snoRNA、组合物以及应用
阅读：37发布：2020-06-25
专利汇可以提供snoRNA、组合物以及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及特定的RNA序列作为药物的应用。本发明特别涉及本 发明人 已经表明参与老化机制的核仁小RNA(snoRNA)的应用。本发明的snoRNA尤其可用于增加患者的抗应激性，控制老化的有害效应，通常用于 预防 或 治疗 退行性 疾病 、核纤层蛋白病、糖尿病、 肥胖症 或癌症，以及通常用于延长患者的寿命。本发明的snoRNA还可以用于生育 力 治疗。本发明还涉及能够表达本发明的snoRNA的载体、细胞、遗传修饰的动物、和组合物，以及利用本发明的前述产物之一作为工具来鉴定在预防或治疗与老化机制有关的疾病、异常或失调中有活性的分子的方法。，下面是snoRNA、组合物以及应用专利的具体信息内容。
1.分离或合成的RNA序列，其包含序列SEQ ID NO:1、直系同源序列或功能类似的序列，所述RNA序列用作药物。
2.权利要求1所述的RNA序列，其特征在于所述直系同源序列是人类来源的并包括序列SEQ ID NO:2或者是小鼠来源的并包括选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列。
3.权利要求1或2所述的RNA序列，其特征在于所述序列是核仁小RNA(snoRNA)。
4.权利要求1所述的RNA序列，其特征在于所述功能类似的序列容许剪接选自Ir56d、buttonhead、klarsicht、CG3262、CG30502(fa2h)、CG11125、CG9339和CG40006的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)基因。
5.权利要求1至4任一项所述的RNA序列，其用于延长受试者的寿命、增加抗应激性、或对抗受试者中老化的有害效应。
6.权利要求1至5任一项所述的RNA序列，其用于在受试者中预防或治疗退行性疾病、特别是神经退行性疾病、核纤层蛋白病、糖尿病、肥胖症或癌症。
7.权利要求6所述的RNA序列，其特征在于所述癌症是由自由基引起的癌症。
8.权利要求1至3任一项所述的RNA序列，其用于在受试者中治疗不育症或刺激生育力。
9.权利要求5至8任一项所述的RNA序列，其特征在于所述受试者是动物或昆虫，典型地是哺乳动物，优选人类，甚至更加优选是不表达权利要求1至3任一项所述的RNA序列或表达所述RNA序列的异常版本的受试者，经历应激状态例如禁食、热冲击或氧化应激的受试者，和/或患有退行性疾病、核纤层蛋白病、糖尿病、肥胖症、癌症或生育力问题的受试者。
10.权利要求9所述的RNA序列，其特征在于不表达权利要求1至3任一项所述的RNA或表达所述RNA序列的异常版本的受试者的基因组含有包含突变的DNA序列，所述序列是选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的野生状态；并且所述突变优选选自一个或多个碱基对的缺失、取代或添加。
11.编码权利要求1至10任一项所述的RNA序列的DNA序列。
12.允许表达权利要求1至4任一项所述的RNA序列的载体，所述载体选自例如质粒、粘粒、病毒载体和噬菌体，优选包含促进所述RNA序列在肠细胞或卵巢细胞中表达的启动子和/或调控子元件。
13.包含权利要求1至4任一项所述的RNA序列或利用权利要求12所述的载体转化的细胞。
14.组合物，其包含权利要求1至4任一项所述的RNA序列、权利要求12所述的载体或权利要求13所述的细胞和饮食可接受或药物可接受的承载体。
15.权利要求1至10任一项所述的RNA序列、权利要求12所述的载体、权利要求13所述的细胞或权利要求14所述的组合物的连续或顺序应用，以恢复或调节所述RNA序列的体外或离体表达。
16.转基因小鼠，在所述转基因小鼠的基因组中，序列SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4已被修饰以预防或修改序列SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的表达。
17.评价被测化合物的美容功效的方法，所述方法包括i)将不表达权利要求1至3任一项所述的RNA序列或表达所述RNA序列的异常版本的细胞或细胞群、或权利要求16所述的转基因小鼠暴露于被测化合物，ii)如果有的话，评价所述被测化合物对所述细胞或所述转基因小鼠的表型的效应，和iii)确定所述被测化合物的美容功效，所述RNA序列的活性和/或表达的恢复与所述被测化合物的功效相关。
18.评价被测化合物对抗老化或应激的有害效应、核纤层蛋白病、糖尿病、肥胖症或对抗不育症的治疗功效的方法，所述方法包括i)将不表达权利要求1至3任一项所述的RNA序列或表达所述RNA序列的异常版本的细胞或细胞群暴露于被测化合物；ii)如果有的话，评价所述被测化合物对所述细胞的表型的效应，和iii)确定所述被测化合物的治疗功效，所述RNA序列的活性和/或表达的恢复与所述被测化合物的功效相关。
19.评价被测化合物的美容功效的方法，所述方法包括i)将权利要求13所述的包含权利要求1至3任一项所述的RNA序列的细胞或包含权利要求13所述的细胞的细胞群暴露于被测化合物，ii)如果有的话，评价所述被测化合物对所述细胞或所述细胞群的表型的效应，和iii)确定所述被测化合物的美容功效，所述RNA序列的活性和/或表达的增加与所述被测化合物的功效相关。
20.评价被测化合物对抗老化或应激的有害效应、核纤层蛋白病、糖尿病、肥胖症或对抗不育症的美容功效的方法，所述方法包括i)将权利要求13所述的包含权利要求1至3任一项所述的RNA序列的细胞或包含权利要求13所述的细胞的细胞群暴露于被测化合物；ii)如果有的话，评价所述被测化合物对所述细胞或所述细胞群的表型的效应，和iii)确定所述被测化合物的治疗功效，所述RNA序列的活性和/或表达的增加与所述被测化合物的功效相关。
21.权利要求17至20任一项所述的方法，其中暴露的细胞或细胞群是肠或卵巢来源的。
snoRNA、组合物以及应用
发明领域
[0001] 本发明涉及特定RNA序列作为药物的应用。更确切地说，它涉及发明人已经说明参与老化机制的核仁小RNA(snoRNA)的应用。本发明的snoRNA尤其可用于增加受试者的应激抗性，对抗老化的有害效应，通常用于预防或治疗退行性疾病尤其是神经退行性疾病、核纤层蛋白病尤其是郝-吉二氏综合征(Hutchinson–Gilford，HGPS)(亦称早老症)、糖尿病、肥胖症或癌症，以及更通常地，延长受试者的寿命。本发明的snoRNA还可以用于治疗不育症。
[0002] 本发明还涉及能够表达本发明的snoRNA的载体、细胞、转基因动物和组合物，以及利用任何上述本发明产物作为鉴定在预防或治疗与老化机制有关的病理、异常、失调或者表观或功能退化中有活性的分子的工具的方法。
背景技术
[0003] 老化机制(即，生存和复制能力随着年龄逐渐减退)已经困扰了社会和科学界几个世纪之久。有两种当前流行的理论，一种是老化由遗传预编程的进化途径引起，另一种是老化是生存期间细胞和分子损伤积累的生存的正常后果。这种损伤将包括由自由基、线粒体缺陷、体细胞突变、端粒的逐渐缩短、细胞程序性死亡和损伤细胞的增殖等引起的氧化性损伤(Semsei I.(2000)关于老化的性质(On the nature of aging.).Mech Aging Dev 117:93–108)。
[0004] 已经显示，在生物体如酵母和小鼠中，减少热量对延长寿命发挥着决定性的正面影响(Sohal，R S，Weindruch，R(1998)氧化应激，热量限制，和老化(Oxidative stress，caloric restriction，and aging).Science273:59–63；Finch，C E，Revkun，G.(2001)老化遗传学(The genetics of aging).Annu.Rev.Genom.Hum.Genet.2:435–462)。最近的研究已经显示，热量限制在灵长类动物、包括人类中也将是有效的(Roth，G S，Lasnikov，V，Lesnikov，M，Ingram，D K，Land，M A(2001)饮食热量限制防止了猕猴的血浆褪黑素水平的年龄相关的减退(Dietary caloric restriction prevents the age–related decline in plasma melatonin levels of rhesus monkeys).J Clin Endocrinol Metab.86：3292–5；Roth G S，Lane M A，Ingramn D K，Mattison J A，Elahi D，Tobin J D，Muller D，Metter E J(2002)热量限制的生物标志物可以预测人类寿命(Biomarkers of caloric restriction may predict longevity in humans).Science.297：811–813；Walford R L，Mock D，Verdery R，MacCallum T.(2002)生物圈中热量限制2：在受到2年期限制的人类中生理、血液、激素和生化参数的改变(Calorie restriction in biosphere 2：alterations in physiologic，hematologic，hormonal，and biochemical parameters in humane restricted for a 2–year period).J Gerontol A Biol Sci Med Sci 57：211–24)。不幸的是，也许大部分人类不能够遵循从这种发现中受益所要求的严格饮食。
[0005] 若干年来，很多科研团队已经致力于鉴定参与老化过程的基因和信号传导途径。在此报告的研究在许多生物体包括酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、蠕虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和蝇黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(Fontana等，2010)中进行，并使得鉴定了日益增长的基因名单。它们中的许多参与激素信号传导并在多种多样的真核生物中是保守的。已经很清楚，至少对于低级物种而言，在生命开始时负责发育和生长的途径保持终身的影响并且甚至部分决定着生命的期限。这些研究还间接显示了代谢能力和应激抗性对于评价受试者寿命的重要性。
[0006] 例如，秀丽隐杆线虫的clk–1基因的突变体参与减少活性氧物质的线粒体外产生(Hekimi，S，Guarente，L.(2003)老化过程的遗传学和特殊性(Genetics and the specificity of the aging process).Science 299:1351–1354)。专利WO 98/17823描述了clk–1基因在发育和寿期过程中的功能。它具体要求了通过调控clk–1基因表达来增加个体寿命的方法。
[0007] 还已经描述了玛士撒拉(Methuselah)基因(其编码G–蛋白偶联受体)的突变能够将果蝇的寿命增加大约35％(US 6,303,768)。
[0008] 端粒缩短也已知是造成细胞老化的机制。在脊椎动物中，端粒酶是核糖核蛋白(RNP)逆转录酶，其作用是通过向正在分裂的真核细胞中的染色体末端添加端粒DNA来保持端粒的长度(Kiss，2002)。在人类中，端粒酶snoRNA的H/ACA框中的突变引起多效遗传疾病，先天性角化不良，其患者存在较短的端粒(Mitchell等，1999；Vulliamy等，2001)。尽管科学界的努力破解了老化的机制并鉴定了新的治疗靶来延迟这种过程和/或抗争它的有害效应，但可利用的工具仍然不足。由于医学进步与生活条件的全面改善相结合已经在仅仅数十年间就让人口以非常显著的方式增加了预期寿命，所以愈发感到需要容许没有通常与老年有关的疾病和不适的“幸福老年”的工具。
发明内容
[0009] 本发明涉及发明人已经证明了特别参与老化机制的目标RNA序列的预防性或治疗性应用。他们特别说明了这些序列通过停止老化机制并对抗与之相关的有害效应而引人瞩目地增加了受试者的寿命的能力。本发明的序列还对抗与老化有关的疾病例如退行性疾病、核纤层蛋白病和癌症、以及糖尿病和肥胖症。他们已经证实了在不孕症或不育症治疗(即，受孕困难或不能受孕)以及增加受试者、尤其是已经达到性成熟的受试者、优选年长受试者对应激的抗性上特别有效。
[0010] 本发明的第一个目的涉及一种分离或合成的RNA序列，其包含序列SEQ ID NO:1、同源序列，优选直系同源序列、或功能类似的序列，所述RNA序列用作药物。
[0011] 本发明人已经证明了在果蝇中发现的RNA序列SEQ ID NO:1与哺乳动物例如灵长类动物和人类以及啮齿动物例如小鼠和大鼠中的直系同源序列对应。本发明还涵盖了在本文本中描述的一种或另一种应用中使用优选选自人类来源的序列SEQ ID NO:2以及小鼠来源的序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的分离或合成RNA序列。在本文本的表1中鉴定的序列SEQ ID NO:2、3、4、9、11、13、15、17、19、21、22、24、26和28是与SEQ ID NO:1直系同源的序列的实例。
[0012] 本发明的另一个目的是编码本发明的目标RNA序列的DNA序列。
[0013] 本发明还涉及容许体外、离体或体内表达本发明的RNA序列的载体。
[0014] 本发明还涉及包含本发明的RNA序列或通过本发明的载体转化的细胞，以及包含本发明的产物和饮食可接受或药物可接受的承载体的组合物。
[0015] 本发明还涉及连续地或顺序地使用本发明的RNA序列、载体、细胞或组合物来恢复或调节所述RNA序列的体内、体外或离体表达。
[0017] 本发明还涵盖了评价被测化合物对抗老化或应激的有害效应、或对抗不育症的美容或治疗功效的方法，所述方法包括i)暴露不表达本发明的RNA序列或表达所述RNA序列的异常版本的细胞或细胞种群；或本发明的转基因小鼠，ii)如果有的话，评价所述被测化合物对所述细胞或所述转基因小鼠的表型的效应，和iii)确定所述被测化合物的美容或治疗功效，所述RNA序列的活性和/或表达的恢复与所述被测化合物的功效相关。
[0018] 本发明还涵盖了评价被测化合物对抗老化或应激的有害效应、或对抗不育症的美容或治疗功效的方法，所述方法包括i)暴露包含本发明的RNA序列的本发明细胞或包含本发明细胞的细胞种群；ii)如果有的话，评价所述被测化合物对所述细胞或细胞种群的表型的效应，和iii)确定所述被测化合物的美容或治疗功效，所述RNA序列的活性和/或表达的增加与所述被测化合物的功效相关。
具体实施方式
[0020] 本发明起于本发明人证明了核仁DNA的小序列(snoRNA：Ψ28S–1153，称为“youth”，在本文本中标识为SEQ ID NO:1)对果蝇寿命的影响。这种snoRNA已被鉴定为系统性筛查与果蝇基因组有关的snoRNA的部分(Huang等，2005)，迄今没有任何功能归于它。
[0021] 本发明人已经表征了这个序列并且特别说明了含有snoRNA:Ψ28S–1153的果蝇基因组的F4区的632个碱基对的基因组缺失将果蝇的寿命缩短了大约30％。他们然后证明了这种RNA序列的过表达，例如利用含有编码这种snoRNA的基因组DNA的转基因，将果蝇的寿命引人瞩目地增加了大约100％。过表达本发明的RNA序列的蝇活到高达两倍之久。此外，本发明人已经鉴定和检测了直系同源的“youth”序列在小鼠和人类中的表达。
[0022] 本发明的RNA序列和其他产物的特性
[0023] 如前面所说明，本发明涉及具有最初在果蝇(黑腹果蝇)中鉴定的序列SEQ ID NO:1的功能特性的分离或合成核苷酸序列(RNA序列)在可受益于它的受试者、典型地是动物或昆虫、例如哺乳动物或啮齿动物、优选人类中用作药物。
[0024] “药物”是指拥有预防或洽愈性质的物质。在本发明的环境中，药物意图在如前面定义的受试者中治愈、促进治愈、减轻或预防与异常的或仅仅不想要的老化过程相关的病理、异常或损害。
[0025] 在果蝇中，目标RNA序列包含在被标识为F4区、本身位于2R染色体上的基因组区中。对于发明人研究的第一个果蝇物种(黑腹果蝇)来说，该核苷酸序列由148个碱基对构成。它在本文本中被标识为SEQ ID NO:1。
[0026] 序列SEQ ID NO:1的同源物/直系同源物以及功能类似物和变体同样是身为本发明目的的目标序列。
[0027] 术语“同源物”在本发明的环境中用于指示其核苷酸序列与在这第一个果蝇物种中鉴定的序列SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或足够接近的结构，从而在另一个物种(果蝇，昆虫，或任何其他动物)中被认为是它的等同物。如果通过例如blastN序列对比程序(Altschul等，1990)、或通过用于“RNA比对推理(INFERence of RNA ALignment)”的INFERNAL程序得到，一个序列与序列SEQ ID NO:1或与其至少50个连续核苷酸的片段具有至少70％、80％或85％、优选至少90或95％、更优选至少96、97、98或99％的序列同一性，则该序列被认为是序列SEQ ID NO:1的同源物。两个不同物种的两个同源遗传序列如果它们由所述两个物种的最后共同祖先中存在的单一顺序传下来，则被认为是直系同源物。
[0028] 同一性的百分比通过比较已经进行过最优比对的两个序列来确定。同一性的百分比通过确定在两个序列上相同位置处出现相同残基的位置的数量除以位置的总数并乘以100来计算。所述两个序列的最优比对可以用例如局部同源性搜索算法(Smith&Watherman，
1981)或本领域技术人员已知的等效系统得到。
1981)或本领域技术人员已知的等效系统得到。
[0029] 术语“类似物”是指身为天然存在并从中分离、或人为制造的化合物并且具有它模仿的核苷酸序列(功能相等的RNA序列)的至少一个内源性功能例如它模仿的核苷酸序列的所有内源性功能的任何模拟物。类似物化合物的实例包括，例如，容许剪接相同基因的序列。因此，本发明的具体目的涉及与SEQ ID NO:1类似并容许剪接一个或多个选自黑腹果蝇的Ir56d、buttonhead、klarsicht、CG3262、CG30502(脂肪酸2–羟化酶-fa2h)、CG11125、CG9339和CG40006基因的序列。本发明人进行的试验已经证明，例如，基因CG9339(称为skywalker)(Uytterhoeven等，2011)在所述F4突变体中没有正确剪接，表明所述youth snoRNA参与该基因的可变剪接(参见图17)。对于klarsicht基因的转录本，其被观察到在所述F4突变体中的剪接RNA少于在Canton–S野生型对照蝇中的(图18A)，以及对于编码基因fa2h的基因CG30502(图18B)，也得到了类似的结果，后一种基因fa2h在人类中参与各种形式的脱髓鞘，例如与铁蓄积相关的神经退行性疾病、脑白质营养不良(典型地是与fa2h基因突变相关的那些)和遗传性痉挛性截瘫(典型地是SPG35遗传性痉挛性截瘫)(Dick等，2008；2010；Pierson等，2012)。
[0030] 术语“功能变体”是指相对于在本申请中描述的亲本序列具有一种或多种修饰或突变(即，例如，一个或多个碱基的缺失、取代或添加)、并容许在本发明的环境中描述的应用的任何核酸。
[0031] 在本发明意义上被认为是参比序列的同源物、优选直系同源物的序列是所述参比序列在本发明意义上的功能变体的实例。这样的序列可以是天然的、重组的或合成的。
[0032] 序列SEQ ID NO:1在进化中始终是高度保守的序列并在很多动物物种中存在。本发明人因此特别说明，该序列存在于基因组已知的12种其他果蝇物种中。与RNA序列SEQ ID NO:1同源/直系同源的序列的实例因此也包括在本文本的表1中鉴定的RNA序列SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、22、24、26和28(参见图9)。
[0033] 本发明人也已经鉴定了人类中的直系同源RNA序列，位于11号染色体上的位置12822722–12822811中。它是在本文本中标识为SEQ ID NO:2的序列。本发明人还已经鉴定了在小鼠中的两个直系同源RNA序列(它们是在本文本中被分别标识为SEQ ID NO:3和4的序列)，位于15号染色体上的位置30336889–30337017(SEQ ID NO:7)和18号染色体上的位置6495012–6495091(SEQ ID NO:8)。
[0034] 在果蝇、人类和小鼠中鉴定的目标核苷酸序列在下面表1中列出。
[0035] 表1:
[0036]
[0037]
[0038]
[0039]
[0040] 本发明的一个具体目的涉及RNA序列SEQ ID NO:1在鉴定靶基因中的应用，其特征在于所述序列SEQ ID NO:1能够识别优选选自Ir56d、buttonhead、klarsicht、CG3262、CG30502(脂肪酸2–羟化酶：fa2h)和CG11125、CG9339、CG40006的黑腹果蝇基因内的靶序列，所述靶序列优选选自SEQ ID NO:31(TGGTTGAATTCACAAAA)、SEQ ID NO:32(TTGAATTCACAAAATA)、SEQ ID NO:33(AATTCACAAAATAGGC)、SEQ ID NO:34
(AAGCGTTAGATATTAA)、SEQ ID NO:35(ACATCTGCGGATAAGA)、SEQ ID NO:36
(AAGCTTTGCGTTTTGA)、和SEQ ID NO:37(AGAAGCTTTGCGTTTT)、或其类似序列。
(AAGCGTTAGATATTAA)、SEQ ID NO:35(ACATCTGCGGATAAGA)、SEQ ID NO:36
(AAGCTTTGCGTTTTGA)、和SEQ ID NO:37(AGAAGCTTTGCGTTTT)、或其类似序列。
[0041] 在本发明的环境下，所述目标RNA序列优选是snoRNA的形式。在本发明的环境中，术语“snoRNA”包括存在于所有真核细胞中的一组非编码RNA。它们位于细胞核中并更具体地在核仁中，在其中它们与蛋白质缔合，它们与所述蛋白质一起形成核仁小核糖核蛋白或snoRNP。它们通常从前mRNA内含子产生。在进化尺度上，这些非编码RNA从古细菌到哺乳动物都存在。snoRNA可以具有几种功能，例如修饰核糖体RNA，如2'–O–核糖甲基化或各种类别的RNA的假尿苷化。它们参与核糖体RNA或甚至在端粒DNA合成中的核酸降解过程(Kiss，2002；Kiss等，2010；Ye，2007)。有两种主要类别的snoRNA：一种包含C/D框和一种包含H/ACA框(图2A)。C/D框充当在特定部位上2'–O–核糖甲基化的向导，而H/ACA框引导尿苷转化为假尿苷(Kiss，2002；Gardner等，2010；Huang等，2005)(图2B)。
[0042] 在第一个果蝇物种中鉴定的所述目标snoRNA:Ψ28S–1153(youth)属于H/ACA类别，也就是说，它的结构包含H/ACA框。因此它将在核糖体RNA成熟期间参与假尿苷化(即，尿苷转化为假尿苷)，并将调控某些基因的蛋白质合成。
[0043] 本发明的snoRNA可以被化学修饰，通常为了增加所述snoRNA对核酸酶的抗性、赋予所述snoRNA更好的亲合性/选择性和因此更好的功能性。所述修饰通常涉及核苷或核苷间联接。它们可以涉及糖，例如(通常是糖的2'位置)，核苷的含氮碱基(其通常包含在2、4或6位的取代基)，或一个(或多个)磷酸基。
[0044] 所述修饰可以包括，例如，胺化、卤化例如氟化、或烷基化例如甲基化。修饰的糖基因此可以选自，例如，2'–O–甲基和2’–O–甲氧基乙基。
[0045] 修饰的核苷酸可以是包含杂环碱基并且不能与杂环DNA或RNA碱基生成氢键的核苷酸。
[0046] 所述核苷间联接的修饰是，例如，选自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、二硫代磷酸酯和硒代磷酸酯键。
[0047] 本发明还涉及负责表达本发明的目标RNA序列的脱氧核糖核苷酸序列(DNA)。容许RNA序列SEQ ID NO:1表达的DNA序列是本发明中标识为SEQ ID NO:5的序列，容许序列SEQ ID NO:2表达的DNA序列是本发明中标识为SEQ ID NO:6的序列，容许序列SEQ ID NO:3表达的DNA序列是本发明中标识为SEQ ID NO:7的序列，和容许序列SEQ ID NO:4表达的DNA序列是本发明中标识为SEQ ID NO:8的序列。
[0048] 因此本发明的一个目的还涉及选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、和SEQ ID NO:30的分离或合成DNA序列，并且特征在于它容许本发明目标RNA序列的表达。
[0049] 如同所述snoRNA，本发明的DNA可以化学修饰(参见上述可能的化学修饰)。
[0050] 本发明还涉及任何重组表达盒，特征在于它包含本发明的目标核酸序列，例如在本文本中所定义的。所述术语表达盒是指包含容许本发明的目标RNA序列表达的核酸序列和可操作地连接的调控子区的核酸构建物/构造。措辞“可操作地连接”表明所述组分相结合使得所述核酸序列(负责所述目标RNA序列的表达)的表达和/或所述目标RNA序列的寻靶在转录启动子的控制下。通常，启动子序列位于核酸序列的上游，距所述核酸序列与表达控制相适合的距离处。在调控子元件和编码序列之间可以存在间隔序列，只要它们不妨碍所述目标RNA序列的表达和/或寻靶即可。
[0051] 本发明的另一个目的涉及包含容许本发明的目标RNA序列在宿主细胞或宿主生物体中表达的核酸或盒、例如前面定义的核酸或盒的任何(表达)载体。所述载体可以是DNA或RNA，环状或别的形式，单链或双链的。它典型地是质粒、噬菌体、病毒载体(选自，例如，腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒相关载体、慢病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体等)、粘粒或人工染色体。有利地，它是能够转化真核细胞、优选动物细胞、典型地是人类细胞、优选肠或卵巢来源的细胞的载体。这样的载体是本领域技术人员公知的并且在专利申请WO 06/085016中或Barton和Medzhitov，2002；Tiscornia等，2004；Xia等，2002et Shen等，2003的论文中具体描述。
[0052] 容许本发明的目标RNA序列表达的一种优选载体可以选自，例如，质粒、粘粒、病毒载体或噬菌体。尤其可用于果蝇中的一种优选载体是pChs–Gal4载体，其中在Gal4转录因子的上游插入了已知在给定组织中调控给定基因的表达的特定DNA序列，例如Myo1A–Gal4、snail–Gal4、Su(H)–GBE–Gal4、Delta–Gal4。同时，包含目标效应基因、在此是snoRNA的第二载体(pUAs–snoRNA)优选布置在UAS(上游活化序列)调控序列的下游，后面这些调控序列被P[GAL4]转录因子识别。这两种载体然后各自通过转基因引入动物。这两种动物系然后杂交。这种系统被称作：P[GAL4]二元表达系统(Brand和Perrimon，1993；Elliott和Brand，2008)。因此，更具体地说，所述Myo1A–Gal4、snail–Gal4、Su(H)–GBE–Gal4和Delta–Gal4载体包含促进在肠细胞中表达所述RNA序列的启动子和调控子元件，而nanos–Gal4或MTD–(母本–微管蛋白)–Gal4载体包含促进在卵巢中表达所述RNA序列的启动子和调控子元件。
[0053] 本发明的载体还可以包含复制起点、选择基因、报告基因和/或重组序列等。所述载体可以通过本领域技术人员公知的标准分子生物学技术，利用例如限制、连接、克隆、复制等酶构建。本发明意义上的载体的具体实例在试验部分提供。这些载体可以包括，例如，P[GAL4]二元系统(上文提到的)(Brand和Perrimon，1993；Elliott和Brand，2008)。
[0054] 本发明还涉及包含本发明的RNA序列或通过本发明的构建物或载体转化的细胞。所述细胞优选是肠或卵巢细胞。甚至更加优选地，它是肠干细胞、成肠细胞、肠上皮细胞、肠内分泌细胞、滋养细胞或卵母细胞。
[0055] 本发明还包括连续地或顺序地使用本发明的产物，典型地是本发明的RNA序列、DNA序列、载体或细胞来在体外、离体或体内恢复或调节、通常是扩增本发明的目标RNA序列的表达。
[0056] 本发明还涉及转基因小鼠，其基因组(典型地是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)已经利用技术人员公知的技术被遗传修饰，以防止或更改、例如增加或减少表达、优选改变SEQ ID NO:3和或SEQ ID NO:4的一个或另一个的表达。
[0057] 所述小鼠有利地通过技术人员已知的同源重组(敲入，敲除，击倒)技术进行遗传修饰，所述技术包括例如利用CRE/LOX系统。
[0058] 本发明还涉及包含本发明的RNA序列、DNA序列、构建物、载体或细胞的组合物。
[0059] 本发明的RNA序列在体外很稳定并且很有抗性。然而，在给药于待治疗受试者情况下，本发明的组合物还可以有利地包含饮食可接受-或药物可接受的承载体。
[0060] 措辞“饮食可接受的承载体”是指这样的介质，其容许受试者摄入和消化但不危及所述包含本发明的RNA序列、构建物、载体或细胞的组合物，并且能够保护所述序列免受在它产生它的治疗作用之前可能改变它的任何侵袭，尤其是与食物消化相关的侵袭。
[0062] 有利地，本组合物的介质促进本发明的目标RNA、构建物或表达载体渗透到被治疗受试者的细胞中，理想地渗透到如本文本中鉴定的特定细胞中，和/或保护所述RNA、构建物或表达载体免受可能损害它的功效的任何损伤。
[0063] 介质的选择以及所述介质中活性物质的含量通常相对于所述活性物质的溶解性和化学性质、给药方式和待治疗受试者的特征来确定。
[0064] 药物可接受的可用介质或承载体包括天然阳离子聚合物例如壳聚糖或缺端胶原，或合成聚合物例如聚(L–赖氨酸)、聚乙烯亚胺(PEI)或树枝状聚合物，其与本发明的核酸形成复合物；脂质体；阳离子型脂质体；半乳糖化脂质体；包被了允许脂质体靶定细胞类型的配体的脂质体，例如包被了靶细胞特异性抗体的免疫脂质体(Zheng等，2009)；布置在由聚合物形成的纳米粒子(Carmona等，2009)或甚至聚阳离子和聚苯胺的多层膜内的脂质体。
[0065] 赋形剂例如乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和崩解剂例如淀粉、藻酸和某些与润滑剂例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石粉相结合的复合硅酸盐可用于制备片剂。为了制备锭剂，使用乳糖和高分子量聚乙二醇是有利的。水悬液含有促进悬浮的乳化剂或试剂。稀释剂例如蔗糖、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油和氯仿或这些的混合物也是可用的。
[0066] 还可以添加佐剂，例如铝盐(例如氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝)、表面活性剂(例如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽和乳剂)、完全和不完全弗氏(Freund)佐剂、MPL–TDM佐TM剂(单磷酰脂质A，合成的海藻糖二棒杆菌分枝菌酸酯)、酪氨酸、铝、皂苷例如Stimulon 、和细胞因子，以改善所述组合物的效率。
[0067] 本发明的RNA序列可以与可以提供所述产物的控释或缓释的试剂一起制备，所述试剂例如可注射的微球、可生物蚀解的粒子、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体。
[0068] 饮食可接受的承载体的实例包括，例如，糖、皂苷等。
[0069] 所述组合物还可以包括一种或多种其他活性成分，其优选选自可用于治疗核纤层蛋白病、尤其是治疗郝-吉二氏综合征或HGPS(也称为早老症，其包括人类的早期和加速老化)、肥胖症、糖尿病、癌症、退行性疾病尤其是神经退行性疾病(例如脑白质营养不良或仍然鉴定为SPG35的遗传性痉挛性截瘫)、应激或不育症的试剂。
[0070] 治疗肥胖症的有效成分可以是，例如，瘦素或它的衍生物之一。
[0071] 治疗糖尿病的有效成分可以是，例如，胰岛素或它的衍生物之一。
[0072] 治疗癌症的有效成分可以是，例如，常规细胞毒性化疗剂，其选自DNA复制抑制剂(例如DNA结合剂，尤其是嵌入性或烷基化化合物)、抗代谢物剂(例如DNA聚合酶抑制剂或拓扑异构酶I或II抑制剂)、抗有丝分裂剂(例如生物碱)和阻滞癌性肿瘤生长的试剂(例如酪氨酸酶抑制剂或单克隆抗体)。
[0073] 本发明的RNA(可能利用本文本中描述的本发明的另一个产物包含或表达)和所述其他活性化合物，可以同时，如果可在同一组合物中应用的话，或顺序地给药。
[0075] 优选地，所述产物适合于口服给药并以固体或液体形式呈现。所述产物可以是食物、片剂、胶囊、丸剂、糖衣丸、锭剂、颗粒或口服溶液的形式。在胃肠外给药的情况下，它优选是液体溶液、乳液或悬液的形式。在静脉内、皮内或皮下给药的情况下，它典型地是注射溶液的形式。
[0076] 所述目标核苷酸序列还可以通过电穿孔给药到肌肉中或透过受试者的皮肤。
[0077] 剂量(或治疗有效量)是由技术人员容易确定的，使得达到预期效果(即，延长寿命，对抗老化、应激和/或不育症的有害效应)。所述产物的具体剂量应该针对所涉及的受试者和预定的应用进行调整。它取决于几种因素，包括受试者的体重、健康状态、性别和饮食、给药途径、吸收和排泄率、以及可能的与一种或多种其他活性分子的组合。
[0078] 所述产物以单剂或以几剂给药于人类受试者的总日剂量可以，例如，包括在1μg和20mg/千克之间，优选在100μg和5mg之间。所述给药可以是每周或每天一次或甚至一天重复几次。本发明的RNA或包含它们的本发明的组合物可以用包含0.05至20mg RNA、优选0.1至
5mg的单位剂量的形式给药。
5mg的单位剂量的形式给药。
[0079] 在一种具体的实施方式中，本发明的目标RNA序列用于治疗组合物、例如疫苗中。
[0080] 在另一种具体实施方式中，本发明的目标RNA序列用于美容组合物中。
[0081] 本发明的产物的应用
[0082] 本发明尤其涉及包括或包含本发明的目标RNA序列或DNA序列的产物、例如在本文本中描述的产物用作药物。
[0083] 它还涉及本发明的产物或组合物用于i)预防或治疗与老化机制相关的病理、异常、失调或者表观或功能退化，ii)延长受试者的寿命，或iii)增加受试者对应激的抗性。
[0084] 在一个具体方面，本发明涉及治疗有效量的这样的产物在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物旨在i)预防或治疗与老化机制相关的病理、异常、失调或者表观或功能退化，ii)延长受试者的寿命，或iii)增加受试者对应激的抗性。
[0085] 在又一个具体方面中，本发明涉及这样的产物在制备美容组合物中的应用。
[0086] 术语“治疗”在本文件中使用时是指改善或消除症状、减慢所述疾病或老化过程的进展、停止所述疾病的进展或消除所述疾病。
[0087] 发明人已经证明了本发明的RNA序列在延迟老化和对抗与这些过程有关的有害效应方面的令人惊讶的功效。
[0088] 本发明人已经特别证明了序列SEQ ID NO:1的snoRNA:Ψ28S–1153在果蝇中的过表达引人注目地将所述果蝇的寿命加倍。特别是，他们证明了snoRNA:Ψ28S–1153的突变蝇在40日龄时具有比野生型蝇更多的神经退行性病变(图12)。一般而言，过表达snoRNA:Ψ28S–1153的蝇具有较少的脑病变或甚至没有，其显示了本发明的snoRNA对于神经退行性病理的防护性质。此外，本发明人已经表明，过表达snoRNA:Ψ28S–1153的40日龄蝇具有比野生型蝇更好的感觉运动表现(在此通过在量化运动活性的试验期间行走的距离表示)，并因此防护与老化机制有关的有害效应(图13)。
[0089] 本发明人已经证明了本发明的目标RNA序列的过表达容许延长受试者的生命、延迟老化机制和对抗与这些机制有关的有害效应。特别是，他们表明了这种过表达是神经保护性的并特别起到预防或治疗退行性疾病作用，所述退行性疾病特别是神经退行性疾病，典型地是与导致脑中脱髓鞘的铁蓄积有关的神经退行性疾病，例如由fa2h基因的一种或多种突变引起的神经退行性疾病。本发明还特别容许治疗脑白质营养不良(典型地是与fa2h基因突变相关的那些)或遗传性痉挛性截瘫(典型地是SPG35遗传性痉挛性截瘫)。它还容许预防或治疗糖尿病、癌症、生育或不孕问题(图14)，并还有利于维护治疗受试者的运动活性。
[0090] “受试者”是指可能从这样的治疗受益的任何生物，不管其性别或年龄。优选地，所述受试者是成年受试者。所述受试者可以是昆虫例如果蝇、或动物例如哺乳动物(优选灵长类动物或人类)或啮齿动物(优选小鼠或大鼠)。
[0091] 优选地，所述受试者i)不表达所述目标RNA序列或表达所述RNA序列的异常版本，ii)是经历应激条件例如禁食、热冲击、氧化应激(例如百草枯暴露)或造成可察觉的细胞增殖或Delta/Notch途径下调的应激(在肠中)的受试者(特别是已经达到性成熟的受试者，优选年长受试者)，和/或iii)是患有与老化相关或由老化促进的疾病的受试者，所述疾病典型地是退行性疾病特别是神经退行性疾病、核纤层蛋白病例如早老症、肥胖症、糖尿病、癌症或生育问题(尤其包括不育或不孕)。
[0092] 在具体的实施方式中，可能从本发明受益的受试者的基因组i)不表达如本文本所述的目标RNA序列，ii)表达所述目标RNA序列的异常版本，或iii)含有包含造成所述目标RNA序列不表达或异常(即非功能)表达的突变的DNA序列。
[0093] 所述DNA序列的正常(野生型)版本可以选自，例如，前面鉴定的序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30。可能影响所述DNA序列的正常版本、即妨碍本发明的目标RNA序列表达的突变，典型地选自一个或多个核苷酸的缺失、添加和/或取代。
[0094] 术语“寿期”或“寿命”是指受试者作为生物物种在理想条件下和在没有疾病或事故的情况下生存的程序化的寿命。“最高寿期”或“最高寿命”是给定物种的个体可以达到的最高寿命。为了实用的目的，受试者的最高寿期由种群成员之一达到的最大年龄来评估。“平均寿期”或“平均寿命”是给定种群的50％存活的年龄。
[0095] 测量“延长寿命”的治疗效应的广泛认可的方法是参考最高寿期或平均寿期。如果相对于对照受试者组，治疗明显增加了受试者组的最高或平均寿期，那么认为是延长寿命和延迟老化。
[0096] 在果蝇中，平均在一日龄时达到性成熟。平均寿命大约30天。最高寿命取决于果蝇物种和种系以及生存或饲育条件，包含在大约60和80天之间。在小鼠中，平均在出生后42天达到性成熟。平均寿命大约832天。在人类中，在9和14岁年龄之间达到性成熟。平均寿命是男性73岁和女性79岁。最高寿命目前是122岁5个月14天。
[0097] 在本发明的环境中，术语“老化”是受试者经过儿童期和青春期，从成熟直到功能衰退的逐渐而自发的变化过程。老化因此包括发育和成熟的正性成分和衰退的负性成分。
[0098] 本发明的目标RNA序列增加了受试者的最高或平均寿期(或寿命)。优选地，这些序列延长了由例如性别和/或年龄(即由最小年龄或最大年龄或由年龄窗)限定的受试者或成年受试者亚群的寿命并延迟其老化。
[0099] 利用本发明，将果蝇以及哺乳动物、包括小鼠并特别是人类的寿命延长了大约50％或甚至100％，同时通常认为改善了老化状况。
[0100] 利用本发明的RNA序列，还可能对抗“老化的有害效应”。在本发明的环境中，这种措辞是指老化的负性成分，即受试者的衰退。生理能力随着年龄逐渐衰退在一种器官与另一种之间和一个受试者与另一个之间不等。受试者的生理衰退导致对环境刺激作出反应的能力降低并增加了对疾病和损害的易感性和脆弱性。老化的有害效应包括对于衰弱给定受试者具有影响并且可以促成其死亡的不希望的改变的累积。这些改变可以归因于发育、先天老化过程、可能的遗传异常、环境、和影响或曾影响受试者的疾病。
[0101] 此外，利用本发明，有可能预防或治疗退行性疾病，特别是神经退行性疾病，典型地是影响中枢和/或周围神经系统的退行性疾病。
[0102] 在优选实施方式中，本发明容许预防或治疗与导致脑中脱髓鞘的铁蓄积有关的神经退行性疾病，特别是由fah2基因的一个或多个突变引起的神经退行性疾病。本发明因此容许治疗脑白质营养不良(典型地是与fa2h基因突变有关系的那些)或遗传性痉挛性截瘫(典型地是SPG35遗传性痉挛性截瘫)。
[0103] 在其他实施方式中，本发明将预防或治疗选自肌病、亨特综合征、先天性角化不良、Prader–Willi综合症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多发性硬化症和肌萎缩性侧索硬化(ALS)的病理。
[0104] 在另一种实施方案中，本发明将预防或治疗核纤层蛋白病例如郝-吉二氏综合征(或早老症)、下颌骨发育不良(MAD)、Emery–Dreifuss肌营养不良、非典型性沃纳(Werner)综合征、限制性皮肤病、致死性胎儿运动不能、和LIRLLC(全身性脂肪萎缩、胰岛素抵抗型糖尿病、脑白质黑皮疣(leukomelanodermic papules)、肝脏脂肪变性和肥厚型心肌病)，优选郝-吉二氏综合征。
[0105] 在又一种实施方案中，本发明将预防或治疗糖尿病或肥胖症。
[0106] 它还可以参与预防或治疗癌症或肿瘤过程。所述癌症典型地选自癌、肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、儿科肿瘤或白血病。它可以，例如，是乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、食管癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、肺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、黑素瘤、白血病、神经母细胞瘤等等。
[0107] 在一种具体实施方式中，本发明尤其可用于对抗由自由基引起的癌症，例如结肠癌和胃癌。
[0108] 利用本发明的产物对抗不育或不孕问题也是可能的。“不育”或“不孕”是指难以受孕或不能受孕。在这种用途的环境下，所述受试者通常是雌性、性成熟的并有例如早产、生殖困难。通常所述受试者是不孕不育的，或者有生育力的早期或过早降低。本发明的目标RNA序列允许治疗不育症，或者恢复、增加、提高或刺激受治疗受试者的生育力。
[0109] 本发明也涉及治疗与老化机制或与应激相关的病理、异常、失调、有害效应或者表观或功能退化、例如本文本中描述的那些的方法。
[0110] 容许评价被测化合物的预防性或治疗性功效的方法
[0111] 本发明还提供了评价被测化合物对抗老化或应激的有害效应以及抵抗与这样的应激或这样的老化机制有关的病理或对抗不育症的美容或治疗功效的方法。
[0113] 化合物可以测试它的潜在治疗功效，即，它预防、治疗或增强老化或应激疾病和有害效应、例如如前面所述的核纤层蛋白病、退行性疾病或癌症的治疗的能力，以预防、治疗或增强糖尿病或肥胖症的治疗，或预防、治疗或增强不育的治疗。
[0114] 化合物还可以测试它的潜在美容功效，即其改善受试者的身体外观和更好地对抗所述受试者与老化机制相关的表观变差的能力。所述被测化合物可以在表皮、体毛和/或毛细血管系统、指甲、嘴唇、外生殖器、牙齿或黏膜的美容治疗中证明有效。
[0115] 在第一种实施方式中，本发明中描述的方法包括以下步骤：
[0116] i)暴露不表达本发明的RNA序列或表达所述RNA序列的异常版本的细胞、细胞群或组织；或本发明的转基因小鼠，
[0117] ii)如果有的话，评价所述被测化合物对所述细胞或所述组织或所述转基因小鼠的表型的效应，和
[0118] iii)确定所述被测化合物的美容或治疗功效，所述RNA序列的活性和/或表达的恢复与所述被测化合物的功效相关。
[0119] 所述被测化合物的美容或治疗功效可以参考对照值评价或确定。该对照值可以从不表达所述RNA序列或表达其异常版本的细胞、细胞群或组织中或者在本发明的转基因小鼠中所述RNA序列的活性和/或表达水平建立。
[0120] 如果在暴露于所述被测化合物的所述细胞、细胞群、组织或转基因小鼠中存在的所述RNA序列的活性和/或表达大于在不表达所述RNA序列或表达其异常版本的所述细胞、细胞群或组织中或本发明的转基因小鼠中所述RNA序列的活性和/或表达的话，那么所述被测化合物具有美容或治疗功效。
[0121] 在第二种实施方式中，本发明中描述的方法包括以下步骤：
[0122] i)暴露包含本发明的RNA序列的本发明细胞或包含本发明细胞的细胞群或组织；
[0123] ii)如果有的话，评价所述被测化合物对所述细胞或细胞群或所述组织的表型的效应，和
[0124] iii)确定所述被测化合物的美容或治疗功效，所述RNA序列的活性和/或表达的增加与所述被测化合物的功效相关。
[0125] 依据本发明的这个方面，对照值可以从表达所述RNA序列的细胞或细胞群中所述RNA序列的活性和/或表达水平来建立。
[0126] 在这种情况下，如果暴露于所述被测化合物的所述细胞或细胞群中存在的所述RNA序列的活性和/或表达大于表达所述RNA序列的细胞或细胞群中所述RNA序列的活性和/或表达的话，那么所述被测化合物具有美容或治疗功效。
[0127] 所述RNA序列的活性和/或表达水平可以利用技术人员已知的技术进行定量，通常通过定量PCR或免疫组织化学(通过针对受所述目标snoRNA调控的基因/蛋白质的抗体进行染色)。
[0128] 还可以，例如，通过测量细胞分裂的数量等来确定所述细胞的寿命，评价所述治疗效应。
[0129] 优选地，所述暴露于被测化合物的细胞或细胞群是肠或卵巢来源的。优选的细胞可以选自在本文本中提到的细胞，通常选自成肠细胞、肠上皮细胞、肠内分泌细胞、肠干细胞、滋养细胞，典型地是卵巢腔滋养细胞、卵母细胞、成卵细胞等。
[0131] 图1：基因座P[Gal4]4C的基因组区的图谱，youth snoRNA和F4缺失的位置。
[0132] 图2：A)H/ACA框基序，B)假尿苷化图(摘自：Kiss等，(2010)Molecular Cell，37，597–606)。
[0133] 图3：雌蝇的寿命。随着天数变化的活蝇数累计减少(％)。Cont–CS＝野生型对照蝇。F4＝F4突变体，G5＝带有G5基因组snoRNA转基因的蝇，F4；G5＝在F4突变体遗传背景中带有G5snoRNA转基因以恢复野生型表型的蝇(括号中：蝇的数量)。
[0134] 图4：对三日龄小鼠进行的抗应激试验(热冲击，禁食，百草枯)。
[0135] A)热冲击：F4突变体比对照更抗性(只有雌性)。过表达所述snoRNA的蝇(G5)、以及拥有所述转基因的F4突变体(F4；G5)比对照(雄性和雌性)更抗性。
[0136] B)禁食：所述F4突变体比对照(雄性和雌性)更抗性。过表达所述snoRNA的蝇(G5)更抗性(只有雌性)。拥有所述转基因的F4突变体雌蝇(F4；G5)类似于对照蝇；因此通过所述转基因恢复了野生型。
[0137] C)百草枯：所述F4突变体比对照(雄性和雌性)更抗性。过表达所述snoRNA的蝇(G5)更抗性(只有雌性)。拥有所述转基因的F4突变体蝇(F4；G5)类似于对照蝇；因此通过所述转基因恢复了野生型。
[0138] 图5：在肠和卵巢中的原位杂交
[0139] A)在野生型对照小鼠(Canton–S)中，所述snoRNA在肠的上皮细胞中表达。蓝色：通过DAPI在细胞核中的DNA染色。红色：snoRNA染色。注意所述snoRNA染色(红点)与细胞核的染色(蓝色)是不同和互补的，证明后者局限在核仁中。
[0140] B)在所述F4突变体(所述snoRNA缺失)中，看出蓝色染色(DAPI)但没有红色染色，因为所述snoRNA被删除，因此不表达。
[0141] C)对照蝇，野生型(Canton–S)。所述snoRNA在卵巢滋养细胞中表达。
[0142] D)F4突变体蝇。所述snoRNA在卵巢中不表达。
[0143] 图6：经由四个不同的Gal4驱动种系，驱动报告基因GFP的表达(UAS–GFP)，在肠的上皮细胞中靶向表达所述snoRNA。通过原位杂交检测所述snoRNA的表达(红色和/或橙色)(左列：a1，b1，c1，d1，e1)，用DAPI染色细胞核(蓝色)(第二列：a2，b2，c2，d2，e2)，通过免疫染色检测GFP的表达(抗GFP抗体通过FITC展现(绿色)(第三列：a3，b3，c3，d3，e3)。右列(a4，b4，c4，d4，e4)叠印了前面三种图像，显示共定位。注意只在(A)(Myo1A–Gal4)处有双重染色，显示所述snoRNA只在肠上皮细胞中表达。A)在Myo1A–Gal4(Myo1A–Gal4；UAS–mCD8–GFP)的控制下，所述snoRNA在肠上皮细胞中的靶向表达。B)在F4突变体遗传背景中(Myo1A–Gal4，F4/F4；UAS–snoRNA–8M/+)，通过Myo1A–Gal4在肠上皮细胞中的靶向表达。C)在esg–Gal4的控制下在肠中的靶向表达(esg–Gal4，UAS–GFP)。D)在Su(H)–Gal4的控制下在肠中的靶向表达(Su(H)–GBE–Gal4；UAS–mCDB–GFP)，染色了成肠细胞。E)在Delta–Gal4的控制下在肠中的靶向表达(Dl–Gal4，UAS–GFP)，染色了肠干细胞(ISC)。
[0144] 图7：经由驱动表达所述snoRNA(UAS–8M)的三个其他的不同Gal4驱动种系，在肠上皮的其他细胞类型中靶向表达所述snoRNA，证明了所述snoRNA可以在其他细胞类型中异位表达。
[0145] A)在esg–Gal4控制下的靶向表达(esg–Gal4，F4/F4；UAS–8M/+)。
[0146] B)在Su(H)–Gal4控制下的靶向表达(Su(H)–GBE–Gal4，F4/F4；UAS–8M/+)。
[0147] C)在Delta–Gal4控制下的靶向表达(Delta–Gal4,F4/F4；UAS–8M/+)。
[0148] 图8：在三日龄蝇的肠中靶向表达所述snoRNA之后(在所述F4突变体遗传背景中所述snoRNA的再表达)，对各种应激的抗性。
[0149] A)禁食：在Myo1A–Gal4控制下靶向表达所述snoRNA(UAS–8M)。相对于两个对照系，在表达所述snoRNA的蝇(Myo,F4/F4；8M/+)中有明确的抗性增加。
[0150] B)禁食：在esg–Gal4控制下靶向表达所述snoRNA(UAS–8M)。相对于两个对照系，在表达所述snoRNA的蝇(esg,F4/F4；8M)中有明确的抗性增加。
[0151] C)禁食：在Su(H)–Gal4控制下靶向表达所述snoRNA(UAS–8M)。相对于两个对照系，在表达所述snoRNA的蝇(Su(H),F4/F4；8M)中有明确的抗性增加。
[0152] D)36℃热冲击：在Su(H)–Gal4控制下靶向表达所述snoRNA(UAS–8M)。相对于两个对照系，在表达所述snoRNA的蝇(Su(H),F4/F4；8M)中有明确的抗性增加。
[0153] 图9：A)在基因组已知的十二种果蝇中的同源性；B)所述12种果蝇的共有结构。
[0154] 图10：染色体11上的人类同源物。
[0155] 图11：在小家鼠(Mus musculus)中的2个同源基因(小鼠–1和小鼠–2)。
[0156] 图12：脑组织学：在40日龄蝇的脑中可见的神经退行性变。对照蝇(Canton–S野生型)(a1)存在神经退行性病变(空泡/空隙)，而F4突变体蝇(a2)存在更多的病变。在突变体遗传背景中表达所述snoRNA的蝇(拯救型：F4；G5)(b1)存在比所述CS和F4少的病变，过表达所述snoRNA的蝇(G5)(b2)也如此。专门在肠上皮细胞中再表达所述snoRNA的F4突变体蝇(Myo,F4/F4；UAS–snoRNA)(c2)也具有比不表达它的蝇(Myo,F4/F4)(c1)少的病变。在(d)中，在年轻蝇(4日龄)和老年蝇(40日龄)中对这些各种基因型进行病变定量。所有这些结果显示，所述snoRNA的表达在老年蝇中防护了神经退行性病变(0，+，++，+++＝基于病变数量和面积的病变严重程度)
[0157] 图13：通过视频跟踪定量的感觉运动参数(运动活性)，在此通过在7小时记录期间行走的距离表示。四十日龄的老年蝇与年轻的4日龄蝇比较。A)雌性行走的距离。B)雄性行走的距离。
[0158] 图14：蝇生育力(产卵数A)，每个雌性/日和B)每个雌性在17天中)。总计，所述F4突变体产卵比对照(CS)多一些，但有轻度延迟。所述转基因(snoRNA)在F4突变体(F4；G4-也称为F4；4M)中的表达降低了生育力。所述转基因(G4-也称为4M)的过表达增加了生育力(产卵数)。
[0159] 图15：肠上皮简图(摘自：Jiang和Edgar，Exp.Cell.Res.，2011).
[0160] A)在成年果蝇中肠上皮再生的模型。
[0161] B)在果蝇(胚胎，幼虫，蛹，成虫)和在哺乳动物中肠内分泌细胞中Notch功能的模型。Dl＝Delta，N＝Notch，NO＝无Notch信号。这个图清楚显示了在果蝇和人类的肠上皮之间的完美相似性。
[0162] 图16：在果蝇中调控肠体内稳态和再生(中肠)的逆控制机制(摘自：Jiang和Edgar，Exp.Cell.Res.，2011)。(缩写同图15)。
[0163] 图17：所述youth snoRNA参与基因CG9339(skywalker)的可变剪接。在一些潜在靶基因中进行了比较型RT-PCR以便看看在所述F4突变体中，这些基因的一些是否相对于野生型蝇(对照–CS)没有被正确剪接。其中，分析了基因CG9339(skywalker)的345–400–432–462bp的4个转录本。所述rp49基因(300–bp片段)用作内部对照，以及关于RNA(预先没有RT)的对照以便证明所使用的RNA没有被痕量的DNA污染。注意在所述F4突变体中没有基因CG9339(skywalker)的小345–bp转录(箭头)。
[0164] 图18：所述youth snoRNA参与两个其他基因：klarsicht和基因CG30502(fa2h)的RNA水平调控。A)对于klarsicht而言，464–bp片段(包含在外显子中)的扩增显示，在所述F4突变体中转录的产物比在野生型对照蝇(Canton–S)中少。B)对于fa2h而言，429–bp片段(包含在外显子中)的扩增显示，在所述F4突变体中转录的比在野生型对照蝇(Canton–S)中少。
[0165] 图19：描述klarsicht作用的模型。A)klarsicht，经由它的KASH结构域，与位于核膜内表面的纤层相互作用(根据：Patterson等，2004)。B)显示核纤层蛋白的结构和功能的示意图。所述纤层蛋白位于核膜的内表面并用来保持细胞核的稳定性、组织染色质和结合核孔(NPC)。还画出了与所述纤层蛋白相互作用的几种蛋白质(根据：Coutinho等，Immunity&Ageing，2009)。
[0166] 图20：在小鼠和人类中表达所述youth snoRNA的直系同源哺乳动物序列(通过小鼠和人类同源物的RT–PCR检测)。这些snoRNA的表达表明它们很可能是功能性的。在人类中，159–bp snoRNA(SEQ ID NO:2)在肠和脑中表达并在卵巢和肾脏中轻度表达(为了更精确，用红色星号标记)。在小鼠中，129–bp snoRNA–1(SEQ ID NO:3)只在脑中表达。与此相反，122–bp snoRNA–2(SEQ ID NO:4)在肠、脑和卵巢中表达，但不在肾脏中表达。
[0167] 图21：youth snoRNA突变的蝇(F4突变体)显示脂肪体肥大。在40日龄的年长蝇中，与它们的也是40日龄的相应对照比较，观察到脂肪体的明显改变。这些病变通过活化的抗半胱天冬酶-3抗体标记显示，所述抗体标记正经历凋亡的细胞。A)“CS”对照蝇。被白色虚线包围的脂肪体相当均匀和光滑。B)F4突变体蝇：注意到大的细胞聚集体(白色箭头)。C)在带有所述snoRNA转基因的蝇(G5)中：所述脂肪体没有聚集，类似“CS”对照的脂肪体。D)在F4突变体遗传背景中具有G5转基因的蝇(F4；G5)中，这些蝇只显示了少数聚集体，并且这些聚集体较小，表明所述转基因部分拯救了由于所述突变引起的脂肪体病变。这些结果强烈提示糖脂代谢的破坏。
[0168] 试验部分
[0169] 1)位于基因座P[GAL4]4C的snoRNA:Ψ28S–1153(youth)的遗传和分子表征[0170] 这个试验是对参与果蝇中运动行为的神经基础的调查和中央复合体并且尤其是椭球体的结构和功能之间关系的研究的一部分。在这种环境下，筛选容许鉴定在所述椭球体中特异性表达的P[GAL4]4C种系的P[GAL4]增强子捕获种系文库(图1)。不同的遗传方法，特别是破伤风毒素的靶向表达，已经显示出阻断这些神经元在运动活性中产生缺陷(Martin等，2002)。在第二步中，为了进一步详细表征这些神经元并更好地确定它们在参与运动活性的神经网络内的功能，在遗传和分子上表征所述P[GAL4]4C种系的所述插入基因座。进行PCR–拯救并容许显示P[GAL4]4C的P–元件在2R染色体上的插入点(右：即在右臂)，在位置50A，两个基因CG13333和CG13334之间(图1)。然后，为了能够显示这两个基因各自的表型和功能，通过再切除所述P–元件(通过称为：跳出、或回复体的遗传方法)在它们中产生突变。从而得到名为F4的632个碱基对(bp)的小缺失(图1)。
[0171] snoRNA:Ψ28S–1153作为Huang等(2005)进行的在果蝇基因组中所有潜在的核仁小RNA(snoRNA)的系统性筛查的一部分，在这个基因座的位置67331中处鉴定(图1)。然而，相应的论文没有区分任何具体的snoRNA并且没有任何功能与snoRNA:Ψ28S–1153关联。在本发明的环境下，不存在所述小F4缺失的这种snoRNA已经被精确定位并在结构上和功能上表征。由此，这种snoRNA由148个碱基对(bp)构成并且它的结构包含H/ACA框。
[0172] 2)所述F4缺失的表型表征：降低寿命
[0173] 在进行经由在P[GAL4]4C种系的标记环神经元中靶向表达破伤风毒素来定量所述蝇的运动活性的研究的同时，本发明人观察到这些蝇具有很短的寿命并且决定精确定量所述P[GAL4]4C/UAS–破伤风毒素蝇以及所述F4蝇(在基因座4C处突变)的所述寿命。由此所述F4蝇具有短的寿命(相对于野生型对照蝇短大约30％)，提示所述snoRNA缺失可能影响寿命(寿期)(图3)。所述发明人还观察到这种效应根据所述蝇的性别而不同，所述效应在雌性中比在雄性比明显得多得多。
[0174] 3)为了恢复野生型表型(“拯救”)生成含有所述snoRNA(youth)的基因组区的转基因种系
[0175] 为了证明所述F4突变体的表型实际上是由于所述snoRNA的缺失所致，产生了转基因果蝇种系，其带有所述区的1723个bp的基因组DNA序列(从66377至68100)，所述基因组DNA序列包含所述snoRNA(图1)及其调控子序列。更确切地说，来自所述1723–bp区的基因组片段通过PCR扩增并经由所述Xba1限制性位点插入到pCaSper–4载体中(这种载体不含任何启动子/调控子序列)。然后根据标准技术产生转基因蝇，并得到表达所述相同的、但是在基因组的不同位置插入的转基因的蝇种系(独立插入物：G4，G5)。
[0176] 接下来，为了验证所述转基因是功能性的并可以拯救所述F4突变(即，恢复所述野生型表型，也就是说寿命恢复到等于没有F4缺失时所观察到的寿命)，本发明人在所述F4遗传突变体的环境中通过标准遗传杂交引入这些转基因种系(F4；G4和F4；G5)。由此可以证明所述转基因可以拯救由于造成所述寿命减少的突变引起的所述表型(图3)(参见，例如：F4对比F4；G5)。此外，这种转基因放入野生型基因组(正常)(其相当于过表达这种snoRNA，因为现在有4个所述snoRNA的拷贝而不是两个内源性拷贝)(G5)增加了寿命(在F4；G5的情况下甚至使寿命加倍或在G5的情况下增加寿命大约30％)(图3)。该试验由此明确显示，过表达这种snoRNA(或修改它的表达水平)，可以增加动物的寿命。总之，在所述区中相当于或等同于这种基因突变的小基因组缺失(632个碱基对，称为F4)(图1)缩短寿命，而通过基因疗法进行过表达(经由含有这种snoRNA的基因组DNA的转基因)不仅拯救了该突变而且大幅延长(加倍)了治疗受试者的寿命(图3)。
[0177] 4)抗应激试验
[0178] 现在普遍承认作用于寿期的基因通常增加抗应激性。本发明人已经验证并得到确认，这种snoRNA的过表达能有效增加所涉及的受试者在应激状态例如禁食、热冲击和氧化应激(百草枯引起)下的寿命(图4)。
[0179] A)耐热试验(热冲击试验)
[0180] 雄性和雌性在含有饲料的标准管中一起饲养3天。在3日龄时，所述雄性和雌性以20一组分开分配到含有饲料的标准管中。为了所述蝇经受热冲击，包含所述蝇的管放入36℃的恒温箱中。每6小时计数死蝇数量。对于热冲击(36℃)，在图4A中，注意到F4突变体蝇(只有雌性)比对照蝇更抗性。然而，G5蝇(雄性和雌性)比对照和F4突变体更抗性，而由于在F4突变体中G5转基因的表达(F4；G5蝇)，这些蝇也比对照蝇和F4突变体蝇抗性得多。
[0181] B)禁食试验
[0182] 像耐热试验一样，雄性和雌性在包含饲料的标准管中一起饲养3天。在3日龄时，所述雄性和雌性以20一组分开分配到含有滤纸和400μL水以免失水的标准管中。所述蝇留在24℃的潮湿室中，每6小时计数死蝇数量。对于禁食，在图4B中注意到，F4突变体蝇(雄性和雌性)比对照蝇更抗性。此外，G5蝇(雌性)更加抗性，而在F4突变体中所述转基因的表达(F4；G5)恢复了正常存活率(在雌性中)。
[0183] C)抗氧化应激(百草枯)性
[0184] 百草枯(1,1’-二甲基-4,4’-联吡啶二氯)还原NADH，产生稳定的百草枯自由基，其与氧反应产生ROS(活性氧)。于是，所述ROS引起细胞损伤(Rzezniczak等，2011)。像前面的试验一样，雄性和雌性在包含饲料的标准管中一起饲养3天。在3日龄时，所述雄性和雌性以20一组分开分配到空标准管中以便将它们禁食6小时。接下来，所述蝇被转移到含有滤纸和
450μl在1％蔗糖中稀释以促进饮食摄入的20mM百草枯的管中。所述蝇留在24℃的潮湿室中，每6小时计数死蝇数量。
450μl在1％蔗糖中稀释以促进饮食摄入的20mM百草枯的管中。所述蝇留在24℃的潮湿室中，每6小时计数死蝇数量。
[0185] 对于氧化应激，在图4C中，注意到F4突变体蝇(只有雌性，虽然雄性也有强趋势)比对照蝇更抗性。类似地，雌性G5蝇比对照更抗性并且与F4突变体相似，而在F4突变体中所述转基因的表达(F4；G5)恢复了蝇的存活率(等于对照蝇)。
[0186] 总之，F4突变体蝇比对照蝇更抗性，而过表达(G5)进一步增加了这种抗性(在雌性中比雄性更显著和一致的效应)。此外，在这两个试验中(禁食和氧化应激)，在F4突变体中所述转基因的表达(F4；G5)恢复了蝇存活率，尤其在雌性中。因此，与F4突变减少寿命的寿期相对照，所述F4突变在年轻的三日龄蝇中进行的三个应激试验中增加了抗性，并且这种效应可以通过所述snoRNA的基因组转基因恢复(在两个试验中)。总之，调节所述“youth”snoRNA的表达(抑制、降低或增加)改变了所测受试者的寿命。
[0187] 5)测定所述snoRNA的空间-时间表达谱(原位杂交)
[0188] 为了确定所述目标snoRNA在什么细胞和/或组织中表达和作用，在本发明的环境下在成蝇中通过利用反义snoRNA的原位杂交(HIS)，测定这种snoRNA的空间-时间表达谱。酪胺用于扩增标记。在雄性和雌性二者中，所述youth snoRNA在肠壁(上皮)(图5A)中表达，同时，正如所料，它在F4突变体中不存在(图5B)。更具体地说，使用专门针对肠的各种细胞类型的P[Gal4]种系，与双标记相结合，证明了所述youth snoRNA在肠上皮细胞的核仁中特异性表达，所述肠上皮细胞是形成肠上皮的主要和多数细胞(图6A)，同时它在其他细胞类型中不表达(图6B、C、D、E)。此外，在雌性中，它也在卵巢、更特别在滋养细胞中表达(图5C和
5D)。
5D)。
[0189] 6)SnoRNA在肠上皮以外的细胞类型中的靶向表达
[0190] 通过使用三个其他不同的Gal4驱动种系，进行snoRNA(UAS–8M)在肠上皮以外的细胞类型中的靶向表达(异位)：esg–Gal4(esg–Gal4,F4/F4；UAS–8M/+)和Delta–Gal4(Delta–Gal4,F4/F4；UAS–8M/+)靶向肠干细胞(ISC)，而Su(H)–Gal4(Su(H)–GBE–Gal4,F4/F4；UAS–8M/+)靶向成肠细胞(图7)。这些结果证明：1)所述snoRNA可以在其他细胞类型中异位表达，
2)这种异位表达也增加对某种应激的抗性(图8)。总之，这些结果显示了所述snoRNA当它在肠上皮以外的细胞类型中表达时也可以赋予保护。
2)这种异位表达也增加对某种应激的抗性(图8)。总之，这些结果显示了所述snoRNA当它在肠上皮以外的细胞类型中表达时也可以赋予保护。
[0191] 7)所述snoRNA的靶向(选择性)表达引起抗应激性的拯救
[0192] 本发明人已经通过两种独立的方法证明，在肠细胞中的靶向表达足以恢复抗应激性表型。通过从基因组转基因种系(增加寿期的那些：G5，另一种独立插入(G4)同样)进行的原位杂交技术可以证明，所述snoRNA在肠细胞中表达，而且为了调控寿期，所述snoRNA在肠细胞中的表达是充分的。
[0193] 为了证实这第一种结果，所述snoRNA通过利用P[Gal4]A二元表达系统只在肠细胞中靶向。构建质粒载体(p[UAS–snoRNA])，其中所述目标snoRNA(只有148个bp)置于Gal4的调控子元件(上游活化序列：UAS)的控制下。然后产生转基因蝇种系(UAS–snoRNA：4M、5M和8M)。为了靶向表达，使用含有转基因(pChs–Gal4)的所谓转基因蝇的“驱动”种系(质粒载体种系Myo1A–Gal4、esg–Gal4(escargot–Gal4)、Su(H)GBE–Gal4、和Dl–Gal4(Delta–Gal4))，所述转基因已知特别在肠细胞中表达(Jiang和Edgar，2011；Takashima等，2011)。接下来，这些各种转基因放入F4突变体遗传背景中，并且通过原位杂交证明，所述snoRNA在它的靶向表达后实际上在这些各种类型的肠细胞中表达(图6和7)(esg–Gal4,F4/F4；UAS–snoRNA–
8M)(Myo1A–Gal4,F4/F4；UAS–snoRNA–8M)(Su(H)–GBE–Gal4,F4/F4；UAS–snoRNA–8M)(F4/F4；Delta–Gal4,/UAS–snoRNA–8M)。所述结果显示，这种靶向表达(在F4突变体中)基本上恢复了抗应激性表型(禁食和热冲击)(图8)。
8M)(Myo1A–Gal4,F4/F4；UAS–snoRNA–8M)(Su(H)–GBE–Gal4,F4/F4；UAS–snoRNA–8M)(F4/F4；Delta–Gal4,/UAS–snoRNA–8M)。所述结果显示，这种靶向表达(在F4突变体中)基本上恢复了抗应激性表型(禁食和热冲击)(图8)。
[0194] 这些试验明确显示，在肠细胞中、更特别在肠上皮细胞中操纵这些snoRNA对恢复抗应激性是必要的和充分的。这些试验，虽然在果蝇中进行，容许提示所述snoRNA在肠的上皮细胞中再表达(恢复表达或拯救)或过表达能够引起哺乳动物并特别是人类的寿命增加。
[0195] 8)在其他果蝇物种中和哺乳动物包括小鼠和人类中鉴定所述youth序列的同源物[0196] 序列同源性研究显示，这些snoRNA在基因组可得到的11种其他果蝇中也存在(图9A)(也参见12种果蝇的共有区结构：图9B)。
[0197] 此外，同源性检索并尤其是经由RNA结构(利用INFERNAL软件)允许在人类中鉴定同源物，位于11号染色体上，位置：12822722–12822811(图10)。在小鼠中，也已经鉴定了两种同源物：在15号染色体上，位置：30336889–30337017；和18号染色体上，位置：6495012–6495091(图11A和11B)。
[0198] 像在果蝇中一样，很可能这种基因和/或合成类似物的过表达(遗传或通过口服给药，或通过注射)将延长人类寿命。这样的表达也能防止各种退行性疾病的有害效应。
[0199] 9)所述snoRNA在神经退行性和神经保护中的作用
[0200] 因为F4蝇具有很短的寿命，而过表达所述snoRNA的蝇(G5)活得较长，研究老年蝇(40日龄)以便检查任何神经退行性病变的存在(在脑中存在尺寸或大或小的或多或少的孔洞)。总的说来，在对照蝇(Canton–S)中，大约60％的蝇存在病变(但是注意到50％的所述CS蝇在40天时已经死亡)(图12)[进一步的细节：参见图12d的半定量分析]。在F4突变体中，所有的蝇(100％)都有病变，并且它们通常比对照更严重(孔洞的尺寸和数量)，而F4；G5蝇具有明显较少的孔洞(只有约10％的蝇)，这些孔洞尺寸也较小。最后，在G5蝇中，与所述CS对照大致相同百分比的蝇存在病变(大约40％)，但是这些病变的严重度明显较低(图12d)。总之，所述基因组转基因(F4；G5)部分拯救了所述神经退行性表型，而过表达所述snoRNA(G5)防止了神经退行性变。
[0201] 10)所述snoRNA在保护感觉运动参数中的作用
[0202] 类似地，为了确定由所述snoRNA提供的神经保护是否对生理参数例如感觉运动参数具有效应，定量比40天老的蝇的运动活性(通过视频跟踪)(Martin，2004)并与4日龄的年轻蝇的运动活性比较(图13)。首先，在4日龄蝇和40日龄蝇之间观察到巨大的差异；40日龄蝇行走的距离是4日龄蝇行走的三分之一。然而，在老年40日龄蝇中，过表达所述snoRNA的蝇(G5)比对照蝇(Canton–S)、F4突变体、和在遗传突变体背景中表达所述snoRNA的蝇(F4；G5)走得多。这种效应在雄性中比雌性更显著。总之，在老年40日龄蝇中，我们看到过表达所述snoRNA的蝇具有比对照蝇更好的感觉运动表现。这些结果证明了所述snoRNA对于与老化机制有关的有害效应的保护性质。
[0203] 11)测试所述snoRNA在卵巢中的功能：生育力(繁殖)作用
[0204] 在雌性中，所述snoRNA也在卵巢并更确切地说在滋养细胞中表达(图5C、D)。本发明人还表明突变体蝇(F4)还具有生育力改变(繁殖表型)。F4突变体产卵比对照蝇(CS)多一些(图14)。在所述突变体遗传背景中带有所述snoRNA的蝇(F4；G4)产卵少得多(生育力降低)，而过表达所述snoRNA的蝇(G4)产卵比对照蝇多得多(图14)。这些结果无可否认地证明了由所述snoRNA在卵巢中施加的重大效应和它对雌性生育力的影响。
[0205] 12)用所述snoRNA治疗(通过口服途径或注射给药)
[0206] 所述snoRNA可以口服(per os)或注射给药。取决于所使用的载体类型，也可以使用其他给药途径，例如吸入和局部/皮肤涂敷。
[0207] 作为本发明的一部分进行的实验显示，由于所述snoRNA的稳定性和体外耐受性以及它局部作用于肠壁细胞(成肠细胞，肠上皮细胞，ISC)的能力，它的口服给药是可能的。如前面所述，所述目标snoRNA的给药因此能容许原本将是不存在的表达(或换句话说，拯救已有的突变)，或者如有必要，容许过表达，以便保护肠壁免受损伤，同时保持更好的激素和代谢平衡。
[0208] 13)癌症治疗
[0209] 在哺乳动物和果蝇二者中，显示了所述delta/notch基因调控肠祖细胞的分化，同时Wnt信号传导途径参与ISC的维护和增殖。同样，细胞因子信号传导途径(Upd/Jak/Stat)和EGFR(表皮生长因子受体)途径调控ISC的增殖(图15–16)(Jiang和Edgar，2011；Takashima等，2011)。
[0210] 我们的试验显示，本发明的目标snoRNA能够调控某些基因，例如notch、delta、JNK、EGFR等(图15)，它们的下调可以引起肠上皮的过度增生并因此引起癌症(Jiang和Edgar，2011；Takashima等，2011)。本发明的目标snoRNA尤其能通过它调控EGFR表达的能力来预防或治疗癌症，在果蝇和哺乳动物的肠中调控ISC增殖的EGFR信号传导途径实际上是特别保守的(图16)[几种疗法目前处于治疗结肠癌的临床试验下，包括两种抗EGFR单克隆抗体(西妥昔单抗和帕尼单抗)(Amado等，2008；Di Nicolantonio等，2008)]。
[0211] 14)所述目标snoRNA(“youth”)参与郝–吉二氏综合征(HGPS)，亦称早老症，其包括人类的早期和加速老化。
[0212] 我们已经证明，所述youth snoRNA调控klarsicht基因的剪接(剪接RNA的量)(图18A)。已经显示，这种基因与位于细胞核内膜的蛋白——纤层相互作用(Patterson等，
2004)，并参与早老症(导致人类早期和加速老化的疾病)(图18B)。早老症是一种罕见病，影响八百万分之一的个体(Scaffidi和Misteli，2006；Broers等，2006；Cohen等，2001；Cau等，
2014；Coutinho等，2009)。所述youth snoRNA通过它的表型(参与寿期)和它参与调控klarsicht基因，提供了治疗下列疾病的新前景：核纤层蛋白病例如郝-吉二氏综合征(或早老症)、下颌骨发育不良(MAD)、Emery–Dreifuss肌营养不良、非典型性沃纳(Werner)综合征、限制性皮肤病、致死性胎儿运动不能、和LIRLLC(全身性脂肪萎缩、胰岛素抵抗型糖尿病、脑白质黑皮疣、肝脏脂肪变性和肥厚型心肌病)(Hutchison，2002；Broers等，2006)，特别是郝-吉二氏综合征(早老症)。
2004)，并参与早老症(导致人类早期和加速老化的疾病)(图18B)。早老症是一种罕见病，影响八百万分之一的个体(Scaffidi和Misteli，2006；Broers等，2006；Cohen等，2001；Cau等，
2014；Coutinho等，2009)。所述youth snoRNA通过它的表型(参与寿期)和它参与调控klarsicht基因，提供了治疗下列疾病的新前景：核纤层蛋白病例如郝-吉二氏综合征(或早老症)、下颌骨发育不良(MAD)、Emery–Dreifuss肌营养不良、非典型性沃纳(Werner)综合征、限制性皮肤病、致死性胎儿运动不能、和LIRLLC(全身性脂肪萎缩、胰岛素抵抗型糖尿病、脑白质黑皮疣、肝脏脂肪变性和肥厚型心肌病)(Hutchison，2002；Broers等，2006)，特别是郝-吉二氏综合征(早老症)。
[0213] 15)所述目标snoRNA(“youth”)参与脂肪酸2-羟化酶(fa2h)基因剪接的调控，并因此参与与这种基因有关的各种形式神经退行性变的调控
[0214] 我们已经证明，所述youth snoRNA调控编码脂肪酸2-羟化酶(fa2h)的基因CG30502的剪接(剪接的RNA的量)(图18B)。这种基因参与脂肪酸生物合成过程，更具体涉及复合脂质例如鞘脂和神经酰胺的代谢过程(Carvalho等，2010)。在人类中，这种fa2h与各种形式的神经退行性变(脱髓鞘)有关，例如与脑中铁蓄积、某些脑白质营养不良和最后遗传性痉挛性截瘫(SPG35)有关的神经退行性变(Kruer等，2010；Pierson等，2012；Schneider和Bhatia，2010)。由于它的表型(在F4突变体中观察到的参与寿期和/或脂肪体肥大)和它参与调控fa2h基因，所述youth snoRNA提供了治疗以上提到的神经退行性疾病的新前景。
[0215] 16)肠和脑之间(脑-肠轴)代谢和神经内分泌关系
[0216] 如前面所述，snoRNA突变体(F4)存在脂肪体肥大，在腹部和头壳中脑周围这两处可见(图21)。此外，甘油三酯定量证实了这种肥大(因此是所述蝇的“肥胖”限定词)。这种表型提示了所述snoRNA在肠中的表达、神经退行性病变和寿命增加之间的代谢和/或神经内分泌关系。更具体地说，这种代谢破坏提示了牵涉胰岛素信号传导途径，这种途径被多次描述为参与果蝇寿期(Tatar等，2001；Bai等，2012；Partridge等，2011；Fontana等，2010)。针对活化的抗半胱天冬酶-3抗体的免疫组织化学标志物显示，在果蝇成虫中，位于脑周边周围的脂肪在F4突变体中被大量破坏(即肥大)，同时通过过表达所述snoRNA(转基因G5)以及在拯救(恢复表达)(F4；G5)中被保护(图21)。这些结果证明了所述snoRNA保护了表达它的生物体免于脂肪体改变，因此，延伸开来，免于肥胖症。此外，包括胰岛素受体(InR)突变和所述F4突变体的遗传相互作用试验(双重突变体)显示了所述snoRNA的突变可以至少部分拯救所述胰岛素受体突变的表型(参见图21和它的说明文字)。这些结果显示了在所述胰岛素信号传导途径、所述snoRNA和寿期之间存在关联(直接或间接)。前述的结果显示了所述snoRNA的突变和/或下调破坏了糖类和脂质代谢。
[0217] 所述youth snoRNA因此提供了治疗糖尿病和肥胖症二者的新前景。
[0218] 17)所述目标snoRNA(“youth”)在人类和小鼠中的表达
[0219] 通过RT–PCR方法，我们已经证明了与所述youth snoRNA(首先在果蝇中鉴定)同源的序列、更确切地说直系同源序列确实在哺乳动物中表达(图20)。在人类中，所述159–bp snoRNA(SEQ ID NO:2)在肠和脑中表达并在卵巢和肾脏中轻度表达。在小鼠中，所述129–bp snoRNA–1(SEQ ID NO:3)只在脑中表达并且所述122–bp snoRNA–2(SEQ ID NO:4)在肠、脑和卵巢中表达，但不在肾脏中表达。这些数据支持了这些snoRNA在人类和小鼠二者中的表达，很可能是功能性的。
[0220] 参考文献
[0221] -Amado RG，Wolf M，Peeters M，Van Cutsem E，Siena S，Freeman DJ，Juan T，Sikorski R，Suggs S，Radinsky R，Patterson SD，Chang DD(2008).野生型KRAS是在转移型结肠直肠癌患者中帕尼单抗疗效需要的(Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer).J Clin Oncol，26，1626-1634.
[0222] -Bai H，Kang P，Tatar M.(2012).果蝇胰岛素样肽-6(dilp6)从脂肪体表达延长寿命并抑制果蝇胰岛素样肽-2从脑分泌(Drosophila insulin-like peptide-6(dilp6)expression from fat body extends lifespan and represses secretion of Drosophila insulin-like peptide-2from the brain).Aging Cell.，11，978-985.[0223] -Brand AH，Perrimon N(1993)靶向基因表达作为改变细胞命运和产生显性表型的工具(Targeted gene expression as a means of altering cell fates and
generating dominant phenotypes).Development 118，401-415
generating dominant phenotypes).Development 118，401-415
[0224] -Broers JL，Ramaekers FC，Bonne G，Yaou RB，Hutchison CJ(2006).核纤层蛋白：核纤层蛋白病和它们在过早衰老中的作用(Nuclear lamins：laminopathies and their role in premature ageing).Physiol Rev.，86，967-1008.
[0225] -Carvalho M，Schwudke D，Sampaio JL，Palm W，Riezman I，Dey G，Gupta GD，Mayor S，Riezman H，Shevchenko A，Kurzchalia TV，Eaton S.(2010)甾醇营养缺陷体的生存策略(Survival strategies of a sterol auxotroph).Development，137，3675-3685.[0226] -Cau P，Navarro C，Harhouri K，Roll P，Sigaudy S，Kaspi E，Perrin S，De Sandre-Giovannoli A，Lévy N.(2014).在翻译研究观点中的核基质、核膜和过早衰老综合征(Nuclear matrix，nuclear envelope and premature aging syndromes in a translational research perspective).Semin Cell Dev Biol.，28，S1084-9521(14)00058-5.
[0227] -Cohen M，Lee KK，Wilson KL，Gruenbaum Y.(2001).核纤层的转录抑制、凋亡、人类疾病和功能进化(Transcriptional repression，apoptosis，human disease and the functional evolution of the nuclear lamina).Trends Biochem Sci.，26，41-47.[0228] -Coutinho HD1， -Silva VS， GF，da Nóbrega RB(2009).在类早老综合征中的分子老化：郝-吉早老症综合征作为模型(Molecular ageing in progeroid syndromes：Hutchinson-Gilford progeria syndrome as a model).Immun Ageing，20，6:
4.
4.
[0229] -Dick，K.J.，Al-Mjeni，R.，Baskir，W.，Koul，R.，Simpson，M.A.，Patton，M.A.，Raeburn，S.，Crosby，A.H.(2008).常染色体隐性遗传性痉挛性截瘫(SPG35)的新基因座作图于16q21-q23(A novel locus for an autosomal recessive hereditary spastic paraplegia(SPG35)maps to 16q21-q23).Neurology 71：248-252.
[0230] -Dick，K.J.，Eckhardt，M.，Paisan-Ruiz，C.，Alshehhi，A.A.，Proukakis，C.，Sibtain，N.A.，Maier，H.，Sharifi，R.，Patton，M.A.，Bashir，W.，Koul，R.，Raeburn，S.，Gieselmann，V.，Houlden，H.，Crosby，A.H.(2010).FA2H突变是遗传性痉挛性截瘫(SPG35)的复杂形式的基础(Mutation of FA2H underlies a complicated form of hereditary spastic paraplegia(SPG35)).Hum.Mutat.31：E1251-1260.
[0231] -Di Nicolantonio F，Martini M，Molinari F，Sartore-Bianchi A，Arena S，Saletti P，De Dosso S，Mazzucchelli L，Frattini M，Siena S，Bardelli A(2008).野生型BRAF是转移型结肠直肠癌响应帕尼单抗或西妥昔单抗需要的(Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer).J Clin Oncol，26，5705-5712.
[0232] -Elliott DA，Brand AH.(2008)GAL4系统：基因表达的通用系统(The GAL4system：a versatile system for the expression of genes).Methods Mol Biol，
420，79-95.
420，79-95.
[0233] -Fontana L，Partridge L，Longo VL(2010).延长健康寿命-从酵母到人类(Extending healthy life span-from yeast to humans).Science，328，321-326.[0234] -Huang ZP，Zhou H，He HL，Chen CL，Liang D，Qu LH.(2005)来自黑腹果蝇的两个snoRNA基因家族的基因组范围分析证明编码snoRNA的内含子的广泛利用(Genome-wide analyses of two families of snoRNA genes from Drosophila melanogaster，demonstrating the extensive utilization of introns for coding of snoRNAs).RNA，11，1303-1316.
[0235] -Hutchison CJ.(2002).纤层蛋白：基因表达的结构单元或调控子？(Lamins：building blocks or regulators of gene expression？)Nat Rev Mol Cell Biol.，3，
848-858.
848-858.
[0236] -Jiang H，Edgar BA(2011).成虫果蝇中肠中的肠干细胞(Intestinal stem cells in the adult Drosophila midgut).Exp Cell Res.317，2780-2788.
[0237] -Kruer MC1，Paisán-Ruiz C，Boddaert N，Yoon MY，Hama H，Gregory A，Malandrini A，Woltjer RL，Munnich A，Gobin S，Polster BJ，Palmeri S，Edvardson S，Hardy J，Houlden H，Hayflick SJ.(2010).缺陷的FA2H引起新的具有脑铁蓄积的神经退行性变形式(NBIA)(Defective FA2H leads to a novel form of neurodegeneration with brain iron accumulation(NBIA)).Ann Neurol.，68，611-618.
[0238] -Martin，JR，Faure，P，Ernst，R(2002).行走时间间隔的幂律分布与果蝇中的椭球体相关(The Power Law Distribution for Walking-Time Intervals Correlates with the Ellipsoid Body in Drosophila).J.Neurogenetics，15，1-15.
[0239] -Martin，JR(2004).通过视频跟踪模式测定果蝇中运动行为的描绘(A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm).Behav.Process.，67，207-219.
[0240] -Partridge L，Alic N，Bjedov I，Piper MD(2011).果蝇中的老化：胰岛素/IGF和TOR信号传导网络的作用(Ageing in Drosophila：the role of the insulin/Igf and TOR signalling network).Exp Gerontol.，46，376-381.
[0241] -Patterson K1，Molofsky AB，Robinson C，Acosta S，Cater C，Fischer JA.(2004)Klarsicht和核纤层蛋白在果蝇眼睛的感光细胞的发育调控核迁移中的功能(The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye).Mol Biol Cell.，15，600-610.
[0242] -Pierson TM1，Simeonov DR，Sincan M，Adams DA，Markello T，Golas G，Fuentes-Fajardo K，Hansen NF，Cherukuri PF，Cruz P，Mullikin JC，Blackstone C，Tifft C，Boerkoel CF，Gahl WA.(2012)外显子组测序和SNP分析检测脂肪酸羟化酶相关的神经退行性中新的化合物杂合性(Exome sequencing and SNP analysis detect novel compound heterozygosity in fatty acid hydroxylase-associated neurodegeneration).Eur J Hum Genet.，20，476-479.
[0243] -Rzezniczak TZ，Douglas LA，Watterson JH，Merritt TJ.(2011)果蝇中百草枯给药用于氧化应激的代谢研究(Paraquat administration in Drosophila for use in metabolic studies of oxidative stress).Analytical Biochem.，419，345-7.[0244] -Scaffidi P，Misteli T.(2006)人类老化中纤层蛋白A依赖性核缺陷(Lamin A-dependent nuclear defects in human aging).Science，312，1059-1063.
[0245] -Schneider SA，Bhatia KP.(2010)同一基因的三面：FA2H关联具有脑铁蓄积的神经退行性变、脑白质营养不良和遗传性痉孪性截瘫(Three faces of the same gene：FA2H links neurodegeneration with brain iron accumulation，leukodystrophies，and hereditary spastic paraplegias).Ann Neurol.，68，575-577.
[0246] -Takashima S，Adams KL，Ortiz PA，Ying CT，Moridzadeh R，Younossi-Hartenstein A，Hartenstein V(2011).果蝇肠内分泌谱系的建立及其通过Notch信号传导途径的说明(Development of the Drosophila entero-endocrine lineage and its specification by the Notch signaling pathway).Dev Biol，353，161-172.
[0247] -Tatar M，Kopelman A，Epstein D，Tu MP，Yin CM，Garofalo RS(2001).延长寿命和损害神经内分泌功能的突变体果蝇胰岛素受体同源物(A Mutant Drosophila Insulin Receptor Homolog That Extends Life-Span and Impairs Neuroendocrine Function).Science，292，107.
[0248] -Uytterhoeven V，Kuenen S，Kasprowicz J，Miskiewicz K，Verstreken P(2011).Skywalker的丢失揭示突触内涵体为突触小泡蛋白质的拣选站(Loss of skywalker reveals synaptic endosomes as sorting stations for synaptic vesicle proteins).Cell，145，117-132.
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 抗生素对果蝇记忆认知影响用测定方法 | 2020-05-25 | 252 |
| 一种WAP基因在果蝇转基因中的应用 | 2020-05-26 | 204 |
| 杀虫剂的筛选测定法 | 2020-05-16 | 504 |
| 一种用于室内饲养果蝇寄生蜂的装置及方法 | 2020-05-24 | 670 |
| 用于筛选神经活性物质及相关神经可塑性的方法 | 2020-05-18 | 151 |
| 一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶 | 2020-05-23 | 144 |
| 一种杨梅园果蝇的人工饲养方法及其饲养寄生蜂的步骤 | 2020-05-17 | 619 |
| 一种潜在的高效重组HIV-1CRF07-BCgp140免疫原的制备方法 | 2020-05-24 | 421 |
| 一种果蝇诱捕剂组合物及应用 | 2020-05-26 | 707 |
| 一种利用嗅觉和视觉信号防治果蝇的装置和方法 | 2020-05-27 | 335 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈