未经暴露的单世代与多世代杂交；对每一代的杂交后代幼虫进行同步骤(1)的指标检测。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
按照步骤(1)的操作步骤中获得的果蝇T0代各污染物浓度与空白对照组之间肿瘤迁移率的指标显著性差异，得到污染物对生物单世代致癌毒性的效应；
根据步骤(2)的操作获得的果蝇T0-Tn代之间同一污染物浓度暴露下肿瘤迁移率的差异，得到污染物对生物多世代致癌毒性效应评价；
根据步骤(3)不同性别果蝇单独暴露和步骤(1)与(2)所有性别一同暴露的指标差异结果，分别得到性别在污染物对生物产生单世代和多世代致癌效应上的影响；
将污染物的致癌毒性分为：不具有明确的致癌毒性、有可修复的致癌毒性、有延迟性的致癌毒性和有不可修复的致癌毒性；
按性别分为污染物仅通过雌性个体即可产生致癌毒性、污染物仅通过雄性个体即产生致癌毒性、污染物需通过两种性别个体才可产生致癌毒性及污染物产生致癌毒性与性别无关。
一种黑腹果蝇肿瘤模型及其应用
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