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复合型piggyBac重组载体及其制备方法和应用

阅读：697发布：2020-06-28

专利汇可以提供复合型piggyBac重组载体及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种复合型piggyBac重组载体及其制备方法和应用，该重组载体在野生型piggyBac转座子臂R1和L1之间插入了目的基因表达框、筛选标记基因表达框I和II、由热激启动子调控的piggyBac转座酶表达框以及截短型piggyBac转座子臂L2和R2，可以方便地介导目的基因连同筛选标记基因以及piggyBac转座酶表达框序列在家蚕基因组的整合，建立并筛选目的基因高效表达的转基因家蚕系，随后通过热激处理诱导piggyBac转座酶在转基因家蚕体内表达，可实现所有转座子序列和筛选标记基因序列在后代转基因家蚕基因组的完全删除，剩余的被attP位点锚定的目的基因表达框通过phiC31整合酶介导的盒式交换反应可方便地实现其它外源基因与该目的基因的替换，进而实现其它外源基因在该基因组位点的定点整合。，下面是复合型piggyBac重组载体及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.复合型piggyBac重组载体，其特征在于，在野生型piggyBac转座子臂R1和L1之间插入了外源目的基因表达框、筛选标记基因表达框I和II、由热激启动子调控的piggyBac转座酶表达框、以及截短型piggyBac转座子臂L2和R2；所述外源目的基因表达框的两端锚定有2个同向排列的phiC31整合酶识别位点即attP位点，形成attP-外源目的基因表达框-attP序列；所述截短型piggyBac转座子臂L2正向排列于attP-外源目的基因表达框-attP序列的5’端；所述截短型piggyBac转座子臂R2反向排列于attP-外源目的基因表达框-attP序列的3’端；所述筛选标记基因表达框I位于野生型piggyBac转座子臂R1和截短型piggyBac转座子臂L2之间；所述筛选标记基因表达框II位于截短型piggyBac转座子臂R2和野生型piggyBac转座子臂L1之间；所述piggyBac转座酶表达框排列于筛选标记基因表达框II之后，同样位于转座子臂R2和L1之间；所述野生型piggyBac转座子臂R1的序列如SEQ ID No.1所示，野生型piggyBac转座子臂L1的序列如SEQ ID No.2所示，截短型piggyBac转座子臂L2的序列如SEQ ID No.3所示，截短型piggyBac转座子臂R2的序列如SEQ ID No.4所示，截短型piggyBac转座子臂L2和R2序列的3′端还分别含有TTAA位点。
2.根据权利要求1所述的复合型piggyBac重组载体，其特征在于，所述外源目的基因表达框是以家蚕丝素重链启动子启动的增强绿色荧光蛋白表达框。
3.根据权利要求1所述的复合型piggyBac重组载体，其特征在于，所述筛选标记基因表达框I是以眼和神经特异表达启动子3×P3启动的红色荧光蛋白表达框；所述筛选标记基因表达框II是以3×P3启动子启动的增强绿色荧光蛋白表达框。
4.根据权利要求1所述的复合型piggyBac重组载体，其特征在于，所述热激启动子为黑腹果蝇hsp70基因启动子。
5.权利要求1至4任一项所述的复合型piggyBac重组载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.采用上游引物attP-R2-F-SpeI和下游引物R2-R-XhoI，以pBac{3×P3-DsRedaf}载体为模板进行PCR扩增，得到attP-pBacR2片段，经SpeI和XhoI双酶切后连入pSL{3×P3-EGFP-SV40}载体，得到pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40}重组载体；所述上游引物attP-R2-F-SpeI的序列如SEQ ID No.5所示，下游引物R2-R-XhoI的序列如SEQ ID No.6所示；
b.采用上游引物SV40-F-NotI和下游引物SV40-R-SphI，以pBac{3×P3-DsRedaf}载体为模板进行PCR扩增，得到SV40polyA片段，经NotI和SphI双酶切后连入pSLfa1180fa载体，得到pSL-SV40polyA重组载体；所述上游引物SV40-F-NotI的序列如SEQ ID No.7所示，下游引物SV40-R-SphI的序列如SEQ ID No.8所示；
采用上游引物PBase-F-SpeI和下游引物PBase-R-NotI，以pHA3PIG载体为模板进行PCR扩增，得到PBase基因片段，经SpeI和NotI双酶切后连入pSL-SV40polyA载体，得到pSL-PBase-SV40重组载体；所述上游引物PBase-F-SpeI的序列如SEQ ID No.9所示，下游引物PBase-R-NotI的序列如SEQ ID No.10所示；
采用上游引物Hsp70-F-SphI/SpeI和下游引物Hsp70-R-SpeI，以pMLS104载体为模板进行PCR扩增，得到hsp70基因启动子片段，经SpeI单酶切后连入pSL-PBase-SV40载体，得到pSL{Hsp70-PBase-SV40}重组载体；所述上游引物Hsp70-F-SphI/SpeI的序列如SEQ ID No.11所示，下游引物Hsp70-R-SpeI的序列如SEQ ID No.12所示；
c.利用SphI单酶切pSL{Hsp70-PBase-SV40}重组载体，回收Hsp70-PBase-SV40片段，再将其插入经相同酶切的pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40}重组载体，得到pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40-Hsp70-PBase-SV40}重组载体；
d.采用上游引物attP-L2-F-AscI和下游引物L2-R-AscI，以pBac{3×P3-DsRedaf}载体为模板进行 PCR扩增，得到pBacL2-attP片段，经 AscI单酶切后连入pBac{3×P3-DsRedaf}-R3载体，得到pBac{R1-3×P3-DsRed-SV40-L2-attP-FibH-EGFP-LBS-L1}重组载体；所述上游引物attP-L2-F-AscI的序列如SEQ ID No.13所示，下游引物L2-R-AscI的序列如SEQ ID No.14所示；
e.利用FseI单酶切pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40-Hsp70-PBase-SV40}重组载体，回收attP-R2-3×P3-EGFP-SV40-Hsp70-PBase-SV40片段，再将其插入经相同酶切的pBac{R1-3×P3-DsRed-SV40-L2-attP-FibH-EGFP-LBS-L1}重组载体，即得到复合型piggyBac重组载体。
6.权利要求1至4任一项所述的复合型piggyBac重组载体在制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统中的应用。
7.利用权利要求1至4任一项所述的复合型piggyBac重组载体制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将复合型piggyBac重组载体和转座酶表达载体共同导入解除滞育的G0代蚕卵，筛选出基因组中插入有单拷贝的R1–L1转座子结构并高效表达外源蛋白的杂合G1代转基因家蚕；
b.将步骤a中筛选获得的杂合G1代转基因家蚕与野生型家蚕回交产生G2代蚕卵，用HCl处理解除G2代蚕卵的滞育，对胚胎或4龄幼虫进行热激处理，再将热激处理后的G2代转基因家蚕与野生型家蚕回交获得G3代转基因家蚕，筛选出基因组中转基因结构两侧的转座子即R1–L2和R2–L1均发生删除的G3代转基因家蚕，该G3代转基因家蚕的基因组中仅含有被2个同向排列的attP位点锚定的外源目的基因表达框序列，即获得了稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统。
8.根据权利要求7所述的利用复合型piggyBac重组载体制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的方法，其特征在于，所述热激处理方法是每天热激3次，每次42℃热激
1小时，连续热激3～5天。
9.利用权利要求1至4任一项所述的复合型piggyBac重组载体制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将复合型piggyBac重组载体和转座酶表达载体共同导入解除滞育的G0代蚕卵，筛选出基因组中插入有单拷贝的R1–L1转座子结构并高效表达外源蛋白的杂合G1代转基因家蚕；
b.将步骤a中筛选获得的杂合G1代转基因家蚕与野生型家蚕回交产生G2代蚕卵，用HCl处理解除G2代蚕卵的滞育，对胚胎或4龄幼虫进行热激处理，再将热激处理后的G2代转基因家蚕与野生型家蚕回交获得G3代转基因家蚕，筛选出基因组中转基因结构单侧R1–L2转座子发生删除而保留R2–L1转座子的G3代转基因家蚕；
c.将步骤b获得的单侧R1–L2转座子发生删除而保留R2–L1转座子的G3代转基因家蚕按照步骤b进行第2轮热激诱导，筛选出基因组转基因结构两侧的转座子即R1–L2和R2–L1均发生删除的G4代转基因家蚕，该G4代转基因家蚕的基因组中仅含有被2个同向排列的attP位点锚定的外源目的基因表达框序列，即获得了稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统。
10.根据权利要求9所述的利用复合型piggyBac重组载体制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的方法，其特征在于，所述热激处理方法是每天热激3次，每次42℃热激
1小时，连续热激3～5天。

说明书全文

复合型piggyBac重组载体及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种piggyBac重组载体及其制备方法，还涉及该重组载体在制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统中的应用。

背景技术

[0002] 自1982年第一例利用P因子在黑腹果蝇中介导实现昆虫遗传转化报道以来，基于转座子的遗传转化系统已经在过去的30多年被广泛用于昆虫和其他无脊椎动物的基础与应用研究。其中，应用最为广泛与成熟的转座子系统是来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的piggyBac转座子。piggyBac是一种典型的II型转座子系统，其内部区域序列编码1个含594个氨基酸的转座酶。该转座酶可作用于piggyBac转座子两端的末端反向重复序列(Terminal inverted repeat，TIR)及其临近的DNA序列，进而介导piggyBac转座子从原位点切除，然后整合至一个新的含有保守的“TTAA”序列的宿主基因组位点。piggyBac转座子的一个缺点在于，其介导外源基因在宿主染色体的插入位置或插入拷贝数不同，会导致外源基因的表达受到位置效应的影响，并且可能导致宿主自身所含基因的突变失活，即存在插入突变现象。而利用位点特异性重组(Site-specific recombination，SSR)技术则能够有效克服转座子介导的外源基因在基因组随机整合而不具有靶向性和易受整合的位置效应影响等缺点。

[0003] 位点特异性重组技术是目前实现基因定点插入与定点敲除最有效的手段之一。其作为一项十分有效的、高靶向性的基因功能研究和遗传改造的方法体系，已被广泛应用于拟南芥、小鼠、果蝇等多种模式生物，正逐渐成为转基因动植物研究领域进行基因操作的强有力工具。目前最常用的位点特异性重组系统包括FLP/FRT、Cre/loxP和phiC31/att系统等。链霉菌噬菌体phiC31整合酶作为丝氨酸重组酶家族的成员，可催化细菌附着位点(attB位点)和噬菌体附着位点(attP位点)间发生有效的单向性重组。attB位点和attP位点的最小长度分别为34bp和39bp，attB位点和attP位点重组后产生attL和attR 2个不同序列的重组位点。在没有辅因子的情况下，phiC31整合酶无法再介导attL和attR位点间发生重组反应。这种不可逆的重组以及较短重组位点的特点吸引了许多研究者进一步研究phiC31整合酶在高等真核生物遗传工程的潜在应用价值。

[0004] 家蚕是目前世界上人类利用得最成功和最悠久的经济昆虫之一，作为一种相当重要的鳞翅目模式生物，具有深入研究的重要价值和意义。随着家蚕基因组框架图、精细图和遗传突变图谱的完成，家蚕基因组研究已逐步进入功能基因组时代。基于piggyBac转座子系统建立转基因家蚕来开展基因的功能研究，已经成为目前家蚕功能基因研究领域最重要的技术手段之一。家蚕也是目前应用piggyBac转座子最为广泛和相对最为成熟的非果蝇属昆虫物种。然而，目前利用piggyBac介导外源基因在家蚕基因组中的随机整合所带来的位置效应和插入突变现象给家蚕基因功能研究带来了许多不良影响，例如不可预知的基因表达的变化、破坏宿主基因的结构、影响转基因家蚕的正常生长发育等。并且，由于piggyBac介导外源基因整合的随机性，单纯利用piggyBac转座子几乎不可能重复多次介导不同外源基因在某个确定的靶位点进行定点整合。而如前所述，如果能够利用phiC31/att位点特异性重组系统介导外源基因在已经确定的家蚕基因组靶位点进行定点整合和替换，将能够有效克服piggyBac介导外源基因随机插入的缺点。

[0005] 利用转座子系统建立转基因昆虫的另一个潜在问题在于，通过转座载体介导插入宿主基因组的转基因存在整合后不稳定现象。目前已经在包括黑腹果蝇、赤拟谷盗、地中海实蝇、斯氏按蚊和家蚕在内的多种昆虫物种中观察到了piggyBac在宿主基因组中的再转座现象。宿主基因组中含有具有转录活性的piggyBac-like序列，能编码生成具有活性的内源性转座酶，是产生这种piggyBac再转座现象的一个很重要原因。家蚕基因组中已经鉴定到超过100条piggyBac-like序列，其中许多序列已证实均具有转录活性。利用piggyBac转座子插入宿主基因组后的再转座，实现piggyBac单侧或两侧包含末端重复序列的转座子臂序列的删除，是一种消除piggyBac转座子整合后不稳定现象的有效策略。2004年，Handler等构建了含有3个转座子臂的复合型piggyBac转座载体，利用piggyBac的插入后再转座，使得整合进入黑腹果蝇基因组的外源DNA片段仅保留了单侧的1个转座子臂序列，从而实现了靶基因在黑腹果蝇基因组的稳定整合而不再发生再转座事件。2006年，Dafa'alla等对piggyBac转座载体进行了进一步改进，他们同样通过利用piggyBac的插入后再转座，实现了除靶基因以外的所有piggyBac转座子序列的删除，从而确保了靶基因在地中海实蝇基因组中的稳定整合。但是，这种通过删除piggyBac两侧臂序列来实现转基因稳定整合的策略目前尚未应用于家蚕和其他的鳞翅目昆虫物种。

[0006] 因此，结合位点特异性重组系统、优化的piggyBac转座系统以及转基因家蚕外源蛋白表达系统，探索一种创制稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的通用且有效的方法，将为有效消除插入位置效应以及潜在的插入突变和整合后不稳定现象对基因表达的影响，为家蚕的基因功能研究、不同蛋白表达研究等提供良好的基础，同时这也是推动家蚕功能基因组研究发展的需要和必然。

发明内容

[0007] 本发明的目的之一在于提供一种复合型piggyBac重组载体，该重组载体可在介导外源目的基因整合后实现所有转座子序列和筛选标记基因序列从家蚕基因组中完全删除，仅在家蚕基因组中保留外源目的基因，并可借助phiC31/att系统实现其它外源基因在家蚕基因组的定点替换；本发明的目的之二在于提供一种所述复合型piggyBac重组载体的制备方法，操作简便；本发明的目的之三在于提供所述复合型piggyBac重组载体在制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统中的应用；本发明的目的之四在于提供一种利用所述复合型piggyBac重组载体制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的方法，该方法可以实现除外源目的基因以外的所有转座子序列和筛选标记基因序列在家蚕基因组中完全删除，确保外源目的基因在家蚕基因组中稳定整合而不发生再转座事件，所得转基因家蚕表达系统还可以通过基于phiC31/att系统的phiC31整合酶介导的盒式交换(RMCE)反应实现其它外源基因在相同整合位点的定点替换。

[0008] 具体技术方案如下：

[0009] 1.复合型piggyBac重组载体，在野生型piggyBac转座子臂R1和L1之间插入了外源目的基因表达框、筛选标记基因表达框I和II、由热激启动子调控的piggyBac转座酶(PBase)表达框、以及截短型piggyBac转座子臂L2和R2；所述外源目的基因表达框的两端锚定有2个同向排列的phiC31整合酶识别位点(attP位点)，形成attP-外源目的基因表达框-attP序列；所述截短型piggyBac转座子臂L2正向排列于attP-外源目的基因表达框-attP序列的5’端；所述截短型piggyBac转座子臂R2反向排列于attP-外源目的基因表达框-attP序列的3’端；所述筛选标记基因表达框I位于野生型piggyBac转座子臂R1和截短型piggyBac转座子臂L2之间；所述筛选标记基因表达框II位于截短型piggyBac转座子臂R2和野生型piggyBac转座子臂L1之间；所述piggyBac转座酶表达框排列于筛选标记基因表达框II之后，同样位于转座子臂R2和L1之间；所述野生型piggyBac转座子臂R1的序列如SEQ ID No.1所示，野生型piggyBac转座子臂L1的序列如SEQ ID No.2所示，截短型piggyBac转座子臂L2的序列如SEQ ID No.3所示，截短型piggyBac转座子臂R2的序列如SEQ ID No.4所示，截短型piggyBac转座子臂L2和R2序列的3′端还分别含有TTAA位点。

[0010] 优选的，所述外源目的基因表达框是以丝腺特异型启动子启动的荧光蛋白表达框。

[0011] 更优选的，所述外源目的基因表达框是以家蚕丝素重链启动子(FibH)启动的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达框。

[0012] 优选的，所述筛选标记基因表达框I和II是以组织特异型启动子启动的荧光标记基因表达框。

[0013] 更优选的，所述筛选标记基因表达框I是以眼和神经特异表达启动子3×P3启动的红色荧光蛋白(DsRed)表达框；所述筛选标记基因表达框II是以3×P3启动子启动的EGFP表达框。

[0014] 优选的，所述热激启动子为黑腹果蝇hsp70基因启动子。

[0015] 在本发明的复合型piggyBac重组载体中，除了以FibH启动EGFP基因在家蚕丝腺中特异表达，并与丝素重链融合表达的FibH-EGFP表达框外，其它外源目的基因表达框同样适用；除了以3×P3启动子启动的DsRed表达框和以3×P3启动子启动的EGFP表达框外，其它筛选标记基因表达框同样适用；除了FibH、3×P3启动子、黑腹果蝇hsp70基因启动子外，其它丝腺特异型启动子(如丝素轻链基因FibL、P25蛋白基因fhx/P25和丝胶1基因Ser1启动子)、组织特异型启动子(如脂肪体、中肠和血液特异型启动子)、热激启动子也能够按照本发明提供的策略用于构建复合型piggyBac重组载体。

[0016] 2.复合型piggyBac重组载体的制备方法，包括以下步骤：

[0017] a. 采用上游引物 attP-R2-F-SpeI 和下游引物 R2-R-XhoI，以pBac{3×P3-DsRedaf}载体为模板进行PCR扩增，得到attP-pBacR2片段，经SpeI和XhoI双酶切后连入pSL{3×P3-EGFP-SV40}载体，得到pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40}重组载体；所述上游引物attP-R2-F-SpeI的序列如SEQ ID No.5所示，下游引物R2-R-XhoI的序列如SEQ ID No.6所示；

[0018] b.采用上游引物SV40-F-NotI和下游引物SV40-R-SphI，以pBac{3×P3-DsRedaf}载体为模板进行PCR扩增，得到SV40polyA片段，经NotI和SphI双酶切后连入pSLfa1180fa载体，得到pSL-SV40polyA重组载体；所述上游引物SV40-F-NotI的序列如SEQ ID No.7所示，下游引物SV40-R-SphI的序列如SEQ ID No.8所示；

[0019] 采用上游引物PBase-F-SpeI和下游引物PBase-R-NotI，以pHA3PIG载体为模板进行PCR扩增，得到PBase基因片段，经SpeI和NotI双酶切后连入pSL-SV40polyA载体，得到pSL-PBase-SV40重组载体；所述上游引物PBase-F-SpeI的序列如SEQ ID No.9所示，下游引物PBase-R-NotI的序列如SEQ ID No.10所示；

[0020] 采用上游引物Hsp70-F-SphI/SpeI和下游引物Hsp70-R-SpeI，以pMLS104载体为模板进行PCR扩增，得到hsp70基因启动子片段，经SpeI单酶切后连入pSL-PBase-SV40载体，得到pSL{Hsp70-PBase-SV40}重组载体；所述上游引物Hsp70-F-SphI/SpeI的序列如SEQ ID No.11所示，下游引物Hsp70-R-SpeI的序列如SEQ ID No.12所示；

[0021] c.利用SphI单酶切pSL{Hsp70-PBase-SV40}重组载体，回收Hsp70-PBase-SV40片段，再将其插入经相同酶切的pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40}重组载体，得到pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40-Hsp70-PBase-SV40}重组载体；

[0022] d. 采用上游引物 attP-L2-F-AscI 和下游引物 L2-R-AscI，以pBac{3×P3-DsRedaf}载体为模板进行PCR扩增，得到pBacL2-attP片段，经AscI单酶切后连入pBac{3×P3-DsRedaf}-R3载体，得到pBac{R1-3×P3-DsRed-SV40-L2-attP-FibH-EGFP-LBS-L1}重组载体；所述上游引物attP-L2-F-AscI的序列如SEQ ID No.13所示，下游引物L2-R-AscI的序列如SEQ ID No.14所示；

[0023] e.利用FseI单酶切pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40-Hsp70-PBase-SV40}重组载体，回收attP-R2-3×P3-EGFP-SV40-Hsp70-PBase-SV40片段，再将其插入经相同酶切的pBac{R1-3×P3-DsRed-SV40-L2-attP-FibH-EGFP-LBS-L1}重组载体，即得到复合型piggyBac重组载体。

[0024] 3.复合型piggyBac重组载体在制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统中的应用。

[0025] 4.利用复合型piggyBac重组载体制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的方法，包括以下步骤：

[0026] a.将复合型piggyBac重组载体和转座酶表达载体共同导入解除滞育的G0代蚕卵，筛选出基因组中插入有单拷贝的R1–L1转座子结构并高效表达外源蛋白的杂合G1代转基因家蚕；

[0027] b.将步骤a中筛选获得的杂合G1代转基因家蚕与野生型家蚕回交产生G2代蚕卵，用HCl处理解除G2代蚕卵的滞育，对胚胎或4龄幼虫进行热激处理，再将热激处理后的G2代转基因家蚕与野生型家蚕回交获得G3代转基因家蚕，筛选出基因组中转基因结构两侧的转座子即R1–L2和R2–L1均发生删除的G3代转基因家蚕，该G3代转基因家蚕的基因组中仅含有被2个同向排列的attP位点锚定的外源目的基因表达框序列，即获得了稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统。

[0028] 进一步，所述热激处理方法是每天热激3次，每次42℃热激1小时，连续热激3～5天。

[0029] 5.利用复合型piggyBac重组载体制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的方法，包括以下步骤：

[0030] a.将复合型piggyBac重组载体和转座酶表达载体共同导入解除滞育的G0代蚕卵，筛选出基因组中插入有单拷贝的R1–L1转座子结构并高效表达外源蛋白的杂合G1代转基因家蚕；

[0031] b.将步骤a中筛选获得的杂合G1代转基因家蚕与野生型家蚕回交产生G2代蚕卵，用HCl处理解除G2代蚕卵的滞育，对胚胎或4龄幼虫进行热激处理，再将热激处理后的G2代转基因家蚕与野生型家蚕回交获得G3代转基因家蚕，筛选出基因组中转基因结构单侧R1–L2转座子发生删除而保留R2–L1转座子的G3代转基因家蚕；

[0032] c.将步骤b获得的单侧R1–L2转座子发生删除而保留R2–L1转座子的G3代转基因家蚕按照步骤b进行第2轮热激诱导，筛选出基因组转基因结构两侧的转座子即R1–L2和R2–L1均发生删除的G4代转基因家蚕，该G4代转基因家蚕的基因组中仅含有被2个同向排列的attP位点锚定的外源目的基因表达框序列，即获得了稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统。

[0033] 进一步，所述热激处理方法是每天热激3次，每次42℃热激1小时，连续热激3～5天。

[0034] 本发明的有益效果在于：

[0035] (1)本发明提供了一种含有4个转座子臂的复合型piggyBac重组载体，该重组载体可方便地介导外源目的基因连同筛选标记基因以及piggyBac转座酶表达框序列在家蚕基因组的整合，建立并筛选外源目的基因高效表达的转基因家蚕系，随后可通过热激处理诱导piggyBac转座酶在转基因家蚕体内表达，实现除外源目的基因以外的所有转座子序列和筛选标记基因序列在后代转基因家蚕基因组中的完全删除，从而确保外源目的基因在后代转基因家蚕基因组中稳定整合而不发生再转座现象，同时避免了筛选标记基因的存在对外源目的基因表达的影响以及所带来的生物安全问题。转座子序列和筛选标记基因序列删除后的转基因家蚕基因组含有被attP位点锚定的外源目的基因表达框，通过基于phiC31/att系统的phiC31整合酶介导的盒式交换反应可方便地实现其他外源基因与该目的基因的替换，进而实现其他外源基因在该基因组位点的定点整合。

[0036] (2)本发明提供了所述复合型piggyBac重组载体在制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统中的应用及一种具体的应用方法，首先利用复合型piggyBac重组载体在家蚕基因组插入的随机性，建立在家蚕染色体不同位置同时插入含有外源目的基因、筛选标记基因以及热激启动子调控piggyBac转座酶表达的表达框序列的多个转基因品系，一旦筛选到外源目的基因表达水平最高的一个转基因品系，即可利用热激诱导策略，在家蚕的胚胎发育期或4龄幼虫发育期，通过42℃持续且反复地热激处理转基因家蚕的方法，实现所有转座子序列和筛选标记基因序列在后代转基因家蚕基因组中的完全删除，操作方法简单易行且成本极低，不仅保证了外源目的基因在转基因家蚕基因组中的稳定整合，避免了转基因在宿主家蚕中的丢失或再转座，也有效避免了筛选标记基因对目的基因表达的影响及其所带来的转基因安全问题。采用上述方法获得的转基因家蚕系，其家蚕个体基因组目的基因两侧含有2个同向排列的attP位点，可以方便地通过phiC31整合酶介导的盒式交换反应实现其它外源基因在相同染色体位点的定点替换，因此，采用本发明方法建立的转基因家蚕表达系统是一种稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统。

[0037] 综上，本发明的复合型piggyBac重组载体及利用其建立稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的方法，有效地消除了插入位置效应以及潜在的插入突变和整合后不稳定现象对基因表达的影响，为家蚕的基因功能研究、不同蛋白表达研究等提供了有力的工具。附图说明

[0038] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

[0039] 图1为复合型piggyBac重组载体PB-TP(A)和转座子臂(B)的结构示意图。

[0040] 图2为含有不同荧光标记基因的TS1家蚕红色和绿色荧光检测照片。

[0041] 图3为R1–L1转基因结构在TS1-RgG家蚕基因组中的示意图(A)及野生型871、TS1-RgG1～TS1-RgG4家蚕的茧壳在白光及绿色荧光下的照片(B)；“H”、“X”和“S”分别表示HaeIII、XhoI和SpeI；白光曝光时间均为1/800sec，绿色荧光曝光时间均为1/10sec。

[0042] 图4为EGFP蛋白在TS1-RgG家蚕茧丝中表达的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)检测；A：野生型871(WT)、TS1-RgG1～TS1-RgG4家蚕的茧丝蛋白用β-巯基乙醇处理后于12％SDS-PAGE胶中进行电泳检测，箭头标示重组EGFP蛋白(～57kDa)，三角形标示GFP标准品(27kDa)，M表示蛋白分子量标记；B：利用GFP抗体通过Western blotting检测与(A)中排列相同的蛋白样品，箭头标示重组EGFP蛋白，三角形标示GFP标准品(25ng、50ng和100ng)。

[0043] 图5为利用DsRed探针通过Southern blotting检测XhoI或SpeI消化的基因组DNA的检测结果。

[0044] 图6为利用复合型piggyBac重组载体PB-TP筛选转基因高效表达的转基因家蚕并实现转基因在宿主基因组中稳定性整合的策略示意图。

[0045] 图7为创制用于荧光检测的G3代家蚕的杂交策略。

[0046] 图8为DsRed和EGFP基因在TS3幼虫中的表达检测结果照片。

[0047] 图9为TS3家蚕基因组4种不同转基因以及野生型871家蚕基因组相同位点的序列结构示意图。

[0048] 图10为对基于piggyBac再转座实现的TS3家蚕基因组两端转座子删除事件的分子鉴定。

[0049] 图11为野生型871和TS3-g2家蚕基因组PCR扩增产物的测序分析。

[0050] 图12为创制用于荧光检测的G5代家蚕的杂交策略。

[0051] 图13为HST或非HST处理条件下的R2–L1在TS3-gG2家蚕后代的删除效率；误差线表示标准差(n＝3)；统计上的显著性差异：*P<0.01，**P<0.001。

[0052] 图14为杂合TS4-gG2或杂合TS4-g2蚕蛾和野生型871蚕蛾交配产生的各G5代家蚕中含有g荧光表型的G5代幼虫所占比例。对FibH-EGFP表达框稳定性统计的所有数据证实，上述比率数值之间均没有统计上的显著性差异(P>0.05)。

[0053] 图15为转基因整合在TS3-g2家蚕后代的稳定性检测，其中A为检测EGFP基因在TS7-g2家蚕新孵化幼虫、5龄7天的幼虫和茧壳中的表达；B为利用引物对pBm2902-3′/pBm2902-5′和pBm2902-3′/FibH-MR进行基因组PCR检测，“–/–”、“+/–”和“+/+”分别表示非转基因、杂合转基因以及纯合转基因DNA样品。

具体实施方式

[0054] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0055] 中系实用滞育家蚕品系871(白茧)由发明人所在实验室保存。载体pSLfa1180fa(Carsten Horn.et al2000)、pBac{3×P3-DsRedaf}(AiChun Zhao.et al2010)、pSL{3×P3-EGFP-SV40}(Dingpei Long.et al2012)、pHA3PIG(Toshiki Tamura.et al2000)、pMLS104(Mark L.Siegal.et al1996)和pBac{3×P3-DsRedaf}-R3(AiChun Zhao.et al2010)均由发明人所在实验室保存。

[0056] 一、复合型piggyBac重组载体的构建

[0057] 复合型piggyBac重组载体pBac{R1-3×P3-DsRed-SV40-L2-attP-FibH-EGFP-LBS-attP-R2-3×P3-EGFP-SV40-Hsp70-PBase-SV40-L1}(piggyBac-derived target plasmid，简称“PB-TP”)的结构示意图如图1所示。其含有1个利用FibH启动EGFP基因在家蚕丝腺中特异表达，并与丝素重链融合表达的FibH-EGFP-LBS表达框(FibH参见公开号为CN1912116A的中国专利)。FibH-EGFP-LBS表达框的两端含有2个同向排列的attP位点。在PB-TP载体整合入家蚕基因组并删除所有转座子元件和筛选标记基因实现FibH-EGFP-LBS表达框的稳定整合之后，上述同向排列的attP位点对可用于通过phiC31整合酶介导的RMCE反应实现不同外源基因在相同整合位点的定点整合(在家蚕个体基因组水平实现phiC31整合酶介导的RMCE反应的策略参见公开号为CN103232977A的中国专利)。attP-FibH-EGFP-LBS-attP序列的两端含有2个相对排列的截短型piggyBac转座子臂L2(序列如SEQ ID No.3所示)和R2(序列如SEQ ID No.4所示)。1个以3×P3启动子启动的DsRed表达框3×P3-DsRed-SV40位于野生型piggyBac转座子臂R1(序列如SEQ ID No.1所示)和截短型piggyBac转座子臂L2之间。1个以3×P3启动子启动的EGFP表达框3×P3-EGFP-SV40位于截短型piggyBac转座子臂R2和野生型piggyBac转座子臂L1(序列如SEQ ID No.2所示)之间。1个由黑腹果蝇hsp70基因启动子调控PBase基因表达的表达框Hsp70-PBase-SV40排列于3×P3-EGFP-SV40表达框之后，同样位于转座子臂R2和L1之间。因此，PB-TP载体结构联合了4个不同的转座子(R1–L1、R1–L2、R2–L1和L2–R2)，而且这些转座子能够通过其含有的3×P3-DsRed(用“R”表示)、3×P3-EGFP(用“G”表示)和FibH-EGFP(用“g”表示)转基因荧光标记表达框的不同组合进行区分。截短型piggyBac臂L2和R2在本发明中被用于提高R1–L2和R2–L1在家蚕基因组中的再转座效率，进而提高R1–L2和R2–L1从最初的染色体插入位点删除的效率。由于piggyBac成功转座所必需的元件不但包含piggyBac转座子5′端和3′端的末端重复序列(Terminal inverted repeat sequence,TIRs)，还包含piggyBac两端的DNA序列，特别是“TTAA”位点，因此本发明在构建复合型piggyBac重组载体的过程中，还将“TTAA”位点插入L2和R2序列的3′端(参见引物序列attP-R2-F-SpeI和attP-L2-F-AscI)。

[0058] 具体构建方法如下：

[0059] (1)根据attP位点和pBac{3×P3-DsRedaf}载体序列设计扩增引物：上游引物 attP-R2-F-SpeI：5’-ttaactagtCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGGGGG CCCTAGAAAGATAATCATAT-3’(SEQ ID No.5)，单下划线为SpeI酶切位点，双下划线为piggyBac转座子臂单侧的“TTAA”位点；下游引物R2-R-XhoI：5’-ggacctcgagTAAAAGTTTTGTTACTTTATAG-3’(SEQ ID No.6)，下划线为XhoI酶切位点。采用上述扩增引物，以pBac{3×P3-DsRedaf}载体为模板进行PCR扩增，扩增条件：94℃5min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃20sec]×30个循环，72℃延伸8min。PCR扩增得到0.3kb的attP-pBacR2片段，经SpeI和XhoI双酶切后连入pSL{3×P3-EGFP-SV40}载体，得到pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40}重组载体。

[0060] (2)根据SV40多聚腺苷酸信号序列设计扩增引物，上游引物SV40-F-NotI：5’-gactgcggccgcGACTCTAGATCATAATCAGCC-3’(SEQ ID No.7)，下划线为NotI酶切位点；下游引物SV40-R-SphI：5’-gactgcatgcTACGCGTATCGATAAGCTTTAAG-3’(SEQ ID No.8)，下划线为SphI酶切位点。采用上述扩增引物，以pBac{3×P3-DsRedaf}载体为模板进行PCR扩增，扩增条件：94℃5min，[94℃30sec，58℃30sec，72℃20sec]×30个循环，72℃延伸8min。PCR扩增得到0.27kb的SV40polyA片段，经NotI和SphI双酶切后连入pSLfa1180fa载体，得到pSL-SV40polyA重组载体。

[0061] 根据piggyBac转座酶基因CDS序列设计扩增引物，上游引物PBase-F-SpeI：5’-tataactagtATGGGTAGTTCTTTAGACG-3’(SEQ ID No.9)，下划线为SpeI酶切位点；下游引物PBase-R-NotI：5’-tatagcggccgCTAGAAACAACTTTGGCACATATC-3’(SEQ ID No.10)，下划线为NotI酶切位点。采用上述扩增引物，以pHA3PIG载体为模板进行PCR扩增，扩增条件：94℃5min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃2min]×30个循环，72℃延伸8min。PCR扩增得到1.8kb的piggyBac转座酶基因片段(简称PBase)，经SpeI和NotI双酶切后连入pSL-SV40polyA载体，得到pSL-PBase-SV40重组载体。

[0062] 根据黑腹果蝇hsp70基因启动子序列设计扩增引物，上游引物Hsp70-F-SphI/SpeI：5’-tataactagtgcatgcCTAGAATCCCAAAACAAACT-3’(SEQ ID No.11)，下划线为SpeI酶切位点；下游引物Hsp70-R-SpeI：5’-ggacactagtTATTCAGAGTTCTCTTCTTGTAT-3’(SEQ ID No.12)，下划线为SpeI酶切位点。采用上述扩增引物，以pMLS104载体为模板进行PCR扩增，扩增条件：94℃5min，[94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec]×30个循环，72℃延伸8min。PCR扩增得到0.48kb的果蝇hsp70基因启动子片段(简称Hsp70)，经SpeI单酶切后连入pSL-PBase-SV40载体，得到pSL{Hsp70-PBase-SV40}重组载体。

[0063] (3)利用SphI单酶切pSL{Hsp70-PBase-SV40}重组载体，回收 2.32kb的Hsp70-PBase-SV40片段，再将其插入经相同酶切的pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40}重组载体，得到pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40-Hsp70-PBase-SV40}重组载体。

[0064] (4)根据attP位点和pBac{3×P3-DsRedaf}载体序列设计扩增引物，上游引物attP-L2-F-AscI：5’-tataggcgcgccCCCCCAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGGCCCTAGAAAGATAGTCTGCG-3’(SEQ ID No.13)，单下划线为AscI酶切位点，双下划线为piggyBac转座子臂单侧的“TTAA”位点；下游引物L2-R-AscI：5’-tataggcgcgccACGATATCTATAACAAGAAAAT-3’(SEQ ID No.14)，下划线为AscI酶切位点。采用上述扩增引物，以pBac{3×P3-DsRedaf}载体为模板进行PCR扩增，扩增条件：94℃5min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec]×30个循环，72℃延伸8min。PCR扩增得到0.37kb的pBacL2-attP片段，经AscI单酶切后连入pBac{3×P3-DsRedaf}-R3载体，得到pBac{R1-3×P3-DsRed-SV40-L2-attP-FibH-EGFP-LBS-L1}重组载体。

[0065] (5)利用FseI单酶切pSL{attP-R2-3×P3-EGFP-SV40-Hsp70-PBase-SV40}重组载体，回收4.23kb的attP-R2-3×P3-EGFP-SV40-Hsp70-PBase-SV40片段，再将其插入经相同酶切的pBac{R1-3×P3-DsRed-SV40-L2-attP-FibH-EGFP-LBS-L1}重组载体，即得到复合型piggyBac重组载体PB-TP。

[0066] 上述各步骤中得到的PCR产物和重组载体均经过测序验证克隆的正确性。

[0067] 二、利用复合型piggyBac重组载体建立稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统[0068] 利用复合型piggyBac重组载体建立稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的策略示意图如图6所示。(i)通过piggyBac转座子介导的滞育家蚕品系的种系转化方法，将PB-TP载体(图6A)和转座酶表达载体pHA3PIG(图6B)共同导入解除滞育的G0代蚕卵，通过荧光标记表型和分子鉴定筛选出基因组中插入有单拷贝R1–L1转座子结构并在其蚕丝中高效表达EGFP蛋白的TS1-RgG家蚕个体(图6C)；(ii)热激处理(Heat shock treatment,HST)胚胎或幼虫发育阶段的非滞育杂合TS2-RgG家蚕，在HST诱导产生的PBase作用下，位于TS2-RgG家蚕生殖细胞基因组转基因结构两侧的转座子(R1–L2、R2–L1)发生再转座事件(图6D)，导致单侧的转座子(R2–L1或R1–L2)或两侧的转座子(R1–L2和R2–L1)在TS3-Rg、TS3-gG或TS3-g家蚕基因组的删除(图6E–G)，发生再转座事件的TS3家蚕可以通过其荧光标记表型的变化(主要是缺失变化)进行鉴定。(iii)实现两侧转座子均发生删除的TS3-g家蚕，其基因组中仅含有被2个同向排列的attP位点锚定的FibH-EGFP-LBS表达框(图6G)。而仅实现单侧转座子删除的TS3-gG家蚕(图6F)可以按照上述策略进行第2轮的热激诱导实验，最终实现所有转座子序列和筛选标记基因序列在其生殖细胞基因组中完全删除，进而在其后代中筛选到基因组中仅含有被2个同向排列的attP位点锚定的FibH-EGFP-LBS表达框序列的TS4-g家蚕(图6H)。通过以上步骤利用复合型piggyBac重组载体介导实现转基因在家蚕基因组的稳定整合而不发生再转座事件之后，即可利用2个同向排列的attP位点，通过phiC31介导的RMCE反应实现不同外源基因在相同整合位点的定点整合(参见公开号为CN103232977A的中国专利)。

[0069] 具体建立方法如下：

[0070] 1、筛选转基因高效表达的G1代转基因家蚕

[0071] 用中系实用滞育家蚕品系871(白茧)作为实验动物材料，亲代蚕卵经低温(16℃)催青处理以解除子代蚕卵的滞育；将5-10nL总浓度为450ng/μL的重组载体PB-TP与辅助质粒pHA3PIG的混合液注射至解除滞育的G0代蚕卵中，用无毒胶水封口，置25℃、相对湿度85％环境中催青孵化，孵化获得的蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，获得的G0代蚕蛾通过回交产生G1代蚕卵，孵化，获得的G1代幼虫用Olympus电动宏观荧光显微镜观察并鉴定眼睛和身体发出的不同荧光，将获得的G1代转基因阳性家蚕以蛾区为单位进行单独饲育，即实现转基因家蚕系(Transgenic strains,TSs)的建立。G1代TS命名为TS1，其后代依次命名为TS2、TS3……TSn(“n”代表世代)，依次类推。2次独立的注射实验的筛选统计结果见表1。

[0072] 表1、PB-TP载体在871品系家蚕G0代蚕卵的注射筛选结果

[0073]

[0074] 如表1所示，2次独立的注射实验共获得了11圈G1代转基因阳性蚕卵，每1圈蚕卵中至少含有1头转基因家蚕个体。在2次独立注射实验中，获得G1代阳性蚕卵圈数占所有筛选G1代蚕卵圈数的百分比分别为13.6％和10.3％。

[0075] 由于PB-TP载体含有4种不同的潜在转座子，因此含有不同转座子插入的TS1代家蚕幼虫显示出不同的荧光表型。含有不同荧光表型的TSn家蚕，根据其荧光表型的不同，如3×P3-DsRed(R)、FibH-EGFP(g)或3×P3-EGFP(G)，分别缩写为TSn-R、TSn-G或TSn-g；例如，如果来自G1代的转基因家蚕个体同时含有3种不同的荧光表型，则记为“TS1-RgG”。
2次独立的注射实验获得的来自不同G1代阳性蛾圈的TS1家蚕的荧光表型分析结果见表
2。同时，图2显示了发育早期的TS1代家蚕幼虫的荧光照片。

[0076] 表2、来自不同G1代阳性蛾圈的TS1家蚕的荧光表型分析结果

[0077]

[0078] 如表2所示，在11圈含有阳性家蚕个体的G1蚕卵中共筛选到了4头分别来自于4圈不同蚕卵的TS1-RgG家蚕，分别命名为TS1-RgG1～TS1-RgG4。由于所有的TS1-RgG家蚕的基因组中均含有FibH-EGFP表达框(图3A)，来自TS1-RgG1～TS1-RgG4家蚕的茧壳显示出非常强烈的绿色荧光，说明它们的茧壳中含有大量的重组EGFP蛋白(图3B)。其中来自于TS1-RgG2家蚕的茧壳在相同的曝光时间和相同的激发光强度下显示出的荧光强度最大(图3B)。采用SDS-PAGE和Western blotting(GFP抗体)分别检测来自TS1-RgG家蚕和野生型871家蚕的茧丝蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示，在每个来自TS1-RgG家蚕茧丝蛋白的电泳泳道，均检测到1条约57kDa的单一的EGFP/H-chain融合蛋白条带(图4A)。根据Western blotting的检测结果(图4B)，经计算，纯EGFP蛋白在TS1-RgG1～TS1-RgG4家蚕茧丝总蛋白所占比例分别为14.6％、16.5％、7.1％和0.9％(表3)，该结果与通过荧光体视显微镜观察到的茧壳荧光强度结果相一致。

[0079] 表3、不同TS1-RgG家蚕茧壳中的重组EGFP蛋白含量

[0080]

[0081] 采用Southern blotting检测R1–L1转基因结构在TS1-RgG1和TS1-RgG2家蚕基因组中的插入拷贝数，结果显示，TS1-RgG1和TS1-RgG2家蚕基因组均插入有单拷贝的R1–L1转基因结构(图5)。采用Inverse PCR检测R1–L1转基因结构在TS1-RgG1～TS1-RgG3家蚕基因组中的插入位点，结果见表4，转基因在TS1-RgG1和TS1-RgG2家蚕基因组中的插入均为杂合形式，R1–L1转座子在TS1-RgG1和TS1-RgG2家蚕基因组中的插入位点分别定位于第24号和第18号染色体。

[0082] 表4、piggyBac转座子插入位点两端20bp的家蚕基因组序列

[0083]基因组序列
3'- TTAAGTGCTTATGGGAGCCCATAG TTAAGTATATTTGTTAATTTATAT TTAATTGCATATTGCGTAGATTCT基因组序列
5'- AGCTCACTGTCCACGTGGTGTTAA AGTCAGTCAGTCAAACATATTTAA TGAAGAGTGACGTCAAAGTTTTAA染色体 24 18 –
Scaffold nscansf2891 nscaf2902 scaffold16066
品系 TS1-RgG1 TS1-RgG2 TS1-RgG3

[0084] 由此，本实施例最终建立起2个杂合的G1代转基因系——TS1-RgG1和TS1-RgG2，来自这2个品系的家蚕个体基因组中均含有单拷贝的R1–L1转基因结构。其中TS1-RgG2家蚕在其茧丝蛋白中表达重组EGFP蛋白的效率最高，即本实施例筛选到了1个在茧丝中高效表达外源蛋白的转基因家蚕系TS1-RgG2。

[0085] 2、创制不含有转座元件及筛选标记基因的转基因家蚕

[0086] 按照图7所示的流程，用前述筛选出的1头杂合的TS1-RgG2雄蛾与1头野生型871# # #雌蛾回交产生1圈G2代蚕卵；将来自同一G2代蛾圈的蚕卵分成3组(1、2和3 )，用HCl处# #
理解除各组蚕卵的滞育，然后，1组不进行热激处理；2 组进行胚胎发育期的热激处理：将发育3天的G2代非滞育蚕卵置于1个有盖塑料培养皿中，再将培养皿置于人工气候培养箱中，42℃热激处理蚕卵60min(湿度保持在85％～90％)，热激处理后的蚕卵再于25℃、湿度85％～90％条件下保持6h，然后重复上述热激步骤，每天热激3次，持续热激处理5天，整个热激处理完成后，将蚕卵于25℃正常催青直至孵化，孵化后的幼虫不再进行热激处理；
#
3组进行幼虫发育期的热激处理：将G2代非滞育蚕卵于25℃正常催青直至孵化，孵化后的G2代幼虫正常饲养至3龄眠，将4龄起蚕置于1个纸盒中，再将纸盒置于人工气候培养箱中，42℃热激处理幼虫60min(湿度保持在75％～80％)，热激处理后的幼虫再于25℃、湿度75％～80％条件下保持6h并喂以新鲜桑叶，然后重复上述热激步骤，每天热激3次，持续热激处理3天，整个热激处理完成后，将幼虫于25℃条件下喂以桑叶正常饲养；结果从来# # #
自1、2和3 组的G2代家蚕中分别筛选到了54头、41头和51头成活TS2-RgG2蚕蛾，将这些蚕蛾与野生型871蚕蛾回交产生G3代蛾圈，检测来自于各组G3代蛾圈的TS3幼虫荧光表型。筛选到的至少含有1头TS3-Rg、TS3-gG或TS3-g幼虫的G3代蛾圈分别被命名为Rg、#
gG或g阳性蛾圈，最终从来自2组的37个G3代蛾圈中筛选到了6个g阳性蛾圈，从来自# # #
3组的45个G3代蛾圈中筛选到了1个g阳性蛾圈，g阳性蛾圈在2 组和3 组的G3代蛾# #
圈中的比例分别为16.22％和2.22％，Rg、gG和g阳性蛾圈总数在2组和3 组的G3代蛾圈中的比例分别为62.16％和15.56％(表5)。图8显示了TS3代幼虫表达DsRed和EGFP基因的图片。

[0087] 表5、基因组中发生piggyBac转座子整合后删除事件的TS3家蚕数量统计[0088]

[0089] 注：a至少含有1头TS3-Rg2、TS3-gG2或TS3-g2幼虫的G3代蛾圈数量。

[0090] 为了进一步鉴定由piggyBac再转座引起的TS3代家蚕个体基因组中所含的两侧转座子(R1–L2和/或R2–L1)的删除事件，提取不同的TS3代蚕蛾和野生型871蚕蛾的基因组，用XhoI消化后，分别用EGFP探针和DsRed探针进行Southern blotting分析。结果如图10A所示，利用EGFP探针从来自TS3-RgG2和TS3-gG2家蚕基因组样品的泳道中均杂交得到了1条2.3kb和1条1.3kb的信号条带，从来自TS3-Rg2和TS3-g2家蚕基因组样品的泳道中则均仅杂交得到了1条大小相同的信号条带，而从来自野生型871家蚕基因组样品的泳道中没有杂交得到任何信号条带；利用DsRed探针从来自TS3-RgG2和TS3-Rg2家蚕基因组样品的泳道中均杂交得到了1条大小相同的信号条带，而从来自TS3-gG2、TS3-g2和野生型871家蚕基因组样品的泳道中则没有杂交得到任何信号条带。上述结果与各不同类型的TS3代家蚕基因组(图9)的预期杂交带型结果是一致的。

[0091] 随后，根据转基因插入位点附近的家蚕基因组序列和插入的转基因序列设计如下引物：pBm2902-5 ′：5’-TACACACATTTATGTATATCACAAAAAGCG-3’(SEQ ID No.15)；pBm2902-3′：5’-TACCGATTGATTGCATCTACG-3’(SEQ ID No.16)，通过基因组PCR对TS3代家蚕基因组中所含的转基因结构进行鉴定。结果如图10B所示，从各个不同的TS3代家蚕基因组中扩增得到的PCR产物条带与预测的发生转座子删除反应后的各TS3代家蚕基因组(图9)扩增条带大小一致。因此，基因组PCR反应的结果证实了TS3-Rg2家蚕基因组中R2–L1的删除、TS3-gG2家蚕基因组中R1–L2的删除以及TS3-g2家蚕基因组中R2–L1和R1–L2的同时删除。同时，当以TS3-g2家蚕基因组为模板，用引物对pBm2902-3′/pBm2902-5′进行PCR扩增反应时，由于转基因结构在筛选到的TS3-g2家蚕中是以杂合形式存在，因此扩增得到了1条3893bp的包含被attP位点锚定的FibH-EGFP表达框序列的PCR产物条带和1条358bp的来自于野生型871家蚕染色体DNA的PCR产物条带(用引物对pBm2902-3′/pBm2902-5′从野生型871家蚕基因组中仅能扩增得到1条358bp的PCR产物条带)。对来自于所有TS3-g2家蚕个体基因组的3893bp的PCR产物条带均进行测序分析，结果显示，在所有TS3-g2家蚕个体基因组中，无论是所含转基因结构本身还是其插入位点附近的基因组DNA，均没有发生突变现象以及由突变引起的结构改变，该结果说明了piggyBac的再转座事件并没有在切除的“TTAA”位点留下任何的“足迹”，这与预期结果相一致。图11显示了TS3-g2家蚕基因组中被attP位点锚定的FibH-EGFP表达框的3′端和
5′端序列的测序结果和野生型871基因组在相同的基因组位点(即转基因插入位点)的测序结果。

[0092] 3、筛选创制不含有转座元件及筛选标记基因的转基因家蚕的最优热激处理条件[0093] 按照图12所示的流程，用前述筛选出的1头杂合的TS3-gG2雄蛾与3头不同的野生型871雌蛾(a、b和c)回交产生3个不同的G4代蛾圈(a、b和c)，将每个G4代蛾圈的# # # #蚕卵又分成3组(1、2和3 )，用HCl处理解除各组蚕卵的滞育，然后按前述相同方法，1组# #
不进行热激处理，2组进行胚胎发育期的热激处理，3 组进行幼虫发育期的热激处理，再从G4代a、b和c蛾圈的各组中分别筛选出50头成活TS4-gG2蚕蛾，将这些蚕蛾与野生型871蚕蛾回交产生G5代蛾圈，最后对来自各组的G5代a、b和c蛾圈的幼虫荧光表型进行检测。
# # #
结果见表6，在来自1组、2 组和3 组的G5代蛾圈中，含有TS5-g2家蚕的g阳性蛾圈的比例分别为0％～2％、70％～80％和10％～14％。经计算，在胚胎发育期进行热激处理实现R2–L1删除的效率显著高于在幼虫发育期进行热激处理，而在幼虫发育期进行热激处理实现R2–L1删除的效率又显著高于不进行热激处理(图13)。因此，在转基因家蚕胚胎发育阶段，利用42℃进行持续且反复多次的热激处理，是实现转座子序列在其后代家蚕基因组中删除的最有效方法。

[0094] 表6、不同热激策略实现的R2–L1在TS3-gG2家蚕后代中的整合后删除效率[0095]

[0096] 注：a(G5代g阳性蛾圈数/筛选G5代蛾圈数)的百分比。

[0097] b(每个G5代g阳性蛾圈含有的TS5-g2家蚕数/该G5代g阳性蛾圈含有的G5代家蚕总头数)的百分比。每个G5代g阳性蛾圈含有450～550头G5代家蚕。

[0098] c具有g荧光表型的G5代家蚕包括TS5-gG2和TS5-g2家蚕。每个G5代蛾圈含有450～550头G5代家蚕。

[0099] 4、检测FibH-EGFP表达框在TS3家蚕后代基因组中的遗传稳定性[0100] 为了检测和评估FibH-EGFP表达框在前述获得的TS3-g2家蚕后代基因组中的稳定性，将TS4-g2(+/–，表示杂合子)或TS4-g2(+/+，表示纯合子)蚕蛾与野生型871蚕蛾通过正反交的方式交配制种，获得了16个G5代蛾圈，然后对来自于这些G5代蛾圈的幼虫荧光表型进行了检测。结果见表7和表8，TS5-g2家蚕在TS4-g2(+/–)蚕蛾和野生型871蚕蛾正反交获得的8个G5代蛾圈(共计4081头G5代家蚕)中所占比例几乎都为50％(如果g荧光表型是稳定的，则在这些G5代蛾圈中，含有g荧光表型的家蚕的理论值为50％)；TS5-g2家蚕在TS4-g2(+/+)蚕蛾和野生型871蚕蛾正反交获得的8个G5代蛾圈(共计
4059头G5代家蚕)中所占比例都为100％(如果g荧光表型是稳定的，则在这些G5代蛾圈中，含有g荧光表型的家蚕的理论值为100％)。以上结果证实了FibH-EGFP表达框在不含有PBase的TS3-g2家蚕后代基因组中的稳定性。

[0101] 表7、TS4-g2(+/–)蚕蛾和野生型871蚕蛾正反交获得的G5代蛾圈中TS5-g2家蚕所占比例

[0102]

[0103] 表8、TS4-g2(+/+)蚕蛾和野生型871蚕蛾正反交获得的G5代蛾圈中TS5-g2家蚕所占比例

[0104]

[0105]

[0106] 结合表6所示数据可知，所有筛选的TS4-gG2蚕蛾基因组中均含有杂合的FibH-EGFP表达框。表6数据还显示，筛选获得的各G5代g阳性蛾圈中含有的TS5-g2家蚕的比例为1.53％～25.78％，该结果说明R2–L1在各G5代g阳性蛾圈中的再转座效率至少为1.53％～25.78％。但是通过检测来自各实验组的150个G5代蛾圈发现(每个实验组均含有共计超过75000头G5代家蚕)，含有g荧光表型(包括TS5-gG2和TS5-g2家蚕)的G5代家蚕个体数占该蛾圈家蚕总个体数的比例几乎都为50％，该结果与理论值相一致(图14)。以上结果证实了FibH-EGFP表达框在体内含有PBase的TS4-gG2家蚕个体的基因组中不能发生再转座事件。

[0107] 此外，用Olympus电动宏观荧光显微镜检测EGFP蛋白在TS7-g2家蚕体内以及茧丝中的表达。结果如图15A所示，EGFP蛋白在TS7-g2家蚕的丝腺中具有特异性高效表达，并能分泌到其茧丝中。为了进一步确认FibH-EGFP表达框在TS3-g2家蚕后代基因组中的整合稳定性，提取TS3-g2(+/–)、TS4-g2(+/–)、TS4-g2(+/+)和TS7-g2(+/+)家蚕的基因组，分别利用引物对pBm2902-3′/pBm2902-5′和pBm2902-3′/FibH-MR通过基因组PCR进行了鉴定。结果如图15B所示，利用引物对pBm2902-3′/pBm2902-5′，从TS3-g2(+/–)、TS4-g2(+/–)、TS4-g2(+/+)和TS7-g2(+/+)家蚕的基因组中均扩增得到了1条3893bp的PCR产物条带，从野生型871(WT，–/–，表示非转基因)、TS3-g2(+/–)和TS4-g2(+/–)家蚕的基因组中均扩增得到了1条358bp的PCR产物条带；利用引物对pBm2902-3′/FibH-MR从TS3-g2(+/–)、TS4-g2(+/–)、TS4-g2(+/+)和TS7-g2(+/+)家蚕的基因组中均扩增得到了1条612bp的PCR产物条带。这些PCR产物条带的大小都和预期值相符合。以上的所有结果证实，无论转基因家蚕体内是否含有PBsae，FibH-EGFP表达框在TS3家蚕后代基因组的整合以及EGFP蛋白在TS3家蚕后代体内及茧丝中的表达均具有稳定性。

[0108] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

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